專利名稱：神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物制劑技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及靶向給藥制劑短鏈神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體及其制備方法，以及其在腫瘤治療中的新用途。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤已成為疾病死亡率排名第一的疾病，化療是最主要的治療手段之一。絕大多數(shù)晚期腫瘤患者均需要化療，化療是全身癌細(xì)胞擴(kuò)散患者較有效的方法。但目前臨床中化療總的有效率仍不到30%，而且?guī)缀跛械幕熕幵谥委熤卸紩?huì)產(chǎn)生多藥耐藥現(xiàn)象，從而進(jìn)一步降低了化療有效率。因此，如何提高化療藥物的治療效果是腫瘤治療的關(guān)鍵問題。短鏈神經(jīng)酰胺(C2、C4、C6、C8，首選C6)是由細(xì)胞膜神經(jīng)鞘磷脂水解產(chǎn)生的一種脂
質(zhì)分子，其以高濃度存在于細(xì)胞膜中，屬脂類分子家族，構(gòu)成了鞘氨醇和脂肪酸。近年來發(fā)現(xiàn)它能夠發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)第二信使的作用，介導(dǎo)了多種細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)，包括細(xì)胞分化、生長(zhǎng)抑制、凋亡、免疫反應(yīng)等。神經(jīng)酰胺還參與了 JNK、p53、bcl-2、p21等抗癌基因的活化表達(dá)調(diào)控。最近研究表明放射線、化療藥物(紫杉醇、多柔比星、柔紅霉素等)、氧化應(yīng)激等能激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺信號(hào)系統(tǒng)，誘導(dǎo)細(xì)胞體內(nèi)合成神經(jīng)酰胺，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，任何增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺積聚的刺激都會(huì)產(chǎn)生促凋亡作用，不能產(chǎn)生足夠神經(jīng)酰胺的腫瘤細(xì)胞通常不能有效的進(jìn)行凋亡。對(duì)大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞來講，內(nèi)源性的神經(jīng)酰胺并不能有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。因此，外源性添加神經(jīng)酰胺作為化療增敏劑，從而有效增加化療藥物敏感性，降低化療耐藥是一個(gè)有效的治療途徑。盡管如此，全身運(yùn)用神經(jīng)酰胺仍受其物理、化學(xué)性質(zhì)影響。由于神經(jīng)酰胺為疏水脂溶性，體內(nèi)輸送形成大的聚集體，難以到達(dá)腫瘤細(xì)胞內(nèi)。即使加入增溶劑聚氧乙基蓖麻油配制成注射液也易引起較多并發(fā)癥，如過敏反應(yīng)及生物利用度低。脂質(zhì)體對(duì)機(jī)體毒副作用小，其脂質(zhì)雙分子層與生物膜有較大的相似性與組織相溶性，易于被組織吸收。脂質(zhì)體包裹藥物為物理過程，不改變藥物分子結(jié)構(gòu)，當(dāng)藥物被包裹后可降低藥物毒性，減小藥物使用量，具有緩釋和控釋作用。因此，開發(fā)靶向腫瘤部位、長(zhǎng)循環(huán)緩釋功能的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體，以滿足臨床給藥需求顯得尤為重要。目前，國(guó)內(nèi)外尚無可用于腫瘤治療的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體(包括注射或口服劑型)，因此，我們的發(fā)明具有極好的創(chuàng)新性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，研制一種性質(zhì)穩(wěn)定且可工業(yè)化生產(chǎn)的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體(包括注射或口服劑型)，同時(shí)提供了神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體的制備方法，并公開該神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體在腫瘤治療中的新用途。本發(fā)明的第一個(gè)目的通過以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體，包括治療有效量的活性成分和類脂雙分子層薄膜，其特征在于所述活性成分的重量份為O. 5-20份，活性成分為神經(jīng)酰胺；所述類脂雙分子層薄膜的重量份為10-350份，包括下述重量份的組分磷脂類物質(zhì)5-100份，膽固醇O. 5-10份，表面活性劑0-100份，附加劑0-20份，有機(jī)溶劑O. 5-10份。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述的磷脂類物質(zhì)選自二月桂酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰甘油、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、二棕櫚酰磷脂酸、二油酰磷脂酰膽堿、二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰、二油酰磷脂酰乙醇胺、大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂、腦磷脂、合成磷脂、氫化大豆卵磷脂中的一種或幾種。
作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述膽固醇選用以蛋黃、動(dòng)物腦髓、羊毛脂為原料生產(chǎn)的天然膽固醇。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述表面活性劑選自脫氧膽酸鹽、膽酸鹽、脫氧膽酸、膽酸、吐溫-80、?；悄懰猁}、泊洛沙姆中的一種或幾種的組合物。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述有機(jī)溶劑選自乙醇、丙酮、甲醇、氯仿、乙醚、異丙醇中的一種或幾種的混合物。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述附加劑選自L-異亮氨酸、蘋果酸、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸氫鈉、維生素C、維生素E、沒食子酸丙酯、反丁烯二酸、L-半胱氨酸或PH緩沖劑磷酸鹽、EDTA中的一種或幾種。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體加入長(zhǎng)循環(huán)輔料，進(jìn)行表面修飾制成長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體，所述長(zhǎng)循環(huán)輔料長(zhǎng)循環(huán)輔料與磷脂類物質(zhì)的摩爾比為1:10-1:200 ;所述長(zhǎng)循環(huán)輔料選自聚乙二醇-磷脂衍生物、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基聚唑啉、聚乙二醇-二棕櫚酰磷脂酰膽堿、聚乙二醇-二硬脂?；字Ｒ掖及贰ぞ厶腔蚓垡蚁┐?。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體加入磁性修飾材料，進(jìn)行表面修飾制成磁性脂質(zhì)體；所述磁性修飾材料為超細(xì)磁粉。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體加入熱敏輔助材料，進(jìn)行表面修飾制成熱敏脂質(zhì)體；所述熱敏輔助材料是本身具有熱敏性的磷脂，包括二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC);或是高分子熱敏聚合物，包括聚丙烯酸、聚磷脂酸；或是一種能夠使脂質(zhì)體的相變溫度適合于腫瘤熱療溫度的油性藥物，包括欖香烯或野鴨子油。傳統(tǒng)的脂質(zhì)體粒徑較大，包封率低、穩(wěn)定性差，特別容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬細(xì)胞將其從血循環(huán)中清除，從而減少到達(dá)腫瘤組織的藥量。本發(fā)明對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行表面修飾，制成的長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體、磁性脂質(zhì)體、熱敏脂質(zhì)體等能夠進(jìn)一步延長(zhǎng)神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體的血循環(huán)時(shí)間，提高神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體的靶向性和生物利用度，降低毒副作用。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體分散相的平均粒徑小于500nm。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體以注射液或固體粉劑的形式存在。固體粉劑的形式可以大大延長(zhǎng)神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體的存放時(shí)間，便于運(yùn)輸。本發(fā)明的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體能以注射或口服方式給藥，其中注射方式可以為靜脈滴注、靜脈注射。皮下注射、肌肉注射、腹腔注射等，優(yōu)選靜脈注射。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體包封率大于80%。本發(fā)明的第二個(gè)目的通過以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟將神經(jīng)酰胺、磷脂類物質(zhì)、膽固醇和附加劑充分溶解在有機(jī)溶劑中，將表面活性劑溶解在分散介質(zhì)中，采用薄膜分散法或有機(jī)溶劑注入法制得神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體，然后采用超聲、高壓均質(zhì)或擠出的方法將制得的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體的平均粒徑降低至500nm以下且均勻分布。所述薄膜分散法的詳細(xì)操作為將神經(jīng)酰胺、磷脂類物質(zhì)、膽固醇和附加劑充分溶解在有機(jī)溶劑中，將此溶液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi)，在40°C下減壓去除有機(jī)溶劑，形成薄膜，然后加入含有表面活性劑的PH值為3. (Γ10. O的分散介質(zhì)，制得神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體。所述有機(jī)溶劑注入法的詳細(xì)操作為將神經(jīng)酰胺、磷脂類物質(zhì)、膽固醇和附加劑充分溶解在有機(jī)溶劑中，將此溶液緩慢注入50-60°C的含有表面活性劑的pH值為3. (Γ10. O的分散介質(zhì)中，用電子恒速攪拌器攪拌至有機(jī)溶劑除盡，再用所述的分散介質(zhì)稀釋至要求濃度，制得神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體。作為所述制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)，所述分散介質(zhì)為Tris緩沖液、水、磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、5%葡萄糖水溶液或O. 9%NaCl溶液；所述分散介質(zhì)中的表面活性劑的重 量濃度為1%_30%。作為所述制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)，在制得的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體中添加凍干粉保護(hù)劑，通過噴霧干燥或冷凍干燥工藝制成凍干粉；所述凍干粉保護(hù)劑選自甘露醇、蔗糖、海藻糖、氯化鈉、葡萄糖、右旋糖酐、甘氨酸、乳糖、山梨醇、木糖醇、果糖、甘油、阿拉伯膠和賴氨酸中的一種或幾種；凍干粉保護(hù)劑神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體的重量份數(shù)配比為(10-20)(O. 5-6. O)。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于
提供所述的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體在制備抗腫瘤藥物中的用途。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，優(yōu)點(diǎn)在于
本發(fā)明制備的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體可對(duì)腫瘤具有一定的靶向性，長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體可顯著提高脂質(zhì)體在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，使藥物更長(zhǎng)期有效地靶向于腫瘤部位，和化療藥物(如紫杉醇類和吉西他濱類藥物等)聯(lián)合運(yùn)用能更有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，降低化療藥物濃度和避免化療耐藥，延長(zhǎng)了生物存活時(shí)間。


圖I是不同的藥物或藥物組合給藥后對(duì)接種胰腺癌細(xì)胞的裸鼠移植瘤的平均腫瘤體積的影響情況曲線圖。圖2是不同的藥物或藥物組合給藥后對(duì)接種胰腺癌細(xì)胞的裸鼠移植瘤的最終大小的抑制情況實(shí)物圖。圖3是不同的藥物或藥物組合給藥后對(duì)接種胰腺癌細(xì)胞的裸鼠的平均存活時(shí)間的影響情況曲線圖。圖4是不同的藥物或藥物組合給藥后對(duì)接種胰腺癌細(xì)胞的裸鼠移植瘤的平均腫瘤體積的影響情況曲線圖。圖5是不同的藥物或藥物組合給藥后對(duì)接種胰腺癌細(xì)胞的裸鼠的存活率的影響情況曲線圖。圖6是MTT法測(cè)得的不同的藥物或藥物組合對(duì)人MIA胰腺癌細(xì)胞株的細(xì)胞存活率的影響情況柱形圖。圖7是MTT法測(cè)得的不同的藥物或藥物組合對(duì)人Ca0V3卵巢癌細(xì)胞株的細(xì)胞存活率的影響情況柱形圖。圖8是MTT法測(cè)得的不同的藥物或藥物組合對(duì)L3. 6胰腺癌細(xì)胞株的細(xì)胞存活率的影響情況柱形圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例I
神經(jīng)酰胺20mg 蛋黃卵磷脂20mg
膽固醇200mg
乙醚IOml
牛磺膽酸鹽30mg
制法將30mg?；悄懰猁}溶解在磷酸鹽緩沖液(pH 7. 4)中，?；悄懰猁}在磷酸鹽緩沖液中的重量濃度為15% ;將20mg神經(jīng)酰胺、20mg蛋黃卵磷脂和200mg膽固醇溶解在乙醚中，然后將此溶液緩慢注入50-60°C的磷酸鹽緩沖液中，用電子恒速攪拌器以600r/min轉(zhuǎn)速攪拌至乙醚除盡，再用上述的磷酸鹽緩沖液稀釋至100ml，即得神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體，置4°C保存。實(shí)施例2
神經(jīng)酰胺30mg
大豆卵磷脂120mg
膽固醇250mg
甲醇IOml
乙醇IOml
脫氧膽酸鈉40mg
制法將40mg脫氧膽酸鈉溶解在適量的摩爾濃度為20mmol/L的Tris-HCl (PH7. 5，含O. 15mol/LNaCl)緩沖液中，脫氧膽酸鈉在Tris-HCl緩沖液中的重量濃度為10% ;將30mg神經(jīng)酰胺溶于IOml甲醇中，120mg卵磷脂、250mg膽固醇溶于IOml乙醇中，將該兩種溶液共同置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi)，在40°C減壓去溶媒，形成薄膜，然后加入上述的，然后加入上述的溶解有脫氧膽酸鈉的Tris-HCl緩沖液，超聲處理30min，即得神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體，經(jīng)噴霧干燥制得神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體的凍干制劑。凍干制劑使用前只需充分水化短時(shí)震蕩，就能重新形成神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體。實(shí)施例3
神經(jīng)酰胺IOOmg
大豆卵磷脂1200mg
氫化飽和磷脂300mg
膽固醇IOOmg
神經(jīng)節(jié)苷脂50mg
無水乙醇50ml維生素E50mg
制法將IOOmg神經(jīng)酰胺、1200mg大豆卵磷脂、300mg氫化飽和磷脂、IOOmg膽固醇、50mg神經(jīng)節(jié)苷脂和6. 5mg維生素E超聲溶解于50ml無水乙醇中，將此溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi)40°C減壓去溶媒，形成薄膜，然后加入20mmol/L Tris-HCl (PH7. 5，含O. 15mol/LNaCl)緩沖液，超聲處理30min，高壓均質(zhì)機(jī)循環(huán)均質(zhì)5-6次，然后過O. 22 μ m微孔濾膜，分裝灌封得神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體，經(jīng)干燥得神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體的凍干制劑。凍干制劑使用前只需充分水化短時(shí)震蕩，就能重新形成脂質(zhì)體。實(shí)施例4
C6神經(jīng)酰胺250mg
大豆卵磷脂1500mg
氫化飽和磷脂500mg
膽固醇150mg
維生素E7. 2mg
油酸50mg
泊洛沙姆50mg
無水乙醇IOml
制法將50mg泊洛沙姆溶解在適量的摩爾濃度為20mmol/L的Tris-HCl (PH7. 5，含O. 15mol/LNaCl)緩沖液中，泊洛沙姆在Tris-HCl緩沖液中的重量濃度為15% ;將250mg C6神經(jīng)酰胺、1500mg大豆卵磷脂、500mg氫化飽和磷脂、150mg膽固醇、7. 2mg維生素E和50mg油酸和超聲溶解于IOml無水乙醇中，將此溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi)40°C減壓去溶媒，形成薄膜，然后加入，然后加入上述的溶解有泊洛沙姆的Tris-HCl緩沖液，超聲處理30min，高壓均質(zhì)機(jī)循環(huán)均質(zhì)5-6次，然后過O. 22um微孔濾膜，分裝灌封得神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體，經(jīng)干燥得神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體的凍干制劑。凍干制劑使用前只需充分水化短時(shí)震蕩，就能重新形成神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體。實(shí)施例5 :雙重靶向腫瘤的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體 C6神經(jīng)酰胺250mg 大豆卵磷脂 1500mg 氫化飽和磷脂 500mg 膽固醇 150mg 維生素E 7. 2mg 油酸 50mg 泊洛沙姆 50mg 無水乙醇 IOml
雙重靶向腫瘤的多肽采用9-FM0C固相合成法合成，采用高效液相色譜法純化，采用質(zhì)譜鑒定。制法將50mg泊洛沙姆溶解在適量的摩爾濃度為20mmol/L的Tris-HCl (PH7. 5，含O. 15mol/LNaCl)緩沖液中，泊洛沙姆在Tris-HCl緩沖液中的重量濃度為15% ;將250mgC6神經(jīng)酰胺、1500mg大豆卵磷脂、500mg氫化飽和磷脂、150mg膽固醇、7. 2mg維生素E、50mg油酸超聲溶解于IOml無水乙醇中，將此溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi)40°C減壓去溶媒，形成薄膜，然后加入上述的溶解有泊洛沙姆的Tris-HCl緩沖液，超聲處理30min，高壓均質(zhì)機(jī)循環(huán)均質(zhì)5-6次，然后過O. 22um微孔濾膜，制得神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體，在該神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體中加入雙重靶向腫瘤的多肽，神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體雙重靶向腫瘤的多肽的摩爾比為1:50，經(jīng)干燥得雙重靶向腫瘤的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體的凍干制劑。該凍干制劑使用前只需充分水化短時(shí)震蕩，就能重新形成神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體。實(shí)施例6 :神經(jīng)酰胺長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的制備 神經(jīng)酰胺20mg
氫化大豆卵磷脂200mg
膽固醇IOOmg
PEG-DSPE50mg 氯仿30ml
α -生育酹20mg
制法將20mg神經(jīng)酰胺、50mg PEG_DSPE、200mg氫化大豆卵磷脂、IOOmg膽固醇和20mg α -生育酚溶于30ml氯仿，置梨形瓶中，在氮?dú)饬飨滦D(zhuǎn)蒸發(fā)，減壓除去溶媒，然后真空干燥2-3天，得恒重薄膜，再加入適量的20mmol/L的Tris-HCl緩沖液(PH7. 0，含O. 15mol/L NaCl)，旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)梨形瓶，得到脂質(zhì)體懸液。用氮?dú)鉀_洗后，封口室溫下平衡I天，探針超聲處理15min，然后在500Kpa壓力下通過微流態(tài)化期混合室，經(jīng)60-80沖程的微流態(tài)化處理，使脂質(zhì)體粒徑小于lOOnm。然后用5. 4%葡萄糖溶液透析除鹽，得神經(jīng)酰胺長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體，再經(jīng)冷凍干燥劑制成凍干制劑。該凍干制劑使用前只需充分水化短時(shí)震蕩，就能重新形成神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體。實(shí)施例7 :神經(jīng)酰胺熱敏脂質(zhì)體的制備 神經(jīng)酰胺O. 4g 注射用豆磷脂 20g 膽固醇 2.4g 二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC) 5. Og 十八胺 O. Ig 維生素E O. 2g 乙醚 200ml
制法將O. 4g的神經(jīng)酰胺、20g的注射用豆磷脂、2. 4g的膽固醇、5. Og的二棕櫚酰磷脂酰膽堿、O. 2g的維生素E溶解于乙醚溶液中并倒入梨形瓶，再加入含有十八胺的少量PH緩沖劑磷酸鹽溶液，超聲使成均勻乳，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓除盡有機(jī)溶劑，使成凝膠，漩渦震蕩間隔減壓蒸餾，得白色均勻脂質(zhì)體溶液，再用緩沖液定溶至200ml。通過加壓過膜(O. 22um)整粒除熱源，分裝至西林瓶中冷凍干燥，重復(fù)3次，得神經(jīng)酰胺熱敏脂質(zhì)體。實(shí)施例8 :神經(jīng)酰胺磁性脂質(zhì)體的制備 神經(jīng)酰胺20mg
大豆卵磷脂IOOmg
膽固醇IOOmg
雙鯨蠟磷脂酸20mg
α -生育酹20mg乙醚20ml
制法將超細(xì)磁粉溶解在磷酸鹽緩沖液(pH 7. 4)中，超細(xì)磁粉在磷酸鹽緩沖液中的重量濃度為O. 5% ;將IOOmg卵磷脂、IOOmg膽固醇、20mg雙鯨蠟磷脂酸、20mga -生育酚和20mg神經(jīng)酰胺溶于20ml乙醚中，減壓蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑至瓶?jī)?nèi)壁上形成一層脂質(zhì)薄膜，加入上述的含有超細(xì)磁粉的磷酸鹽緩沖液，在水溶型超聲儀上超聲至混合物形成單相體系，再減壓蒸發(fā)至凝膠形成，繼續(xù)減壓蒸發(fā)至形成水性混濁液，充氮?dú)?，冰浴超聲即得神?jīng)酰胺磁性脂質(zhì)體，加入8%乳糖做支架劑，再經(jīng)冷凍干燥劑制成凍干制劑。實(shí)驗(yàn)例9 :神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體和化療藥物紫杉醇聯(lián)合用藥的抗胰腺癌作用。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2個(gè)月齡的BALB/c雄性裸鼠(購(gòu)自上海斯克萊實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司)，共40只。試驗(yàn)方法
我們選擇實(shí)施例4和實(shí)施例5制得的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體，分別定義為神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體I和神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體2。按以下方法建立在體裸鼠胰腺癌模型裸鼠靠近右大腿皮下注射IXlO6的L3. 6胰腺癌細(xì)胞株，2周后，待可見50_3實(shí)體腫瘤后，根據(jù)靜脈內(nèi)給藥量的不同，將裸鼠按每組10只分成4組，分別為不給藥的對(duì)照組、紫杉醇組、紫杉醇+神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體I組、紫杉醇+神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體2組。按前6天每天給藥一次，后6天每2天給藥一次的方式進(jìn)行給藥，共進(jìn)行12天。每周2次記錄腫瘤大小、裸鼠存活率和體重，共記錄6周，記錄結(jié)果見圖f圖3。圖2中a.對(duì)照，b.紫杉醇，c.紫杉醇+神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體l，d.紫杉醇+神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體2。由圖f圖3中可以看出外源性單加紫杉醇，腫瘤大小、裸鼠存活率和不給藥的對(duì)照組沒有明顯區(qū)別；但是聯(lián)合或者組合給予紫杉醇和神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體，卻能夠大幅抑制腫瘤生長(zhǎng)，減少腫瘤體積，延長(zhǎng)裸鼠存活時(shí)間，增加裸鼠存活率。此外該聯(lián)合療法對(duì)裸鼠體重影響不大，提示其對(duì)正常組織和細(xì)胞毒性作用有限。以上的實(shí)驗(yàn)研究表明，短鏈神經(jīng)酰胺紫杉醇和對(duì)接種胰腺癌細(xì)胞的裸鼠移植瘤均具有一定的抑瘤活性，但是單加外源性的短鏈神經(jīng)酰胺或紫杉醇的抑瘤效果有限。短鏈神經(jīng)酰胺及其藥物制劑需要聯(lián)合紫杉醇后才對(duì)接種胰腺癌細(xì)胞的裸鼠移植瘤具有顯著的抑瘤活性。實(shí)施例10 :神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體和化療藥物吉西他濱聯(lián)合用藥的抗胰腺癌作用。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2個(gè)月齡的BALB/c雄性裸鼠(購(gòu)自上海斯克萊實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司)，共30只。試驗(yàn)方法
吉西他濱是胰腺癌化療的金標(biāo)準(zhǔn)藥物。我們選擇實(shí)施例6制得的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體。按以下方法建立在體裸鼠胰腺癌模型裸鼠靠近右大腿皮下注射IX IO6的L3. 6胰腺癌細(xì)胞株，2周后，待可見50_3實(shí)體腫瘤后，根據(jù)靜脈內(nèi)給藥量的不同，將裸鼠按每組10只分成3組，分別為不給藥的對(duì)照組、吉西他濱組、吉西他濱+神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體組。按前6天每天給藥一次，后6天每2天給藥一次的方式進(jìn)行給藥，共進(jìn)行12天。每周2次記錄腫瘤體積和裸鼠存活率，共記錄6周，記錄結(jié)果見圖4、圖5。圖4中A.對(duì)照組(腫瘤雙倍時(shí)間5. 6天)；B.吉西他濱(腫瘤雙倍時(shí)間5. 4天)；C.吉西他濱+神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體(腫瘤雙倍時(shí)間是9. I天);異體移植胰腺癌裸鼠腫痛生長(zhǎng)曲線-吉西他濱5毫克/千克。圖5 :異體移植胰腺癌裸鼠存活率
A.對(duì)照；B.吉西他濱；C.加吉西他濱+神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體。由圖4、圖5中可以看出外源性單加吉西他濱，腫瘤體積、裸鼠存活率和不給藥的對(duì)照組沒有明顯區(qū)別；但是聯(lián)合或者組合給予吉西他濱和神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體，卻能夠大幅抑制腫瘤生長(zhǎng)，減少腫瘤體積，增加裸鼠存活率。實(shí)施例11 :神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體對(duì)體外培養(yǎng)的人胰腺癌細(xì)胞株的增殖抑制試驗(yàn)。試驗(yàn)細(xì)胞人MIA胰腺癌細(xì)胞株，得自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC)。試驗(yàn)藥品及試劑神經(jīng)酰胺(Avanti，USA)，3_ (4，5_ 二甲基噻唑_2) _2，5_ 二苯基四氮唑溴鹽(MTT) (sigma, USA);胰蛋白酶(sigma, USA) ;二甲亞砜(DMSO) (sigma, USA)； DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基(GIBCO，Invitragen, USA) ;RPMI1640 細(xì)胞培養(yǎng)液(GIBCO，Invitragen,USA);胎牛血清(GIBCO, Invitragen, USA);特級(jí)胎牛血清 Fetal Bovine Serum(Hyclone)。儀器超低溫冰箱(Nature，USA),倒置顯微鏡(NIKON, Japan),酶標(biāo)儀(Bio-TekInstruments，USA);細(xì)胞培養(yǎng)箱(SANYO, Japan)，超凈工作臺(tái)(FLC-哈爾濱東聯(lián)儀器廠)，PH計(jì)(Thermo orion, USA)。實(shí)驗(yàn)方法
按常規(guī)采用MTT法將人MIA胰腺癌細(xì)胞株按常規(guī)方法傳代培養(yǎng)，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度為5*104個(gè)/ml左右。將細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中，每個(gè)孔加入180 μ I ;置于37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。將吉西他濱和神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體(實(shí)施例6制得的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體)分別用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液配成梯度濃度(0. 75μ g/ml、l. 5μ g/ml、3l·! g/ml)的溶液。實(shí)驗(yàn)組加入各濃度的吉西他濱溶液(A)、神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體+吉西他濱混合溶液(B)，它們按上述濃度同時(shí)加入，每孔加入20 μ 1，每組各設(shè)4個(gè)平行孔，并設(shè)空白孔(只加入DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液)以調(diào)零。在37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h,用移液槍將96孔培養(yǎng)板中的液體吸凈,然后每孔加入30 μ I濃度為lmg/ml的MTT溶液，置37°C，5%C02的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清，每孔加入二甲亞砜(DMSO) 150μ 1，置搖床搖勻30min，用酶標(biāo)儀在492nm下檢測(cè)每孔吸光度(A)值，然后用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，具體如圖6所示。由圖6可以看出，聯(lián)合或者組合給予吉西他濱和神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體大幅降低人MIA胰腺癌細(xì)胞株的存活率，導(dǎo)致人MIA胰腺癌細(xì)胞株大幅死亡，明顯優(yōu)于單用吉西他濱的抗胰腺癌作用。實(shí)施例12 :神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體對(duì)體外培養(yǎng)的人卵巢癌細(xì)胞的增殖抑制試驗(yàn)。試驗(yàn)細(xì)胞人Ca0V3卵巢癌細(xì)胞株，得自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC)。試驗(yàn)藥品及試劑神經(jīng)酰胺(Avanti，USA)，3_ (4，5_ 二甲基噻唑_2) _2，5_ 二苯基四氮唑溴鹽(MTT) (sigma, USA);胰蛋白酶(sigma, USA) ;二甲亞砜(DMSO) (sigma, USA)；DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基(GIBC0，Invitragen, USA) ;RPMI1640 細(xì)胞培養(yǎng)液(GIBC0，Invitragen,USA);胎牛血清(GIBCO, Invitragen, USA);特級(jí)胎牛血清 Fetal Bovine Serum(Hyclone)。儀器超低溫冰箱(Nature，USA),倒置顯微鏡(NIKON, Japan),酶標(biāo)儀(Bio-TekInstruments, USA);細(xì)胞培養(yǎng)箱(SANYO，Japan)，超凈工作臺(tái)(FLC-哈爾濱東聯(lián)儀器廠)，PH計(jì)(Thermo orion, USA)。實(shí)驗(yàn)方法
按常規(guī)采用MTT法將卵巢癌細(xì)胞株按常規(guī)方法傳代培養(yǎng)，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度為5*104個(gè)/ml左右。將細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中，每個(gè)孔加入180 μ I ;置于37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。將吉西他濱、神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體I (實(shí)施例4制得的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體)和神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體2(實(shí)施例5制得的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體)分別用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液配成梯度濃度(O. 75 μ g/ml、l. 5μ g/ml、3y g/ml)的溶液。實(shí)驗(yàn)組加入各濃度的吉西他濱溶液(A)、神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體 1+吉西他濱混合溶液(B)、神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體2+吉西他濱混合溶液(C)，它們按上述濃度同時(shí)加入，每孔加入20 μ 1，每組各設(shè)4個(gè)平行孔，并設(shè)空白孔(只加入DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液)以調(diào)零。在37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h,用移液槍將96孔培養(yǎng)板中的液體吸凈,然后每孔加入30 μ I濃度為lmg/ml的MTT溶液，置37°C，5%C02的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清，每孔加入二甲亞砜(DMSO) 150 μ 1，置搖床搖勻30min，用酶標(biāo)儀在492nm下檢測(cè)每孔吸光度(A)值，然后用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，具體如圖7所示。由圖7可以看出，Ca0V3人卵巢癌細(xì)胞株單加入外源性的吉西他濱溶液不同時(shí)間的細(xì)胞存活率有明顯差別(細(xì)胞存活用通用的MTT方法檢測(cè))。聯(lián)合或者組合給予吉西他濱和神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體大幅降低了 Ca0V3人卵巢癌細(xì)胞的存活率，導(dǎo)致Ca0V3人卵巢癌細(xì)胞株大幅死亡，明顯優(yōu)于單用吉西他濱的抗卵巢癌作用。實(shí)施例13 :神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體與神經(jīng)酰胺抗癌作用比較。試驗(yàn)細(xì)胞L3. 6胰腺癌細(xì)胞株，得自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC)。試驗(yàn)藥品及試劑神經(jīng)酰胺(Avanti，USA)，3_(4，5_ 二甲基噻唑_2) _2，5_ 二苯基四氮唑溴鹽(MTT) (sigma, USA);胰蛋白酶(sigma, USA) ;二甲亞砜(DMSO) (sigma, USA)；DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基(GIBCO，Invitragen, USA) ;RPMI1640 細(xì)胞培養(yǎng)液(GIBCO，Invitragen,USA);胎牛血清(GIBCO, Invitragen, USA);特級(jí)胎牛血清 Fetal Bovine Serum(Hyclone)。儀器超低溫冰箱(Nature，USA),倒置顯微鏡(NIKON, Japan),酶標(biāo)儀(Bio-TekInstruments，USA);細(xì)胞培養(yǎng)箱(SANYO, Japan)，超凈工作臺(tái)(FLC-哈爾濱東聯(lián)儀器廠)，PH計(jì)(Thermo orion, USA)。實(shí)驗(yàn)方法
按常規(guī)采用MTT法將L3. 6胰腺癌細(xì)胞株按常規(guī)方法傳代培養(yǎng)，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度為5*104個(gè)/ml左右。將細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中，每個(gè)孔加入180 μ I ;置于37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。實(shí)驗(yàn)組共分為2大組，第一大組僅加神經(jīng)酰胺或神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體，第二大組在運(yùn)用吉西他濱的基礎(chǔ)上加神經(jīng)酰胺或神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體。A、B、C、D、E分別對(duì)應(yīng)對(duì)照組、加神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體I、加神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體2、加C6神經(jīng)酰胺(I μ g/ml)、加C6神經(jīng)酰胺(10 μ g/ml )。具體為A組不加入神經(jīng)酰胺，B組加I μ g/ml的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體I (實(shí)施例4制得的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體)，C組加I μ g/ml的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體2 (實(shí)施例5制得的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體)，D組加游離態(tài)的I μ g/ml的C6神經(jīng)酰胺，E組加游離態(tài)的10 μ g/ml的C6神經(jīng)酰胺；每孔加入20 μ 1，每組各設(shè)4個(gè)平行孔，該五個(gè)實(shí)驗(yàn)組同時(shí)設(shè)對(duì)照組(只加入DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液)，以調(diào)零。在37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h,用移液槍將96孔培養(yǎng)板中的液體吸凈,然后每孔加入30 μ I濃度為lmg/ml的MTT溶液，置37°C，5%C02的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清，每孔加入二甲亞砜(DMSO) 150 μ 1，置搖床搖勻30min，用酶標(biāo)儀在492nm下檢測(cè)每孔吸光度(A)值，然后用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，具體如圖8所示。由圖8可以看出脂質(zhì)體包裹的神經(jīng)酰胺和吉西他濱聯(lián)合用藥后能更高效的促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞死亡。脂質(zhì)體包裹的神經(jīng)酰胺只需I μ g/ml就可達(dá)到游離神經(jīng)酰胺10 μ g/ml的效果，而同等低濃度的游離態(tài)神經(jīng)酰胺對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的癌細(xì)胞死亡幾乎無影響(圖8)。提示脂質(zhì)體能有效促進(jìn)神經(jīng)酰胺進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，低濃度(游離濃度的10%)脂質(zhì)體神經(jīng)酰胺能
大幅增加吉西他濱對(duì)胰腺癌的化療敏感性。
權(quán)利要求
1.神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體，包括治療有效量的活性成分和類脂雙分子層薄膜，其特征在于所述活性成分的重量份為0. 5-20份，活性成分為神經(jīng)酰胺；所述類脂雙分子層薄膜的重量份為10-350份，包括下述重量份的組分磷脂類物質(zhì)5-100份，膽固醇0. 5-10份，表面活性劑0-100份，附加劑0-20份，有機(jī)溶劑0. 5-10份。
2.如權(quán)利要求I所述的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體，其特征在于所述的磷脂類物質(zhì)選自二月桂酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰甘油、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、二棕櫚酰磷脂酸、二油酰磷脂酰膽堿、二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰、二油酰磷脂酰乙醇胺、大豆卵磷脂、蛋黃卵磷月旨、腦磷脂、合成磷脂、氫化大豆卵磷脂中的一種或幾種；所述膽固醇選用以蛋黃、動(dòng)物腦髓、羊毛脂為原料生產(chǎn)的天然膽固醇；所述表面活性劑選自脫氧膽酸鹽、膽酸鹽、脫氧膽酸、膽酸、吐溫-80、?；悄懰猁}、泊洛沙姆中的一種或幾種的組合物；所述有機(jī)溶劑選自乙醇、丙酮、甲醇、氯仿、乙醚、異丙醇中的一種或幾種的混合物；所述附加劑選自L-異亮氨酸、蘋果酸、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸氫鈉、維生素C、維生素E、沒食子酸丙酯、反丁烯二酸、L-半胱氨酸或PH緩沖劑磷酸鹽、EDTA中的一種或幾種。
3.如權(quán)利要求I所述的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體，其特征在于所述神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體加入長(zhǎng)循環(huán)輔料，進(jìn)行表面修飾制成長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體，所述長(zhǎng)循環(huán)輔料長(zhǎng)循環(huán)輔料與磷脂類物質(zhì)的摩爾比為1:10-1:200 ;所述長(zhǎng)循環(huán)輔料選自聚乙二醇-磷脂衍生物、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基聚唑啉、聚乙二醇-二棕櫚酰磷脂酰膽堿、聚乙二醇-二硬脂?；字Ｒ掖及贰ぞ厶腔蚓垡蚁┐?。
4.如權(quán)利要求I所述的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體，其特征在于所述神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體加入磁性修飾材料，進(jìn)行表面修飾制成磁性脂質(zhì)體；所述磁性修飾材料為超細(xì)磁粉。
5.如權(quán)利要求I所述的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體，其特征在于所述神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體加入熱敏輔助材料，進(jìn)行表面修飾制成熱敏脂質(zhì)體；所述熱敏輔助材料是本身具有熱敏性的磷脂，包括二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC )、二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC );或是高分子熱敏聚合物，包括聚丙烯酸、聚磷脂酸；或是一種能夠使脂質(zhì)體的相變溫度適合于腫瘤熱療溫度的油性藥物，包括欖香烯或野鴨子油。
6.如權(quán)利要求I所述的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體，其特征在于所述神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體分散相的平均粒徑小于500nm ;所述神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體以注射液或固體粉劑的形式存在；所述神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體包封率大于80%。
7.神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟將神經(jīng)酰胺、磷脂類物質(zhì)、膽固醇和附加劑充分溶解在有機(jī)溶劑中，將表面活性劑溶解在分散介質(zhì)中，采用薄膜分散法或有機(jī)溶劑注入法制得神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體，然后采用超聲、高壓均質(zhì)或擠出的方法將制得的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體的平均粒徑降低至500nm以下且均勻分布。
8.如權(quán)利要求7所述的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于所述分散介質(zhì)為Tris緩沖液、水、磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、5%葡萄糖水溶液或0. 9%NaCl溶液；所述分散介質(zhì)中的表面活性劑的重量濃度為1%_30%。
9.如權(quán)利要求7所述的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于在制得的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體中添加凍干粉保護(hù)劑，通過噴霧干燥或冷凍干燥工藝制成凍干粉；所述凍干粉保護(hù)劑選自甘露醇、蔗糖、海藻糖、氯化鈉、葡萄糖、右旋糖酐、甘氨酸、乳糖、山梨醇、木糖醇、果糖、甘油、阿拉伯膠和賴氨酸中的一種或幾種；凍干粉保護(hù)劑神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體的重量份數(shù)配比為 10-20 :0. 5-6. O。
10.權(quán)利要求f 6任一項(xiàng)所述的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體在制備抗腫瘤藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體及其制備方法和用途。所述神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體包括治療有效量的活性成分和類脂雙分子層薄膜，其特征在于所述活性成分的重量份為0.5-20份，活性成分為神經(jīng)酰胺；所述類脂雙分子層薄膜的重量份為10-350份，包括下述重量份的組分磷脂類物質(zhì)5-100份，膽固醇0.5-10份，表面活性劑0-100份，附加劑0-20份，有機(jī)溶劑0.5-10份。所述制備方法是將神經(jīng)酰胺、磷脂類物質(zhì)、膽固醇和附加劑充分溶解在有機(jī)溶劑中，將表面活性劑溶解在分散介質(zhì)中，制得神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體，然后將制得的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體的平均粒徑降低至500nm以下且均勻分布。本發(fā)明還公開該神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體在腫瘤治療中的新用途。
文檔編號(hào)A61K31/164GK102805730SQ20121006646
公開日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2012年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月14日
發(fā)明者陸培華, 曹聰, 李晨, 陳敏斌 申請(qǐng)人:陸培華, 曹聰