抗流感病毒中和抗體及其篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種抗流感病毒抗體，并提供了生產(chǎn)它的方法，和用于確定受試對象是否攜帶該中和抗體的檢測方法。所述抗體即使是在根據(jù)血凝素氨基酸的保守性而分類的兩組流感病毒之間，也超越組間的障礙而具有中和活性。
【專利說明】抗流感病毒中和抗體及其篩選方法
[【技術領域】]
[0001]本發(fā)明涉及一種抗流感病毒抗體，其超越了亞型之間的障礙，對所有流感病毒均顯示普遍的中和活性，并涉及生產(chǎn)該抗體的方法和用于檢測受試對象中該抗體的方法。
[【背景技術】]
[0002]流感病毒是一種RNA包膜病毒，顆粒直徑為大約lOOnm，屬于正粘病毒科。根據(jù)其內(nèi)在蛋白的抗原性可以分成3型:甲型(A型)、乙型(B型)和丙型(C型)。流感病毒由被具有脂質(zhì)雙層結構的病毒包膜所包圍的內(nèi)部核衣殼或者與核蛋白會合的核糖核酸(RNA)核心，以及外部糖蛋白構成。病毒包膜的內(nèi)層主要由基質(zhì)蛋白形成,而外層大多由宿主來源的脂質(zhì)形成。流感病毒的RNA呈現(xiàn)分節(jié)結構(segmentary structure)。全球范圍內(nèi)蔓延的流感是由甲型流感病毒導致的。甲型病毒具有血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)這兩種包膜糖蛋白。根據(jù)抗原性不同，HA分為16種亞型，而NA可分成9種亞型。
[0003]近年來，高致病性的H5N1型禽流感病毒在全球猛烈蔓延；這樣的狀況，即使什么時候出現(xiàn)了人感染人的新型病毒，并引起大流行，也不會令人感到奇怪。為了應對這種情況，全球病毒檢測系統(tǒng)正在被加強，大量儲備達菲(Tamiflu)等治療藥物，疫苗的開發(fā)、生產(chǎn)和大量儲備也正在進行。然而，情況是許多問題依然未被闡明，包括這樣的病毒何時以及以什么形式出現(xiàn)，那時達菲等是否有治療效果，所開發(fā)的疫苗是否有效，何時以及向誰接種，何時開始高預警狀態(tài)以及何時宣告解除該狀態(tài)。這是因為，我們要迎來要針對尚未出現(xiàn)的病原菌和病毒來準備疫苗和治療藥物這樣的人類從未經(jīng)歷過的情況。特別地，疫苗開發(fā)因為如下事實而存在問題，即流感病毒基因組中，每年會在血凝素基因中導入很多突變，導致抗原漂移(抗原性改變)，這被認為是疫情流行的原因所在。因此，接種與正在流行的型不匹配的疫苗不具有預期的預防效果。之所以不嘗試開發(fā)流感病毒的抗體治療藥物(預防藥物)的原因即在于，擔心在開發(fā)期間本來可以被中和的病毒通過抗原漂移改變其特征，而導致通過巨大努力開發(fā)的藥物不再.有用。
[0004]本發(fā)明人們針對在1968-2004年間分離的12個H3N2型流感病毒株，篩選了由采集自單個個體的大量B淋巴細胞制作的噬菌體展示人抗體文庫，結果發(fā)現(xiàn)，大部分顯示中和活性的克隆是抗血凝素抗體，并且它們可以被粗略分為三組:特異性中和在1968-1973年間分離的病毒株的抗體，特異性中和在1977-1993年間分離的病毒株的抗體，或特異性中和在1997-2003年間分離的病毒株的抗體(非專利文獻I)。盡管這一發(fā)現(xiàn)打破了傳統(tǒng)的開發(fā)用于流感病毒的抗體治療藥物(預防藥物)沒有意義的普遍認識，但是迄今為止噬菌體抗體文庫尚未被嚴肅地加以研究，因為重鏈和輕鏈的組合不一定反應生物體內(nèi)情況等原因。
[0005]在這種狀況下，三個研究組獨立地成功分離了可以中和H5型流感病毒的人單克隆抗體(專利文獻I和2，非專利文獻2-4)。這些抗體不僅對H5型流感病毒，而且對其它亞型(例如Hl型等)也具有中和活性。然而，盡管根據(jù)表位可以將血凝素的16種亞型(H1-H16)分成兩個大組(組I和2)，這些抗體僅對其中的組I (例如Hl，H2, H5, H6, H8, H9型等)顯示中和活性，對屬于組2的流感病毒(例如H3和H7型等)不顯示中和活性。也就是說，可超越基于血凝素的序列而劃分的兩個組之間的障礙，發(fā)揮廣泛的中和活性的抗流感病毒抗體，至今尚沒有分離、報告。
[0006]X-射線結構分析顯示了這些抗體與血凝素的結合模式，可以顯見，血凝素的38位氨基酸在組2的H3和H7型中變成了天冬酰胺，經(jīng)歷N型糖鏈修飾(非專利文獻4和5)。而且，已有報道，H5的38位引入N型糖鏈修飾位點，會導致中和抗體的結合能力下降70% (非專利文獻5)。還已知，當在血凝素中產(chǎn)生了突變的流感病毒逃離中和抗體時，這些突變主要集中在據(jù)報道含有中和表位的血凝素基因內(nèi)的5個區(qū)域(A、B、C、D和E區(qū))(非專利文獻6和7)。這些發(fā)現(xiàn)提示，獲得可以超越兩組之間障礙的中和抗體是很困難的。
[0007][現(xiàn)有技術文獻]
[0008][專利文獻]
[0009][專利文獻1]冊2007/1:34327
[0010][專利文獻2]冊2008/028946
[0011][非專利文獻]
[0012][非專利文獻 I] Virology Vol.397，pp.322-330，2010
[0013][非專利文獻 2]Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.，Vol.105，pp.5986-5991，2008
[0014][非專利文獻 3]PLoS ONE, Vol.3，pp.5986-5991，e3942, 2008
[0015][非專 利文 獻 4] Nature Structural&MolecularBiology, Vol.16, pp.265-273，2009
[0016][非專利文獻 5] Science, Vol.324, pp.246-251，2009
[0017][非專利文獻6]Nature, Vol.289，pp.373-378，1981
[0018][非專利文獻 7] J.Gen.Virol.,Vol.62，pp.153-169，1982
[發(fā)明概要]
[0019][本發(fā)明所要解決的問題]
[0020]在準備應對預計在不久的將來發(fā)生的H5N1型流感的大流行以及隨后很可能發(fā)生的H7和H9型病毒所致的大流行中，高度需要代替預測抗原性的變化來設計疫苗這樣的傳統(tǒng)的針對流感的預防概念，開發(fā)出基于更普遍、更可靠的新概念的預防手段。
[0021 ] 因此，本發(fā)明的目的是提供抗流感病毒抗體，其發(fā)揮超越根據(jù)血凝素蛋白的氨基酸序列的保守性而分類的2組之間的障礙的中和活性，優(yōu)選的是提供對H1-H16型的所有的亞型的流感病毒均具有中和活性的抗體，并提供制備該抗體的方法。此外，本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測方法，其能夠簡單地并且相對廉價地考察受試對象是否攜帶上述通用的中和抗體。
[0022][解決問題的方法]
[0023]本發(fā)明人使用單采血液成分術(apheresis)(分離采集血液中的一種組分),從單個個體采集了 IO9個這樣大量的B淋巴細胞，制作了反映幾乎全部抗體譜的噬菌體展示人抗體文庫，使用已滅活的H3N2流感病毒作為抗原,通過淘選法(panning method),網(wǎng)羅性地篩選了結合該抗原的抗體克隆。從選出的噬菌體回收抗體，測試其對屬于組2的H3型流感病毒和屬于組I的Hl型、H2型和H5型流感病毒的中和活性。結果，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，成功獲得了 40個以上的克隆的下述抗體，所述抗體不僅對用作篩選抗原的H3型顯示中和活性，而且對屬于和H3型所屬不同組的Hl型、H2型和H5型流感病毒，也顯示中和活性。這些克隆具有6種不同的重鏈可變域(VH)氨基酸序列，但對所有這些序列進行了 IgBLAST檢索,結果判斷出它們?nèi)繉儆赩H1-69種系(germline)。而且,IgBLAST檢索顯示,這6種克隆所具有的輕鏈可變域(VL)限定為3種種系。
[0024]考慮到先前報道的針對H5型的中和抗體是利用VH1-69或者相似的VHl_e，以及X-射線結構分析所顯示的該中和抗體與血凝素的結合模式，本發(fā)明人所獲得的抗體能夠中和H3型流感病毒是非常令人意外的事情。然而，本發(fā)明人想到，在檢索可以中和與抗原所屬不同組的病毒亞型的抗體時，通過徹底性地篩選與某種作為抗原的亞型相互反應的抗體，可能獲得能夠超越組間障礙、中和所有流感病毒亞型的抗體。因此，本發(fā)明人從ー個個體采集了 IO9個B淋巴細胞，比傳統(tǒng)慣例大兩個數(shù)量級,并生成了幾乎完全反映供體抗體譜的人抗體文庫，網(wǎng)羅性地篩選可以結合H3型流感病毒的抗體克隆，并檢查其對Hl型、H2型和H5型流感病毒的中和活性，從而首次成功分離了能夠既中和組I又中和組2中流感病毒的抗體。
[0025]分析所得中和抗體的氨基酸序列顯示，所有中和抗體均使用VH1-69基因作為重鏈可變域V區(qū)。值得注意的是，與其它克隆相比，對組I中流感病毒的中和活性比其他克隆高的克隆，在重鏈可變域V區(qū)中被發(fā)現(xiàn)具有ー個氨基酸缺失。因為抗體產(chǎn)生細胞在生長和分化刺激下轉(zhuǎn)化(抗體成熟)的過程，伴隨著編碼重鏈和輕鏈的DNA雙鏈中的一條鏈被切割，并且在經(jīng)常會導致錯誤的DNA聚合酶修復該切割的過程中引入了突變，所以生成的突變幾乎都是基于單堿基取代的氨基酸替換。因此，缺失一個氨基酸(3個堿基)的頻率極低；即使發(fā)生這種缺失，由于幾乎都是具有壞的影響，其刺激生產(chǎn)該抗體的B細胞，進而在機體內(nèi)作為記憶細胞長時間存在的機制啟動的可能性進ー步降低?？紤]到相關技術常識，如下的發(fā)現(xiàn)是令人驚訝的，即由于在除了 CDR3之外的重鏈可變域內(nèi)的一個氨基酸的缺失，導致本來主要中和組2的流感病毒的抗體獲得了也可以強カ中和屬于組I的流感病毒的活性。
[0026]本發(fā)明人根據(jù)這些 發(fā)現(xiàn)進行了進ー步的研究，并形成了本發(fā)明。
[0027]因此，本發(fā)明提供了:
[0028][I] 一種分離抗體，其中和選自組I的至少ー種流感病毒和選自組2的至少ー種流感病毒，其中組I由Hl型、H2型、H5型、H6型、H8型、H9型、Hll型、H12型、H13型和H16型流感病毒構成，組2由H3型、H4型、H7型、HlO型、H14型和H15型流感病毒構成；
[0029][2]根據(jù)如上[I]的抗體,其中該抗體至少中和Hl型和/或H5型流感病毒，且中和H3型流感病毒；
[0030][3]根據(jù)如上[I]的抗體，其中該抗體中和Hl型-H16型流感病毒；
[0031][4]根據(jù)如上[I]的抗體，其中該重鏈可變域V區(qū)利用VH1-69或VHl-e基因；
[0032][5]根據(jù)如上[I]的抗體，其中該重鏈可變域V區(qū)具有氨基酸缺失；
[0033][6]根據(jù)如上[5]的抗體，其中由Vm-69或VHl_e基因編碼的該重鏈可變域V區(qū)中，至少具有缺失第27位甘氨酸的突變；
[0034][7]根據(jù)如上[I]的抗體，其中該輕鏈可變域V區(qū)利用VL1-44，VL1-47或VL1-51
基因;
[0035][8]根據(jù)如上[I]的抗體，其中在該抗體在轉(zhuǎn)變?yōu)镮gG型時的、在灶形成抑制試驗(focus formation inhibition test)中的最小抑制濃度為 10_n-10_12M 量級;
[0036][9]根據(jù)如上[I]的抗體，其中該抗體是人抗體；
[0037][10]根據(jù)如上[I]的抗體，其中該重鏈可變域的互補決定區(qū)I由序列號I所示氨基酸序列構成，互補決定區(qū)2由序列號2所示氨基酸序列構成；
[0038][11]根據(jù)如上[10]的抗體，其中該重鏈可變域的框架區(qū)I由序列號3所示氨基酸序列構成；
[0039][12]根據(jù)如上[I]的抗體，其中該重鏈可變域V區(qū)由序列號4-9中任一個所示的氨基酸序列構成；
[0040][13]根據(jù)如上[I]的抗體，其中該重鏈可變域由序列號10-15中任一個所示的氨基酸序列構成；
[0041][14]根據(jù)如上[I]的抗體，其中該重鏈可變域和輕鏈可變域分別由如下(a)-(l)中任一個所示的氨基酸序列構成:
[0042](a)序列號10和序列號16;
[0043](b)序列號10和序列號17;
[0044](c)序列號10和序列號18;
[0045](d)序列號10和序列號19;
[0046](e)序列號10和序列號20;
[0047](f)序列號10和序列號21;
[0048](g)序列號10和序列號22 ;
[0049](h)序列號11和序列號23;
[0050]⑴序列號13和序列號24;
[0051](j)序列號14和序列號25;
[0052](k)序列號15和序列號26;和
[0053](I)序列號12和序列號70.[0054][15] 一種用于流感的被動免疫治療劑，其含有根據(jù)如上[I]的抗體；
[0055][16] 一種用于流感的被動免疫治療方法，該方法包括向已被流感病毒感染的、或者存在被感染的可能性的哺乳類或鳥類受試對象給藥有效量的根據(jù)如上[I]的抗體；
[0056][17]根據(jù)如上[16]的方法，其中受試對象是人；
[0057][18] 一種生產(chǎn)根據(jù)如上[I]的抗體的方法，包括如下步驟:
[0058](I)提供包含抗體克隆的抗體文庫，所述抗體克隆是來自從一個個體采集到的大約IO8個以上的B細胞，
[0059](2)以Hl~H16中任一個的流感病毒、或該病毒的血凝素蛋白、或其胞外域作為抗原，使其與抗體文庫(I)接觸，網(wǎng)羅性地篩選與該抗原反應的抗體克隆，
[0060](3)由在步驟(2)中篩選到的各抗體克隆回收抗體分子，
[0061](4)針對在步驟(3)中獲得的各抗體，檢測所述抗體對選自組I的至少一種流感病毒和選自組2的至少一種流感病毒的中和活性，和
[0062](5)使用產(chǎn)生中和屬于組I的流感病毒和屬于組2的流感病毒這二者的抗體的克隆來產(chǎn)生該抗體,回收該抗體；
[0063][19]根據(jù)如上[18]的方法，其中該抗體是人抗體；[0064][20]根據(jù)如上[18]的方法，其中該抗體文庫是噬菌體展示文庫；
[0065][21]根據(jù)如上[20]的方法，其中抗體克隆的數(shù)目為IOic1-1O11 ；
[0066][22]根據(jù)如上[18]的方法，其中B細胞通過單采血液成分術(apheresis)而采集到的； [0067][23]根據(jù)如上[18]的方法，其中，在上述步驟(2)中，使用所述采集了 B細胞的個體沒有感染史的流感病毒分離株、或其血凝素蛋白、或其胞外域作為抗原；
[0068][24]根據(jù)如上[23]的方法，其中該流感病毒分離株屬于Hl、H2或H3型；
[0069][25]根據(jù)如上[23]的方法，其中，所述流感病毒分離株屬于所述采集了 B細胞的個體沒有感染史的血凝素亞型；
[0070][26]根據(jù)如上[25]的方法，其中該流感病毒分離株屬于H5、H7或H9型；
[0071][27]根據(jù)如上[18]的方法，包括在上面的步驟(4)中檢測對至少Hl型和/或H5型流感病毒和H3型流感病毒的中和活性；
[0072][28]根據(jù)如上[20]的方法，進一步包括將抗體轉(zhuǎn)變成IgG型的步驟；
[0073][29] 一種在受試對象體內(nèi)檢測根據(jù)如上[I]的抗體的方法，包括如下步驟:
[0074](I)向受試對象接種Hl型~H16型中任一項的亞型的血凝素，
[0075](2)接種后，在抗體產(chǎn)生細胞已充分地擴增時，從受試對象采集血液，和
[0076](3)考察該血液中是否存在呈遞下述抗體的抗體產(chǎn)生細胞，所述抗體結合選自組I的亞型的血凝素和選自組2的亞型的血凝素這二者，并且具有由VH1-69或VHl-e基因編碼的重鏈可變域V區(qū)；
[0077][30] 一種在受試對象體內(nèi)檢測根據(jù)如上[I]的抗體的方法，包括如下步驟:
[0078](I)向受試對象分別接種選自組I的亞型的血凝素和選自組2的亞型的血凝素，
[0079](2)各血凝素接種后，在抗體產(chǎn)生細胞已充分地擴增時，從受試對象采集血液，和
[0080](3)考察各血液中是否存在呈遞下述抗體的抗體產(chǎn)生細胞，所述抗體結合選自與所接種了的凝血素不同的組的亞型的血凝素，并且具有由VH1-69或VHl-e基因編碼的重鏈可變域V區(qū)，
[0081]等。
[0082][發(fā)明效果]
[0083]根據(jù)本發(fā)明，可以獲得具有針對所有流感病毒血凝素亞型的中和能力的人抗體。用該中和抗體進行被動免疫能夠有效預防或治療流感，甚至在抗原漂移以及抗原轉(zhuǎn)變事件下也可以預防或治療流感。本發(fā)明還能確定受試對象是否具有可以產(chǎn)生超越組間障礙、對流感病毒顯示中和活性的抗體的記憶B細胞。
[附圖簡述]
[0084]圖1-1顯示了從噬菌體展示人抗體文庫中以H3N2病毒株篩選得到的抗體，對所有12種H3N2病毒株和一種HlNl病毒株的結合活性的ELISA確定結果。
[0085]圖1-2顯示了從噬菌體展示人抗體文庫中以H3N2病毒株篩選得到的抗體，對所有12種H3N2病毒株和一種HlNl病毒株的結合活性的ELISA確定結果。
[0086]圖2顯示了在篩選以組11和組22分類的克隆時，使用哪種H3型流感病毒株作為抗原。[0087]圖3顯示了用于篩選組11中各抗體克隆的流感病毒株，以及所分離克隆的數(shù)目。
[0088]圖4顯示了組11中克隆的VH和VL的氨基酸序列，其中FR045-092的FRl區(qū)中顯示的點“.”表示缺失的氨基酸。
[0089]圖5顯示了組11中的克隆與已報道的對Hl株和H5株都顯示中和活性的抗體的重鏈可變域的氨基酸比較結果，其中FR045-092的FRl區(qū)中顯示的點“.”表示缺失的氨基酸。
[0090]圖6顯示了組11中的克隆針對H3N2流感病毒株的結合活性的ELISA確定結果。
[0091]圖7提供的Western blot圖顯示了組11中的克隆可識別H3和Hl株的HA。
[0092]圖8顯示了組11中的克隆針對H3型和Hl型流感病毒的血細胞凝聚抑制活性研
究結果。
[0093]圖9顯示了組11中的克隆針對H3型和Hl型流感病毒的灶形成抑制活性研究結果。
[0094]圖10顯示了組11中的克隆是否競爭性抑制小鼠單克隆抗體C179與H3型流感病毒的結合活性的ELISA確定結果。在存在Fab-p3抗體(F022-360，F(xiàn)026-146, F026-427, FO45-092, F005-126)和不存在(無Fab_p3)的條件下，用C179的甲型流感蘇聯(lián)型新喀里多尼亞株進行ELISA實驗，其中與甲型流感蘇聯(lián)型新喀里多尼亞株HA無反應的R)05-126用作陰性對照。
[0095]圖11顯示了小鼠單.克隆抗體C179是否競爭性抑制組11中的克隆與H3型流感病毒的結合活性的ELISA確定結果。在存在(C179(+))和不存在(C179(-))C179的條件下，確定Fab-p3抗體(F022-360，F(xiàn)026-146, F026-427, F045-092)對甲型流感蘇聯(lián)型新喀里多尼亞株的作用。
[0096]圖12顯示了圖2所示抗體克隆R)05_1269(其對H3型流感病毒株具有廣泛的株特異性)，和識別組11中H3型和Hl型流感病毒這兩者的抗體克隆，是否共有表位的ELISA 確定結果。在存在 Fab-p3 抗體(F022-360，F(xiàn)026-146, F026-427, F045-092, F005-12
6,F019-102)和不存在(無Fab-p3)的條件下，進行ELISA實驗，確定Fab-PP型R)05_126對甲型流感香港型愛知株的作用，其中Fab-p3型R)05-126用作競爭性抑制的陽性對照，R)19-102用作不與甲型流感香港型愛知株反應的陰性對照。
[0097]圖13顯示了組11中的克隆對表達來自H3型流感病毒的血凝素的細胞的結合能力的FACS分析結果，其中所有灰色峰來自陰性對照H)08-038，實線峰分別來自a)F026-427、b)F045-092 和 c)F49。
[0098]圖14顯示了各IgG抗體針對H3型、H5型、H2型和Hl型流感病毒的中和活性的測量結果，其中縱軸表示感染抑制率(％)，橫軸表示抗體濃度(U g/mL)。
[0099]圖15-1顯示了 Fab克隆對甲型流感病毒/H3N2愛知株HAO和HAl的反應性的圖示，其中灰色峰表示模擬轉(zhuǎn)染結果，緑色峰表示pDisp-Aic68HA0轉(zhuǎn)染結果，粉色峰表示pDisp-Aic68HAl轉(zhuǎn)染結果，藍色峰表示pDisp_Fuk85HA0轉(zhuǎn)染結果，橙色峰表示pDisp-Fuk85HAl 轉(zhuǎn)染結果。
[0100]圖15-2顯示了 Fab克隆對甲型流感病毒/H3N2愛知株HAO和HAl的反應性的圖示，其中灰色峰表示模擬轉(zhuǎn)染結果，緑色峰表示pDisp-Aic68HA0轉(zhuǎn)染結果，粉色峰表示pDisp-Aic68HAl轉(zhuǎn)染結果，藍色峰表示pDisp_Fuk85HA0轉(zhuǎn)染結果，橙色峰表示pDisp-Fuk85HAl 轉(zhuǎn)染結果。
[0101]圖16顯示了識別HA分子表位B的抗體R)04-104與組11中的抗體克隆是否共有表位的ELISA確定結果。在存在IgG抗體(F026-427IgG，F(xiàn)045-092IgG, F004-104IgG)和不存在(無IgG)的條件下進行ELISA，確定Fab_p3型單克隆抗體F026-427p3, F045-092p3, F004-104p3和小鼠來源抗甲型流感/H3N2抗體F49對甲型流感/H3N2巴拿馬株的作用。
[0102]圖17-1顯示了流感病毒亞型和每種病毒株的HAl和HA2的氨基酸序列。
[0103]圖17-2顯示了流感病毒亞型和每種病毒株的HAl和HA2的氨基酸序列。
[0104]圖18顯示了各種HA抗體對如下細胞的結合能力的FACS分析結果，其中該細胞表達以蘇氨酸或丙氨酸替換Aic68流感病毒株來源的血凝素的136位絲氨酸殘基而產(chǎn)生的血凝素，其中灰色峰指示模擬轉(zhuǎn)染的結果，綠色峰指示野生型Aic68的HA的結果，藍色峰指示Aic68的HA的S136T的結果，粉色峰指示Aic68的HA的S136A的結果。
[0105]圖19顯示了 HM5-092對如下細胞的結合能力的FACS分析結果，其中該細胞表達通過相互替換來自各種H3N2流感病毒HAl的142-146位或133-137位氨基酸而產(chǎn)生的突變HA1，其中灰色峰指示模擬轉(zhuǎn)染的結果，綠色峰指示對野生型的反應性，粉色峰指示移植了 142-146位氨基酸序列的嵌合142A的反應性，藍色峰指示移植了 133-137位氨基酸序列的嵌合133A的反應性。
[0106]圖20顯示了通過相互替換來自各種H3N2流感病毒的HAl的142-146位或133-137位氨基酸而產(chǎn)生的突變HAl區(qū)域的91-260位氨基酸部分的三維結構，其中受體結合區(qū)域顯示橙色，八化68_野生型的133-137位氨基酸顯示藍色，142-146位氨基酸顯示亮藍色，%003_野生型的133-137位氨基酸顯示紅色，142-146位氨基酸顯示粉色，F(xiàn)uk85_野生型的133-137位氨基酸顯示綠色，142-146位氨基酸顯示黃綠色。
[0107]圖21顯示了 H3N2流感病毒HAl區(qū)的91-260位氨基酸部分的三維結構、被各種抗體識別的HAl區(qū)的位點、和用于通過EMAC方法確定位點的病毒株的名稱，其中受體結合區(qū)域顯示橙色，被各個抗-HA抗體識別的位點顯示粉色，受體結合區(qū)內(nèi)的氨基酸編號顯示黑色，抗原識別位點的氨基酸編號顯示藍色，受體結合區(qū)中包含的作為抗原識別位點的氨基酸顯示藍色。
[0108]圖22是與HAl中的A、B、C、D和E位點結合的各種抗-HA抗體與R)45_092抗體之間競爭實驗的結果圖示，其中左圖是以HM5-092作為競爭者生成的，右圖是以cp3型抗-HA抗體作為競爭者生成的(+:有cp3抗體，無cp3抗體)。所用的病毒株在圖的左下方顯示。無Fab-pp:使用PBS代替pp型抗體；無Ab:使用PBS代替所有抗體。
[0109][本發(fā)明的實施方式]
[0110]本文中，流感病毒包括所有目前已知的亞型，甚至包括可能在將來分離和鑒定的亞型。目前已知的流感病毒亞型包括由從H1-H16中選出的血凝素類型和從N1-N9中選出的神經(jīng)氨酸酶類型的亞型組合。
[0111]根據(jù)血凝素的氨基酸序列相似性，流感病毒可以被粗略分成兩組。這里，由Hl型、H2型、H5型、H6型、H8型、H9型、Hll型、H12型、H13型和H16型流感病毒構成的組被稱作組1，由H3型、H4型、H7型、HlO型、H14型和H15型流感病毒構成的組被稱作組2。在這些組中選擇類別時，不考慮神經(jīng)酰胺酶亞型。將來分離和鑒定出的新亞型將根據(jù)血凝素的氨基酸序列相似性分類到組I或組2中。
[0112]本發(fā)明提供了分離抗體，其中和至少一種選自組I (Hl型、H2型、H5型、H6型、HS型、H9型、HlI型、H12型、H13型和H16型)的流感病毒和至少一種選自組2 (H3型、H4型、H7型、HlO型、H14型和H15型)的流感病毒。優(yōu)選地，本發(fā)明的中和抗體至少中和組I中的Hl型和/或H5型流感病毒，且至少中和組2中的H3型流感病毒。更優(yōu)選地，本發(fā)明的中和抗體進一步中和組I中的H9型流感病毒，還進一步中和組2中的H7型流感病毒。本發(fā)明的中和抗體特別優(yōu)選地中和所有的H1-H16型流感病毒，最優(yōu)選地，甚至中和在將來會分離和鑒定出的新型血凝素亞型流感病毒。
[0113]本發(fā)明的中和抗體可以通過如下的方法加以產(chǎn)生，包括如下步驟:
[0114](1)提供包含抗體克隆的抗體文庫，所述抗體克隆是來自從一個個體采集到的大約IO8個以上的B細胞，
[0115](2)以Hl~H16中任一個的流感病毒、或該病毒的血凝素蛋白、或其胞外域作為抗原，使其與抗體文庫(I)接觸，網(wǎng)羅性地篩選與該抗原反應的抗體克隆，
[0116](3)由在步驟(2)中篩選到的各抗體克隆回收抗體分子，
[0117](4)針對在步驟(3)中獲得的各抗體，檢測所述抗體對選自組I的至少一種流感病毒和選自組2的至少一種流感病毒的中和活性，和
[0118](5)使用產(chǎn)生中和屬于組I的流感病毒和屬于組2的流感病毒這二者的抗體的克隆來產(chǎn)生該抗體,回收該抗體。
[0119]采集B細胞作為抗體產(chǎn)生細胞用于生產(chǎn)抗體文庫的供體，可以是任何曾經(jīng)被流感病毒感染的哺乳動物(例如人、豬、馬等)或鳥類(雞、鴨等);可以適當?shù)剡x擇與作為用本發(fā)明中和抗體進行被動免疫的受試對象相同的動物物種，比如選擇人。在選擇人的情況下，供體的年齡、性別、疫苗接種狀態(tài)(已接種或未接種)等不受限制；然而，因為供體理想地具有盡可能多的流感病毒感染經(jīng)歷，所以供體優(yōu)選地為20歲以上，優(yōu)選地30歲以上，再優(yōu)選地40歲以上，特別優(yōu)選地50歲以上，然而，這并不是限制。顯示出超越組間障礙的中和活性的抗體，由于能夠中和組內(nèi)和亞型內(nèi)所有病毒分離株，所以具有可產(chǎn)生該中和抗體的細胞的供體被認為不易被每年的季節(jié)性流感所感染。因此，在過去給定時期內(nèi)沒有甲型流感病毒感染史的人是更理想的。
[0120]用于采集足以制備普通抗體文庫的B細胞的采血量為大約20_30mL，該血量中含有的B細胞數(shù)目為大約107。分離出針對高致病性H5N1禽流感病毒的人中和抗體的所有研究組,均通過從多個供體采集普通量的血液生成了其大約101°個克隆的抗體文庫。而本發(fā)明人嘗試生成可以反映整個抗體譜的大小的抗體文庫，目的是徹底地(網(wǎng)羅性)地獲得可以結合某種血凝素亞型的抗體。通常，在單次操作中，從一個人采集的血量極限為大約200-300mL;因此，使用這種方法可以采集到的B細胞數(shù)量為大約108。因此，本發(fā)明人使用單采血液成分術，從一個個體采集了超過上述量的血液中所含的B細胞。優(yōu)選地，用于本發(fā)明目的的抗體文庫是由IO9個以上的B細胞構成的。例如，通過單采血液成分術從大約3L血液分離B細胞可以實現(xiàn)從一個人個體采集大約IO9個B細胞。
[0121]只要含有來自一個個體的大約IO8個或更多個，優(yōu)選地大約IO9個或更多個B細胞,用于生成抗體文庫的抗體產(chǎn)生細胞可以進一步包括來自另一個個體的抗體產(chǎn)生細胞。具體地，例如，通過單采血液成分術回收相當于大約3L血液的單核細胞數(shù)量，之后通過例如Ficoll-Paque密度梯度離心等方法分離和回收B細胞。
[0122]抗體文庫包括，但不僅限于，例如噬菌體展示文庫，通過用EB病毒使B細胞永生獲得的文庫，通過融合B細胞與骨髄瘤細胞獲得的雜交瘤文庫，等。優(yōu)選地，可以使用噬菌體展示文庫。
[0123]如這里提到的用于產(chǎn)生噬菌體展示人抗體文庫的方法實例包括，但不僅限于，如下。
[0124]盡管所用卩遼菌體的選擇沒有特別限制,但是絲狀卩遼菌體(filamentous phage, Ff噬菌體)通常是優(yōu)選使用的。將外來蛋白呈遞到噬菌體表面上的方法包括，表達外來蛋白并將其作為與包膜蛋白g3p(cp3)和g6p (cp6)-g9p (cp9)其中之一的融合蛋白呈遞到包膜蛋白上的方法，和通常使用的方法，其中外來蛋白與cp3或cp8的N端融合。噬菌體展示載體包括I)以融合形式將外來基因引入噬菌體基因組包膜蛋白基因內(nèi)，從而使所有包膜蛋白作為與外來蛋白的融合蛋白被呈遞到噬菌體表面上的方法，以及2)插入與野生型包膜蛋白基因分離的編碼融合蛋白的基因，從而同時表達融合蛋白和野生型包膜蛋白，和3)使攜帯有編碼融合蛋白的基因的噬菌粒載體的腸埃希氏菌被具有野生型包膜蛋白基因的輔助噬菌體感染，并產(chǎn)生同時表達融合蛋白和野生型包膜蛋白的噬菌體顆粒。在I)的實例中，與大的外來蛋白融合會導致感染性喪失；因此，在這種情況下，使用2)或3)型方法產(chǎn)生抗體文庫。
[0125]具體地，有用的載體包括Holt 等(Curr.0pin.Biotechnol.，11:445-449, 2000)介紹的載體。例如，PCESl (見 J.Biol.Chem.，274:18218-18230，1999)是 Fab 表達型噬菌粒載體，其攜帯置于cp3信號肽下游的編碼K L鏈恒定區(qū)的DNA，編碼Ch3的DNA，并且該cp3編碼序列通過His-標簽、c-myc標簽和琥珀終止密碼子(TAG)置于cp3信號肽的下游，受到ー個乳糖啟動子的控制。該載體在被引入到具有琥珀突變的大腸埃希氏桿菌內(nèi)時，會將Fab呈遞到cp3包膜蛋白上面。然而，當在沒有琥珀突變的HB2151菌株等內(nèi)表達時，該菌株產(chǎn)生可溶性Fab抗體。有 用的scFv表達型噬菌粒載體包括，例如，pHENl (J.Mol.Biol.，222:581-597，1991)等。
[0126]同時，輔助噬菌體包括，例如，Ml3-K07、VCSMl3等。
[0127]其它的噬菌體展示載體包括如下的載體，其被設計成將包含編碼半胱氨酸的密碼子的序列連接到抗體基因3’端和包膜蛋白基因5’端，從而同時和分別(不作為融合蛋白)表達兩個基因，并通過被引入的半胱氨酸殘基間的S-S鍵使抗體呈遞到噬菌體表面的包膜蛋白上(Morphosis公司的CysDisplayTM技術)等。
[0128]本發(fā)明中生成的抗體文庫的種類包括天然(naive)/非免疫文庫、合成文庫、免疫
文庫等。
[0129]天然(naive)/非免疫文庫是通過RT-PCR獲取正常動物保留的VH和VL基因，并將其隨機克隆到上述噬菌體展示載體其中之一內(nèi)獲得的。通常，來自正常動物外周血、骨髄、扁桃體的淋巴細胞(優(yōu)選地外周血淋巴細胞)的mRNA或類似物用作模板。通過僅擴增來自如下IgM的mRNA生成的文庫，其中IgM由于抗原敏化而未經(jīng)歷種類變換，從而避免與V基因有關的偏向，被特別稱作天然文庫。
[0130]代表性的天然/非免疫文庫包括CAT公司的文庫(見J.Mol.Biol.，222:581-597，1991;Nat.Biotechnol.，14:309-314，1996)，MRC 公司的文庫(見 Annu.Rev.1mmunol.，I2:433_455，1"4)，Dyax 公司的文庫(見 J.Biol.Chem., 1999 (ibid.) ; Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 14:7969-7974, 2000)等。 [0131]合成文庫的產(chǎn)生，是通過選擇在人B細胞中發(fā)揮功能的特殊抗體基因，并用編碼具有合適長度的隨機氨基酸序列的DNA代替V基因片段的一部分，例如CDR3的抗原結合區(qū)部分等。合成文庫被認為在抗體表達效率和穩(wěn)定性方面是優(yōu)異的，因為它們能夠用可產(chǎn)生從一開始便具有功能的scFv和Fab的VH和VL基因的組合加以構建。代表性的實例包括 Morphosys 公司的 HuCAL 文庫(見 J.Mol.Biol.，296:57-86，2000)，BioInvent 公司的文庫(見 Nat.Biotechnol., 18:852，2000), Crucell 公司的文庫(見 Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 92:3938, 1995; J.1mmunol.Methods, 272:219-233, 2003)等。當使用合成文庫時，理想地使用VH1-69和VHl-e基因片段作為重鏈可變域的V基因片段。
[0132]免疫文庫的產(chǎn)生，是通過從具有針對靶抗原的高血液抗體滴度的人，例如疫苗接種的受體，采集的淋巴細胞制備mRNA，或者從通過外部免疫等用靶抗原人工免疫的人采集的淋巴細胞制備mRNA，其執(zhí)行方式與上述天然/非免疫文庫的方式相同，并通過RT-PCR擴增VH和VL基因。因為期望的抗體基因在一開始便已存在于文庫中，所以甚至在文庫體積相對較小時就可獲得期望的抗體。然而，在人的實例中，因為通過接種注射的特異針對病毒亞型的抗體得到了擴增，所以當用機體中預期已經(jīng)存在多種針對它的抗體的H1-H3血凝素亞型之一的流感病毒進行接種時，會導致具有窄范圍中和活性的抗體擴增，從而使該亞型中僅有特定的分離物被中和；這恐怕會掩蓋期望的中和抗體。因此，在接種時，優(yōu)選地接種如下亞型的流感病毒，其廣泛傳染迄今為止尚未見報道(例如在人類實例中，H5、H7、H9等)。
[0133]文庫的多樣性越大越好；然而實際上，考慮到在隨后淘選操作(panningoperation)中可以處理的噬菌體數(shù)目(IOll-1O13個噬菌體)和在普通淘選中用于克隆分離和擴增所需的噬菌體數(shù)目(100-1，000個噬菌體/克隆)，適當?shù)奈膸斐叽鐬榇蠹sIO8-1O11個克隆。優(yōu)選地，對于％和'基因，大小分別為IO9和IO6個克隆，F(xiàn)ab或scFv克隆的數(shù)目為IOic1-1O11個克隆。
[0134]通過用EB病毒使細胞永生產(chǎn)生抗體文庫的方法包括，但不僅限于，例如PLosMedicine4(5): el780928-9936 (2007)中介紹的方法。大部分人對EB病毒免疫，因為他們已經(jīng)以傳染性單核細胞增多癥的無癥狀感染方式被病毒感染過；然而，當使用普通EB病毒時，還是會產(chǎn)生病毒體(virion)，因此必須進行適當?shù)募兓?。還優(yōu)選地使用保留使B淋巴細胞永生的能力、但缺乏病毒體復制能力(例如缺乏用于從晚期感染狀態(tài)轉(zhuǎn)變成裂解感染狀態(tài)的開關基因等)的重組EB病毒，作為永遠不會被病毒污染的EB系統(tǒng)。
[0135]因為狨猴來源的B95-8細胞分泌EB病毒，所以使用其培養(yǎng)物上清可以容易地轉(zhuǎn)化B淋巴細胞。產(chǎn)抗體B細胞系的獲得，可以通過例如用補充有血清和青霉素/鏈霉素(P/S)的培養(yǎng)基(例如RPMI1640)或補充有細胞增殖因子的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，之后通過過濾和離心等分離培養(yǎng)物，以合適的濃度(例如大約IO7個細胞/mL)懸浮其中的產(chǎn)抗體B淋巴細胞，并通常在20-40° C，優(yōu)選地30-37° C孵育懸浮液，通常大約0.5_2小時。當產(chǎn)人抗體的細胞作為混合淋巴細胞提供時，優(yōu)選地先通過使它們與例如綿羊紅細胞等形成E玫瑰花結除去T淋巴細胞，從而增加轉(zhuǎn)化頻率，因為大部分人具有對被EB病毒感染的細胞有毒性的T淋巴細胞。還可能選擇特異針對靶抗原的淋巴細胞，其是通過將事先與可溶抗原偶聯(lián)的綿羊紅細胞與產(chǎn)抗體的B淋巴細胞混合，并使用Percoll密度梯度等分離玫瑰花結。進一步，因為抗原特異性B淋巴細胞被所添加的大幅過量的抗原覆蓋，導致它們不再將IgG呈遞到表面上，所以與事先用抗-1gG抗體偶聯(lián)的綿羊紅細胞混合，僅有抗原非特異性B淋巴細胞會形成玫瑰花結。因此，通過用Percoll密度梯度等從該混合物采集未形成玫瑰花結的細胞層，有可能選擇抗原特異性B淋巴細胞。
[0136]由于轉(zhuǎn)化而獲得無限增殖能力的抗體分泌細胞可以和小鼠或人骨髓瘤細胞回融合(back-fused)，以便穩(wěn)定保持抗體分泌能力。骨髓瘤細胞的實例包括小鼠骨髓瘤細胞例如 NS-1, P3U1, SP2/0 和 AP-1，和人骨髓瘤細胞例如 SK0-007, GM1500-6TG-2, LICR-L0N-HMy2和 UC729-6。
[0137]通過細胞融合生成抗體文庫，可以根據(jù)用于產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤制備的普通程序加以實現(xiàn)。具體地，產(chǎn)抗體的雜交瘤可以通過將從供體采集的B細胞與上述的骨髓瘤細胞之一融合加以制備。
[0138]融合操作可以根據(jù)已知的方法執(zhí)行,例如Koehler和Milstein[Nature, vol.256,p.495(1975)]的方法。融合促進劑包括聚乙二醇(PEG)、仙臺病毒等，優(yōu)選地使用PEG等。盡管PEG的分子量沒有特別限制，但是低毒性和相對低粘性的PEG1000-PEG6000是優(yōu)選的。PEG濃度的實例包括大約10-80%，優(yōu)選地大約30-50%。用于稀釋PEG的有用溶液包括各種緩沖溶液，例如無血清培養(yǎng)基(例如RPMI1640)，包含大約5-20%血清的完全培養(yǎng)基，磷酸緩沖鹽(PBS)和Tris緩沖液?？梢愿鶕?jù)期望添加DMSO (例如大約10_20%)。融合溶液的pH實例包括大約4-10，優(yōu)選地大約6-8。
[0139]B細胞與骨髓瘤細胞的比例通常為大約1:1-20:1 ;通過在正常20-40° C，優(yōu)選地30-37° C孵育通常1-10分鐘，可以實現(xiàn)高效的細胞融合。
[0140]雜交瘤篩選和繁殖通常用適用于動物細胞的包含5_20%FCS的培養(yǎng)基(例如RPMI1640)或補充有細胞增殖因子的無血清培養(yǎng)基執(zhí)行，并添加HAT (次黃嘌呤、氨基喋呤、胸苷)。次黃嘌呤、氨基喋呤和.胸苷的濃度實例分別包括大約0.1mM、大約0.4μΜ和大約0.016mM等。為了篩選人-小鼠雜交瘤,可以使用烏本苷抗性。因為人細胞系比小鼠細胞系對烏本苷更敏感，所以有可能通過向培養(yǎng)基添加大約KT7-1O-3M烏本苷清除未融合的人細胞。
[0141]在選擇雜交瘤時，優(yōu)選地使用滋養(yǎng)細胞或特定細胞的培養(yǎng)物上清。作為滋養(yǎng)細胞，一種具有壽命極限從而在幫助雜交瘤出現(xiàn)后死亡的同種異體細胞類型，使用能夠產(chǎn)生大量有利于雜交瘤出現(xiàn)的生長因子并且增殖潛力被放射性輻照等降低的細胞。例如，小鼠滋養(yǎng)細胞包括脾細胞、巨噬細胞、血液、胸腺細胞等；人滋養(yǎng)細胞包括外周血單核細胞等。細胞培養(yǎng)物上清包括，例如，上述各種細胞的原代培養(yǎng)物上清和各種已建立細胞系的培養(yǎng)物上清。
[0142]通過曬菌體展示方法選擇針對祀抗原的抗體的步驟稱作淘選(panning)。具體地講，通過重復大約2-4次如下系列的操作濃縮呈遞抗原特異性抗體的噬菌體:使上面固定有H1-H16任一亞型流感病毒或病毒血凝素蛋白或其胞外域的載體(carrier)與噬菌體文庫彼此接觸，洗掉未結合的噬菌體，之后從載體洗脫結合的噬菌體，并用噬菌體感染大大腸埃希氏桿菌以擴增噬菌體。在本發(fā)明中，用作抗原的流感病毒可以通過福爾馬林處理使之失活。優(yōu)選地，用作抗原的流感病毒分離株是作為B細胞采集來源的個體從未感染過的。這是因為，當使用個體曾經(jīng)感染過的病毒分離物作為抗原時，恐怕使僅顯示窄范圍中和活性的抗體克隆占據(jù)優(yōu)勢，從而掩蓋本發(fā)明期望的中和抗體。因此，優(yōu)選地，屬于作為B細胞采集來源的個體從未感染過的血凝素亞型的流感病毒或其血凝素，可以用作抗原。實例包括H5型、H7型和H9型流感病毒。可選擇地，當使用屬于H1-H3型任意之一的流感病毒分離株作為抗原時，理想地，例如，使用在作為B細胞采集來源的個體出生前曾經(jīng)流行過的亞型分離物。
[0143]編碼各種亞型血凝素的cDNA序列是公知的；使用普通的基因重組技術可以產(chǎn)生任何期望亞型的重組血凝素。而且，根據(jù)上述非專利文獻6中介紹的方法可以產(chǎn)生血凝素的三聚體胞外域結構。
[0144] 用于固定抗原的有用載體包括在普通抗原-抗體反應或親和色譜中使用的各種載體，例如不溶性多糖如瓊脂糖、葡聚糖和纖維素；合成樹脂如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺和硅；包含玻璃、金屬或類似物的微孔板、試管、膜、柱、球珠等；表面等離子體共振(SPR)傳感器芯片，和類似物。對于抗原固定，可以使用物理吸附，也可以接受使用化學鍵合方法，其在蛋白或酶等的不可溶和固定化中使用。例如，優(yōu)選使用生物素_(鏈霉)親合素系統(tǒng)等。對于未結合噬菌體的清洗，可以順次使用封閉溶液例如BSA溶液(一次或兩次)、含有表面活性劑如吐溫的PBS (3-5次)和類似物。有一個報道提到，使用檸檬酸緩沖液(pH5)或類似物是優(yōu)選的。對于特異噬菌體的洗脫，通常使用酸(例如0.1M鹽酸或類似物)；也可能使用特異蛋白酶切割(例如可以再抗體基因和包膜蛋白基因之間的連接位點中引入一個編碼胰蛋白酶切割位點的基因序列；在這種情況下，甚至當所有包膜蛋白以融合蛋白形式表達時，也可能實現(xiàn)大腸埃希氏桿菌感染和擴增，因為被洗脫的噬菌體表面上存在野生型包膜蛋白)，用可溶抗原競爭洗脫，或通過還原S-S鍵洗脫(例如在前述的CysDisplay?中，在進行淘選之后，可以通過使用合適的還原劑使抗體和包膜蛋白解吸附，回收抗原特異性噬菌體)。當用酸進行洗脫時，洗脫物用Tris等中和，然后用洗脫的噬菌體感染大腸埃希氏桿菌，然后進行培養(yǎng)，之后通過傳統(tǒng)方法回收噬菌體。
[0145]在將抗原固定到載體上時，有可能使用酵母展示在細胞膜表面上表達血凝素三聚體。
[0146]在通過淘選濃集呈遞抗原特異性抗體的噬菌體之后，用噬菌體感染大腸埃希氏桿菌，并將細胞接種在平板上并進行細胞克隆。再次回收噬菌體，通過抗體滴度測定(例如ELISA、RIA、FIA等)或利用熒光激活細胞分選(FACS)或表面等離子體共振(SPR)的測量方法確認抗原結合活性。
[0147]用上面獲得的噬菌體抗體克隆感染大腸埃希氏桿菌并從培養(yǎng)物上清回收抗體的步驟可以如下執(zhí)行，例如，當使用在抗體基因和包膜蛋白基因之間的連接位點含有琥珀終止密碼子的載體時，用噬菌體感染不具有琥珀突變的大腸埃希氏桿菌株(例如HB2151菌株)，在周質(zhì)或培養(yǎng)基中產(chǎn)生和分泌可溶抗體分子，用溶菌酶等裂解細胞壁，回收細胞外餾分，用與上面用于噬菌體展示載體的相同純化技術純化餾分。假如已經(jīng)事先引入了 His-標簽或c-myc標簽,使用IMAC、抗c-myc抗體柱子等可以容易地純化抗體。當在淘選中使用特異蛋白酶進行切割時，通過蛋白酶對其發(fā)揮作用，可以從噬菌體表面分離抗體分子，從而通過執(zhí)行相同的純化操作可以純化期望的抗體。在本發(fā)明中，因為當抗體是IgG型競爭抗體時，抗體的中和活性比Fab型高大約100-1000倍，所以從所得噬Fe菌體克隆回收質(zhì)粒DNA，通過基因操作添加相應于連接IgG之Fe的結構域的序列，用其轉(zhuǎn)化大腸埃希氏桿菌，并培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，其操作如下面的實施例所述。用IgG瓊脂糖柱純化從培養(yǎng)物上清回收的抗體，然后測試其中和活性。
[0148]期望的抗體也可以通過如下的方法從使用EB病毒或細胞融合術獲得永生的抗體產(chǎn)生細胞系中選出，例如，使先前用突光物質(zhì)標記的上述抗原與永生化細胞或融合細胞反應，然后用熒光激活細胞分選(FACS)法分離與抗原結合的細胞。在這種情況下，可以直接選出產(chǎn)生針對祀抗原的抗體的雜交瘤或永生B細胞,從而顯著減輕克隆的勞動量。
[0149]可以使用各種方法克隆可產(chǎn)生針對靶抗原的單克隆抗體的雜交瘤。因為氨基喋呤會抑制許多細胞功能，所以優(yōu)選地盡快從培養(yǎng)基中除去它。然而，人雜交瘤在融合后通常用含有氨基喋呤的培養(yǎng)基維持大約4-6周。理想地，在除去氨基喋呤后I周或更久時間后，除去次黃嘌呤和胸苷。當克隆出現(xiàn)并且直徑達到大約Imm時，可以測量培養(yǎng)上清中的抗體含量。
[0150]抗體量可以用例如如下的方法測量，其中向上面吸附有靶抗原或其衍生物或部分肽的固相(例如微孔板)添加雜交瘤培養(yǎng)物，靶抗原等可以是單獨吸附，或者與載體、杭-免疫球蛋白(IgG)抗體(針對來自于與所使用作為最初抗體產(chǎn)生細胞來源的動物屬于相同物種的IgG的抗體)或蛋白A—起吸附，載體等事先用放射性物質(zhì)(例如1251，1311，3H，14C)、酶(例如3 -半乳糖苷酶、3 -葡萄糖苷酶、堿性磷酸酶、過氧化物酶、蘋果酸脫氫酶)、熒光物質(zhì)(例如熒光胺、異硫氰基熒光素)、化學發(fā)光物質(zhì)(例如魯米諾、魯米諾衍生物、蟲熒光素、光澤精)或類似物標記，檢測與固相結合的針對靶抗原的抗體；或者如下的方法，其中向上面吸附有抗-1gG抗體或蛋白A的固相添加雜交瘤培養(yǎng)物上清，添加用與上面相同的標記物標記的靶抗原或其衍生物或其部分肽，并檢測與固定結合的針對靶抗原的抗體，等。
[0151]盡管通常使用有限稀釋作為克隆方法，但是也可能使用軟瓊脂克隆或使用FACS克隆(如上所述)。通過有限稀釋進行克隆可以通過例如如下的程序執(zhí)行，然而不應認為這具有限制意義。
[0152]如上所述地測量抗體量，選擇陽性孔。先前，選擇合適的滋養(yǎng)細胞并添加到96孔板中。從抗體陽性孔吸取細胞，并懸浮在完全培養(yǎng)基中[例如補充了 10%FCS (胎牛血清)和P/S的RMPI1640]，密度為30個細胞/mL ;向添加有滋養(yǎng)細胞的96孔板添加0.1mL懸液(3個細胞/孔);將部分剰余細胞懸液稀釋成10個細胞/mL，并用相同的方法接種到其它孔中(I個細胞/孔);將再剩余的細胞懸液稀釋成3個細胞/mL，并接種到其它孔中(0.3個細胞/孔)。將這些細胞培養(yǎng)2-3周，直到出現(xiàn)肉眼可見的克??； 測量抗體量，選擇陽性孔，并再次克隆。在人細胞情況下，克隆相對困難，因此還要準備含有每孔10個細胞的板。盡管通常通過兩次亞克隆可以獲得生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤，但是理想地將再克隆規(guī)律性地重復更多個月，以確認其穩(wěn)定性。
[0153]雜交瘤可以在體外或體內(nèi)培養(yǎng)。
[0154]體外培養(yǎng)方法包括從孔板逐漸放大如上所述獲得的產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤，同時將細胞密度保持在例如大約105-106個細胞/mL，并逐漸降低FCS濃度的方法。
[0155]體內(nèi)培養(yǎng)方法包括例如將礦物油腹腔注射到小鼠體內(nèi)(小鼠與雜交瘤的親本株是組織相容的)誘導漿細胞骨髓瘤(MOPC)，5-10天后腹腔注射大約105-107個雜交瘤細胞，并2-5周后在麻醉狀態(tài)下采集腹水。
[0156]單克隆抗體的分離和純化根據(jù)免疫球蛋白的分離和純化方法執(zhí)行[例如鹽析、乙醇沉淀、等電點沉淀、電泳、用離子交換劑(如DEAE，QEAE)吸附-解吸、超離心、凝膠過濾、通過抗原偶聯(lián)固相或活性吸附劑如蛋白A或蛋白G選擇性采集抗體的特異性純化、和解交聯(lián)吸附獲得抗體，等]，其執(zhí)行方式與普通的多克隆抗體制備和純化方式相同。
[0157]如上所述，通過在溫血動物體內(nèi)或體外培養(yǎng)雜交瘤，并從體液或其培養(yǎng)物采集抗體，可以篩選與特殊血凝素亞型流感病毒結合的單克隆抗體。
[0158]這樣獲得的單克隆抗體是否能夠超越組間的障礙中和流感病毒，可以通過檢測對至少一種選自組I中的流感病毒和至少一種選自組2中的流感病毒的中和活性加以確定。
[0159]通常，對流感病毒的中和活性的研究常常通過血凝抑制(HI)試驗加以執(zhí)行。流感病毒通過血凝素頭部區(qū)域，以呈遞在紅細胞表面上的含唾液酸的糖鏈(唾液酸的糖鏈，sialosugar chain)作為流感病毒受體,與紅細胞結合。結果,流感病毒導致紅細胞凝集。因為具有流感病毒中和活性的抗體會識別并結合血凝素，所以流感病毒的血凝性質(zhì)被中和抗體抑制。因此，是否抑制血凝可以用作是否存在中和活性的指示。盡管參與血凝素凝血的區(qū)域可能經(jīng)歷抗原漂移，但是參與該區(qū)域唾液酸鍵合的氨基酸在流感病毒亞型中趨向于是高度保守的，提示具有廣泛中和活性的本發(fā)明中和抗體可以識別該氨基酸作為表位。可選擇地，本發(fā)明的中和活性測試方法包括，例如，灶形成抑制試驗[J.Clin.Microbiol.Vol.28，pp.1308-1313 (1990)]。具體地，流感病毒和宿主細胞在存在和不存在測試抗體的條件下彼此接觸，并根據(jù)測試抗體是否顯著抑制由于病毒感染宿主細胞導致的細胞灶形成，確定是否存在中和活性及其水平。
[0160]盡管待進行中和活性測試的流感病毒的亞型沒有特殊限制，優(yōu)選地包括組I中的至少Hl型和/或H5型流感病毒和組2中的至少H3型流感病毒。可選擇地，還優(yōu)選地進一步測試對組I中H9型流感病毒和對組2中H7型流感病毒的中和活性。
[0161]對于在抗體分子中和活性測試中已經(jīng)被確認中和至少一種選自組I的流感病毒和至少一種選自組2的流 感病毒的抗體，使用產(chǎn)生該抗體分子的克隆可以大量產(chǎn)生該抗體分子。當所用抗體文庫是噬菌體展示文庫時，可以用呈遞期望中和抗體Fab或scFv的噬菌體克隆感染大腸埃希氏桿菌，其可以被培養(yǎng)產(chǎn)生Fab型抗體或scFv型抗體,優(yōu)選地將它們轉(zhuǎn)變成IgG型抗體，以顯著提高其中和活性。例如，F(xiàn)ab向IgG的轉(zhuǎn)換，可以通過從噬菌體DNA切除編碼VHCHl和VLCL的片段，將該片段插入到含有編碼Fe區(qū)的片段的質(zhì)粒中，構建包含編碼重鏈和輕鏈的DNA的質(zhì)粒，用其轉(zhuǎn)染動物細胞例如CHO細胞，并培養(yǎng)細胞使之在培養(yǎng)物上清中分泌IgG型抗體。所獲得的抗體可以通過已知的方法加以純化和回收。
[0162]當所用抗體文庫是通過用EB病毒或細胞融合加以永生化的B細胞制備的雜交瘤時，有可能如上所述地使雜交瘤在體外或體內(nèi)生產(chǎn)抗體分子，通過傳統(tǒng)方法純化抗體，并回收抗體。
[0163]為了中和所得的抗體，有可能在體外模擬免疫系統(tǒng)所采用的步驟(體細胞突變和選擇)，以提高其對抗原的親和性。抗體基因中的突變方法包括鏈重排、使用很可能缺乏修復系統(tǒng)的大腸埃希氏桿菌從而發(fā)生突變的隨機突變、或易錯聚合酶鏈反應(error-pronePCR)、CDR步移等。對抗原具有更高親和性的中和抗體的篩選，可以通過從由突變產(chǎn)生的突變體文庫中選擇高親和性中和抗體實現(xiàn)。例如，可以使用I)用低濃度的用于篩選的抗原回收具有高親和力的抗體噬菌體的方法，2)用強沖洗條件回收不容易離開抗原的抗體噬菌體的方法，3)采用拮抗反應的方法，等。
[0164]如上所述獲得的本發(fā)明中和抗體的種類大多利用VH1-69或VHl-e基因作為重鏈可變域V區(qū)。這個特征是各種迄今已經(jīng)報道可以中和多種組I中亞型流感病毒的抗體所共有的；需要有興趣地指出，盡管采用相同的V基因片段，但是在所顯示的中和活性范圍內(nèi)存在一定的差異，本發(fā)明中和抗體的ー個特征是，只使用VL1-44，VL1-47或VL1-51基因作為輕鏈可變域V區(qū)。另外，本發(fā)明的中和抗體在IgG型抗體的細胞灶形成抑制測試中具有10_n-10_12M量級的最小抑制濃度，比迄今已報道的所有可中和組I中多種亞型流感病毒的抗體顯示出更高水平的中和活性。
[0165]抗體經(jīng)過免疫球蛋白基因重排，即在B細胞分化過程中重鏈可變域V、D和J區(qū)的重組或輕鏈可變域V和J區(qū)的重組，之后在可變區(qū)的堿基序列中引入體細胞突變。結果，可以產(chǎn)生具有高抗原親和性的可變區(qū)的抗體。因此，本發(fā)明中和抗體的種類，其是B細胞來源的抗體克隆，甚至可以包括具有在原始免疫球蛋白基因中通過體細胞突變產(chǎn)生的氨基酸序列的中和抗體。在中和抗體與流感病毒抗原形成抗原-抗體偶聯(lián)時，所有與血凝素分子接觸的點均存在于重鏈可變域內(nèi)；因此重鏈可變域被認為是對流感病毒中和抗體的親和性具有最基本貢獻的位點；然而，在輕鏈可變域的突變中也觀察到了收斂(convergence),提示輕鏈可變域在本發(fā)明的中和抗體中也發(fā)揮某種作用。因此在本發(fā)明的中和抗體中，互補決定區(qū)3(CDR3)對抗原結合的貢獻較小，所以重鏈可變域V區(qū)中存在的互補決定區(qū)I和2更重要。這里，重鏈可變域V區(qū)(輕鏈可變域V區(qū))是指重排后構成重鏈(輕鏈)可變區(qū)的V區(qū)，并可以是包含例如框架區(qū)1、2、3和互補決定區(qū)1、2的區(qū)域。重鏈(輕鏈)可變區(qū)是指抗體的一部分，其不是Fab區(qū)的恒定區(qū)域，并且可以是包含例如框架區(qū)1、2、3和互補決定區(qū)1、2、3的區(qū)域。因此，本發(fā)明的中和抗體優(yōu)選地是，例如，以序列號I氨基酸序列作為重鏈可變域互補決定區(qū)1，并以序列號2氨基酸序列作為互補決定區(qū)2的中和抗體。
[0166]本發(fā)明人還獲得了如下克隆，其與其它克隆相比，對屬于組I的H1、H2和H5型具有顯著的中和活性，同時對屬于組2的H3型流感病毒具有中和活性。該克隆與其它克隆不同，其結構在重鏈可變域的框架區(qū)I中缺少ー個氨基酸(序列號27的第27位甘氨酸)。因此，重鏈可變域的框架區(qū)I由序列號3所示氨基酸序列構成的中和抗體也優(yōu)選地作為本發(fā)明的中和抗體。
[0167]另ー個具體的實例包括如下的中和抗體，其中重鏈可變域V區(qū)由序列號4-9中任一個所示的氨基酸序列構成的中和抗體，重鏈可變域由序列號10-15中任一個所示的氨基酸序列構成的中和抗體，重鏈可變域(序列號10-15)和輕鏈可變域(序列號16-26和70)由下面所示氨基酸序列組合其中之ー構成的中和抗體。。
[0168](a)序列號10,序列號16;
[0169](b)序列號10，序列號17;
[0170](c)序列號10，序列號18;
[0171]⑷序列號10，序列號19;
[0172](e)序列號10，序列號20;
[0173](f)序列號10，序列號21;
[0174](g)序列號10，序列號22;
[0175](h)序列號11，序列號23;
[0176]⑴序列號13，序列號24;
[0177](j)序列號14，序列號25;[0178](k)序列號15，序列號26:或
[0179](I)序列號12，序列號70
[0180]實例還包括以序列號71-76所示堿基序列分別作為編碼前述抗體(序列號10-15)重鏈可變域氨基酸序列的堿基序列，以序列號77-88所示堿基序列分別作為編碼輕鏈可變域氨基酸序列(序列號16-26和70)的堿基序列。因此，本發(fā)明的中和抗體可以用如下的中和抗體舉例，其中中和抗體的重鏈可變域由序列號71-76中任一個所示堿基序列編碼的氨基酸序列構成，中和抗體的重鏈可變域和輕鏈可變域由如下所示堿基序列組合中的其中一個編碼氨基酸序列構成。
[0181](a)序列號71，序列號77;
[0182](b)序列號71，序列號78;
[0183](C)序列號71，序列號79;
[0184](d)序列號71，序列號80;
[0185](e)序列號71，序列號81;
[0186](f)序列號71，序列號82;
[0187](g)序列號71，序列號83;
[0188](h)序列號72， 序列號84;
[0189]⑴序列號74，序列號85;
[0190](j)序列號75，序列號86;
[0191](k)序列號76，序列號87;或
[0192](I)序列號73，序列號88
[0193]這些發(fā)現(xiàn)證明，本發(fā)明的方法非常有用，因為它不僅提供了能夠比通過傳統(tǒng)方法獲得的抗體顯示更廣范圍中和活性的抗體，即超越了組間障礙，還提供了比通過傳統(tǒng)方法獲得的抗體具有更高中和活性的抗體。
[0194]由于其中和活性的廣泛性，考慮通過本發(fā)明方法獲得的流感病毒中和抗體的識別位點與傳統(tǒng)中和抗體所識別的表位不同。如果本發(fā)明中和抗體識別的表位明確的話，那么包含該表位氨基酸序列(抗原氨基酸序列)的肽可以用作流感病毒的疫苗，包含編碼該抗原肽的堿基序列的核酸(基因)可以用作流感測試劑和測試劑試劑盒。免疫反應表位可以用公知的方法加以鑒定；實例包括I)檢查通過酶學或化學處理血凝素制備的有限降解產(chǎn)物與本發(fā)明獲得的IgG型中和抗體之間的反應性的方法，2)檢查通過參考氨基酸序列數(shù)據(jù)庫合成的重疊肽與本發(fā)明獲得的IgG型中和抗體之間的反應性的方法，等。
[0195]在轉(zhuǎn)錄和翻譯后，血凝素作為前體經(jīng)過糖基化；糖基化血凝素已知被切割成兩個亞基(subunit)HAl和HA2。表1顯示了各種流感病毒HAl和HA2亞基的氨基酸序列和序列號之間的對應關系。
[0196][表 I]
[0197]
【權利要求】
1.一種分離抗體，該抗體中和選自組I的至少ー種流感病毒和選自組2的至少ー種流感病毒，所述組I由Hl型、H2型、H5型、H6型、H8型、H9型、Hll型、H12型、H13型和H16型流感病毒構成，所述組2由H3型、H4型、H7型、HlO型、H14型和H15型流感病毒構成。
2.根據(jù)權利要求1的抗體，其中，該抗體至少中和Hl型和/或H5型流感病毒、并且中和H3型流感病毒。
3.根據(jù)權利要求1的抗體，其中，該抗體中和Hl型-H16型流感病毒。
4.根據(jù)權利要求1的抗體，其中，重鏈可變域V區(qū)利用VH1-69或VHl-e基因。
5.根據(jù)權利要求4的抗體，其中，重鏈可變域V區(qū)具有氨基酸的缺失。
6.根據(jù)權利要求5的抗體，其中，由Vm-69或Vm-e基因編碼的重鏈可變域V區(qū)中，至少具有缺失第27位甘氨酸的突變。
7.根據(jù)權利要求1的抗體，其中，輕鏈可變域V區(qū)利用VLト44，VLト47或VLト51基因。
8.根據(jù)權利要求1的抗體，其中，該抗體在轉(zhuǎn)變?yōu)镮gG型抗體時的、在灶形成抑制試驗中的最小抑制濃度為10-n-10-012M量級。
9.根據(jù)權利要求1的抗體，其是人抗體。
10.根據(jù)權利要求1的抗體，其中，重鏈可變域的互補決定區(qū)I由序列號I所示氨基酸序列構成，并且，互補決定區(qū)2由序列號2所示氨基酸序列構成。
11.根據(jù)權利要求1 0的抗體，其中，重鏈可變域的框架區(qū)I由序列號3所示氨基酸序列構成。
12.根據(jù)權利要求1的抗體，其中，重鏈可變域V區(qū)由序列號4-9中任一個所示的氨基酸序列構成。
13.根據(jù)權利要求1的抗體，其中，重鏈可變域由序列號10-15中任一個所示的氨基酸序列構成。
14.根據(jù)權利要求1的抗體，其中，重鏈可變域和輕鏈可變域分別由下述(a)~⑴中的任一個所示的氨基酸序列構成: (a)序列號10和序列號16; (b)序列號10和序列號17; (c)序列號10和序列號18; (d)序列號10和序列號19; (e)序列號10和序列號20; (f)序列號10和序列號21; (g)序列號10和序列號22; (h)序列號11和序列號23; (i)序列號13和序列號24; (j)序列號14和序列號25; (k)序列號15和序列號26;和 (I)序列號12和序列號70.
15.一種用于流感的被動免疫治療劑,其含有根據(jù)權利要求1的抗體。
16.一種用于流感的被動免疫治療方法，該方法包括，向已被流感病毒感染的、或者存在被流感病毒感染的可能性的哺乳類或鳥類受試對象給藥有效量的根據(jù)權利要求1的抗體。
17.根據(jù)權利要求16的方法，其中，受試對象是人。
18.—種生產(chǎn)根據(jù)權利要求1的抗體的方法，該方法包括以下步驟: (1)提供包含抗體克隆的抗體文庫，所述抗體克隆是來自從一個個體采集到的大約IO8個以上的B細胞， (2)以Hl~H16中任一個的流感病毒、或該病毒的血凝素蛋白、或其胞外域作為抗原，使其與抗體文庫(I)接觸，網(wǎng)羅性地篩選與該抗原反應的抗體克隆， (3)由在步驟(2)中篩選到的各抗體克隆回收抗體分子， (4)針對在步驟(3)中獲得的各抗體，檢測所述抗體對選自組I的至少一種流感病毒和選自組2的至少一種流感病毒的中和活性，和 (5)使用產(chǎn)生中和屬于組I的流感病毒和屬于組2的流感病毒這二者的抗體的克隆來產(chǎn)生該抗體，回收該抗體。
19.根據(jù)權利要求18的方法，其中，抗體是人抗體。
20.根據(jù)權利要求1 8的方法，其中，抗體文庫是噬菌體展示文庫。
21.根據(jù)權利要求20的方法，其中，抗體克隆的數(shù)目為101°~IO11。
22.根據(jù)權利要求18的方法，其中，前述B細胞是通過單采血液成分術而采集到的。
23.根據(jù)權利要求18的方法，其中，在上述步驟(2)中，使用所述采集了B細胞的個體沒有感染史的流感病毒分離株、或其血凝素蛋白、或其胞外域作為抗原。
24.根據(jù)權利要求23的方法，其中，所述流感病毒分離株是H1、H2或H3型。
25.根據(jù)權利要求23的方法，其中，所述流感病毒分離株屬于所述采集了B細胞的個體沒有感染史的血凝素亞型。
26.根據(jù)權利要求25的方法,其中，所述流感病毒分離株屬于H5、H7或H9型。
27.根據(jù)權利要求18的方法，其中，在所述步驟(4)中，檢測對至少Hl型和/或H5型流感病毒和對H3型流感病毒的中和活性。
28.根據(jù)權利要求20的方法，其進一步包括將抗體轉(zhuǎn)變成IgG型的步驟。
29.一種檢測受試對象中的根據(jù)權利要求1的抗體的方法，該方法包括以下步驟: (1)向受試對象接種Hl型~H16型中任一項的亞型的血凝素， (2)接種后，在抗體產(chǎn)生細胞已充分地擴增時，從受試對象采集血液，和 (3)考察該血液中是否存在呈遞下述抗體的抗體產(chǎn)生細胞，所述抗體結合選自組I的亞型的血凝素和選自組2的亞型的血凝素這二者，并且具有由VH1-69或VHl-e基因編碼的重鏈可變域V區(qū)。
30.一種檢測受試對象中的根據(jù)權利要求1的抗體的方法，該方法包括以下步驟: (1)向受試對象分別接種選自組I的亞型的血凝素和選自組2的亞型的血凝素， (2)各血凝素接種后，在抗體產(chǎn)生細胞已充分地擴增時，從受試對象采集血液，和 (3)考察各血液中是否存在呈遞下述抗體的抗體產(chǎn)生細胞，所述抗體結合選自與所接種了的凝血素不同的組的亞型的血凝素，并且具有由VH1-69或VHl-e基因編碼的重鏈可變域V區(qū)。
【文檔編號】A61P31/16GK103476929SQ201180053180
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2011年9月2日 優(yōu)先權日:2010年9月3日
【發(fā)明者】黑澤良和, 伊庭善孝, 大島信子, 奧野良信 申請人:學校法人藤田學園, 一般財團法人阪大微生物病研究會