一種短肽及其制備方法和在診斷或治療與apoA-I相關(guān)疾病中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種短肽及其制備方法及其在診斷或治療與apoA-I相關(guān)疾病中的應(yīng)用，該短肽的序列為Ac-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-NH2，所用的氨基酸均為L-氨基酸。本發(fā)明的L-4F具有類似apoA-I功能，在加速性動脈硬化的鼠類狼瘡模型中，顯著降低IgG抗雙鏈DNA和抗氧化型PL的水平，改善了蛋白尿、腎小球腎炎、和骨質(zhì)減少的程度，增加了平滑肌細(xì)胞的數(shù)量、減少了巨噬細(xì)胞的浸潤，同時降低了致動脈粥樣硬化的炎癥趨化類因子的水平，意味著L-4F的治療不僅在狼瘡樣疾病中是一種保護機制，同時對潛在的斑塊重塑和固定有一定的作用，具有廣闊的應(yīng)用前景和較高的應(yīng)用價值。本發(fā)明的L-4F能夠用于診斷以及治療與apoA-I相關(guān)疾病，醫(yī)用價值高，且其采用操作簡單的固相合成法獲得，因此具有廣闊的市場前景。
【專利說明】—種短肽及其制備方法和在診斷或治療與apoA-1相關(guān)疾病中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及具有藥理作用的多肽，具體涉及一種多肽及其制備方法及其在診斷或治療與apoA-1相關(guān)疾病中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] apoA-1是HDL的一種主要載脂蛋白成分，能驅(qū)動膽固醇的逆轉(zhuǎn)運，可接受外周細(xì)胞過剩膽固醇并將其轉(zhuǎn)運回肝臟HDL顆粒，同時也具有抗炎、抗氧化及抗冠狀動脈粥樣硬化作用。目前，根據(jù)apoA-1的生物結(jié)構(gòu)和特性而設(shè)計合成的apoA-1模擬肽有18A小肽(如Ac-DWLKAFYDKVAEKLKEAF-NH2)，其均不存在apoA-1的同源性序列，但能形成類似apoA_I的A級雙親螺旋結(jié)構(gòu)，從而具有連接脂質(zhì)的生物特性。通過調(diào)整18個氨基酸中苯丙氨酸殘基(F)數(shù)量及其位置，可設(shè)計合成多個不同的apoA-1模擬肽。根據(jù)這些苯丙氨酸的數(shù)量，這些小肽分別被命名為2F、3F、4F等。相關(guān)的物理生物特性研究顯示，18A小肽的疏水能力隨苯丙氨酸殘基數(shù)量的增加而上升，這也從理論方面反映了小肽的脂親和能力。迄今為止，大部分apoA-1模擬肽均具有良好的脂連接能力，但生物特性卻不相同。根據(jù)apoA-1的生物特性，具有雙親性的apoA-1模擬肽已經(jīng)被設(shè)計并開展相關(guān)的實驗研究項目。D-4F是一種apoA-1模擬肽，由18個D-氨基酸組成，具有通過哺乳動物胃腸道抑制酶降解的優(yōu)點。在ApoE基因缺陷小鼠的飲用水中加入D-4F能夠顯著抑制動脈粥樣硬化的發(fā)展。給這些小鼠口服D-4F能通過提高apoA-1和對氧磷酶(PON)活性，從而增加抗炎性HDL的顆粒組分，最終達(dá)到改善HDL介導(dǎo)膽固醇膽固醇流出并促進巨噬細(xì)胞膽固醇逆向轉(zhuǎn)運。這些實驗研究結(jié)果提示，apoA-1模擬肽具有潛在治療紅斑狼瘡、及其伴有的CHD病變的臨床價值和意義。
[0003]系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)并發(fā)動脈粥樣硬化(AS)是SLE主要致死原因之一。早在1976年，人們已經(jīng)注意到了 SLE死亡率曲線呈"雙峰"模式，一個是在活動性狼瘡早期階段敗血癥的高發(fā)生率，另一個是非活動性狼瘡?fù)砥陔A段心肌梗死的高發(fā)生率。盡管各種疾病控制措施大大提高了系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的生存率，然而AS仍然是導(dǎo)致SLE患者死亡的主要原因。紅斑狼瘡的病例對照(年齡，種族，和性別相匹配)研究表明:在年齡小于50歲的紅斑狼瘡的患者中，31-37%患者表現(xiàn)出AS病變的代表性標(biāo)志物，而對照組中僅有9-15%的人群表現(xiàn)出這種代表標(biāo)志物；在年齡大于或等于50歲的患者中，70-80%的狼瘡患者表現(xiàn)出動脈粥樣硬化病變的代表性標(biāo)志物，而對照人群中只有21-45%的人具有這種代表性標(biāo)志物。Framingham研究結(jié)果顯示:包括高血壓、肥胖、糖尿病、吸煙、高膽固醇血癥、絕經(jīng)后狀態(tài)等在內(nèi)傳統(tǒng)危險因素均不能完全解釋紅斑狼瘡患者中冠心病加重的原因，而系統(tǒng)性紅斑狼瘡本身(非長期使用糖皮質(zhì)激素的情況下)依然是一個獨立危險因素。盡管疾病病程與系統(tǒng)性紅斑狼瘡損傷指數(shù)都是促進動脈粥樣硬化(頸動脈斑塊)的獨立預(yù)測因素，但狼瘡如何增加動脈粥樣硬化的發(fā)生風(fēng)險尚未完全明了。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種類似apoA-1，具有脂類連接能力，能有效地通過減緩動脈硬化、腎小球腎炎、蛋白尿、自身免疫性抗體異常以及嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)過程從而阻止加速性動脈粥樣硬化的鼠類狼瘡模型狼瘡樣病變的多肽。
[0005]本發(fā)明的另一個目的是提供一種上述多肽的制備方法。
[0006]本發(fā)明進一步目的在于提供上述多肽在診斷與治療與apoA-1相關(guān)疾病中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實現(xiàn)的:
[0008]本發(fā)明經(jīng)過大量的研究發(fā)現(xiàn)，18氨基酸組成的apoA-1模擬小肽具有良好的生理效果，同時，在該類模擬肽中，苯丙氨酸的含量對其效果的發(fā)揮具有重要的作用。我們前期研究表明，D-4F具有治療紅斑狼瘡、及其伴有的CHD病變的臨床價值和意義。然而，模擬肽中的D型氨基酸是否是必須的仍是未知。因此，我們采用同種類L型氨基酸來替代D-4F中的氨基酸，以期證明L氨基酸的非必要性，同時又能夠具有相類似甚至更好的生理療效。
[0009]在多肽合成中，每生成一個肽鍵，都需要經(jīng)過官能團保護、縮合、去保護等操作步驟，加上每一步產(chǎn)物的分離純化，操作相當(dāng)復(fù)雜而且費時，因此現(xiàn)在多采用固相合成法進行多肽的合成。固相合成法有兩種，即Fmoc法和tBoc法，由于Fmoc法幣tBoc法存在更多優(yōu)勢，所以本發(fā)明采用Fmoc法固相合成法L-4F。合成中采用的縮合劑為HBTU ；HBTU:苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸鹽，其配方以及用量均為本領(lǐng)域人員共知的，此處的Fmoc法是本領(lǐng)域的通用方法，其操作方法可參考相關(guān)教科書。
[0010]細(xì)胞與動物實驗結(jié)果表明:本發(fā)明的L-4F具有與D-4F相同的生理功能，即類似apoA-1功能。在加速性動脈硬化的鼠類狼瘡模型中，無論是否合用普伐他汀，L-4F治療后將顯著降低IgG抗雙鏈DNA和抗氧化型PL的水平，改善了蛋白尿、腎小球腎炎、和骨質(zhì)減少的程度。增加了平滑肌細(xì)胞的數(shù)量、減少了巨噬細(xì)胞的浸潤，同時降低了致動脈粥樣硬化的炎癥趨化類因子的水平，意味著L-4F的治療不僅在狼瘡樣疾病中是一種保護機制，同時對潛在的斑塊重塑和固定有一定的作用。
[0011]因此,本發(fā)明的L-4F可用于診斷與治療與apoA-1相關(guān)疾病。由于apoA_I在生物進化過程中非常保守，具有廣泛而重要的生物功能，所以本發(fā)明的L-4F可能治療的疾病覆蓋動脈硬化、冠狀動脈病、腎小球腎炎、蛋白尿、自身免疫性抗體異常以及嚴(yán)重的炎癥相關(guān)疾病、高脂血癥、糖尿病、肥胖癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、高血壓、血栓、卵巢癌、缺血性心臟病、肝炎、艾滋病。
[0012]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
[0013]1.本發(fā)明的L-4F具有apoA-1的A級雙親螺旋結(jié)構(gòu)，即MMF及MMPF結(jié)構(gòu)，能夠在體內(nèi)發(fā)揮類似apoA-1的功能，具有廣闊的應(yīng)用前景和較高的應(yīng)用價值。
[0014]2.本發(fā)明的L-4F完全由L型氨基酸組成，具有不易被哺乳動物胃腸道中的酶降解的特性，保證其在體內(nèi)穩(wěn)定發(fā)揮其類apoA-1的功能。
[0015]3.本發(fā)明的L-4F采用固相合成發(fā)，最初反應(yīng)物和產(chǎn)物都是連接在載體上，因此可在一個反應(yīng)容器中進行所以的反應(yīng)，便于自動化操作，加入過量的反應(yīng)物可以獲得高產(chǎn)率的產(chǎn)物，同時產(chǎn)物很容易分離。
[0016]4.本發(fā)明的L-4F在加速性動脈硬化的鼠類狼瘡模型中，能顯著降低IgG抗雙鏈DNA和抗氧化型PL的水平，改善了蛋白尿、腎小球腎炎、和骨質(zhì)減少的程度。增加了平滑肌細(xì)胞的數(shù)量、減少了巨噬細(xì)胞的浸潤，同時降低了致動脈粥樣硬化的炎癥趨化類因子的水平，意味著L-4F的治療不僅在狼瘡樣疾病中是一種保護機制，同時對潛在的斑塊重塑和固定有一定的作用。
[0017]5.本發(fā)明的L-4F能夠用于診斷及治療與apoA-1相關(guān)的疾病，鑒于apoA-1在生物進化過程中非常保守，而且具有廣泛而重要的生物功能，因此L-4F的醫(yī)用價值高，而且該短肽通過操作簡單的固相合成法即可獲得，因此具有廣闊的市場前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1L-4F治療或聯(lián)合普伐他汀治療減少小鼠自身免疫癥狀
[0019]圖2L-4F治療或聯(lián)合普伐他汀治療改善apoE+Fas+雌性小鼠腎臟病變
[0020]圖3L-4F治療或聯(lián)合普伐他汀治療增加小鼠骨密度，減少骨質(zhì)疏松
[0021]圖4L-4F治療后血清脂質(zhì)成分的改變與促炎反應(yīng)的脂蛋白活性的降低
【具體實施方式】
[0022]實施例1 L-4F的制備
[0023]本實施例的L-4F采用固相合成法制備，其具體步驟如下:
[0024]本短妝米用PS3小型全自 動多妝合成儀(PS3Protein Technologies,Woburn,MA)進行合成。L-型FMOC氨基酸被耦合到酰胺樹脂上，利用HBTU和NMM(N-甲基嗎啉)進行縮合，并與醋酸酐在N-末端進行乙?；?。加入含1% anisole (二氯甲烷苯甲醚)，0.1%mercaptoeathanol和色氨酸(肽樹脂重量的20% ),將短肽從柱子上洗脫下來,然后利用反向高效液相色譜進行純化。色譜柱為VYDAC C-4柱(22mmX 25cm，10 μ m),洗脫液為含0.1 %TFA (三氟乙酸)的乙腈，洗脫梯度為O~66min，25 %~85 %，流速4.8ml/min。肽的純度用反向高效液相色譜分析，色譜柱為VYDAC C-18柱(4.6mmX25cm, 5 μ m),洗脫液為含0.1 %TFA(三氟乙酸)的乙腈，洗脫梯度為O~33min，25%~85%，流速4.8ml/min。
[0025]實施例2 L-4F對自身免疫性疾病狼瘡樣表型的抑制作用
[0026]26-27周給藥:1)普伐他汀，2)L-4F，3)L_4F+普伐他汀，4)空白對照。與空白對照組小鼠相比，L4F或者L-4F+普伐他汀組給藥組顯示改善了狼瘡樣自身免疫的表象，淋巴結(jié)顯著減小(0.17±0.17g: 0.40±0.22g 和 0.16±0.IOg: 0.40±0.22g ;ρ = 0.0012、
0.0007)。然而，治療組和空白對照組相比，脾臟大小和脾細(xì)胞數(shù)量沒有顯著的變化，其中B細(xì)胞、⑶4+、⑶8+T細(xì)胞、NK、⑶11c，、⑶Ilb細(xì)胞由多色流動分析所測定(數(shù)據(jù)未列出)。
[0027]試驗中四組的總IgG水平相差不大，一般認(rèn)為對免疫沒有抑制作用(圖1C)。L-4F給藥組中血清IgG抗雙鏈DNA抗體(圖1C)和IgG抗心磷脂(數(shù)據(jù)未列出)的水平明顯地降低了。同樣地，與空白對照組相比，小鼠不論是否聯(lián)合使用普伐他汀，在給予L-4F后血清IgG對抗oxPLs-PGPC和POVPC的自身抗體水平也顯著下降(圖1C)。
[0028]腎臟疾病通常隨著尿蛋白水平的增加而加重，在給藥后的20周時間里，L-4F組與對照組相比蛋白尿水平更低(圖2C)。組織學(xué)的研究顯示，對照組中腎小球細(xì)胞浸潤類似于SLE患者的彌漫增生性腎小球腎炎(DPGN)。與對照組相比，L-4F和L-4F+普伐他汀治療組都降低了腎小球叢的大小(6，846 ±1，062 μ m2: 6，227± 1，007 μ m2 ;6，846 ± 1,062 μ m2: 7，645± 1，201 μ m2 ;p = 0.02 ;0.004)，同時，聯(lián)合治療組被證實具有更好地保護腎小球叢擴大的作用(圖2A，B)。最后，免疫熒光染色也證實，與對照組相比L-4F治療小鼠中腎臟切片IgG和C3的沉淀總量減少(數(shù)據(jù)未列)。
[0029] 實施例3 L-4F治療對循環(huán)中血清炎癥趨化因子和細(xì)胞因子的水平幾乎沒有改變
[0030]為了探討治療組中潛在的生物標(biāo)記物的變化，我們使用Luminex-basedbeadarray分析了雌性apoE+Fas+小鼠68種炎癥趨化因子和細(xì)胞因子。結(jié)果顯示,與對照組相比，L-4F組中組織受損和炎癥的水平都下降了:包括CRP(C反應(yīng)蛋白)、纖維蛋白原、TNF-α (腫瘤壞死因子a)、CCL12(單核細(xì)胞趨化蛋白5[MCP_5])。多樣本(54種檢測抗原)Bonferroni校正后顯示，無論是否使用普伐他汀，血清IL-1O (白介素10)、CCL9 (巨噬細(xì)胞炎性蛋白質(zhì)I Y [MIP-1 y]), VCAM-1 (血管細(xì)胞黏附分子I)在L-4F組中的水平較對照組明顯更低，同時，循環(huán)的CCL19 (巨噬細(xì)胞炎性蛋白質(zhì)3 Y [MIP-3 y])的水平也顯著的降低了。然而，這些指標(biāo)在普伐他汀單獨給藥的情況下卻沒有受到影響(數(shù)據(jù)未列)。
[0031]實施例4 L-4F用于防止BMD流失和小梁骨衰退的作用
[0032]通過DEXA測量顯示，與對照組相比，雌性給藥組小鼠的腰椎BMD水平顯著升高，普伐他汀、L-4F、L-4F+ 普伐他汀組(分別是 0.051 ±0.0015mg/cm2、0.051 ±0.005mg/cm2、
0.053±0.003mg/cm2、0.042±0.007mg/cm2 ；p = 0.0005、6X lO'0.0002,0.0001)，而在普
伐他汀、L-4F、L-4F+普伐他汀組之間沒有明顯的差異(圖3A)。此外，總的骨骼BMD (除了頭蓋骨)或者股骨BMD上沒有因治療引起的變化(數(shù)據(jù)未列)。11(^分析也證實了1^4?組治療與空白對照組小鼠相比骨體積密度、小梁數(shù)量、連接密度顯著升高(P = 0.023,0.019、
0.00054)，同時小梁間隔顯著降低(P = 0.04)(圖3B，C)。相反的，單獨普伐他汀給藥輕微降低了骨體積密度，統(tǒng)計學(xué)上具有顯著性；L-4F+普伐他汀給藥組在小梁結(jié)構(gòu)方面沒有明顯的改善，因此我們認(rèn)為普伐他汀可能能單獨的起到保護作用。
[0033]實施例5 L-4F治療后血清脂質(zhì)成分的改變與促炎反應(yīng)的脂蛋白活性的降低
[0034]apoE+Fas+中L_4F治療組和空白對照組小鼠之間甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、非高密度脂蛋白膽固醇、游離脂肪酸的水平?jīng)]有顯著的差異(圖4A)。小鼠注射給予L-4F治療結(jié)果顯示，與空白對照組相比改善了其血清高密度脂蛋白的抗炎功能，同時降低了低密度脂蛋白的促炎反應(yīng)活性，與人體主動脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)的實驗結(jié)果相一致(圖 4B)。
【權(quán)利要求】
1.一種 apoA-1 模擬肽，其氨基酸序列為 Ac-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-NH2,即Ac-天冬氨酸-色氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-天冬氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-谷氨酸-賴氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-谷氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-NH2。
2.一種制備權(quán)利要求1所述模擬肽的方法，其特征在于該方法是固相合成法，所用氨基酸均為L-氨基酸。
3.如權(quán)利要求1，2所得模擬肽，其特征在于能夠形成類似apoA-1的A級雙親螺旋結(jié)構(gòu)，即MMF及MMPF結(jié)構(gòu)。
4.權(quán)利1，2所述多肽在診斷與治療與apoA-1相關(guān)疾病中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述疾病為動脈硬化、冠狀動脈病、腎小球腎炎、蛋白尿、自身免疫性抗體異常以及嚴(yán)重的炎癥相關(guān)疾病、高脂血癥、糖尿病、肥胖癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、高血壓、血栓、卵巢癌、缺血性心臟病、肝炎、艾滋病。
【文檔編號】A61P3/04GK103570807SQ201210259345
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月25日
【發(fā)明者】林灼鋒, 林紹強, 潘薛波, 吳帆, 龔琦 申請人:溫州醫(yī)學(xué)院生物與天然藥物開發(fā)中心有限公司, 廣州格魯斯特生物技術(shù)有限公司