專利名稱：一種酵母M-dsRNA作為TLR3激動(dòng)劑的應(yīng)用及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酵母M-dsRNA作為TLR3激動(dòng)劑的應(yīng)用及其制備方法。
背景技術(shù)：
Toll樣受體(Toll-like Receptors,TLRs)是一類進(jìn)化中序列高度保守的天然免疫受體大家族。TLRs能特異地識(shí)別病原相關(guān)的分子模式(Pathogen Associated MolecularPatterns, PAMPs)，不僅在激活天然免疫中發(fā)揮重要的作用，而且還調(diào)節(jié)獲得性免疫，是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁。TLRs是單個(gè)的跨膜非催化性蛋白質(zhì)，可以識(shí)別來源于微生物的具有 保守結(jié)構(gòu)的分子。當(dāng)微生物突破機(jī)體的物理屏障，如皮膚、粘膜等時(shí)，TLRs可以識(shí)別它們并激活機(jī)體產(chǎn)生免疫細(xì)胞應(yīng)答。目前，在哺乳動(dòng)物及人類中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的人TIRs家族成員有11個(gè)。根據(jù)染色體的位置、基因結(jié)構(gòu)和氨基酸序列，人的TLRs受體可以分為5個(gè)亞科，即TLR2、TLR3、TLR4、TLR5和 TLR9。TLR2 亞科有 TLRl、TLR2、TLR6 和 TLR10 ；TLR9 亞科有 TLR7、TLR8 和 TLR9 ;TLR3、TLR4和TLR5各自形成一個(gè)亞科。TLR如同天然免疫的眼睛，監(jiān)視與識(shí)別各種不同的疾病相關(guān)分子模式(PAMP)，是機(jī)體抵抗感染性疾病的第一道屏障。其中TLR4可以識(shí)別革蘭氏陰性菌脂多糖(LPS)，還可識(shí)別宿主壞死細(xì)胞釋放的熱休克蛋白(Heat-Shock Proteins, HSP),體內(nèi)類肝素硫酸鹽和透明質(zhì)酸鹽降解的多糖部分以及局部的內(nèi)源性酶的級(jí)聯(lián)活化反應(yīng)也可激活TLR4。TLR2的配體較TLR4的廣泛，包括脂蛋白、脂多肽、脂壁酸(LTA)、阿拉伯甘聚糖(LAM)及酵母多糖等。TLR5可以識(shí)別鞭毛蛋白，鞭毛蛋白是目前發(fā)現(xiàn)的TLR5的惟一配體。具有鞭毛蛋白的L型細(xì)菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌和鼠傷寒沙門菌等可被TLR5識(shí)別。TLR7識(shí)別咪喹啉家族低分子量的咪唑莫特、R-848和R-847等。TLR9識(shí)別細(xì)菌的CpG-DNA(含有胞嘧啶-鳥嘌呤模體的未甲基化DNA片段)，激活B細(xì)胞和APC的免疫刺激特性。TLR3特異識(shí)別病毒復(fù)制的中間產(chǎn)物雙鏈RNA (double-stranded RNA, dsRNA)，從而激活NF- K B和干擾素IFN- β前體。Doyle S E等證實(shí)，抗TLR3單克隆抗體能抑制成纖維細(xì)胞IFN-β的產(chǎn)生。ChristopherA等證實(shí)TLR3還具有調(diào)控鼻病毒對(duì)人支氣管細(xì)胞感染的能力，這也說明了 TLR3在宿主抵抗活病毒中發(fā)揮重要的作用。TLR3表達(dá)于免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞如皮膚角質(zhì)化細(xì)胞、纖維母細(xì)胞和肺上皮細(xì)胞等，近年來發(fā)現(xiàn)人腫瘤組織中也有TLR3表達(dá)。TLR3配體dsRNA能直接激活自然殺傷細(xì)胞，增強(qiáng)抗原特異性⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答，促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的抗原呈遞激活。dsRNA也能通過激活多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，即誘生干擾素(IFN)、激活dsRNA激活蛋白激酶(PKR)、激活 2' ,5' A合成酶(2' ,5' oligoadenylate synthetase)、抑制蛋白質(zhì)合成、刺激前列腺素E的合成、促進(jìn)白細(xì)胞的分化、促進(jìn)巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞及特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的活性，誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞產(chǎn)生各種細(xì)胞因子，抑制化學(xué)致突變劑的作用，恢復(fù)細(xì)胞間的接觸抑制等。
從腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的的內(nèi)環(huán)境而言，均依賴于豐富的血管形成，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)可以引起腫瘤血管生成，并導(dǎo)致腫瘤組織的快速生長(zhǎng)。TLR3配體dsRNA能通過刺激體內(nèi)干擾素生成，發(fā)揮抗腫瘤血管生成的作用，是抑制腫瘤的生成與轉(zhuǎn)移的另一個(gè)重要因素。dsRNA作為體內(nèi)干擾素(IFN)誘生劑而言經(jīng)濟(jì)而實(shí)惠。從植物、微生物到不同種類的動(dòng)物，其細(xì)胞內(nèi)的dsRNA組份都具有干擾素誘生活性。目前干擾素已經(jīng)用于治療許多慢性病毒性疾病和腫瘤，但基本上都是使用基因工程干擾素或從人的細(xì)胞組織培養(yǎng)中經(jīng)誘生、純化而生產(chǎn)的干擾素制品。前者不僅價(jià)格昂貴，而且一般只含有單一亞型，抗病毒效果不盡完全；組織細(xì)胞培養(yǎng)干擾素價(jià)格亦較昂貴，而且經(jīng)常存在批間差別、外源性污染和純度等問題，這些外源性干擾素反復(fù)使用還經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)抗干擾素抗體，從而大大降低了干擾素再使用的效果。以天然dsRNA為干擾素誘生劑直接用于機(jī)體，在體內(nèi)誘生的自身干擾素是廣譜的，而且dsRNA是免疫調(diào)節(jié)劑(Immune Modulator),已經(jīng)證實(shí)dsRNA還可誘生其他一些細(xì)胞因子。因此，dsRNA作用于機(jī)體以后的生物學(xué)活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了單純的干擾素誘生活性，而且自身干擾素在體內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生抗體，因此可表現(xiàn)出更好的治療效果?！?br> TLR3激動(dòng)劑是不需要大分子(長(zhǎng)鏈)dsRNA的，小分子dsRNA完全可以有效的激活TLR3。人們?cè)缇屠萌斯ず铣傻膁sRNA聚合物-聚肌胞(Poly(I:C):由多聚肌苷酸和多聚胞苷酸組成的雙股多核苷酸鏈)作為免疫佐劑已應(yīng)用到某些腫瘤的輔助性免疫治療。由于Poly(I:C)的急性毒性較大，且非天然品，故不適合用于保健品類產(chǎn)品的開發(fā)。近年來也證實(shí)人工合成小分子dsRNA可以作為TLR3有效的激動(dòng)劑而抗血管新生等(WG Cho, PNAS2009)。由于dsRNA作為配體激活TLR3為廣譜的(何序列度可以作為配體而激活TLR3)，只要滿足功能性長(zhǎng)度19-25bp即可作激活TLR3受體(ME Kleinman，Nature 2008)，但原料造價(jià)昂貴，每克達(dá)數(shù)萬元，目前無法滿足大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化的要求。天然酵母菌是人類文明史中被應(yīng)用得最早的微生物。最常提到的酵母為釀酒酵母(也稱面包酵母)(Saccharomyces cerevisiae),自從幾千年前人類就用其發(fā)酵面包和酒類，在全球范圍都被認(rèn)定為食品。熱帶假絲酵母RNA累積能力很好，也被用于RNA的制備和提取。酵母菌屬于單細(xì)胞真核生物。大多數(shù)酵母菌在生存競(jìng)爭(zhēng)中都有相互嗜殺特性。具有這種特性的酵母為嗜殺酵母。其遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)為這種酵母細(xì)胞核外具有自我復(fù)制能力的dsRNA嗜殺質(zhì)粒。利用天然酵母菌中的dsRNA為原料，將其制備為小分子dsRNA作為TLR3配體(激動(dòng)劑)，激活人體各種組織細(xì)胞膜表面的TLR3發(fā)揮其局部及提高全身免疫力用于防癌、抗癌、抗病毒醫(yī)學(xué)健康保健品開發(fā)具有廣闊的使用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種酵母M-dsRNA作為TLR3激動(dòng)劑的應(yīng)用及其制備方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種酵母M-dsRNA作為TLR3激動(dòng)劑的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述酵母M-dsRNA的序列與SEQ ID NO 1同源。優(yōu)選地，所述酵母M-dsRNA的分子長(zhǎng)度為15_100bp。進(jìn)一步地，所述酵母M-dsRNA的分子長(zhǎng)度為19_25bp。優(yōu)選地，所述的酵母M-dsRNA可以激活細(xì)胞內(nèi)天然免疫系統(tǒng)TLR3的信號(hào)通路，引發(fā)下游相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步地,所述的下游相關(guān)基因?yàn)镮FNi、NF_k B> Caspase-3或Caspase-8。一種上述任意一項(xiàng)所述的酵母M-dsRNA作為TLR3激動(dòng)劑在制備防癌、抗癌及抗病毒醫(yī)學(xué)健康保健品中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種酵母M-dsRNA的制備方法，其特征在于，通過RNA酶消化法或柱層析法從酵母總RNA中分離制得小分子dsRNA群，即酵母M-dsRNA。優(yōu)選地，所述的RNA酶為RNase Tl、RNase A或兩者的混合物。優(yōu)選地，所述的酵母為嗜殺酵母，含有大分子dsRNA和中等分子dsRNA中的至少一種。
進(jìn)一步地，所述的嗜殺酵母為啤酒酵母或熱帶假絲酵母。優(yōu)選地，所述的柱層析法為CFll纖維素層析。優(yōu)選地，所述酵母M-dsRNA的分子長(zhǎng)度為15_100bp。進(jìn)一步地，所述酵母M-dsRNA的分子長(zhǎng)度為19_25bp。在嗜殺酵母細(xì)胞中，有兩種核外dsRNA所編碼的蛋白質(zhì)和嗜殺現(xiàn)象有關(guān)一種是分子量約為2. 5 X IO6道爾頓的大分子dsRNA (Large dsRNA,簡(jiǎn)稱L_dsRNA，長(zhǎng)度約為
4.5kb)，占90%以上；另一種是分子量約為I I. 4X IO6道爾頓的中等分子dsRNA (MediumdsRNA，簡(jiǎn)稱M-dsRNA，長(zhǎng)度約為I. 8kb)，占6%左右。兩者的總和約占嗜殺酵母細(xì)胞全部核酸的O. 1%。這兩種大、中分子的dsRNA可以作為Toll樣受體3 (TLR3)的激動(dòng)劑，而工業(yè)級(jí)生產(chǎn)的酵母總RNA中含有的dsRNA由于剪切力的原因，其分子長(zhǎng)度小于lOObp。最新的研究表明，長(zhǎng)度為19 25bp的小分子dsRNA即可以作為TLR3的配體，有效的激活TLR3而發(fā)揮其應(yīng)有的生理功能(ME Kleinman, Nature 2008)。利用酵母小分子dsRNA作為TLR3的激動(dòng)劑開發(fā)新一代的天然健康產(chǎn)品不但可以使酵母天然的大分子及中等分子dsRNA生物利用率提高 20倍，而且更加安全(理論上普遍認(rèn)為，分子量越大越易引起過敏反應(yīng))。本發(fā)明提供的酵母M-dsRNA可以作為TLR3的配體，激活人體各種組織細(xì)胞膜表面的TLR3，進(jìn)而產(chǎn)生內(nèi)源性干擾素(如IFN-Y)及細(xì)胞介素(如IL-12)細(xì)胞活性物質(zhì)，發(fā)揮局部及全身防癌、抗癌、抗病毒等作用。本發(fā)明提供的制備方法簡(jiǎn)便，易操作。


圖I為RNA酶消化法純化的釀酒酵母M-dsRNA和熱帶假絲酵母M-dsRNA的凝膠電泳圖；圖中M為RNA Marker ；1為熱帶假絲酵母總RNA ；2為經(jīng)RNase Tl分離的熱帶假絲酵母小dsRNA ；3為釀酒酵母總RNA ；4為經(jīng)RNase Tl分離的釀酒酵母小dsRNA。圖2為層析法分離的熱帶假絲酵母小dsRNA電泳檢測(cè)圖；圖中1為熱帶假絲酵母總RNA ；2為RNA Marker ；3為層析分離后的熱帶假絲酵母小 dsRNA。圖3為層析法分離的釀酒酵母小dsRNA電泳檢測(cè)圖；圖中I為釀酒酵母總RNA ；2為層析分離后的釀酒酵母小dsRNA ;3為RNA Marker。圖4為酵母小dsRNA分子轉(zhuǎn)化成cDNA后PCR產(chǎn)物I. 5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖；圖5 為 pRNAi_U6Hl/Neo 的載體圖譜；
圖6為酵母小dsRNA分子庫電轉(zhuǎn)化后克隆培養(yǎng)平板照片。圖7為菌檢PCR產(chǎn)物I. 5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖；圖8為SfiI酶切證實(shí)重組體和非重組體的I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖；圖9為酵母小dsRNA分子庫中24例重組質(zhì)粒(陽性克隆)電泳檢測(cè)圖；圖中M為 Ikb plus DNA Ladder。圖10為酵母小dsRNA分子庫的小dsRNA位點(diǎn)均勻分布示意圖；圖中1為酵母嗜殺質(zhì)粒(dsRNA)全長(zhǎng)序列(1801bp) ；2為酵母小dsRNA。
圖11 為 pNF- K B-TA-Luc 質(zhì)粒圖；圖12為酵母小dsRNA各組之間螢火蟲熒光素酶的RLU值海參熒光素酶的RLU的比值圖；圖13A為釀酒酵母小dsRNA處理主動(dòng)脈環(huán)血管向外生長(zhǎng)遷出抑制試驗(yàn)顯微鏡觀察圖；圖13B為熱帶假絲酵母小dsRNA處理主動(dòng)脈環(huán)血管向外生長(zhǎng)遷出抑制試驗(yàn)顯微鏡觀察圖；圖13C為酵母小分子dsRNAPool處理主動(dòng)脈環(huán)血管向外生長(zhǎng)遷出抑制試驗(yàn)顯微鏡觀察圖；圖13D為Avastin處理主動(dòng)脈環(huán)血管向外生長(zhǎng)遷出抑制試驗(yàn)顯微鏡觀察圖；圖13E為5%葡萄糖處理主動(dòng)脈環(huán)血管向外生長(zhǎng)遷出抑制試驗(yàn)顯微鏡觀察圖；圖14為各處理組動(dòng)脈環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞向外生長(zhǎng)遷出的節(jié)點(diǎn)數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果柱形圖；圖15為各處理組23周時(shí)測(cè)得的肝臟/體重比柱形圖(*P < O. 05，與PBS組相比)；圖16為實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定的各處理組TLR3、NF- κ B的mRNA相對(duì)表達(dá)水平柱形圖；圖17 為酵母小 dsRNAPool、poly (I:C)、PBS 分別處理 TLR3、NF-κ B、β -actin(內(nèi)參基因)的蛋白表達(dá)水平Western Blot分析結(jié)果對(duì)比圖；圖18為圖17中各處理組TLR3、NF-κ B相對(duì)于β -actin蛋白表達(dá)水平的柱形圖(*TLR3，P < 0. 05，與 PBS 組相比，#NF- κ B，P < 0. 05，與 PBS 組相比)；圖19Α為酵母小dsRNA Pool處理大鼠HCC模型23周時(shí)肝臟切片Laminin抗體免疫組化抗體標(biāo)記染色放大100倍的顯微照片；圖19B為poly (I:C)處理大鼠HCC模型23周時(shí)肝臟切片Laminin抗體免疫組化抗體標(biāo)記染色放大100倍的顯微照片；圖19C為PBS處理大鼠HCC模型23周時(shí)肝臟切片Laminin抗體免疫組化抗體標(biāo)記染色放大100倍的顯微照片；圖19D為酵母小dsRNAPool處理大鼠HCC模型23周時(shí)肝臟切片PCNA抗體免疫組化抗體標(biāo)記染色放大400倍的顯微照片；圖19E為poly (I: C)處理大鼠HCC模型23周時(shí)肝臟切片PCNA抗體免疫組化抗體標(biāo)記染色放大400倍的顯微照片； 圖19F為PBS處理大鼠HCC模型23周時(shí)肝臟切片PCNA抗體免疫組化抗體標(biāo)記染色放大400倍的顯微照片；圖20為用軟件Histolab 5. 8計(jì)算的圖20A中腫瘤結(jié)節(jié)的數(shù)量柱形圖(*P < O. 05，與PBS組相比；#P < O. 05，與酵母小dsRNAPool組相比)；圖21為19D-19F中PCNA陽性細(xì)胞數(shù)柱形圖(*P < O. 05，與PBS組相比;#P< O. 05，與酵母小dsRNAPool組相比)；圖22為實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定的各處理組Caspase-8、IFN- Y和VEGF的mRNA相對(duì)表達(dá)水平柱形圖(*p < O. 05，與PBS組相比；#P < O. 05，與酵母小dsRNA Pool組相比)。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明更明顯易懂，茲以優(yōu)選實(shí)施例，并配合附圖作詳細(xì)說明如下。為方便起見，在具體實(shí)施方式
中，術(shù)語“酵母小分子dsRNA”、“酵母小dsRNA”、“酵母小分子dsRNA群”或“酵母小dsRNA群”可以互換，它們表示的意思和范圍相同。實(shí)施例IRNA酶消化法分離酵母小分子dsRNAI.酵母總RNA :釀酒酵母總RNA(百奧邁科生物技術(shù)有限公司)、熱帶假絲酵母總RNA (南通秋之友生物科技有限公司)。2.主要試劑和材料RNase Tl (美國 Fermentas 公司)、RNAMarker (RL1000，TaKaRa公司)，無RNA酶污染的肝糖(上海瑞齊生物科技)，其它生化試劑均購于上海生工。3.主要儀器超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2F蘇州凈化設(shè)備廠)；低溫冰箱(_80°C，DF-U4086S,日本三洋)；電泳儀(Bio-rad，美國);凝膠成像系統(tǒng)(Biosens，美國);紫外分光光度計(jì)及分析工作站(島津Shimadazi,日本)等。4.用RNaseTl處理酵母總RNA分離出dsRNA。反應(yīng)系如下200 μ L的液中含有20 μ L (20 μ g) RNA ； 10 μ L (IOU) RNase Tl ；20μ L 10ΧΤΕ Buffer (IOmMTris-HCl, ImN EDTA,pH = 8.0)，150 μ L 無菌水。37°C 反應(yīng) 30min，加 20μ L EDTA (250mM)中止反應(yīng)，72 °C 加熱20min滅活酶。取5μ L電泳分析。并用取I μ L酵母dsRNA加入99 μ L的I X TE Buffer (100倍稀釋)，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD26tl及OD28tl比值(此值在I. 8 2. O之間為dsRNA)。5.電泳分析消化產(chǎn)物分離后的酵母小dsRNA經(jīng)15%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖I所示，分離的酵母小dsRNA長(zhǎng)度主要分布于IOObp以下，無DNA及其他單鏈RNA所見。圖中M為RNAMarker ；1為熱帶假絲酵母總RNA ；2為經(jīng)RNaseTl分離的熱帶假絲酵母小dsRNA ；3為釀酒酵母總RNA ；4為經(jīng)RNase Tl分離的釀酒酵母小dsRNA?！?.紫外分光光度計(jì)檢測(cè)測(cè)得經(jīng)分離熱帶假絲酵母和釀酒酵母小dsRNA的OD26tl與OD280比值分別為I. 91和I. 89，證實(shí)為dsRNA。實(shí)施例2柱層析法分離酵母小分子dsRNAI.主要試劑材料和儀器I. I酵母總RNA :釀酒酵母總RNA(百奧邁科生物技術(shù)有限公司)、熱帶假絲酵母總RNA (南通秋之友生物科技有限公司)。I. 2主要試劑CF11纖維素填料(美國Waterman公司)、STE Buffer (25mMTris-HCl,pH7. 5、50mM NaCl、0. 5M EDTA)、其它生化試劑(百奧邁科)、RNAMarker (RL1000，TaKaRa公司)，其它生化試劑均購于上海生工。I. 3主要儀器SHZ-III型循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)、凝膠電泳系統(tǒng)(北京六一)、離心機(jī)(Eppendorf公司)、凝膠成像系統(tǒng)(上海山富)。I. 4其它材料空層析柱(美國QIAGEN公司)、抽濾瓶(海門儀器)、5mL注射器(河南曙光健士醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司)等。2.實(shí)驗(yàn)方法CFll纖維素填料預(yù)先用STE Buffer洗滌一次，然后填充到空的層析柱里，將填充好的層析柱連接到5mL注射器和真空泵上。將酵母總RNA配置成溶液，將其加到層析柱里，用真空泵進(jìn)行洗脫，立即加入5mL洗滌Buffer (含16%乙醇的STE Buffer)以完全洗脫DNA和ssRNA。將層析柱移到I. 5mL·離心管中，10, 000 Xg離心30sec去除殘余的洗漆Buffer。將層析柱移到一新的I. 5mL離心管中，加入200 μ L不含乙醇的STE Buffer,以覆蓋CFll纖維素填料，10，OOOXg離心2min洗脫。每一步得到的樣品均重復(fù)上述步驟分離，以提高回收率。洗脫后的dsRNA加入2倍體積的乙醇后，置于_20°C進(jìn)行沉淀過夜。0，OOOXg離心15min,吹干dsRNA沉淀,然后用適量無核酸酶水重懸沉淀。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果分離后的酵母小dsRNA經(jīng)15%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2-3所示，分離的酵母小dsRNA長(zhǎng)度主要分布于IOObp以下，無DNA及其他單鏈RNA所見。圖2為熱帶假絲酵母小dsRNA電泳檢測(cè)圖，圖中1為熱帶假絲酵母總RNA ；2為RNA Marker (分子量大小與圖I相同);3為層析分離后的熱帶假絲酵母小dsRNA。圖3為釀酒酵母小dsRNA電泳檢測(cè)圖，圖中I為釀酒酵母總RNA ；2為層析分離后的釀酒酵母小dsRNA ；3為RNA Marker (分子量大小與圖I相同)。實(shí)施例3構(gòu)建酵母小dsRNA分子庫(方法見朱遠(yuǎn)源，專利號(hào)為ZL 200710024217. 6的專利)鑒定酵母小dsRNA的序列I.主要試劑材料和儀器I. I酵母小dsRNA :實(shí)施例2制得的釀酒酵母dsRNA。I. 2主要試劑T4DNA Ligase (NEB公司)、LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基等(百奧邁科)、QIAEX II Gel Extration Kit (美國 QIAGEN 公司)、TIANprep Mini PlasmidKit(TIANGEN 公司)、pRNAi-U6H 1/Neo (百奧邁科)、SuperScript II RT (SSII RT)(美國Invitrogen 公司)、lkb plus DNA Ladder (美國 Invitrogen 公司)、BSA(美國 NEB 公司)、Taq DNA聚合酶(百奧邁科)、瓊脂糖(上海生工)、dNTP (上海生工)、酚氯仿異戊醇(上海生工)、低分子量DNALadder (美國NEB公司)、T4DNA聚合酶(美國NEB公司)、BsaI酶(美國NEB公司)、SfiI酶(美國NEB公司)、感受態(tài)細(xì)胞(美國Invitrogen公司)，其它生化試劑(百奧邁科)等。1.301丨80及引物:Smart Oligo 5，AAGCAGTGGTATCAACCAGAGTTTTTGNG-3，(GNG :2’-0_ 甲基化修飾的RNA堿基，N為A、U、C、G中任一種);
5’ 引物5’ -AAGCAGTGGTATCAACCAGAG-3’ ；反轉(zhuǎn)錄引物5’ -AAGCAGTGGTATCAACCAGAG TTTTTNNNNNNNN-3’ (N :為 DNA 堿基 A、T、C、G 中任一種)；5， U6 :5， -AAGGTCGGGCAGGAAGAGGGC-3，；3’ Hl :5’ -TATTTGCATGTCGCTATGTGTTCT-3’。I. 3主要儀器PCR儀(ABI公司)、凝膠電泳系統(tǒng)(北京六一)、離心機(jī)(Eppendorf公司)、凝膠成像系統(tǒng)(上海山富)、電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad公司)等。2.實(shí)驗(yàn)步驟 2. I 將酵母 RNA 稀釋至 lmg/mL。2. 2反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈(用Smart技術(shù)(朱遠(yuǎn)源，專利號(hào)ZL01113524. 7)將酵母dsRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA):建立如下體系，混勻2 μ L(2 μ g)的RNA，I μ L的反轉(zhuǎn)錄引物(10 μ Μ), I μ L 的 Smart Oligo (10 μ Μ), I. 5 μ L 的 dNTPs (IOmM each),用無 RNase 水補(bǔ)足至15 μ L。70°C反應(yīng)5min，反應(yīng)結(jié)束后置冰上冷卻5min。將下列試劑加入到上述反應(yīng)體系中5μ L 的 5XM-MLV RT Reaction Buffer，I μ L 的 SSII RT，3 μ L 的無 RNase 水和 I μ L 的RNasin。42°C 反應(yīng) 60min。2. 3PCR擴(kuò)增4 μ L 的 cDNA, O. 5 μ L 的 dNTP, 2· 5 μ L 的 10 X Taq Buffer, I μ L 的 5，引物(10 μ Μ), O. 25yL的Taq DNA聚合酶，用ddH20補(bǔ)足至25 μ L，反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性lmin，95°C變性15sec，68°C退火延伸5min，循環(huán)30次。PCR產(chǎn)物進(jìn)行I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖4中箭頭所示。2. 4PCR產(chǎn)物純化在上述100 μ L的PCR產(chǎn)物中加入2倍體積的酚氯仿異戊醇(體積比為25 24 I)，渦旋振蕩混勻，置于離心機(jī)中，13，OOOrpm離心5min。將上清液轉(zhuǎn)移至另一干凈I. 5mL離心管中，加入2. 5倍體積的無水乙醇，1/10體積的3M的醋酸鈉溶液，混合均勻，置于_80°C超低溫冰箱約lh。取出置于離心機(jī)，13，OOOrpm離心20min。棄掉上清液，吹干殘余乙醇。加入約10 μ L的無RNA酶水充分溶解沉淀。2. 5BsaI酶切=BsaI酶消化上述純化后PCR產(chǎn)物，切成粘端DNA片段。取20μ L上述PCR純化后產(chǎn)物，加入2μ L BsaI酶，5 μ L的NEBuf fer_4，I μ L的100XBSA，用ddH20補(bǔ)到50yL，混勻后加100 μ L，37°C反應(yīng)2h。用15%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并用QIAEX II Gel Extration Kit回收目的片段。2. 6與RNA表達(dá)載體連接將BsaI酶切后的DNA片段連接到帶有U6和Hl雙啟動(dòng)子的RNA表達(dá)載體pRNAi-U6Hl/Neo，如圖 5 所示。反應(yīng)體系為Iμ L 載體，2μ L BsaI 酶切的 DNA，10 μ L I. 5ΧΡ Buffer (90mMTris(pH8. 5 9. 0) ；12mM DTT ；6mM MgCl2 ;40% PEG8000)，0. 5 μ L 的 ATP (IOmM)，0. 25 μ L的 T4DNA Ligase，用 ddH20 補(bǔ)足到 15 μ L，16°C反應(yīng) 30min。連接后用 ddH20 補(bǔ)至Ij 100 μ L，進(jìn)行連接產(chǎn)物純化加I. 5μ L glycogen(10mg/mL) ,2. 5倍體積的預(yù)冷無水乙醇，_80°C放置30min沉淀后,離心加5 μ L ddH20溶解DNA沉淀。2. 7電轉(zhuǎn)化融化-80°c保存的感受態(tài)細(xì)胞。將40 μ L的細(xì)胞和5 μ L純化后的連接產(chǎn)物在冰上混勻，放置lmin，然后加入到預(yù)冷的電擊杯中，將電擊杯置于電轉(zhuǎn)化儀中進(jìn)行電擊。加入
150μ L SOC培養(yǎng)基(2% (ff/V) Tryptone, O. 5% (ff/V) Yeast, O. 05% (W/V)NaCl,2. 5mM KCl,IOmM MgCl2, 20mM葡萄糖，pH7. O)，37°C搖床，220rpm振搖40 60min。將菌液均勻涂布到含 50yg/ml 卡那霉素(Kan+)的 LB 瓊脂平板(1% (W/V) Tryptone，O. 5 % (ff/V) Yeast, I %(ff/V)NaCl, I. 5% (ff/V) Agar, pH7. 0)上，37°C恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，次日觀察平板克隆數(shù)達(dá)到IO3/平板(12cm平板)，如圖6所示。2. 8菌液PCR檢測(cè)隨機(jī)挑取菌斑至400 μ L LB (I % (ff/V), TryptoneO. 5% (ff/V), Yeastl % (ff/V),NaCl，pH7. 0)48 深孔板中，37°C 搖床，220rpm 振搖 2h。PCR檢測(cè)取2 μ L培養(yǎng)菌液為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR體系為2yL菌液、O. 5yL3’Η1(10μΜ)、0·5μ 5’U6(10yM)、0.5yL dNTP (IOmM)、3 μ L lOXPCRBuffer.O. 3 μ L Taq DNA polymerase,用 ddH20 補(bǔ)足至 30 μ L。反應(yīng)體系為 95°C預(yù)變性 5min, 94°C變性 30sec,62°〇退火3086(3，721延伸40sec，72°C終末延伸7min，循環(huán)25次。PCR產(chǎn)物進(jìn)行I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如圖7所示，有條帶的為陽性；沒有PCR產(chǎn)物的為沒挑到菌斑或接菌培養(yǎng)失敗。計(jì)算得到平均陽性率為93%。SfiI酶切證實(shí)真陽性重組體(真陽性克隆)和非重組體(假陽性空載體克隆)的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度鑒定極為困難。為了進(jìn)-步鑒定真陽克隆，利用pRNAi-U6Hl/Ne0空載體多克隆位點(diǎn)含有SfiI酶切位點(diǎn)的特點(diǎn)，將菌液PCR產(chǎn)物進(jìn)行SfiI酶切，PCR產(chǎn)物不能被消化者為真陽性克隆。反應(yīng)體系為取4μ L菌液PCR產(chǎn)物，加入0.25 μ L SfiI酶，0.75 μ LNEBuffer-2,混勻后PCR儀，50°C，反應(yīng)I. 5h。酶切產(chǎn)物經(jīng)I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖8中箭頭所示，被SfiI消化即為假陽性，計(jì)算得到重組率為97. 6%。2. 9接菌擴(kuò)大培養(yǎng)，質(zhì)粒抽提取100 μ L的2h培養(yǎng)的菌液接種到4mL Kan+ LB液體培養(yǎng)基試管中，37 °C搖床，220rpm過夜搖菌。次日取800 μ L菌液保種為20%的甘油菌，_20°C保存；用TIANpr印MiniPlasmid Kit抽提質(zhì)粒，50 μ L ddH20洗脫DNA，-20°C保存。I μ L質(zhì)粒I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如圖9所不，其中M為Ikb plus DNALadder,質(zhì)粒大小約為5. 5kb。2. 10測(cè)序鑒定從抽提的質(zhì)粒中取出20 μ L，送測(cè)序(上海英駿生物技術(shù)有限公司)。所得序列用alignment program軟件和酵母嗜殺質(zhì)粒(dsRNA)全長(zhǎng)序列進(jìn)行比對(duì)。3.結(jié)果分析I)美國NCBI數(shù)據(jù)庫中的酵母的嗜殺質(zhì)粒(Saccharomyces cerevisiae killervirus Ml)M_dsRNA 序列如下lgaaaaauaaa gaaaugacga agccaaccca aguauuaguu agauccguca guauauuauu6luuucaucaca uuacuacacc uagucguagc gcugaacgau guggccgguc cugcagaaac121agcaccagug ucauuacuac cucgugaagc gccgugguau gacaagaucu gggaaguaaa18lagauuggcua uuacagcgug ccacagaugg caauuggggc aagucgauca ccugggguuc241auucguagcg agcgaugcag guguaguaau cuuugguauc aaugugugua agaacugcgu30lgggugagcgu aaggaugaua ucaguacgga cugcggcaag caaacacuug cuuuacuagu36lcagcauuuuu guagcaguua cauccggcca ucaucuuaua ugggguggua auaggccggu
421gucgcaguca gauccuaaug gcgcuaccgu ugcucgucgu gacauuucua cugucgcaga48Icggggauauu ccacuggacu uuagugcguu gaacgacaua uuaaaugaac augguauuag541uauacuccca gcuaacgcau cacaauaugu caaaagauca gacacagccg aacacacgac60laaguuuugua gugaccaaca acuacacuuc uuugcauacc gaccugauuc aucaugguaa66luggaacauau accacguuua ccacaccuca cauuccagca guggccaagc guuauguuua72luccuaugugc gagcauggua ucaaggccuc auacuguaug gcccuuaaug augccauggu781gucggcuaau gguaaccugu auggacuagc agaaaagcug uuuagugagg augagggaca841augggagacg aauuacuaua aauuguauug gaguacuggc caguggauaa ugucgaug aa90lguuuauugag gaaaguauug auaacgccaa uaaugacuuu gaaggcugug acacaggcca961cuagggcauc gugucugacc ucugaugcga uaacucgacc cuacagagca ccgggcuaua102luauaauauag uaggcacaaa auaaaauaaa aauuaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa114laaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaagaaaag agagagaaga agaagaagaa aaagaaaaaaI20lcaaaagaaac agaaaaagag agaacaggac aacaaacgca acaaaacaca aacacaagca1261cacucaccuu gagucuaacu gguggcacgc agcauaucuc acccugagac uaacuggcgg1321caggcgaccg ugagcauaca gcaugcccca cucgauucga gacgcgauuc gcgcucguag1381guaucgagcg gcuacguuga gcuauuaugg cagugacaug cgauucgcgc acugccaaga1441ucagcucagc aaaguuaaga ccaguaucgg auaugguaga cuacuacaau ucgcacaggu1501augagauucu cagucuagug uauggaugag uaguugagcc aaugaaucua ggguuuaaau1561uacuaugcau ugacauauag cagguacaag cguagauaau acuuacuagg ccccagccgg162luacacccugu auugaauaaa uacgacuauu uggccagguc uggacggggc agucgaauua1681cuagguugag cacacacacg ugaaucacac aacauaacag uguaggaaca uaaugugcca1741uucguagucu gagacgccgc uagccugguu uaaugcaaca gcauagaaga aacacacauc1801a (SEQ ID NO :1)2)從酵母小dsRNA分子庫中，隨機(jī)抽樣30例進(jìn)行測(cè)序，所得結(jié)果統(tǒng)計(jì)見表I :表I
權(quán)利要求
1.一種酵母M-dsRNA作為TLR3激動(dòng)劑的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種酵母M-dsRNA作為TLR3激動(dòng)劑的應(yīng)用，其特征在于，所述酵母M-dsRNA的序列與SEQ ID NO 1同源。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種酵母M-dsRNA作為TLR3激動(dòng)劑的應(yīng)用，其特征在于，所述酵母M-dsRNA的分子長(zhǎng)度為15-100bp。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種酵母M-dsRNA作為TLR3激動(dòng)劑的應(yīng)用，其特征在于，所述酵母M-dsRNA的分子長(zhǎng)度為19-25bp。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種酵母M-dsRNA作為TLR3激動(dòng)劑的應(yīng)用，其特征在于，所述的酵母M-dsRNA可以激活細(xì)胞內(nèi)天然免疫系統(tǒng)TLR3的信號(hào)通路，引發(fā)下游相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種酵母M-dsRNA作為TLR3激動(dòng)劑的應(yīng)用，其特征在于，所述的下游相關(guān)基因?yàn)?IFN- Y、NF- K B> Caspase-3 或 Caspase-8。
7.—種權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述酵母M-dsRNA作為TLR3激動(dòng)劑在制備防癌、抗癌及抗病毒醫(yī)學(xué)健康保健品中的應(yīng)用。
8.一種酵母M-dsRNA的制備方法，其特征在于，通過RNA酶消化法或柱層析法從酵母總RNA中分離制得小分子dsRNA群，即酵母M-dsRNA。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種酵母M-dsRNA的制備方法，其特征在于，所述的RNA酶為RNase Tl、RNaseA或兩者的混合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種酵母M-dsRNA的制備方法，其特征在于，所述的酵母為嗜殺酵母，含有大分子dsRNA和中等分子dsRNA中的至少一種。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的一種酵母M-dsRNA的制備方法，其特征在于，所述的嗜殺酵母為啤酒酵母或熱帶假絲酵母。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種酵母M-dsRNA的制備方法，其特征在于，所述的柱層析法為CFll纖維素層析。
13.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種酵母M-dsRNA的制備方法，其特征在于，所述酵母M-dsRNA的分子長(zhǎng)度為15-100bp。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的一種酵母M-dsRNA的制備方法，其特征在于，所述酵母M-dsRNA的分子長(zhǎng)度為19-25bp。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酵母M-dsRNA作為TLR3激動(dòng)劑的應(yīng)用及其制備方法。制備方法為通過RNA酶消化法或柱層析法從酵母總RNA中分離制得小分子dsRNA群，即酵母M-dsRNA。酵母M-dsRNA可以刺激細(xì)胞的天然免疫，激活TLR3的信號(hào)通路，從而抑制腫瘤。本發(fā)明可用于制備防癌、抗癌及抗病毒醫(yī)學(xué)健康保健品。本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)便，易操作。
文檔編號(hào)A61K31/7105GK102935238SQ201210264480
公開日2013年2月20日 申請(qǐng)日期2012年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月27日
發(fā)明者朱遠(yuǎn)源, 陳莉, 李鐵軍 申請(qǐng)人:水愛生物科技(南通)有限公司