專利名稱：一種短肽、其異構(gòu)體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種短肽、其異構(gòu)體及其應(yīng)用。特別是涉及以該短肽、其異構(gòu)體為活性成分的舒血管、降血壓、抗血栓、控制心率失常并有抗癌功效的藥物。
背景技術(shù)：
天冬氨酸-精氨酸-纈氨酸-酪氨酸-異亮氨酸-組氨酸-脯氨酸 (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro)，簡寫為DRWIHP，它是一個內(nèi)源性七肽也被稱為 angl-7，廣泛分布于體內(nèi)各種組織及體液中。這個七肽主要由血管緊張素II經(jīng)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2水解，或由血管緊張素原由其他途徑少量合成而釋放。在血液中的濃度一般為納摩爾級。angl-7的藥代動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，angl-7靜脈注入體內(nèi)后，很快就被降解，半衰期僅為8 12秒。angl-7在人體內(nèi)通過四種機制從血漿中清除①血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)介導(dǎo)的水解作用；②中性內(nèi)肽酶(NEP)介導(dǎo)的水解作用③亮氨酸內(nèi)肽酶(LAP)介導(dǎo)的水解作用④腎小球濾過作用。其中酶解介導(dǎo)的水解作用是angl-7代謝的主要途徑。angl-7是腎素-血管緊張素調(diào)控系統(tǒng)內(nèi)的一個重要組成部分。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 2在把血管緊張素II水解為angl-7降低了血管緊張素II在血液中的含量。同時angl-7 的特異性受體Mas受體因結(jié)合angl-7活化后可直接降低ATl對血管緊張素II的結(jié)合活性，angl-7長期刺激可降低ATl受體的表達。因此在體內(nèi)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2水解血管緊張素II產(chǎn)生angl-7的途徑是體內(nèi)腎素血管緊張素系統(tǒng)中平衡調(diào)節(jié)血管緊張素II生理功能的主要內(nèi)源平衡抑制劑。在多種心腦血管系統(tǒng)疾病中內(nèi)源產(chǎn)生的血管緊張素II是重要的致病因子，因此除了現(xiàn)在市面上大量使用ACE酶抑制劑(抑制ANGII的生成 < 普利類>) 和其受體阻斷劑(主要阻斷ATl受體作用 < 沙坦類 >)外，ANG1-7作為ANGII的內(nèi)源平衡抑制劑也納入了人們的視線范圍。angl-7作為一種主要為平衡血管緊張素II功能的多功能性生理調(diào)控因子，具有多種生物學(xué)活性。早期報道，angl-7可以促進內(nèi)皮細胞生成NO并舒張血管的功效。隨后發(fā)現(xiàn)angl-7在細胞上擁有獨立于AT1受體和AT2受體以外的血管緊張素受體Mas受體， 并通過該受體發(fā)揮多種調(diào)節(jié)拮抗血管緊張素II功能的生物學(xué)活性，包括抗血管增生、抗血栓、抗心肌肥、抗心律失常等一系列有益的生物學(xué)活性。此外angl-7還被發(fā)現(xiàn)具有獨特的抑制和VEGF于PIGF表達相關(guān)的異體移植瘤功效。雖然angl-7具有非常顯著的抗心腦血管疾病的特點，但由于其進入人體后，在體內(nèi)多種酶的作用下迅速降解，使其濃度大大下降，極大地限制了其生物活性的發(fā)揮。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為一種短肽及其異構(gòu)體，它的結(jié)構(gòu)式(以下簡稱發(fā)明短肽1)為Ac-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-NH2其中Ac-代表氮末端乙酰化，-NH2代表碳末端酰胺化。其異構(gòu)體的(以下簡稱發(fā)明短肽2)結(jié)構(gòu)式為
Ac-Asp-Arg-Val-Tyr(D)-Ile-His(D)-Pro其中“D”表示此氨基酸殘基為D構(gòu)型。該短肽及其異構(gòu)體的獲得，采用現(xiàn)有技術(shù)中的公知方法進行，可以用常規(guī)的化學(xué)合成方法，或生物合成方法獲得。該短肽及其異構(gòu)體分別與ACE酶、NEP酶、LAP酶作用，HPLC檢測分析，確定其都能抵抗這三種酶降解。分別以該短肽及其異構(gòu)體為活性成份的抗高血壓藥物、抗血栓藥物和抗癌藥物，具有與天然angl-7基本相同甚至優(yōu)于天然angl-7的特性，而且在體內(nèi)抵抗上述三種降解酶降解，含酶條件下其半衰期延長超過原型100倍以上，使其更能夠持續(xù)有效的發(fā)揮功能。該短肽及其異構(gòu)體可制備如舒血管降血壓藥物，它的活性成份是治療有效量的本發(fā)明短肽或其異構(gòu)體；抗血管增生藥物，它的活性成份是治療有效量的本發(fā)明短肽或其異構(gòu)體；抗心律失常藥物，它的活性成份是治療有效量的本發(fā)明短肽或其異構(gòu)體；抗癌藥物， 它的活性成份是治療有效量的本發(fā)明短肽或其異構(gòu)體。需要的時候，在上述藥物中還可以含有一種或多種藥學(xué)上可以接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等，必要時還可以加入香味劑、甜味劑等。本發(fā)明的藥物可以制成片劑、粉劑、粒劑、膠囊、及凍干粉注射液等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。上述藥物的用量一般為每天100 μ g/kg體重。


圖1所示為本發(fā)明短肽對比血管緊張素1-7的耐酶解效果HPLC圖譜；A圖血管緊張素1-7標準品；
B圖發(fā)明短肽1標準品；
C圖發(fā)明短肽2標準品；
D圖血管緊張素1-7被ACE酶水解結(jié)果
E圖發(fā)明短肽1被ACE酶水解結(jié)果；
F圖發(fā)明短肽2被ACE酶水解結(jié)果；
G圖血管緊張素1-7被LAP酶水解結(jié)果
H圖發(fā)明短肽1被LAP酶水解結(jié)果；
I圖發(fā)明短肽2被LAP酶水解結(jié)果；
J圖血管緊張素1-7被NEP酶水解結(jié)果
K圖本發(fā)明短肽1被NEP酶水解結(jié)果；
L圖發(fā)明短肽2被NEP酶水解結(jié)果。圖2所示為本發(fā)明短肽1刺激HUVEC釋放NO的含量測定對比。圖3所示為血管緊張素1-7、本發(fā)明短肽1、本發(fā)明短肽2抑制HUVEC細胞形成小管對比圖；A圖為小管數(shù)目統(tǒng)計圖；B圖無藥物刺激情況下HUVEC細胞形成光鏡下可見的小管；
C圖血管緊張素1-7抑制HUVEC細胞形成光鏡下可見的小管；D圖本發(fā)明短肽1抑制HUVEC細胞形成光鏡下可見的小管；E圖本發(fā)明短肽2抑制HUVEC細胞形成光鏡下可見的小管。圖4所示為本發(fā)明短肽抑制A549細胞增殖的對比結(jié)果，其中A圖為血管緊張素1-7抑制A549細胞生長結(jié)果；B圖為本發(fā)明短肽1抑制A549細胞生長結(jié)果；C圖為本發(fā)明短肽2抑制A549細胞生長結(jié)果。
具體實施例方式實施1本發(fā)明短肽及其異構(gòu)體對比血管緊張素1-7的耐酶解效果用PBS溶解血管緊張素1-7、發(fā)明短肽1、發(fā)明短肽2至5mmol/L。用PBS溶解血管緊張素1-7、發(fā)明短肽1、發(fā)明短肽25μ1+20μ1 PBS 37°C水浴 30min+5 μ 1乙腈過HPLC作標準圖譜。發(fā)明短肽15μ 1+10μ 1 ACE 或 NEP 或 LAP 酶(0. 05U)+10PBS 37°C 水浴 30min+5 μ 1 乙腈過HPLC。發(fā)明短肽25μ 1+10μ 1 ACE 或 NEP 或 LAP 酶(0. 05U)+10PBS 37°C 水浴 30min+5 μ 1 乙腈過HPLC。色譜條件A液0.1%磷酸溶液B液100%乙腈溶液C18 柱流速0. ;35ml/min12% B溶液平衡柱子后上樣，B液濃度15min中逐漸梯度升至M%，24% B液濃度繼續(xù)沖洗15min。結(jié)果見圖1，如圖所示，相比于血管緊張素1-7標準品，兩種發(fā)明短肽可以更好的抵抗降解血管緊張素1-7相關(guān)酶的降解。實施例2本發(fā)明短肽及其異構(gòu)體刺激HUVEC釋放一氧化氮消化HUVEC細胞后以每孔2X IO5個細胞鋪入12孔板加入10% FBS DMEM37°C 5% CO2培養(yǎng)過夜。取10% FBS DMEM分別稀釋angl-7、本發(fā)明短肽其結(jié)構(gòu)式為Ac-Asp-Arg-Val-Tyr -Ile-His-Pro-NH2,和 Ac-Asp-Arg-Val-Tyr (D)-Ile-His (D)-Pro-NH2,為 1 μ m/L。12 孔分為無藥組、angl-7、本發(fā)明短肽1、發(fā)明短肽2，四組每組2個副孔吸取培養(yǎng)液后加入新鮮培養(yǎng)基或藥物900 μ 1 37°C培養(yǎng)30min。取出12孔板每孔取50 μ 1培養(yǎng)液做一氧化氮含量測定。結(jié)果見圖2，如圖所示，加入改構(gòu)體后改構(gòu)體可刺激血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)釋放一氧化氮，而一氧化氮是一種強效的舒血管活性物質(zhì)并對機體氧化損傷有保護作用。實施例3本發(fā)明短肽及其異構(gòu)體抑制HUVEC細胞形成小管預(yù)冷96孔板和200 μ 1槍頭，4°C過夜融化_20°C保存的matrgiel基質(zhì)膠。將融化的matrgiel基質(zhì)膠50 μ 1每孔快速加入預(yù)冷的96孔板，室溫放置IOmin待matrgiel基質(zhì)膠凝固。消化HUVEC細胞調(diào)節(jié)細胞密度2 X IO5HiL取144 μ 1細胞懸液加入凝固的matrgiel 基質(zhì)膠上。DMEM調(diào)配1 μ m/L angl_7、本發(fā)明短肽1、本發(fā)明短肽2，16孔分為無藥組、angl_7、 本發(fā)明短肽1、本發(fā)明短肽2四組，每組3個副孔加入16 μ 1藥液于加好細胞的96孔板中。370C 5% CO2培養(yǎng)他觀察小管形成效果并計算小管數(shù)目。結(jié)果見圖3，如圖所示，本發(fā)明短肽可以比原型更好的抑制血管內(nèi)皮細胞的小管形成，內(nèi)皮細胞遷移、相互融合并形成管狀結(jié)構(gòu)是血管形成過程中的重要環(huán)節(jié)，如能抑制這一環(huán)節(jié)，就可以抑制血管的形成和增生。實施例4本發(fā)明短肽抑制Α549細胞增殖消化Α549細胞每孔1 X IO4鋪入M孔板加入10% FBS164037°C 5% CO2培養(yǎng)培養(yǎng)過夜。熱壓PBS(PH7. 2)并用其稀釋本發(fā)明短肽。取出M孔板后消化第一列孔中細胞計數(shù)，其余孔中細胞吸去培養(yǎng)液4行分別加入PBS，本發(fā)明短肽0. 1 μ m/L、1 μ m/L、10 μ m/L沖洗細胞并在37°C孵育30min。吸去洗液加入FBS 164037°C 5% CO2培養(yǎng)培養(yǎng)Id。第二天重復(fù)第二段步驟，消化計數(shù)第二列孔中細胞并以此類推直到第六天完成實驗，沒孔細胞數(shù)描點繪制細胞生長曲線。結(jié)果見圖4，如圖所示，本發(fā)明短肽1和本發(fā)明短肽2擁有類似Angl-7的抑制A549 細胞(肺癌)的增殖的效果。
權(quán)利要求
1.一種短肽，其結(jié)構(gòu)式為Ac-Asp-Arg-Val-Tyr-IIe-HiS-Pro-NH2其中Ac-代表氮末端乙?；?，-NH2代表碳末端酰胺化。
2.一種短肽，其結(jié)構(gòu)式為Ac-Asp-Arg-Val-Tyr(D)-Ile-His(D)-Pro其中“D”表示此氨基酸殘基為D構(gòu)型。
3.—種舒血管降血壓藥物，它的活性成份是治療有效量的權(quán)利要求1所述短肽或權(quán)利要求2所述短肽。
4.一種抗血管增生藥物，它的活性成份是治療有效量的權(quán)利要求1所述短肽或權(quán)利要求2所述短肽。
5.一種抗心律失常藥物，它的活性成份是治療有效量的權(quán)利要求1所述短肽或權(quán)利要求2所述短肽。
6.一種抗癌藥物，它的活性成份是治療有效量的權(quán)利要求1所述短肽或權(quán)利要求2所述短肽。
7.權(quán)利要求1所述短肽或權(quán)利要求2所述短肽在制造降壓藥物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述短肽或權(quán)利要求2所述短肽在制造抗心律失常藥物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述短肽或權(quán)利要求2所述短肽在制造抗血栓藥物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1所述短肽或權(quán)利要求2所述短肽在制造抗癌藥物中的應(yīng)用。
11.權(quán)利要求7、8、9、10所述藥物應(yīng)用中含有一種或多種藥學(xué)上可以接受的載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等所制成的片劑、粉劑、粒劑、膠囊、及凍干粉注射液等藥用形式和保健品及食品添加劑形式。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種短肽、其異構(gòu)體，其結(jié)構(gòu)如下Ac-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-NH2和Ac-Asp-Arg-Val-Tyr(D)-Ile-His(D)-Pro，兩種改構(gòu)體擁有促進HUVEC細胞釋放NO遷移和形成小管的能力并且能夠抑制A549細胞生長等類似于血管緊張素1-7的生物學(xué)活性；與此同時，該改構(gòu)體擁有抵抗ACE、NEP、AP這3三種降解酶降解的能力，從而保證其比血管緊張素1-7原型更長的半衰期；該改構(gòu)體獲得簡單，對開發(fā)成為新型心腦血管治療用多肽藥物有重要應(yīng)用價值。
文檔編號A61P9/06GK102532265SQ201110449129
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者張英起, 王增祿, 郭翰文, 黃同列 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)