專(zhuān)利名稱(chēng)：質(zhì)粒dna快速提取試劑盒及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)研究領(lǐng)域，是一種簡(jiǎn)易快速提取質(zhì)粒DNA的試劑盒及其應(yīng)用方法。
質(zhì)粒DNA的提取和純化是分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中應(yīng)用最為廣泛和最基本的技術(shù)。因此，國(guó)內(nèi)外主要生物試劑公司都研制了與此技術(shù)有關(guān)的試劑盒，如Qiagen、Promega、華美、華順、晶美等生物工程公司。國(guó)外的試劑盒都是以純化柱為主體，因而成本高，價(jià)格昂貴。國(guó)內(nèi)的試劑盒主要是在傳統(tǒng)的堿裂解、酚-氯仿抽提的基礎(chǔ)上所作的改良，其獲取的質(zhì)粒DNA得量低，質(zhì)量不高，不能滿足分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中連接、序列測(cè)定和轉(zhuǎn)染的要求，提取過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)，且因酚和氯仿均為有毒物質(zhì)，有異味，既污染環(huán)境，又危害實(shí)驗(yàn)操作人員健康。
本發(fā)明的目的是提供一種快速、簡(jiǎn)易、高效、高質(zhì)、價(jià)廉、無(wú)害的提取質(zhì)粒DNA的試劑盒及其應(yīng)用方法。
在質(zhì)粒DNA提取技術(shù)中，要獲取質(zhì)量好、純度高的質(zhì)粒DNA，關(guān)鍵技術(shù)在于菌體裂解、蛋白質(zhì)和RNA的消除。本發(fā)明的核心部分是所用試劑采用不同pH和不同濃度的鹽，用分步沉淀法取代酚-氯仿抽提法去除蛋白質(zhì)和RNA，所提取的質(zhì)粒DNA純度能滿足分子生物學(xué)有關(guān)實(shí)驗(yàn)的要求，包括克隆鑒定、酶切、連接、序列測(cè)定和轉(zhuǎn)染等。本發(fā)明包括6種試劑，即菌體重懸緩沖液(R1)；菌體裂解緩沖液(R2)；質(zhì)粒沉淀緩沖液(R3)；異丙醇(R4)；蛋白沉淀緩沖液(R5)；DNA稀釋液(R6)。它們的組成及配比分別為試劑R1組分50mmol葡萄糖25mmol Tris-Hcl(pH8.0)10mmol EDTA(pH8.0)5mg/ml溶菌酶配比配制100ml R1取葡萄糖(COH12O6.H2O) 0.991克雙蒸水 80ml0.5mol EDTA(pH8.0) 2ml
1mol Tris-Hcl(pH8.0)2.5ml用雙蒸水定容至100ml,10Ibf/in2(6.895×104pa)高壓滅菌15分鐘，再加入500mg溶菌酶。按25次使用量分裝5.6ml于不透光塑料瓶，4℃保存。
試劑R2組分0.2mol NaOH1％SDS配比配制100ml R2取10mol NaOH2ml雙蒸水80ml10％SDS 10ml用雙蒸水定容至100ml，按25次使用量分裝11.2ml于不透光塑料瓶，室溫保存。
試劑R3組分5.0～6.0mol醋酸銨(或醋酸鈉)，最佳醋酸銨(或醋酸鈉)濃度為5.5mol。
配比配制100ml R3取醋酸銨42.4g雙蒸水 80ml攪拌溶解后，調(diào)至pH7.4～7.6，其優(yōu)選pH值7.5，用雙蒸水定容到100ml，按25次使用量分裝8.4ml于不透光塑料瓶，室溫保存。
試劑R4異丙醇(分析純)為商品化試劑。
試劑R5組分1.2～1.6mol醋酸銨(或醋酸鈉)，最佳醋酸銨(或醋酸鈉)濃度為1.4mol。
配比配制100ml R5取醋酸銨10.8g雙蒸水 80ml攪拌溶解后，調(diào)至pH7.2～7.3，其優(yōu)選pH值為7.25。用雙蒸水定容至100ml，按25次使用量分裝2.8ml于不透光塑料瓶，室溫保存。
試劑R6組分TE緩沖液(pH7.6)100mlRNase A 10mgRNase T10000萬(wàn)單位配比配制100ml TE緩沖液取Tris鹽(分析純)1.58gEDTA(分析純)0.372g雙蒸水 80ml攪拌溶解后，調(diào)至pH7.6，用雙蒸水定容至100ml，加入RNase A 10mg和RNase T 10000萬(wàn)單位，按25次使用量分裝0.56ml于不透光塑料瓶，4℃保存。
本發(fā)明主要的優(yōu)點(diǎn)為操作簡(jiǎn)便，結(jié)果穩(wěn)定；耗時(shí)短，80分鐘左右可完成全部過(guò)程；得量高，對(duì)一高拷貝質(zhì)粒，常規(guī)培養(yǎng)16小時(shí)，當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)密度OD600約為3.5時(shí)，1.5ml菌液可獲得10μg～15μg DNA；純度好，無(wú)蛋白質(zhì)和RNA污染，提取的質(zhì)粒DNA可供內(nèi)切酶酶切、連接、序列測(cè)定、真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)用；價(jià)廉，與國(guó)內(nèi)外同類(lèi)產(chǎn)品比較，價(jià)格降低20％～40％；由于不需用酚和氯仿，既消除了環(huán)境污染之慮，又對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員身體無(wú)害。
應(yīng)用本試劑盒提取質(zhì)粒DNA可按下列方法操作1．按常規(guī)搖菌擴(kuò)增質(zhì)粒(詳見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》)；2．取常規(guī)培養(yǎng)16小時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)密度OD600約為3.5的菌液1.5ml于1.5ml離心管，室溫以12000rpm離心30秒鐘，棄上清；3．沉淀中加200μl R1，充分振蕩混勻；4．加入400μl R2，輕輕顛倒5次后置冰浴2分鐘；5．加入預(yù)冷的300μl R3，輕輕顛倒5次后置冰浴2分鐘；6．室溫以12000rpm離心5分鐘；7．收集上清，加入600μl R4混勻后置室溫2分鐘；8．室溫以12000rpm離心10分鐘；9．棄上清，立即加入100μl R5重懸沉淀后置冰浴2分鐘；10．室溫以12000rpm離心5分鐘；11．收集上清，加入100μl R4混勻；12．室溫以12000rpm離心5分鐘，棄上清，沉淀用75％乙醇洗，干燥后溶于20μl R6,37℃水浴15分鐘；13．加入10μl R3和30μl R4混勻，室溫2分鐘；14．室溫以12000rpm離心10分鐘，棄上清；15．沉淀用75％乙醇洗，干燥后溶于15μl TE緩沖液，-20℃保存?zhèn)溆茫?br> 所得質(zhì)粒DNA可用0.8％瓊脂糖凝膠電泳加以驗(yàn)證。


圖1顯示對(duì)含同一質(zhì)粒DNA的菌體應(yīng)用本試劑盒和應(yīng)用Qiagen柱式純化試劑盒提取的質(zhì)粒DNA電泳對(duì)照?qǐng)D譜。圖中，M為λDNA/HindⅢ分子量標(biāo)志物，1A、2A、3A為使用本試劑盒所提取的質(zhì)粒DNA,1B、2B、3B為使用Qiagen柱式純化盒所提取的相應(yīng)質(zhì)粒DNA。從圖中看出用兩種試劑盒所得的質(zhì)粒DNA，電泳條帶清晰，無(wú)RNA混雜。說(shuō)明使用本發(fā)明提取的質(zhì)粒DNA與使用Qiagen柱式純化試劑盒提取的同一質(zhì)粒DNA比較，在純度和得量方面無(wú)明顯區(qū)別。
權(quán)利要求
1．一種提取質(zhì)粒DNA的試劑盒，其特征在于包括菌體重懸緩沖液(R1)、菌體裂解緩沖液(R2)、質(zhì)粒沉淀緩沖液(R3)、異丙醇(R4)、蛋白沉淀緩沖液(R5)和DNA稀釋液(R6)六種試劑，R1的組分為50mmol葡萄糖，25mmol Tris-Hcl(pH8.0),10mmol EDTA(pH8.0),5mg/ml溶菌酶；R2的組分為0.2mol NaOH,1％SDS；R3的組分為5.0～6.0mol醋酸銨(或醋酸鈉)，pH7.4～7.6；R4為分析純的異丙醇；R5的組分為1.2～1.6mol醋酸銨(或醋酸鈉)，pH7.2～7.3；R6的組分為T(mén)E緩沖液中加入終濃度為0.1mg/ml RNase A和100單位/mlRNase T。
2．按權(quán)利要求1所述的提取質(zhì)粒DNA的試劑盒，其特征在于所述的試劑R3的最佳濃度為5.5mol醋酸銨(或醋酸鈉)。
3．按權(quán)利要求1所述的提取質(zhì)粒DNA的試劑盒，其特征在于試劑R3的最佳pH值為7.5。
4．按權(quán)利要求1所述的提取質(zhì)粒DNA的試劑盒，其特征在于試劑R5的最佳濃度為1.4mol醋酸銨(或醋酸鈉)。
5．按權(quán)利要求1所述的提取質(zhì)粒DNA的試劑盒，其特征在于試劑R5最佳pH值為7.25。
6．權(quán)利要求1所述的提取質(zhì)粒DNA試劑盒的應(yīng)用方法，其特征在于按如下步驟操作(1)按常規(guī)搖菌擴(kuò)增質(zhì)粒(詳見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》)；(2)取經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)16小時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)密度OD600約3.5的菌液1.5ml于1.5ml離心管，室溫以12000rpm離心30秒鐘，棄上清；(3)沉淀中加200μl R1，充分振蕩混勻；(4)加入400μl R2，輕輕顛倒5次后置冰浴2分鐘；(5)加入預(yù)冷的300μl R3，輕輕顛倒5次后置冰浴2分鐘；(6)室溫以12000rpm離心5分鐘；(7)收集上清，加入600μl R4混勻后置室溫2分鐘；(8)室溫以12000rpm離心10分鐘；(9)棄上清，立即加入100μl R5重懸沉淀后置冰浴2分鐘；(10)室溫以12000rpm離心5分鐘；(11)收集上清，加入100μl R4混勻；(12)室溫以12000rpm離心5分鐘，棄上清，沉淀用75％乙醇洗，干燥后溶于20μl R6,37℃水浴15分鐘；(13)加入10μl R3和30μl R4混勻，室溫2分鐘；(14)室溫以12000rpm離心10分鐘，棄上清；(15)沉淀用75％乙醇洗，干燥后溶于15μl TE緩沖液，-20℃保存?zhèn)溆茫?br> 全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)研究領(lǐng)域,為一種簡(jiǎn)易快速提取質(zhì)粒DNA的試劑盒及其應(yīng)用方法。本試劑盒包括菌體重懸緩沖液、菌體裂解緩沖液、質(zhì)粒沉淀緩沖液、異丙醇、蛋白沉淀緩沖液和DNA稀釋液六種試劑。本發(fā)明與國(guó)內(nèi)外相關(guān)的試劑盒相比,具有快速、簡(jiǎn)易、高效、高質(zhì)、價(jià)廉和無(wú)害的優(yōu)點(diǎn),提取的質(zhì)粒DNA(1A、2A、3A)與應(yīng)用Qiagen柱式純化試劑盒提取的相應(yīng)質(zhì)粒DNA(1B、2B、3B)的電泳圖譜比較,電泳條帶同樣清晰,無(wú)RNA混雜。
文檔編號(hào)C12N15/10GK1226600SQ99113448
公開(kāi)日1999年8月25日 申請(qǐng)日期1999年1月29日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月29日
發(fā)明者朱明華 申請(qǐng)人:朱明華