專利名稱：人參糖蛋白的制備及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種由人參中提取分離得到的人參糖蛋白，其中總糖含量為30%左右，酸性糖含量在10%左右，蛋白質(zhì)含量在30%以上，人參糖蛋白重均分子量(Mw)分布在I. 7X IO4左右，糖部分的糖苷鍵連接方式為以I — 4連接葡萄糖為主鏈，蛋白質(zhì)部分由16種氨基酸組成。此人參糖蛋白具有抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜的作用。本發(fā)明屬于醫(yī)藥和保健食品開(kāi)發(fā)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人參為五加科植物人參(Panax ginseng C. A. Meyer)的干燥根及根莖。為名貴藥材，具有獨(dú)特的藥用價(jià)值和醫(yī)療保健作用，一直深受人們的重視。多年的研究結(jié)果表明，人參在調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、提高學(xué)習(xí)記憶能力、改善心臟功能、降血糖作用、增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能、抗腫瘤作用、抗氧化作用等方面都顯示出很強(qiáng)的藥用活性。迄今為止，已從人參中分 離出的化學(xué)成分有皂苷類化合物、多糖(寡糖)類成分、多肽、脂肪酸類化合物、氨基酸等，其中研究最多的是人參皂苷類和多糖類成分為人參生物活性的主要成分。目前，對(duì)人參糖蛋白的研究報(bào)道甚少。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，僅查到張彬等報(bào)道的人參糖蛋白的分離純化及其性質(zhì)研究(藥物分析雜志2006 (26) 2 272-276頁(yè))，該文獻(xiàn)報(bào)道的人參糖蛋白的制備是將人參粗多糖提取物先經(jīng)Hiprep2660Sephacryl S200柱層析分離純化得到第一個(gè)組分峰I,再經(jīng)過(guò)HitrapQ 26/60柱層析梯度洗脫純化得到組分P1,經(jīng)HPGPC檢測(cè)，該組分P1為一峰形對(duì)稱的蛋白質(zhì)-糖組分，重均分子量(Mw)分布在24000左右，該組分對(duì)水透析，冷凍干燥，SP為人參糖蛋白。張彬報(bào)道的人參糖蛋白僅是人參糖蛋白其中的一個(gè)片段(分子量在24000左右)，并對(duì)該片段的理化性質(zhì)進(jìn)行了研究。而本權(quán)利要求書(shū)I所制得的人參糖蛋白重均分子量(Mw)分布在I. 7X IO4左右，所以，本權(quán)利要求書(shū)I與張彬報(bào)道的人參糖蛋白有其本質(zhì)差異。本發(fā)明所得到的人參糖蛋白其重均分子量(Mw)分布在I. 7X IO4左右，其中人參糖蛋白中的總糖含量為30%左右，酸性糖含量為10%左右，蛋白質(zhì)含量在30%以上。本發(fā)明所得到的人參糖蛋白，為今后以人參為原料開(kāi)發(fā)新藥、保健食品或食品拓寬了開(kāi)發(fā)空間。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，有關(guān)糖蛋白生物活性報(bào)道很多，主要集中在抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫方面的活性研究，關(guān)于糖蛋白的其他方面的用途非常少見(jiàn)。到目前為止，尚未檢索到有關(guān)人參糖蛋白生物活性的報(bào)道。在本發(fā)明中，通過(guò)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明了人參糖蛋白在抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜方面的活性，其中抗炎作用通過(guò)對(duì)小鼠二甲苯耳水腫的影響和對(duì)小鼠角叉菜膠足腫脹的影響來(lái)證實(shí)；鎮(zhèn)痛作用通過(guò)對(duì)醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響和對(duì)福爾馬林所致小鼠疼痛的影響來(lái)證實(shí)；鎮(zhèn)靜作用通過(guò)對(duì)小鼠自主活動(dòng)的影響和對(duì)小鼠戊四氮致驚厥的影響來(lái)證實(shí)。在本發(fā)明之前，尚未見(jiàn)有關(guān)人參糖蛋白抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜方面的研究報(bào)道。因此，本發(fā)明權(quán)利要求所保護(hù)的內(nèi)容具有創(chuàng)新性和新穎性
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供了一種植物資源豐富、可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的人參糖蛋白，可以更好地開(kāi)發(fā)和利用著稱為“百草之王”的傳統(tǒng)中藥一人參。該人參糖蛋白的特征在于
(a)人參糖蛋白中的總糖含量為30%左右，酸性糖含量為10%左右，蛋白質(zhì)含量在30%以上；
(b)人參糖蛋白重均分子量(Mw)分布在I.7X IO4左右；(c)人參糖蛋白中的糖部分主要為葡萄糖，此外，還含有少量的甘露糖、半乳糖、巖藻糖、半乳糖醛酸；(d)糖部分的糖苷鍵連接方式為以I — 4連接葡萄糖為主鏈，(e)蛋白質(zhì)部分由天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、組氨酸、甘氨酸、精氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、絡(luò)氨酸等16種氨基酸組成。本發(fā)明的目的之二是通過(guò)藥效學(xué)試驗(yàn)篩選出人參糖蛋白的活性，通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果表明人參糖蛋白在抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜方面具有良好的生物活性，為將人參糖蛋白開(kāi)發(fā)成新藥、保健食品或食品用于疾病的預(yù)防治療及保健奠定了基礎(chǔ)。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案 I、人參糖蛋白的制備將人參Panax ginseng C. A. Meyer粉碎,加10_15倍量的水煎煮2次,每次3小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，濃縮至每Iml含Ig藥材，通過(guò)已處理好的DlOl大孔吸附樹(shù)脂，用水洗脫2倍量柱體積，水洗脫液通過(guò)截留分子量為20000的中空纖維柱進(jìn)行超濾，超濾液繼續(xù)通過(guò)截留分子量為1000的中空纖維柱進(jìn)行超濾，濃備液濃縮，真空干燥，得人參糖蛋白。2、人參糖蛋白結(jié)構(gòu)表征為了確定人參糖蛋白中糖與蛋白部分的基本構(gòu)成，我們利用化學(xué)方法和光譜數(shù)據(jù)驗(yàn)證上述工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品為人參糖蛋白，分析結(jié)果如下(I)理化性質(zhì)結(jié)果總糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸法，葡萄糖作為對(duì)照品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，人參糖蛋白中的總糖含量在34%。酸性糖含量的測(cè)定采用間-羥基聯(lián)苯法，半乳糖醛酸作為對(duì)照品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，人參糖蛋白中的酸性糖含量為12%，蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用Lowry法，牛血清蛋白作為對(duì)照品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，人參糖蛋白中的蛋白含量在45%。(2)分子量分布采用HPLC，示差檢測(cè)器，美國(guó)賽芬柱SRT SEC-100 (截留分子量100-100000)，以色氨酸(分子量為204. 23)、蛋白酶抑制劑(分子量為6512)、VB12(分子量為1355)、細(xì)胞色素C(分子量為12327)、牛血清白蛋白(分子量為66200)作為對(duì)照品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，GPC軟件計(jì)算結(jié)果表明，人參糖蛋白重均分子量(Mw)分布在1.74X 104左右。Ln(Mn) =Βο+Β1 X T+B2 X T2+B3 X T3Βο=6· 421077，Bl=-O. 1460711, Β2=0, Β3=0R2=O. 996563(3)組成糖分析采用PMP-柱前衍生化法，將人參糖蛋白中糖部分制備成衍生物，以各單糖的衍生物作為對(duì)照品，HPLC結(jié)果表明，人參糖蛋白中糖部分主要為葡萄糖，還含有及少量的甘露糖、半乳糖、巖藻糖及半乳糖醛酸組成。(4)甲基化分析采用Hakomori法,將人參糖蛋白中糖部分制備成衍生物，GC-MS結(jié)果表明，人參糖蛋白中糖苷鍵連接方式為以I — 4連接葡萄糖為主鏈。
(5)氨基酸分析，采用HPLC，將人參糖蛋白用6mol/L鹽酸水解20小時(shí)，以20種氨基酸作為對(duì)照品，分別制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，人參糖蛋白由天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、組氨酸、甘氨酸、精氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、絡(luò)氨酸16種氨基酸組成。人參糖蛋白具有抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜的作用，這些藥理作用，通過(guò)以下藥效學(xué)試驗(yàn)例得到證實(shí)?？诜案骨唤o予小鼠人參糖蛋白，觀察其對(duì)炎癥、疼痛及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響。方法采用小鼠二甲苯耳水腫及角叉菜膠足腫脹作為炎癥模型、小鼠醋酸扭體、甲醛舔后足為疼痛模型，小鼠自主活動(dòng)、戊四氮引起驚厥作鎮(zhèn)靜模型。動(dòng)物昆明種小鼠，體重18_22g，雄性，購(gòu)自長(zhǎng)春生物制品研究所，許可證號(hào)SCXK (吉)-2006-0001。自由攝食飲水。
藥物人參糖蛋白由吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院植化室提供，為淺黃色粉末。阿司匹林為沈陽(yáng)奧吉娜藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)20120107。安痛定為河南潤(rùn)弘制藥股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)1206091。300、200、100mg/kg為人參糖蛋白口服給藥劑量，實(shí)驗(yàn)前一天口服給藥2次，每次間隔8h,實(shí)驗(yàn)當(dāng)天再給藥一次,共3次；60、30、15mg/kg為人參糖蛋白腹腔給藥劑量，只在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天給藥一次。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果用t檢驗(yàn)處理。實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果(I).抗炎作用a.對(duì)小鼠二甲苯耳水腫的影響取雄性小鼠80只，隨機(jī)分為對(duì)照組、50mg/kg阿司匹林口服組、300、200、100mg/kg為人參糖蛋白口服組、60、30、15mg/kg為人參糖蛋白腹腔組，每組10只，共8組，于口服給藥45min及腹腔給藥30min后與小鼠左耳涂二甲苯20μ1, 20min后處死小鼠,利用9mm鐵沖下動(dòng)物左右耳，以動(dòng)物左右耳差作為腫脹度，進(jìn)行“t”檢驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表I。b.對(duì)小鼠角叉菜膠足腫脹的影響分組及給藥同前，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天于每只小鼠右后足注射O. 1%角叉菜膠O. 03ml,注射角叉菜膠后4h處死小鼠，在處死小鼠前45、30min分別口服及腹腔給藥，于腳掌于腳踝絨毛分界處剪下左右腳掌，以左右足重量之差作為腫脹度，進(jìn)行“t”檢驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表1、2。表I. 口服給予人參糖蛋白對(duì)小鼠炎癥模型的影響
權(quán)利要求
1.一種人參糖蛋白的制備方法，其特征在于將人參Panax ginseng C. A. Meyer粉碎，加10-15倍量的水煎煮2次，每次3小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，濃縮至每Iml含Ig藥材，通過(guò)已處理好的DlOl大孔吸附樹(shù)脂，用水洗脫2倍量柱體積，水洗脫液通過(guò)截留分子量為20000的中空纖維柱進(jìn)行超濾，超濾液繼續(xù)通過(guò)截留分子量為1000的中空纖維柱進(jìn)行超濾，濃備液濃縮，真空干燥，得人參糖蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述人參糖蛋白，其特征在于 (a)人參糖蛋白中的總糖含量為30%左右，酸性糖含量為10%左右，蛋白質(zhì)含量在30%以上； (b)人參糖蛋白重均分子量分布在I.7 X IO4左右； (c)人參糖蛋白中的糖部分主要為葡萄糖，此外，還含有少量的甘露糖、半乳糖、巖藻糖、半乳糖醛酸； (d)糖部分的糖苷鍵連接方式為以I— 4連接葡萄糖為主鏈； (e)人參糖蛋白中的蛋白部分由天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、組氨酸、甘氨酸、精氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、絡(luò)氨酸16種氨基酸組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述人參糖蛋白在制備抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜的藥物和保健食品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥和保健食品開(kāi)發(fā)技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂、中空纖維柱超濾分離等技術(shù)，從傳統(tǒng)中藥人參中提取分離得到人參糖蛋白的方法，該糖蛋白中總糖含量為30%左右，酸性糖含量在10%左右，蛋白質(zhì)含量在30%以上，人參糖蛋白重均分子量(Mw)分布在1.7×104左右，糖部分的糖苷鍵連接方式為以1→4連接葡萄糖為主鏈，蛋白質(zhì)部分由16種氨基酸組成，通過(guò)藥效學(xué)試驗(yàn)也證明了人參糖蛋白具有抗炎、鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜的作用。
文檔編號(hào)A61P29/00GK102827256SQ20121036157
公開(kāi)日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月25日
發(fā)明者姜瑞芝, 王穎, 陳英紅, 高其品, 劉威, 徐宏, 羅浩銘 申請(qǐng)人:姜瑞芝