專利名稱：用于兔子皮膚移植后免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)的試劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)用配置品，具體涉及用于兔子皮膚移植后免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)的試劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
器官移植后必需應(yīng)用免疫抑制劑防止急性排斥反應(yīng)的發(fā)生，免疫抑制劑通過(guò)抑制 T細(xì)胞和B細(xì)胞等靶細(xì)胞的細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子合成而起作用。但是目前仍然無(wú)法區(qū)分移植抗原引起的免疫排斥反應(yīng)和病毒細(xì)菌感染引起的免疫反應(yīng)。理想的免疫抑制治療應(yīng)該在免疫抑制和保持免疫力間取得平衡，因此對(duì)于臨床醫(yī)生來(lái)說(shuō)移植患者管理是一件很困難的事。保存受體免疫力，盡可能減小免疫抑制劑用量或誘導(dǎo)免疫耐受一直是移植免疫學(xué)家的主要目標(biāo)，因此移植后免疫監(jiān)測(cè)至關(guān)重要。目前臨床常用受體免疫狀態(tài)的監(jiān)測(cè)的方式仍然是臨床癥狀評(píng)估結(jié)合移植物活檢。 但是，活組織病理檢查對(duì)移植物和宿主均是一種損傷性檢查，不能重復(fù)進(jìn)行，不能完全反應(yīng)移植器官的免疫狀態(tài)，而且當(dāng)病理檢查已出現(xiàn)排斥反應(yīng)時(shí)，移植排斥已經(jīng)發(fā)生，因此病理檢查有其固有的局限性。除了病理檢查，常用的免疫監(jiān)測(cè)方法有外周血T細(xì)胞計(jì)數(shù)、殺傷細(xì)胞CTL和NK細(xì)胞活性測(cè)定、MHC分子檢測(cè)、細(xì)胞因子測(cè)定、Perforin、顆粒酶B、⑶40L和FasL的測(cè)定、循環(huán)抗體檢測(cè)等。由于免疫反應(yīng)的復(fù)雜性，上述免疫學(xué)檢測(cè)方法的均有其局限性，依靠單一免疫指標(biāo)來(lái)評(píng)估機(jī)體的免疫狀態(tài)不太現(xiàn)實(shí)，臨床上衡量器官移植后排斥反應(yīng)及免疫抑制治療的效能主要通過(guò)排斥反應(yīng)的發(fā)生情況(病理活檢)和移植物功能情況，如腎移植時(shí)肝腎毒性的發(fā)生情況，肝移植時(shí)肝功能情況(血Cr、ALT等)來(lái)進(jìn)行評(píng)估。病理診斷目前仍然是診斷排斥反應(yīng)的金標(biāo)準(zhǔn)，但是移植物活組織病理檢查也有其局限性一、活檢組織檢測(cè)是一種損傷性檢查方法，對(duì)移植物的正常存活有一定的影響，不能反復(fù)采取樣本，另外，采取樣本過(guò)少又會(huì)影響病理切片讀片的正確性；二、活檢組織病理學(xué)檢查是非定量性指標(biāo)，影響其臨床診斷的準(zhǔn)確性，病理學(xué)檢查容易受讀片者的主觀因素及技術(shù)水平的影響，產(chǎn)生偏倚，缺乏客觀性； 三、病理切片檢查無(wú)法對(duì)浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞做功能性評(píng)判，不利于排斥反應(yīng)的早期診斷.在排斥反應(yīng)發(fā)生的早期或移植物失功能的受者，甚至臨床上表現(xiàn)為穩(wěn)定型的受者，病理活檢切片都可看到大量T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，或僅表現(xiàn)為斑點(diǎn)性T細(xì)胞浸潤(rùn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供用于兔子皮膚移植后免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)的試劑及其制備方法。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案為
用于兔子皮膚移植后免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)的試劑，該試劑是經(jīng)CFSE染色的兩種同品系的兔脾細(xì)胞的PBS懸液，兩種兔脾細(xì)胞的總濃度為(5 7) X IO7個(gè)/mL，二者的比例為I :1， 其中，兩種兔脾細(xì)胞分別來(lái)自經(jīng)過(guò)異體皮膚移植后的供體和受體，染色后的陽(yáng)性細(xì)胞比例≥95%，活細(xì)胞比例≥彡95%。優(yōu)選的，供體為雌性兔子。優(yōu)選的，受體為雄性兔子。上述的用于兔子皮膚移植后免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)的試劑的制備方法，包括如下步驟
1)取同品系的雌性兔子和雄性兔子分別為供體和受體，進(jìn)行異體皮膚移植；
2)異體皮膚移植后第10 13天切除供體和受體的脾臟，分別制成供體脾細(xì)胞的PBS 懸液和受體脾細(xì)胞的PBS懸液；
3)往供體脾細(xì)胞的PBS懸液中加入6μM CFSE，往受體脾細(xì)胞的PBS懸液中加入
O.24 μ M CFSE，然后在溫度為37°C下孵育染色；
4)染色后，將供體脾細(xì)胞和受體脾細(xì)胞用PBS洗滌后，按細(xì)胞數(shù)I: I的比例混合，用 PBS調(diào)整細(xì)胞總濃度為(5 7) X IO7個(gè)/mL，得用于兔子皮膚移植后免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)的試劑。優(yōu)選的,雌性兔子為雌性大白兔。優(yōu)選的，雄性兔子為雄性大白兔。優(yōu)選的，孵育染色時(shí)間為15 20 min。本發(fā)明中所述的CFSE為羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯。本發(fā)明所述的細(xì)胞來(lái)源于經(jīng)過(guò)異體皮膚移植后的供體和受體的脾細(xì)胞，供體細(xì)胞與移植物同基因，抗原性與移植物完全相同，能被因移植產(chǎn)生的免疫反應(yīng)特異性殺傷，全面、準(zhǔn)確地反映移植物所受的免疫攻擊；受體細(xì)胞與進(jìn)行皮膚移植的兔同基因，作為免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)的內(nèi)參，用于消除由于細(xì)胞破碎、死亡、歸巢等一系列細(xì)胞在體外染色處理及體內(nèi)自然死亡等非特異生損失帶來(lái)的誤差。本發(fā)明所述的細(xì)胞取自兔異體皮膚移植后第10 13天的供體和受體細(xì)胞，皮膚移植后體內(nèi)的免疫環(huán)境會(huì)發(fā)生復(fù)雜的變化，而異體皮膚移植后第10 13天會(huì)出現(xiàn)排斥反應(yīng)，取此階段的細(xì)胞用于監(jiān)測(cè)兔子皮膚移植后免疫狀態(tài)，更真實(shí)，更準(zhǔn)備。本發(fā)明用于兔子皮膚移植后免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)的試劑的監(jiān)測(cè)方法，包括如下步驟
1)將本發(fā)明的用于兔子皮膚移植后免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)的試劑通過(guò)耳緣靜脈注射到皮膚移植后的兔子體內(nèi)，注射到皮膚移植的兔子體內(nèi)的試劑含有細(xì)胞總數(shù)為(I 1.4) XlO9個(gè)；
2)注射后第8h，將兔子進(jìn)行耳緣靜脈取血，血液進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)，得出外周血兩種陽(yáng)性細(xì)胞比率；
3)計(jì)算殺傷率，根據(jù)殺傷率判斷兔子皮膚移植后的免疫狀態(tài)，若注射后第8h，殺傷率 ^ 80%，就可以判斷為受體兔對(duì)移植物處于免疫排斥狀態(tài)。本發(fā)明所述兔的免疫狀態(tài)指受體對(duì)移植物的排斥程度，即試劑中的異體(供體) 脾臟細(xì)胞被受體排斥的程度。本發(fā)明的監(jiān)測(cè)方法，殺傷率越高，則移植排斥越強(qiáng)，本發(fā)明的監(jiān)測(cè)方法的判斷原則為用于兔子皮膚移植后免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)的試劑注射后第8h，殺傷率 ^ 80%，就可以判斷為受體兔對(duì)移植物處于免疫排斥狀態(tài)。本發(fā)明的有益效果是
本發(fā)明用于兔子皮膚移植后免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)的試劑，能快速、直觀、準(zhǔn)確的監(jiān)測(cè)移植手術(shù)后兔的免疫狀態(tài)。本發(fā)明的試劑直接注射于皮膚移植后的兔子體內(nèi)，不需要模擬體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境，通過(guò)測(cè)試細(xì)胞的特異性損失來(lái)反映免疫狀態(tài)，監(jiān)測(cè)結(jié)果更全面、準(zhǔn)確，首次在大動(dòng)物中證明了本發(fā)明試劑能有效地檢測(cè)兔子皮膚移植后免疫狀態(tài)。


圖I為本發(fā)明試劑用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的技術(shù)流程圖2為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中各分組的殺傷率曲線圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限如此。實(shí)施例所用的供體選為雌性新西蘭大白兔，受體選為雄性新西蘭大白兔，用于免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)的兔子為雄性新西蘭大白兔，體重均為I. 9 2. 5kg，許可證號(hào)SCXK(粵)一 0015。CFSE 試劑購(gòu)自美國(guó) Molecularprobes 公司。實(shí)施例I
用于兔子皮膚移植后免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)的試劑，該試劑是經(jīng)CFSE染色的兩種兔脾細(xì)胞的 PBS懸液，兩種兔脾細(xì)胞的總濃度為6X IO7個(gè)/mL，二者的比例為I :1，其中，兩種兔脾細(xì)胞分別來(lái)自經(jīng)過(guò)異體皮膚移植后的供體和受體，染色后在熒光顯微鏡下觀察，陽(yáng)性細(xì)胞比例為95%，并用錐蟲(chóng)藍(lán)溶液檢測(cè)細(xì)胞活性，活細(xì)胞比例為96%。上述的用于兔子皮膚移植后免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)的試劑的制備方法，包括如下步驟
1)按照隨機(jī)配對(duì)的原則，取雌性大白兔和雄性大白兔分別為供體和受體，進(jìn)行異體皮膚移植；
2)異體皮膚移植后第12天，手術(shù)切除供體(雌性大白兔)和受體(雄性大白兔)的脾臟， 脾臟切除后逐層縫合關(guān)閉腹腔，予紗布覆蓋，術(shù)后予輸液及青霉素8萬(wàn)單位/kg治療；
3)脾臟切除后立即用200目不銹鋼網(wǎng)研磨法制備脾細(xì)胞懸液，7.5 g/L氯化銨裂解紅細(xì)胞，O. 01mol/L PBS稀釋分別制備供體和受體單個(gè)脾細(xì)胞懸液；
4)受體脾細(xì)胞懸液用O.24 μ M CFSE染色，供體脾細(xì)胞用6 μ M高濃度CFSE染色，染色孵育溫度為37°C，時(shí)間15 min ；
5)染色后，將供體脾細(xì)胞和受體脾細(xì)胞用PBS洗滌一次，然后按細(xì)胞數(shù)I: I的比例混合兩種細(xì)胞，并用PBS調(diào)整細(xì)胞總濃度為6X IO7個(gè)/mL，得混合脾細(xì)胞懸液，即本發(fā)明免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)的試劑。實(shí)施例2
用于兔子皮膚移植后免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)的試劑，該試劑是經(jīng)CFSE染色的兩種兔脾細(xì)胞的 PBS懸液，兩種兔脾細(xì)胞的總濃度為5X IO7個(gè)/mL，二者的比例為I :1，其中，兩種兔脾細(xì)胞分別來(lái)自經(jīng)過(guò)異體皮膚移植后的供體和受體，染色后在熒光顯微鏡下觀察，陽(yáng)性細(xì)胞比例為97%，并用錐蟲(chóng)藍(lán)溶液檢測(cè)細(xì)胞活性，活細(xì)胞比例為95%。上述的用于兔子皮膚移植后免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)的試劑的制備方法，包括如下步驟
1)按照隨機(jī)配對(duì)的原則，取雌性大白兔和雄性大白兔分別為供體和受體，進(jìn)行異體皮膚移植；
2)異體皮膚移植后第10天，手術(shù)切除供體(雌性大白兔)和受體(雄性大白兔)的脾臟， 脾臟切除后逐層縫合關(guān)閉腹腔，予紗布覆蓋，術(shù)后予輸液及青霉素8萬(wàn)單位/kg治療；
3)脾臟切除后立即用200目不銹鋼網(wǎng)研磨法制備脾細(xì)胞懸液，7.5 g/L氯化銨裂解紅細(xì)胞，O. 01mol/L PBS稀釋分別制備供體和受體單個(gè)脾細(xì)胞懸液；
4)受體脾細(xì)胞懸液用O.24 μ M CFSE染色，供體脾細(xì)胞用6 μ M高濃度CFSE染色，染色孵育溫度為37 °C，時(shí)間18 min ；
5)染色后，將供體脾細(xì)胞和受體脾細(xì)胞用PBS洗滌一次，然后按細(xì)胞數(shù)I: I的比例混合兩種染色后的細(xì)胞，并用PBS調(diào)整細(xì)胞總濃度為5 X IO7個(gè)/mL，得混合脾細(xì)胞懸液，即本發(fā)明免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)的試劑。實(shí)施例3
用于兔子皮膚移植后免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)的試劑，該試劑是經(jīng)CFSE染色的兩種兔脾細(xì)胞的 PBS懸液，兩種兔脾細(xì)胞的總濃度為7X IO7個(gè)/mL，二者的比例為I :1，其中，兩種兔脾細(xì)胞分別來(lái)自經(jīng)過(guò)異體皮膚移植后的供體和受體，染色后在熒光顯微鏡下觀察，陽(yáng)性細(xì)胞比例為96%，并用錐蟲(chóng)藍(lán)溶液檢測(cè)細(xì)胞活性，活細(xì)胞比例為97%。上述的用于兔子皮膚移植后免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)的試劑的制備方法，包括如下步驟
1)按照隨機(jī)配對(duì)的原則，取雌性大白兔和雄性大白兔分別為供體和受體，進(jìn)行異體皮膚移植；
2)異體皮膚移植后第13天，手術(shù)切除供體(雌性大白兔)和受體的脾臟，脾臟切除后逐層縫合關(guān)閉腹腔，予紗布覆蓋，術(shù)后予輸液及青霉素8萬(wàn)單位/kg治療；
3)脾臟切除后立即用200目不銹鋼網(wǎng)研磨法制備脾細(xì)胞懸液，7.5 g/L氯化銨裂解紅細(xì)胞，O. 01mol/L PBS稀釋分別制備供體和受體單個(gè)脾細(xì)胞懸液；
4)受體脾細(xì)胞懸液用O.24 μ M CFSE染色，供體脾細(xì)胞用6 μ M高濃度CFSE染色，染色孵育溫度為37°C，時(shí)間20 min ；
5)染色后，將供體脾細(xì)胞和受體脾細(xì)胞用PBS洗滌一次，然后按細(xì)胞數(shù)I: I的比例混合兩種染色后的細(xì)胞，并用PBS調(diào)整細(xì)胞總濃度為7 X IO7個(gè)/mL，得混合脾細(xì)胞懸液，即本發(fā)明免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)的試劑。上述異體皮膚移植的方法如下取約3X3cm大小供體新西蘭大白兔背部皮膚，用眼科剪將皮下組織修剪干凈，并將受體大白兔背部用手術(shù)刀切除一塊同樣大小的皮膚，保留皮下組織，然后將供體皮片用5-0無(wú)創(chuàng)縫合線固定在受體小鼠背部，用紗布包扎傷口，膠布固定，松緊適度，并將供體傷口消毒并包扎。下面通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明所述的試劑能有效地檢測(cè)兔子皮膚移植后免疫狀態(tài)，本實(shí)驗(yàn)的技術(shù)流程圖參見(jiàn)圖I。I.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
選擇雌性新西蘭大白兔，L 9 2. 5kg，作為供體(許可證號(hào)SCXK (粵)一 0015);選擇雄性新西蘭大白兔，L 9 2. 5kg，作為受體(許可證號(hào)SCXK (粵)一 0015);上述動(dòng)物及制備本發(fā)明試劑所用的動(dòng)物均購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，所有的動(dòng)物都受到了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所應(yīng)有的待遇，而且實(shí)驗(yàn)程序經(jīng)過(guò)了當(dāng)?shù)貏?dòng)物保護(hù)與研究機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)。2.實(shí)驗(yàn)分組
實(shí)驗(yàn)共分為5組(n=5)，A組異體移植排斥組出組自體皮膚移植組；(組未移植組； D組異體移植免疫抑制劑低劑量組；E組異體移植免疫抑制劑高劑量組。3.皮膚移植模型的建立
根據(jù)分組需要建立兩組皮膚移植模型，以雌性新西蘭大白兔為供體，雄性新西蘭大白兔為受體建立異體皮膚移植模型；以雄性新西蘭大白兔建立自體皮膚移植模型。A、B、C三組為異體皮膚移植模型，E組為自體皮膚移植模型，D組相當(dāng)于空白對(duì)照組，該組均為雄性新西蘭大白兔。異體皮膚移植模型的構(gòu)建參見(jiàn)上述的異體皮膚移植方法；自體皮膚移植模型的構(gòu)建與上述的異體皮膚移植方法基本相同，區(qū)別在于供體和受體都為同一雄性大白兔。D組(異體移植免疫抑制劑低劑量組)受體給予2mg/kg環(huán)孢素A (CsA)，靜脈注射，受體在移植前8小時(shí)用一次，以后每日一次；
E組(異體移植免疫抑制劑高劑量組):受體給予15mg/kg環(huán)孢素A (CsA)，靜脈注射，受體在移植前8小時(shí)用一次，以后每日一次。4.采用實(shí)施例I的免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)試劑輸注
1)將各組的雄性大白兔(受體)固定；
2)將大白兔的耳緣用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇消毒；
3)用4號(hào)頭皮針穿刺耳緣靜脈成功后注射實(shí)施例I的免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)試劑，用量20mL/ 只，每只雄性大白兔注射的混合脾細(xì)胞數(shù)為I. 2X109個(gè)。5.標(biāo)本采集及流式
每組皮膚移殖后的雄性大白兔，在本發(fā)明免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)試劑輸注后第lh、2h、4h、8h，經(jīng)耳緣靜脈取血進(jìn)行流式監(jiān)測(cè)外周血兩種陽(yáng)性細(xì)胞比率，即供體脾細(xì)胞數(shù)/受體供體脾細(xì)胞數(shù)。每次約200 μ L，用紅細(xì)胞裂解液(BD公司，美國(guó))在室溫下裂解紅細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌3 次后流式細(xì)胞儀(BD公司，美國(guó))檢測(cè)，選定淋巴細(xì)胞分析為分析對(duì)象，每份標(biāo)本測(cè)定約IO5 個(gè)細(xì)胞。6.計(jì)算殺傷率
試劑注射到兔子體內(nèi)后，由于供體細(xì)胞MHC表型的不同而受到受體的排斥，我們把注射試劑的供體細(xì)胞(異基因)被排斥的程度叫做殺傷率，按以下公式進(jìn)行計(jì)算
殺傷率(R) =1 一供體脾細(xì)胞數(shù)/受體脾細(xì)胞數(shù)X 100%。7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 13. O軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差表示(土SD),每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組間比較統(tǒng)計(jì)方法采用單向方差(F)分析。組間用Dunnett t (2-sided)法檢驗(yàn)與A組(異體移植排斥組)比較。P〈0. 05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，制作殺傷率曲線圖。各組實(shí)驗(yàn)的殺傷率結(jié)果見(jiàn)表1，殺傷率曲線圖見(jiàn)圖2。判斷標(biāo)準(zhǔn)注射試劑后第 8h，殺傷率> 80%，可判定為移植排斥反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.用于兔子皮膚移植后免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)的試劑，該試劑是經(jīng)CFSE染色的兩種同品系的兔脾細(xì)胞的PBS懸液，兩種兔脾細(xì)胞的總濃度為(5 7) X IO7個(gè)/mL，二者的比例為I :1， 其中，兩種兔脾細(xì)胞分別來(lái)自經(jīng)過(guò)異體皮膚移植后的供體和受體，染色后的陽(yáng)性細(xì)胞比例彡95%，活細(xì)胞比例彡95%。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于兔子皮膚移植后免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)的試劑，其特征在于供體為雌性兔子。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于兔子皮膚移植后免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)的試劑，其特征在于受體為雄性兔子。
4.如權(quán)利要求I 3任一項(xiàng)所述的用于兔子皮膚移植后免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)的試劑的制備方法，包括如下步驟1)取同品系的雌性兔子和雄性兔子分別為供體和受體，進(jìn)行異體皮膚移植；2)異體皮膚移植后第10 13天切除供體和受體的脾臟，分別制成供體脾細(xì)胞的PBS 懸液和受體脾細(xì)胞的PBS懸液；3)往供體脾細(xì)胞的PBS懸液中加入6 μ M CFSE,往受體脾細(xì)胞的PBS懸液中加入O.24 μ M CFSE，然后在溫度為37°C下孵育染色；4)染色后，將供體脾細(xì)胞和受體脾細(xì)胞用PBS洗滌后，按細(xì)胞數(shù)I: I的比例混合， 用PBS調(diào)整細(xì)胞總濃度為(5 7) X IO7個(gè)/mL，得用于兔子皮膚移植后免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)的試劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于兔子皮膚移植后免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)的試劑的制備方法，其特征在于雌性兔子為雌性大白兔。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于兔子皮膚移植后免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)的試劑的制備方法，其特征在于雄性兔子為雄性大白兔。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于兔子皮膚移植后免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)的試劑的制備方法，其特征在于孵育染色時(shí)間為15 20 min。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了用于兔子皮膚移植后免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)的試劑及其制備方法，該試劑是經(jīng)CFSE染色的兩種兔脾細(xì)胞的PBS懸液，兩種兔脾細(xì)胞的總濃度為(5～7)×107個(gè)/mL，二者的比例為1∶1，其中，兩種兔脾細(xì)胞分別來(lái)自經(jīng)過(guò)異體皮膚移植后的供體和受體，染色后的陽(yáng)性細(xì)胞比例≥95%，活細(xì)胞比例≥95%。本發(fā)明能快速、直觀、準(zhǔn)確的監(jiān)測(cè)移植手術(shù)后兔的免疫狀態(tài)。本發(fā)明的試劑直接注射于皮膚移植后的兔子體內(nèi)，不需要模擬體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境，通過(guò)測(cè)試細(xì)胞的特異性損失來(lái)反映免疫狀態(tài)，監(jiān)測(cè)結(jié)果更全面、準(zhǔn)確。
文檔編號(hào)A61K49/00GK102580119SQ20121001393
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月17日
發(fā)明者潘明新, 蔣澤生, 鐘利民, 高毅 申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院