專利名稱：：減少炎性反應(yīng)的具有減少的脂磷壁酸的重組乳桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于減少炎癥的方法和組合物。對(duì)作為文本文件通過EFS-WEB提交的序列表的引用序列表的正式副本作為文本文件通過EFS-Web與說明書一起提交，其遵從美國信息交換標(biāo)準(zhǔn)碼(ASCII)，文件名稱為406734seqlist.txt，創(chuàng)建日期為2011年6月16日，大小為15.7KB。通過EFS-Web提交的序列表為說明書的一部分，因此通過引用以其整體結(jié)合到本文中。發(fā)明背景腸道免疫穩(wěn)態(tài)的維持涉及細(xì)菌微生物區(qū)系、腸上皮與宿主先天免疫細(xì)胞之間的平衡相互作用。這些免疫相互作用的失調(diào)可導(dǎo)致免疫功能障礙并引起明顯的炎癥，這是人炎性腸病(IBD)，包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病通常所具有的。盡管還未完全理解IBD的細(xì)胞和分子機(jī)制，但數(shù)據(jù)表明炎性細(xì)胞因子(例如IL-12)誘導(dǎo)的慢性腸炎癥起關(guān)鍵作用。這些細(xì)胞因子啟動(dòng)對(duì)強(qiáng)烈牽涉疾病進(jìn)展的致病性CD4+T細(xì)胞的分化。相應(yīng)地，研究顯示對(duì)這些細(xì)胞的調(diào)節(jié)減輕實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎。此外，如IL-12、活化樹突狀細(xì)胞(DC)利用IL-12p40亞基分泌的IL-23也牽涉多種自身免疫疾病(包括IBD)的發(fā)展。IL-23的炎性性質(zhì)已被歸因于對(duì)Thl7的誘導(dǎo)。此外，該細(xì)胞因子還激活DC中炎性細(xì)胞因子例如TNFα和IL-6的產(chǎn)生。合起來，研究顯示阻斷IL-12p40亞基信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)顯著減少炎癥，并表明IL-12和IL-23二者參與導(dǎo)致IBD的炎性級(jí)聯(lián)。與此二者細(xì)胞因子相反，IL-10對(duì)炎性信號(hào)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，從而調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子引發(fā)的免疫反應(yīng)。益生菌(probiotic)微生物可與宿主免疫細(xì)胞相互作用，并且特定益生菌乳桿菌種類可刺激DC產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子(即IL-12)和調(diào)節(jié)性IL-10。乳桿菌是人胃腸道中的正常棲居者(inhabitant)，且為小腸中天然小型生物群的主要組分。認(rèn)為這些細(xì)菌是有益的共生物，并且一些種類和菌株由于人類消費(fèi)的歷史悠久而被普遍認(rèn)為是安全的。本領(lǐng)域需要進(jìn)一步的方法和組合物以改進(jìn)炎性胃腸病癥例如IBD的治療。發(fā)明簡述提供用于減少受試者炎癥的方法和組合物。所述組合物包含經(jīng)遺傳修飾以減少細(xì)胞表面上脂磷壁酸(lipoteichoicacid)展示的重組細(xì)菌。方法包括給予受試者經(jīng)修飾以減少細(xì)胞表面上脂磷壁酸展示的重組細(xì)菌。給予所述重組細(xì)菌促進(jìn)所需的治療反應(yīng)。所述重組細(xì)菌可以以單劑量或系列劑量給予。方法在治療或預(yù)防多種炎性病癥包括，例如，治療或預(yù)防炎性腸病、結(jié)腸炎或克羅恩病中得到應(yīng)用。附圖簡述圖1(A和B)顯示LTA生物合成相關(guān)通路和基因。C-D顯示使用剪接重疊延伸(SOEing)PCR擴(kuò)增和連接的靶ORF內(nèi)部區(qū)域側(cè)翼的兩個(gè)非鄰接片段(Horton，RM(1995)MolBiotechnol.Apr;3(2):93-9)。將所得片段克隆到p0RI28并轉(zhuǎn)化到包含溫度敏感型輔助質(zhì)粒PTRK669的嗜酸乳桿菌(Z.acidophilus)NCK1392中。利用PCR，使用靶區(qū)域側(cè)翼的引物，針對(duì)缺失突變對(duì)ERM敏感型細(xì)胞進(jìn)行篩選，并通過對(duì)包含缺失的區(qū)域進(jìn)行測(cè)序來確認(rèn)。圖2(A)顯示用NCK56(也稱為嗜酸乳桿菌NCFM)或NCK2025處理的DC的表型。將骨髓來源的DC與NCK56或NCK2025共培養(yǎng)24小時(shí)。細(xì)胞用相應(yīng)的抗體染色，固定，隨后用FACSCalibur分析。B部分顯示單獨(dú)培養(yǎng)或與NCK56或NCK20251:1培養(yǎng)I和6小時(shí)的DC。提取RNA、反轉(zhuǎn)錄并使用針對(duì)TLRl和TLR2的引物進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。所顯示數(shù)據(jù)表示單獨(dú)的DC或這些細(xì)胞與NCK56或NCK2025的共培養(yǎng)物(I小時(shí))。C部分顯示細(xì)胞因子分析。通過ELISA測(cè)定NCK56或NCK2025處理以及未處理DC的上清液中釋放的細(xì)胞因子。D部分顯示T細(xì)胞增殖。連續(xù)四天用NCK56或NCK2025口服治療多組C57BL/6小鼠(5/組)。取得腸系膜LN-T細(xì)胞，并與NCK56或NCK2025處理的以及未處理的DC共培養(yǎng)4天以使用[3H]胸苷摻入測(cè)定T細(xì)胞增殖。在一些實(shí)驗(yàn)中，為恢復(fù)抑制的T細(xì)胞增殖，將抗IL-10抗體加入來源于與NCK2025共培養(yǎng)的DC的上清液中。來源于各組小鼠的腸系膜LN-T細(xì)胞與用嗜酸乳桿菌菌株處理或未處理的DC共培養(yǎng)以測(cè)定細(xì)胞因子。圖3顯示NCK2025對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的改善。A部分顯示連續(xù)4天經(jīng)口接種NCK56或NCK2025(5xl08cfu/100μ/小鼠)或PBS的C57BL/6小鼠(η=10)。將這些組的小鼠暴露于3%DSS(溶解在飲用水中)中5天，接著7天白水，并評(píng)估結(jié)腸炎隨時(shí)間的進(jìn)展，包括Η&Ε染色、體重減輕、腹灣和潛血檢測(cè)陽性(hemoccultpositivity)。B-E部分顯示結(jié)腸H&N染色。B顯示未處理的小鼠；C部分DSS處理的小鼠；D顯示NCK56-DSS處理的小鼠；以及E顯示NCK2025-DSS處理的小鼠。F表示結(jié)腸炎評(píng)分。FOB代表糞便潛血檢測(cè)血液陽性(fecalhemoccultbloodpositivity),DAI代表疾病活性指數(shù)。數(shù)據(jù)表示至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。G部分顯示結(jié)腸細(xì)胞因子分析。NCK56或NCK2025或DSS處理的小鼠(5/組)的結(jié)腸用冷PBS清洗，切成碎片，37°C培養(yǎng)18h。使用ELISA測(cè)定細(xì)胞因子。圖4顯示NCK2025對(duì)已建立的結(jié)腸炎的減輕。A-D部分顯示三組C57BL/6小鼠(10/組)，其首先接受五天周期的3%DSS(溶解在無菌水中)以引發(fā)結(jié)腸炎，其中的兩組隨后連續(xù)四天用NCK56或NCK2025口服治療。監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展，直至實(shí)驗(yàn)方案的第13天(此時(shí)小鼠被處死)，評(píng)估結(jié)腸。B-D部分顯示結(jié)腸H&N染色。B部分顯示DSS處理的小鼠；C部分顯示DSS-NCK56處理的小鼠；D部分顯示DSS-NCK2025處理的小鼠。E部分表示結(jié)腸炎評(píng)分。FOB代表糞便潛血檢測(cè)血液陽性，DAI代表疾病活性指數(shù)。數(shù)據(jù)表示至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。F部分顯示結(jié)腸細(xì)胞因子分析。洗滌各組小鼠的結(jié)腸，切成碎片，37°C培養(yǎng)18h。通過ELISA測(cè)定細(xì)胞因子。圖5顯示NCK2025對(duì)Treg細(xì)胞的誘導(dǎo)。A-B部分顯示連續(xù)4天經(jīng)口接種NCK56或NCK2025(5xl08cfu/100μ/小鼠)或PBS的C57BL/6小鼠(5/組)。在第五天，將小鼠處死，清洗分離的結(jié)腸。自每組小鼠制備結(jié)腸單細(xì)胞懸浮液，并通過Percol梯度富集。淋巴細(xì)胞用相應(yīng)的或同種型匹配抗體染色，并通過FACSCalibur分析。重復(fù)實(shí)驗(yàn)至少7次。圖6顯示IL-10+小鼠中結(jié)腸炎的誘導(dǎo)。A-B:C57BL/6IL-10+小鼠組(10/組)常規(guī)喂養(yǎng)I周。小鼠連續(xù)四天接種NCK56或NCK2025，然后喂食低劑量吡羅昔康(piroxicam)I周，隨后喂食高劑量吡羅昔康I周以加速并誘導(dǎo)結(jié)腸炎的發(fā)病。測(cè)定體重減輕，兩周后處死小鼠，制備結(jié)腸橫斷面瑞士卷(coloncross-sectionalSwissroll)和組織切片用于H&E染色。C顯示吡羅昔康單獨(dú)處理的小鼠；D顯示NCK56-吡羅昔康處理的小鼠；以及E顯示NCK2025-吡羅昔康處理的小鼠。這些評(píng)分在0-4的范圍內(nèi)無分別地測(cè)定。圖7顯示在小鼠中，在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中用NCK56或NCK202治療或不治療時(shí)的基因調(diào)節(jié)。A-B部分顯示DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎前給予NCK56、NCK2025或未處理達(dá)四天的小鼠(5/組)。分離近端或遠(yuǎn)端結(jié)腸區(qū)域并提取RNA。cDNA微陣列分析顯示小鼠結(jié)腸中免疫調(diào)節(jié)/刺激、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖、凋亡、血管發(fā)生和粘附相關(guān)通路的差異性基因表達(dá)模式。值表示與對(duì)照小鼠相比暴露于實(shí)驗(yàn)條件的基因表達(dá)的倍數(shù)增加(>1.0)或表達(dá)的倍數(shù)減少(〈1.0)。圖8提供SEQIDN0S:1-16的序列。發(fā)明詳述現(xiàn)在將在下文中參照附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更全面地描述，其中顯示本發(fā)明的一些但并非全部實(shí)施方案。事實(shí)上，這些發(fā)明可以以多種不同形式實(shí)施，并且不應(yīng)解釋為限于本文所示實(shí)施方案；更確切地，提供這些實(shí)施方案使得本公開內(nèi)容將滿足適用的法律要求。在全文中相似的數(shù)字指相似的元素。受益于前述說明和相關(guān)附圖所呈現(xiàn)的教導(dǎo)，這些發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將想到本文所示發(fā)明的多種修飾和其它實(shí)施方案。因此，應(yīng)理解的是，本發(fā)明并非限于所公開的特定實(shí)施方案，且修飾和其它實(shí)施方案意欲包括在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。盡管本文采用了特定術(shù)語，但其僅以一般性和描述性意義使用，而不用于限制目的。概沭提供用于減少受試者炎癥的方法和組合物，包括用于治療或預(yù)防炎性病癥的方法和組合物。使用經(jīng)修飾以減少細(xì)菌細(xì)胞表面上LTA展示的重組細(xì)菌，這些方法和組合物可用于減少胃腸道炎癥。胃腸道明顯炎癥是人IBD(包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病)的代表性特征。通過減少細(xì)胞表面上的LTA展示，本發(fā)明重組細(xì)菌比相應(yīng)的野生型細(xì)菌細(xì)胞顯著減少凈的炎性反應(yīng)。因此，提供多種重組細(xì)菌及其使用方法，其在有需要的受試者中通過刺激抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和限制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生而減少炎性反應(yīng)。LTA展示減少的重組細(xì)菌細(xì)胞提供減少細(xì)胞表面上LTA展示的方法和組合物。如本文所使用的，細(xì)胞表面上LTA展示的減少包括與適當(dāng)?shù)膶?duì)照相比，細(xì)胞表面上展示的LTA水平的任何統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的減少。這樣的減少可包括，例如，細(xì)胞表面上展示的LTA的量至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的減少。測(cè)定細(xì)胞表面上LTA量的方法包括，例如，丁醇和疏水相互作用色譜(MorathS，GeyerA,&HartungT(2001)JExpMed193(3):393-397)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)(Tadler等(2005)JClinLabAnal.1989;3(I):21)。如本文所使用的，術(shù)語“表面”、`“細(xì)胞表面”或“細(xì)菌表面”指包括質(zhì)膜和在質(zhì)膜外的細(xì)菌細(xì)胞的區(qū)域。革蘭氏陽性細(xì)菌在質(zhì)膜外包含一層其中散布磷壁酸的肽聚糖。革蘭氏陰性細(xì)菌還包含覆蓋肽聚糖層的外膜。因此，本發(fā)明表面上LTA的展示可在革蘭氏陽性細(xì)菌質(zhì)膜或肽聚糖層中或上，或在革蘭氏陰性細(xì)菌的質(zhì)膜、肽聚糖層或外膜中或上。提供經(jīng)遺傳修飾以減少細(xì)胞表面上LTA展示的重組細(xì)菌細(xì)胞。如本文所使用的，術(shù)語“重組細(xì)菌”或“重組細(xì)菌細(xì)胞”指其中對(duì)于目的基因已產(chǎn)生至少一種遺傳改變的細(xì)菌或多個(gè)(plurality)或細(xì)菌細(xì)胞，或源自于如此改變的細(xì)胞并且包括遺傳改變的細(xì)胞。因此，如本文所使用的，術(shù)語“遺傳修飾的”或“遺傳修飾”指對(duì)于目的基因或核酸序列已產(chǎn)生的遺傳改變，例如缺失、添加或取代。在一些實(shí)施方案中，所述遺傳改變?yōu)槿斯ぶ亟M技術(shù)所導(dǎo)致的改變。在一些實(shí)施方案中遺傳改變包括向細(xì)菌細(xì)胞基因組內(nèi)引入異源多核苷酸。如本文所使用的，關(guān)于序列“異源的”為來源于外來物種的序列，或者，若源自同一物種，則自其天然形式在組成和/或基因組位點(diǎn)方面基本上被修飾。例如，可操作地連接到異源多核苷酸的啟動(dòng)子來自與衍生該多核苷酸的物種不同的物種，或者，若來自相同/類似物種，則其一或二者自其原始形式和/或基因組位點(diǎn)基本上被修飾，或所述啟動(dòng)子不是可操作地連接的多核苷酸的天然啟動(dòng)子。本文所述方法和組合物中可使用任何目的細(xì)菌。在具體實(shí)施方案中，所述細(xì)菌包括益生菌細(xì)菌。如本文使用的術(shù)語“益生菌”指給予足夠量時(shí)賦予宿主健康益處的活微生物(FA02001:參見網(wǎng)址isapp.net/docs/ProbioticDefinition.pdf)或至少一種有助于受試者腸道健康和平衡的生物。在具體實(shí)施方案中，其也被稱為“友好的”、“有益的”或“好的”細(xì)菌，當(dāng)受試者攝入時(shí)其幫助維持健康腸道并幫助部分或完全減輕病和/或疾病的一種或多種癥狀。如本文所使用的，“益生菌性質(zhì)”包括增強(qiáng)的腸功能和穩(wěn)定性、改善的針對(duì)傳染和非傳染性疾病的防護(hù)、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、減輕的乳糖不耐性、改善的消化和營養(yǎng)物吸收、減少的血液膽固醇、減少的變態(tài)反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)和減少的尿道感染風(fēng)險(xiǎn)。在一些實(shí)施方案中，益生菌性質(zhì)包括接受益生菌細(xì)菌的受試者中抗炎細(xì)性胞因子產(chǎn)生的增加、接受益生菌細(xì)菌的受試者中促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的減少或接受益生菌細(xì)菌的受試者中抗炎與促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的比率增加。在一些實(shí)施方案中，已經(jīng)對(duì)本文所述細(xì)菌進(jìn)行修飾以增強(qiáng)一種或多于一種益生菌性質(zhì)。例如，在一些實(shí)施方案中，提供已被修飾以增加胃腸上皮粘附并已被進(jìn)一步修飾以減少細(xì)胞表面上LTA展示的細(xì)菌。在其它實(shí)施方案中，提供已被修飾以增加酸或膽汁抗性并已被進(jìn)一步修飾以減少細(xì)胞表面上LTA展示的細(xì)菌。在其它實(shí)施方案中，所述細(xì)菌為乳酸細(xì)菌。如本文所使用的，“乳酸細(xì)菌”是指選自以下屬的細(xì)菌:氣球菌屬(AGrococcu)、肉桿菌屬ijOetrnobeicteriurn)、腸球菌屬{Enterococcus)、乳球菌屬{Lactococcus)、乳桿菌屬、明串珠菌屬、Leuconostoe)、酒球菌屬、0enococcus)、片球菌屬(Pediococcus)、鏈球菌屬{Streptococcus)、蜜蜂球菌屬(Melissococcus)、差異球菌屬(Alloiococcii)、狡詐球菌屬iPolosigranulimi)、乳球形菌屬、四聯(lián)球菌屬(TfetrageflococciAs)、漫游球菌屬(Vagvcoccus)和魏斯氏菌屬{Weissella)(Holzapfel攀(2001)Am.J.Clin.Nutr.73:365S-373S;Sneath,ed.(1986)BergeyfsManualofSystematicBacteriology第2卷，Lippincott,Williams和Wilkins,Hagerstown,MD)。在又其它實(shí)施方案中，使用乳桿菌。“乳桿菌”意指來自乳桿菌屬的任何細(xì)菌，包括但不限于干酪乳桿菌(Z.類干酪乳桿菌(Z.、路氏乳桿菌(Z.rewieri)、鼠李糖乳桿菌(Z.、約氏乳桿菌(Z.jbAflso/wi)、加氏乳桿菌(Z.gasseri)、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌H.、發(fā)酵乳桿菌H./e/mwiw)、唾液乳桿菌{L.、保加利亞乳桿菌(Z.buIgaricus)以及Wood等概述的許多其它種類(Holzapfel和Wood,eds.(1995)TheGeneraofLacticAcidBacteria(乳酸細(xì)菌JM),第2卷”Springer,NewYork)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述細(xì)菌為嗜酸乳桿菌NCFM。LTA展示減少的細(xì)菌的產(chǎn)生、所述細(xì)菌起子培養(yǎng)物的制備以及使底物特別是食物底物例如牛奶發(fā)酵的方法可根據(jù)已知技術(shù)實(shí)施，所述技術(shù)包括但不限于MjiyrjHVEkinen和Bigret(1993)LacticAcidBacteria.Salminen和vonWright編輯.MarcelDekker,Inc.NewYork.65-96.;Sandine(1996)DairystarterculturesCbgan和Accolas編輯.VCH出版社，NewYork.191-206;Gilliland(1985)BacterialstarterculturesforFood.CRCPress,BocaRaton,Florida中所描述的技術(shù)。本文所述細(xì)菌細(xì)胞可在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),如Sambrook攀(1989)MolecularCloning,ALaboratoryManual(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))(第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork)中所一般性描述的。在一些實(shí)施方案中，本文所述細(xì)菌菌株為生物學(xué)上純的細(xì)菌培養(yǎng)物，所述細(xì)菌包含至少一種如本文所述導(dǎo)致細(xì)胞表面上LTA展示減少的遺傳改變。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述細(xì)菌包含一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸添加、缺失和/或取代。這些菌株可包括但不限于:嗜酸乳桿菌、加氏乳桿菌、約氏乳桿菌或植物乳桿菌?！吧飳W(xué)上純的”是指90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%不含其它細(xì)菌細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，本文所述細(xì)菌菌株與其它細(xì)菌菌株組合存在，以產(chǎn)生混合培養(yǎng)物?！皩?duì)照”或“對(duì)照細(xì)胞”或“對(duì)照細(xì)菌”為測(cè)量重組細(xì)菌細(xì)胞表型變化提供參考點(diǎn)。對(duì)照細(xì)菌可包括，例如:(a)野生型細(xì)菌，即，具有與起始材料(其用于產(chǎn)生主題細(xì)菌的遺傳改變)相同的基因型；或(b)具有與起始材料相同的基因型但已用空構(gòu)建體(nullconstruct)(即,用對(duì)目的性狀無已知作用的構(gòu)建體,例如包含標(biāo)記基因的構(gòu)建體)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。LTA相關(guān)多肽和多核苷酸已經(jīng)改變細(xì)胞表面上LTA展示減少的重組細(xì)菌使得至少一種LTA相關(guān)多核苷酸或多肽的活性水平已被調(diào)節(jié)(即升高或降低)。如本文所使用的，術(shù)語“LTA”指脂磷壁酸，一種糖脂錨定在膜中和聚(甘油磷酸酯)(Gro-P)鏈延伸至壁中的大型兩親性分子。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語“LTA”或“脂磷壁酸”包括壁磷壁酸(WTA)，一種與細(xì)胞壁肽聚糖層共價(jià)連接的磷壁酸。LTA的生物合成從碳水化合物單元通過糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移以形成錨定在細(xì)胞內(nèi)部膜上的糖脂開始。糖脂通過膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞并錨定在細(xì)胞外面的細(xì)胞膜上。最終，磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶將甘油磷酸酯(Gro-P)單元轉(zhuǎn)運(yùn)至錨定的糖脂以形成伸長的LTA(圖1)。因此，本發(fā)明LTA相關(guān)多核苷酸和多肽應(yīng)理解為包括細(xì)胞表面上LTA產(chǎn)生、組成、轉(zhuǎn)運(yùn)、裝配以及展示有關(guān)的多核苷酸和多肽。在一些實(shí)施方案中，細(xì)菌表面上LTA的展示減少以調(diào)節(jié)給予細(xì)菌的受試者的炎性反應(yīng)。這些LTA相關(guān)序列的片段和變體也可用于實(shí)施本文所述方法。如本文所使用的，術(shù)語“基因”和“重組基因”指包含開放閱讀框的核酸分子，特別是編碼LTA產(chǎn)生、裝配或展示有關(guān)蛋白的那些。在一個(gè)實(shí)施方案中，LTA相關(guān)多核苷酸和多肽包含SEQIDN0S:1和2，或其活性片段或變體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，LTA相關(guān)多核苷酸和多肽包含SEQIDNOS:3-16或其活性片段或變體。LTA相關(guān)多核苷酸包含編碼LTA相關(guān)蛋白的編碼序列，以及調(diào)節(jié)序列例如啟動(dòng)子兩者。LTA相關(guān)多核苷酸可進(jìn)一步包含正確翻譯LTA相關(guān)mRNA所必需的位點(diǎn)，例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)。分離的LTA、細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞表面相關(guān)多肽和蛋白、或分泌的所述多肽和蛋白及其變體和片段為包括在內(nèi)的。用于本發(fā)明目的，術(shù)語“蛋白”和“多肽”可互換使用。如本文所使用的，術(shù)語“表達(dá)”指源自本發(fā)明核酸片段的有義(mRNA)或反義RNA的翻譯。表達(dá)可還指mRNA翻譯為多肽。減小LTA展示提供調(diào)節(jié)靶LTA相關(guān)多核苷酸表達(dá)水平(濃度和/或活性)的方法和組合物。如本文所使用的，“靶序列”包括期需調(diào)節(jié)表達(dá)水平的任何序列。靶序列包括編碼和不編碼多肽的序列。功能性LTA相關(guān)多核苷酸或多肽理解為編碼負(fù)責(zé)細(xì)菌表面上LTA產(chǎn)生、裝配、轉(zhuǎn)運(yùn)或展示的蛋白、序列或RNA。因此，表達(dá)降低的LTA相關(guān)多核苷酸或多肽將產(chǎn)生與其野生型相應(yīng)物相比LTA表面展示減少的細(xì)菌。在一些實(shí)施方案中，LTA表面展示減少的細(xì)菌可減少或預(yù)防患有IBD例如結(jié)腸炎的受試者的炎性反應(yīng)?！皽p少”或“降低”多核苷酸或其編碼的多肽的表達(dá)水平意欲指靶序列的多核苷酸或多肽水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于適當(dāng)對(duì)照中相同靶序列的多核苷酸水平或多肽水平。在特定實(shí)施方案中，根據(jù)目前公開的主題降低靶序列的多核苷酸水平和/或多肽水平導(dǎo)致適當(dāng)對(duì)照中相同靶序列的多核苷酸水平或其編碼的多肽水平至少95%的降低、至少90%的降低、至少80%的降低、至少70%的降低、至少60%的降低、至少50%的降低、至少40%的降低、至少30%的降低、至少20%的降低、至少10%的降低、至少5%的降低。在其它實(shí)施方案中，降低靶序列的多核苷酸水平和/或多肽水平導(dǎo)致與適當(dāng)對(duì)照相比，多核苷酸水平或其編碼的多肽水平約3%-15%、10%-25%、20%-35%、30%_45%、40%_55%、50%_65%、60%_75%、70%_90%、70%_80%、70%-85%、80%-95%、90%-100%的降低。用于測(cè)定RNA轉(zhuǎn)錄物水平、所編碼多肽水平或多核苷酸或多肽活性的方法在本文別處討論。在一些實(shí)施方案中，提高目的多核苷酸或多肽水平可減少細(xì)胞表面上LTA的展示。“增加”或“提高”多核苷酸或其編碼的多肽水平意指靶序列的多核苷酸或多肽水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于適當(dāng)對(duì)照中相同靶序列的多核苷酸水平或多肽水平。在特定實(shí)施方案中，根據(jù)目前公開的主題提高靶序列的多核苷酸水平和/或多肽水平導(dǎo)致適當(dāng)對(duì)照中相同靶序列的多核苷酸水平或其編碼的多肽水平至少95%的提高、至少90%的提高、至少80%的提聞、至少70%的提聞、至少60%的提聞、至少50%的提聞、至少40%的提聞、至少30%的提高、至少20%的提高、至少10%的提高、至少5%的提高。在其它實(shí)施方案中，提高靶序列的多核苷酸水平和/或多肽水平導(dǎo)致與適當(dāng)對(duì)照相比，多核苷酸水平或其編碼的多肽水平約3%-15%、10%-25%、20%-35%、30%_45%、40%_55%、50%_65%、60%_75%、70%_90%、70%_80%、70%-85%、80%-95%、90%-100%的提高。用于測(cè)定RNA轉(zhuǎn)錄物水平、所編碼多肽的水平或多核苷酸或多肽活性的方法在本文別處討論。表面LTA展示減少的重組生物可使用多種技術(shù)構(gòu)建。在本發(fā)明中，可降低編碼LTA裝配途徑中一個(gè)的至少一種酶例如磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶或糖基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸或多肽的表達(dá),如本文所述。在一個(gè)實(shí)施方案中，降低LTA相關(guān)多肽(包括磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶)的水平。在某些實(shí)施方案中，降低SEQIDNO:2所示磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶或其活性片段或變體的表達(dá)。磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶是參與將Gro-P單元轉(zhuǎn)移至糖脂從而延伸LTA鏈的多肽。已經(jīng)知道多種磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶多肽和編碼所述多肽的基因。如本文所使用的，磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶包括LTA合酶(LtaS)、甘油憐酸轉(zhuǎn)移酶(glycerolphosphotransferase)、甘油憐酸轉(zhuǎn)移酶(glycerophosphotransferase)和任何其它催化Gro-Ρ單元轉(zhuǎn)移以形成LTA聚甘油磷酸酯主鏈的多肽。磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶為堿性磷酸酶超家族(MdoB[C0G1368]磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶)的成員。參見,例如,NCBI登錄號(hào)NZ_ACGX01000068.1和NC_010609.1。這些參考的每一個(gè)通過引用結(jié)合到本文中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，LTA相關(guān)多肽可包括糖基轉(zhuǎn)移酶。在該實(shí)施方案中，使用本文別處描述的任何降低多核苷酸或多肽水平的方法降低糖基轉(zhuǎn)移酶水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，降低SEQIDNO:4或6所示糖基轉(zhuǎn)移酶或其活性片段或變體的表達(dá)。糖基轉(zhuǎn)移酶為參與LTA的糖脂或脂錨合成的多肽。已經(jīng)知道糖基轉(zhuǎn)移酶多肽和編碼所述多肽的基因。如本文所使用的，術(shù)語糖基轉(zhuǎn)移酶指催化LTA的糖脂或脂錨合成的任何多肽，包括例如YgpP、Ugt、BgsA、IagA、LafA或LafB。糖基轉(zhuǎn)移酶為糖基轉(zhuǎn)移酶_GTB_型超家族[cl10013]的成員。已知多種糖基轉(zhuǎn)移酶。參見，例如NCBI登錄號(hào)NC_010609.1和EF138835.1。這些參考的每一個(gè)通過弓I用結(jié)合到本文中。對(duì)磷壁酸的D-Ala取代的質(zhì)量和水平可減少細(xì)胞表面上LTA的展示。D-丙氨酰LTA的合成需要操縱子編碼的四個(gè)蛋白，DltA、DltB、DltC或DltD。因此，在一些實(shí)施方案中，LTA相關(guān)多核苷酸或多肽可包括Dlt操縱子中所示多核苷酸或多肽，包括SEQIDN0S:9-16。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用本文別處所述任何降低LTA相關(guān)多核苷酸或多肽水平的方法降低DltA、DltB、DltC或DltD水平。已知dlt操縱子的多種成員。參見，例如NCBI登錄號(hào)AAF09201(DltA)、NCBI登錄號(hào)AAB17658.1(DltB)、NCBI登錄號(hào)CAR86674.1(DltC)和NCBI登錄號(hào)CAQ65981.1(DltD)。這些參考的每一個(gè)通過引用結(jié)合到本文中。LTA的結(jié)構(gòu)可使用已知技術(shù)通過NMR和MS測(cè)量。參見,例如，MorathS，GeyerA,&HartungT(2001)JExpMed193(3):393-397。LTA相關(guān)多核苷酸或多肽表達(dá)的降低可通過本領(lǐng)域熟知的多種技術(shù)實(shí)現(xiàn)。例如，可通過突變降低基因表達(dá)。所述突變可為插入、缺失、取代或其組合，只要該突變導(dǎo)致功能性LTA相關(guān)蛋白表達(dá)降低或?qū)е翷TA相關(guān)多核苷酸表達(dá)降低使得細(xì)胞表面上LTA展示減少。LTA展示減少的細(xì)菌可用于減少受試者炎性反應(yīng)，從而治療或預(yù)防炎性腸病，例如結(jié)腸炎?？墒褂弥亟MDNA技術(shù)向染色體的特定位點(diǎn)引入突變。這樣的突變可為插入、缺失、一個(gè)核苷酸被另一個(gè)核苷酸置換或其組合，只要突變基因?qū)е鹿δ苄訪TA相關(guān)蛋白表達(dá)降低或?qū)е翷TA相關(guān)基因表達(dá)降低使得細(xì)胞表面上LTA展示減少。這樣的突變可通過缺失若干喊基對(duì)獲得。在一個(gè)實(shí)施方案中，單個(gè)喊基對(duì)的缺失可致使LTA相關(guān)蛋白無功能，從而減少細(xì)菌表面上LTA的展示，這是因?yàn)橛捎谠撏蛔?，其它堿基對(duì)不再處于正確的閱讀框中。在其它實(shí)施方案中，移去多個(gè)堿基對(duì)例如100個(gè)堿基對(duì)。在又其它的實(shí)施方案中，缺失整個(gè)LTA相關(guān)基因的長度。在開放閱讀框中引入終止密碼子的突變或?qū)е麻_放閱讀框移碼的突變可用于降低LTA相關(guān)基因的表達(dá)。用于降低LTA相關(guān)基因表達(dá)以減少LTA展示的其它技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知。例如，技術(shù)可包括通過定向誘變修飾基因序列、限制酶消化后重新連接、基于PCR的誘變技術(shù)、等位交換、等位置換、RNA干擾或翻譯后修飾。標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)例如將LTA相關(guān)基因克隆入質(zhì)粒、用限制酶消化基因、隨后用內(nèi)切核酸酶處理、重新連接以及同源重組為本領(lǐng)域所熟知，并在Maniatis/Sambrook(Sambrook,J.攀Molecularcloning:alaboratorymanual(分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)).1SBN0-87969-309-6)中描述。定向誘變可使用Clontech出售的TRANSFORMER試劑盒通過體外定向誘變方式獲得。PCR技術(shù)在(Dieffenbach&Dreksler;PCRprimers,alaboratorymanual(PCR引物，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)).ISBN0-87969-447-3和ISBN0-87969-447-5)中詳細(xì)描述。認(rèn)為編碼區(qū)中的突變以及正確轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的序列(包括調(diào)節(jié)序列例如啟動(dòng)子)中的突變落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，通過定向誘變修飾重組細(xì)菌以在表面上具有減少的LTA展示。在其它實(shí)施方案中，LTA展示減少的細(xì)菌自細(xì)菌種群中分離。將理解的是，本文所用術(shù)語分離的指從其天然環(huán)境中分離出的細(xì)菌。這可例如從混合細(xì)菌種群或環(huán)境樣品中純化。分離的細(xì)菌基本上不含其它細(xì)菌種類和該細(xì)菌天然環(huán)境組分?；静缓渌?xì)菌種類和天然環(huán)境組分的細(xì)菌包括污染細(xì)菌種類或天然環(huán)境組分少于約30%、20%、10%、5%或1%的細(xì)菌制備物。測(cè)定法檢測(cè)所公開多肽和/或核酸分子表達(dá)的測(cè)定法可包括LTA的檢測(cè)和/或定量。用于檢測(cè)LTA的方法在本文別處描述。細(xì)菌細(xì)胞表面上LTA展示的減少可導(dǎo)致暴露在細(xì)菌中的宿主細(xì)胞的抗炎性反應(yīng)增加或促炎性反應(yīng)減少。測(cè)量抗炎性或促炎性反應(yīng)的測(cè)定法，例如，還可用于評(píng)估本發(fā)明LTA相關(guān)多肽的表達(dá)。測(cè)量炎性反應(yīng)的方法亦在本文別處描述。片段和變體根據(jù)上下文，“片段”指多肽或蛋白氨基酸序列的一部分，或編碼多肽或蛋白氨基酸序列的一部分的多核苷酸。片段可保留原始蛋白的活性，因此，這樣的“活性”片段包括，例如，LTA相關(guān)蛋白的片段，例如保留磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶活性的SEQIDNO:2的片段。LTA相關(guān)核苷酸序列的片段，例如編碼活性磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶的SEQIDNO:1的片段，可編碼具有生物學(xué)活性的蛋白片段。此外，LTA相關(guān)蛋白片段包括SEQIDN0S:2、4、6、8、10、12、14和16的片段。生物學(xué)活性核苷酸片段可如下制備:分離LTA相關(guān)多核苷酸或多肽的部分，表達(dá)LTA相關(guān)蛋白的編碼部分并評(píng)估LTA相關(guān)蛋白的編碼部分的活性。在其它實(shí)施方案中，LTA相關(guān)蛋白核苷酸序列的片段不需編碼生物學(xué)活性多肽，而是可包含表達(dá)時(shí)抑制靶LTA相關(guān)多肽表達(dá)的多核苷酸(即有義、反義、miRNA或siRNA抑制)。LTA相關(guān)多核苷酸的片段包括SEQIDN0S:1、3、5、7、9、11、13和15的片段。LTA相關(guān)核酸分子的片段包含至少約15、20、50、75、100、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000個(gè)核苷酸或多達(dá)本文所公開全長LTA相關(guān)核苷酸序列中存在的核苷酸總數(shù)的核苷酸。氨基酸序列的片段包括包含與LTA相關(guān)蛋白的氨基酸序列足夠相同或衍生自LTA相關(guān)蛋白的氨基酸序列的氨基酸序列的肽，或部分長度的蛋白并且顯示至少一種LTA相關(guān)蛋白活性(即調(diào)節(jié)細(xì)胞表面上展示的LTA水平)，但其包含比本文所公開全長LTA相關(guān)蛋白少的氨基酸。LTA相關(guān)蛋白的生物學(xué)活性部分可為這樣的多肽，其為例如10、25、50、100、150、200個(gè)連續(xù)氨基酸長度或多達(dá)本發(fā)明全長LTA相關(guān)蛋白(即SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14或16)中存在的氨基酸總數(shù)。這些生物學(xué)活性部分可通過重組技術(shù)制備并針對(duì)天然LTA相關(guān)蛋白的一種或多種功能活性，例如磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶活性進(jìn)行評(píng)估。如本文所使用的，片段包含SEQIDN0S:2、4、6、8、10、12、14或16的至少5個(gè)連續(xù)氨基酸。然而，本發(fā)明包括其它片段，例如蛋白中多于6、7、8或9個(gè)氨基酸的片段。在一些實(shí)施方案中提供已被修飾以降低本文別處所提供核苷酸和氨基酸序列的變體表達(dá)的重組細(xì)菌。變體意指足夠相同的序列。因此，本發(fā)明包括細(xì)菌，其經(jīng)修飾以降低與編碼SEQIDNOS:2、4、6、8、10、12、14或16中LTA相關(guān)蛋白的核苷酸序列足夠相同的核酸分子的表達(dá)或降低包含SEQIDNOS:1、3、5、7、9、11、13或15核苷酸序列或其互補(bǔ)序列(complement)的核酸分子的表達(dá)。變體多核苷酸進(jìn)一步包括包含一個(gè)或數(shù)個(gè)添加、缺失或取代的序列。變體還包括本發(fā)明核苷酸序列編碼的變體多肽。此外，本發(fā)明多肽具有與SEQIDN0S:2、4、6、8、10、12、14或16中所示氨基酸序列足夠相同的氨基酸序列?！白銐蛳嗤摹币庵敢环N氨基酸序列或核苷酸序列與另一氨基酸序列或核苷酸序列性比，包含足夠或最小數(shù)目的相當(dāng)或相同氨基酸殘基或核苷酸，因此提供共同的結(jié)構(gòu)域和/或表明共同的功能活性。保守變體包括由于遺傳密碼簡并性而不同的那些核苷酸序列。一般而言，分別與SEQIDN0S:2、4、6、8、10、12、14或16的任一氨基酸序列或SEQIDN0S:1、3、5、7、9、11、13或15的任一核苷酸序列具有至少約45%、55%、或65%同一性、優(yōu)選至少約70%或75%同一性、更優(yōu)選至少約80%、85%或90%、最優(yōu)選至少約91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%序列同一性的氨基酸序列或核苷酸序列，在本文中被定義為足夠相同的。本發(fā)明所包括的變體蛋白具有生物學(xué)活性，即其保留所需的天然蛋白LTA相關(guān)生物學(xué)活性，例如SEQIDNO:2的磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶活性。參見，例如，Varcamonti攀(2003)Appl.Environ.Microbiol.69:1287-1289。蛋白的生物學(xué)活性變體可與該蛋白具有少至1-15個(gè)氨基酸殘基、少至1-10例如6-10、少至5、少至4、3、2或甚至I個(gè)氨基酸殘基的差異。LTA相關(guān)多肽可通過多種方式改變，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。用于誘變和多核苷酸改變的方法為本領(lǐng)域所熟知。參見，例如，Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA82:488-492;Kunkel攀(1987)MethodsinEnzymol.154:367-382;U.S.專利號(hào)4，873，192;Walker和Gaastra,eds.(1983)TechniquesinMolecularBiology(分子生物學(xué)技術(shù))(MacMillan出版公司，NewYork)及其中引用的參考文獻(xiàn)。關(guān)于不影響目的蛋白生物學(xué)活性的氨基酸取代的指導(dǎo)可參見Dayhoff攀(1978)AtlasofProteinSequenceandStructure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)的模型，其通過引用結(jié)合到本文。可進(jìn)行保守取代，例如一個(gè)氨基酸用另一個(gè)具有相似性質(zhì)的氨基酸進(jìn)行交換。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是，本文所公開LTA相關(guān)多肽的活性可通過常規(guī)篩查測(cè)定法，例如本文別處所描述的測(cè)定法評(píng)估。如本文所使用的，“天然序列”多肽包括與來源于自然的相應(yīng)多肽具有相同氨基酸序列的多肽。這些天然序列多肽可從自然分離或可通過重組和/或合成方法產(chǎn)生。術(shù)語“天然序列”特別地包括多肽的天然存在的截短、可溶或分泌形式、天然存在的變體形式以及天然存在的等位變體。如本文所使用的，兩個(gè)多核苷酸或多肽序列背景下的“序列同一性”或“同一性”為當(dāng)在特定比較窗口內(nèi)比對(duì)最大對(duì)應(yīng)性時(shí)，涉及兩個(gè)序列中相同的殘基。當(dāng)序列同一性百分?jǐn)?shù)關(guān)于蛋白而使用時(shí)，公認(rèn)不相同的殘基位點(diǎn)往往因保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸殘基被具有相似化學(xué)性質(zhì)(例如，電荷或疏水性)的氨基酸殘基取代，并因此不改變?cè)摲肿拥墓δ苄再|(zhì)。當(dāng)序列差異在于保守取代時(shí)，序列同一性百分?jǐn)?shù)可向上調(diào)整以校正取代的保守性質(zhì)。因這些保守取代而不同的序列被認(rèn)為具有“序列相似性”或“相似性”。進(jìn)行該調(diào)整的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。典型地，其涉及給作為部分而非完全錯(cuò)配的保守取代評(píng)分，從而增加序列同一性百分?jǐn)?shù)。因此，例如，當(dāng)相同氨基酸給予分?jǐn)?shù)1，非保守取代給予分?jǐn)?shù)O時(shí)，保守取代給予0-1之間的分?jǐn)?shù)。計(jì)算保守取代的評(píng)分，例如在程序PC/GENE(Intelligenetics,MountainView,California)中執(zhí)行。如本文所使用的，“序列同一性百分?jǐn)?shù)”意指通過在比較窗口內(nèi)比較兩個(gè)最佳比對(duì)序列所確定的值，其中為了兩個(gè)序列的最佳比對(duì)，比較窗口中的多核苷酸序列部分與參考序列(其不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即空位)。所述百分?jǐn)?shù)如下計(jì)算:確定兩序列中出現(xiàn)相同核酸堿基或氨基酸殘基的位點(diǎn)數(shù)目以得到匹配位點(diǎn)數(shù)目，將匹配位點(diǎn)數(shù)目除以比較窗口中的總位點(diǎn)數(shù)并將該結(jié)果乘以100以得到序列同一性百分?jǐn)?shù)。除非另外說明，本文所提供序列同一性/相似性值指使用GAP版本10獲得的值，其使用下列參數(shù):使用GAP權(quán)重50和長度權(quán)重3的核苷酸序列％同一丨生和％相似性以及nwsgapdna.cmp評(píng)分矩陣,使用GAP權(quán)重8和長度權(quán)重2的氨基酸序列％同一'丨生和％相似性以及BL0SUM62評(píng)分矩陣；或其任何等價(jià)程序。“等價(jià)程序”意指對(duì)于任何兩個(gè)目的序列，與GAP版本10產(chǎn)生的相應(yīng)比對(duì)相比時(shí)，產(chǎn)生具有相同核苷酸或氨基酸殘基匹配的比對(duì)以及相同的序列同一性百分?jǐn)?shù)的任何序列比較程序。治療和預(yù)防方法提供用于減少受試者炎癥的方法，包括給予本文別處所述重組細(xì)菌。在一些實(shí)施方案中，給予LTA展示減少的重組細(xì)菌可改善受試者的IBD例如結(jié)腸炎癥狀。在其它實(shí)施方案中，給予LTA展示減少的重組細(xì)菌可預(yù)防受試者IBD例如結(jié)腸炎發(fā)病。在一些實(shí)施方案中，LTA相關(guān)蛋白(包括，例如，磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶)表達(dá)降低(包括，例如，SEQIDN0:1或其活性片段或變體表達(dá)降低)的重組細(xì)菌在細(xì)胞表面上具有減少的LTA展示，并且可改善已建立結(jié)腸炎的癥狀和預(yù)防結(jié)腸炎發(fā)病。參見下文實(shí)施例1。在一些實(shí)施方案中，提供用于在受試者中局部治療和/或預(yù)防胃腸道炎癥、治療和/或預(yù)防胃腸道炎性病癥以及局部治療腸疼痛的方法?！爸委煛痹诒疚闹卸x為治愈、愈合、緩和、減輕、改變、醫(yī)治、改良、改善或影響患有胃腸病癥的受試者的癥狀。待治療受試者可患有胃腸病癥或處于出現(xiàn)胃腸病癥的風(fēng)險(xiǎn)中，包括例如，患有炎性腸病或處于出現(xiàn)炎性腸病的風(fēng)險(xiǎn)中。給予重組細(xì)菌可用于預(yù)防或治療目的?！邦A(yù)防”意指重組細(xì)菌預(yù)防性地提供，即細(xì)菌在任何癥狀之前提供。預(yù)防性給予重組細(xì)菌用于預(yù)防或減弱任何后續(xù)的癥狀。當(dāng)治療性地提供時(shí)，細(xì)菌在癥狀出現(xiàn)時(shí)(或其后不久)提供。物質(zhì)的治療性給予用于減弱任何實(shí)際癥狀?！笆茉囌摺币庵竸?dòng)物。在具體實(shí)施方案中，受試者為哺乳動(dòng)物，例如靈長類或人。在其它實(shí)施方案中，受試者包括馴養(yǎng)動(dòng)物例如貓科動(dòng)物或犬科動(dòng)物，或農(nóng)用動(dòng)物例如反芻動(dòng)物、馬、豬、家禽或綿羊。在具體實(shí)施方案中，用本發(fā)明藥物制劑進(jìn)行治療的受試者為人。在一些實(shí)施方案中，進(jìn)行治療的人可為新生兒、嬰兒、幼兒、青春期前的少年、青少年或成年人。本發(fā)明的受試者可能患有胃腸病癥的癥狀或可能有胃腸病癥的風(fēng)險(xiǎn)(例如已進(jìn)行抗生素治療的受試者)。胃腸病癥本發(fā)明方法和組合物涉及炎性胃腸病癥的治療。如本文所使用的，術(shù)語“炎性胃腸病癥”或“胃腸病癥”或“胃腸道炎性病癥”指免疫系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)細(xì)胞介導(dǎo)的胃腸道或腸疾病。炎性胃腸病癥包括，例如，炎性腸病(IBD)例如克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎、淋巴細(xì)胞結(jié)腸炎、顯微鏡下結(jié)腸炎、膠原性結(jié)腸炎、自身免疫性腸病、變應(yīng)性胃腸疾病和嗜酸性胃腸疾病，以及腹瀉、胃氣脹、腸胃氣脹、腹部絞痛、腹痛或便秘。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法涉及肥胖癥或肥胖癥癥狀包括IBD、腹瀉、胃氣脹、腸胃氣脹、腹部絞痛、腹痛或便秘的治療或預(yù)防。參見，例如，KadookaY等(2010)EurJClinNutr.64(6):636-43,其通過引用結(jié)合到本文中。在一些實(shí)施方案中，炎癥的減少可包括刺激腸健全；降低腸通透性；改善粘蛋白合成、分泌和/或質(zhì)量；改善腸上皮的成熟和分化；改善營養(yǎng)吸收；增加轉(zhuǎn)移抗微生物活性的可溶性因子的產(chǎn)生；刺激、改善或支持感染抗性；支持針對(duì)病毒或細(xì)菌感染的細(xì)胞或體液應(yīng)答；增加細(xì)胞毒性(抗病毒和抗腫瘤兩者)；支持全身和/或粘膜接種應(yīng)答；提高或支持細(xì)胞和/或體液免疫；提高或支持天然免疫(包括嗜中性粒細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞活性)；提高或支持適應(yīng)性T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫；刺激輔助T細(xì)胞I(Thl)細(xì)胞因子模式(提高IL-1、IL-2、IFN-y、IL-12、TNF-a;人白細(xì)胞抗原-Dr(HLA-Dr)表達(dá))；抑制炎癥或產(chǎn)生全身和粘膜炎癥介質(zhì)(包括細(xì)胞因子和/或趨化因子)；通過降低總IgE和/或變應(yīng)原特異性IgE而降低敏化；降低變應(yīng)性細(xì)胞因子的產(chǎn)生；降低Th2支持性免疫球蛋白概況及其組合。本文所用術(shù)語“抗炎細(xì)胞因子”指在具有該細(xì)胞因子受體的細(xì)胞中引發(fā)抗炎反應(yīng)的天然存在的或重組的蛋白、其類似物或其片段。本發(fā)明抗炎細(xì)胞因子可為控制促炎細(xì)胞因子應(yīng)答的免疫調(diào)節(jié)分子。本發(fā)明抗炎細(xì)胞因子包括白介素(IL)-1受體拮抗物、IL-4、IL-10、IL-1l和IL-13、IL-16、IFN-a,TGF-β、G_CSF。本文所用術(shù)語“促炎細(xì)胞因子”是指有利于炎癥的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子。本發(fā)明的促炎細(xì)胞因子包括ILl-a、ILl-β、TNF-a、IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-17、IL-18、TNF-a、LT、LIF、制瘤素或IFN-a、IFN-β、IFN-γ。在一些實(shí)施方案中，給予重組細(xì)菌導(dǎo)致抗炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的增加。如本文所使用的，抗炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的增加或提高包括與適當(dāng)?shù)膶?duì)照相比抗炎細(xì)胞因子水平的任何統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的增加。所述增加可包括，例如，抗炎細(xì)胞因子水平至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%或更大的增加。所述增加還可包括，例如，抗炎細(xì)胞因子水平至少約3%-15%、10%-25%、20%-35%、30%_45%、40%_55%、50%_65%、60%_75%、70%_85%、80%-95%、90%-105%、100%_115%、105%_120%、115%-130%、125%_150%、140%_160%、155%-500%或更大的增加。測(cè)定抗炎細(xì)胞因子水平的方法是已知的。參見，例如，LengS.，攀(2008)JGerontolABiolSciMedSci63(8):879-884。測(cè)定抗炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的方法包括多重微珠測(cè)定法(multiplexbeadassay)、ELISP0T和流式細(xì)胞術(shù)。參見,例如，Maecker等(2005)BMCImmunology6:13。方法和組合物還包括降低促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的方法和組合物，其可減少或防止炎性反應(yīng)。如本文所使用的，促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生水平的降低包括與適當(dāng)對(duì)照相比受試者中促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生水平的任何統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的降低。所述降低可包括，例如，促炎細(xì)胞因子水平至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的降低。測(cè)定細(xì)胞因子水平的方法是已知的，包括，例如LengS.，等(2008)JGerontolABiolSciMedSci63(8):879-884。測(cè)定促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的方法包括多重微珠測(cè)定法、ELISP0T和流式細(xì)胞術(shù)。參見，例如，Maecker攀(2005)BMCImmunology6:13。炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生還可通過測(cè)定抗炎細(xì)胞因子產(chǎn)生與促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的比率測(cè)量。在特定方面，與適當(dāng)對(duì)照相比抗炎細(xì)胞因子產(chǎn)生與促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的比率增加約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、300、600、900、1000倍或更多。在其它方面，與適當(dāng)對(duì)照相比抗炎細(xì)胞因子產(chǎn)生與促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的比率增加約1-5倍、約5-10倍、約10-20倍、約20-30倍、約30-40倍、約40倍-60倍、約60倍-80倍、約80倍-約100倍、約100-200倍、約200倍-300倍、約300-400倍、約400-約500倍、約500-約500倍、約500倍-約700倍、約700倍-800倍、約800倍-約1000倍或更多。測(cè)定抗炎細(xì)胞因子產(chǎn)生與促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的比率的方法可參見例如，LengS.，等(2008)JGerontolABiolSciMedSci63(8):879-884。測(cè)定細(xì)胞因子產(chǎn)生的方法包括多重微珠測(cè)定法、ELISP0T和流式細(xì)胞術(shù)。參見，例如，Maecker等(2005)BMCImmunology6:13。炎性病癥在一些實(shí)施方案中，通過使用本文別處所述組合物和方法減少炎癥，可治療或預(yù)防免疫和炎性病癥。例如，可通過本文所述方法和組合物治療或預(yù)防的病癥包括，但不限于:關(guān)節(jié)炎(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎)、銀屑病、皮炎包括特應(yīng)性皮炎、慢性自身免疫性蕁麻疹、多肌炎/皮肌炎、中毒性表皮壞死松解癥、系統(tǒng)性硬皮病和硬化癥、呼吸窘迫綜合征、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、腦膜炎、過敏性鼻炎、腦炎、葡萄膜炎、結(jié)腸炎、腎小球腎炎、過敏性病況、濕疹、哮喘、T細(xì)胞浸潤和慢性炎癥反應(yīng)相關(guān)病況、動(dòng)脈粥樣硬化、自身免疫心肌炎、白細(xì)胞粘附缺陷、全身性紅斑狼瘡(SLE)、狼瘡(包括腎炎、非腎臟的、盤狀、脫發(fā))、青少年糖尿病、多發(fā)性硬化癥、過敏性腦脊髓炎、細(xì)胞因子和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)型過敏癥相關(guān)免疫反應(yīng)、結(jié)核病、結(jié)節(jié)病、肉芽腫病包括韋格納氏肉芽腫病(Wegener’sgranulomatosis)、粒細(xì)胞缺乏癥、血管炎(包括ANCA)、再生障礙性貧血、Coombs陽性貧血、DiamondBlackfan貧血、免疫溶血性貧血包括自身免疫溶血性貧血(AIHA)、惡性貧血、純紅細(xì)胞再生障礙(PRCA)、因子VIII缺乏、血友病A、自身免疫性中性粒細(xì)胞減少癥、全血細(xì)胞減少癥、白血球減少癥、白細(xì)胞滲出相關(guān)疾病、CNS炎性病癥、多發(fā)性器官損傷綜合征、重癥肌無力、抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病、抗腎小球基底膜疾病、抗磷脂抗體綜合征、變應(yīng)性視神經(jīng)炎、Bechet疾病、Castleman氏綜合征、古德帕斯丘綜合征、蘭伯特-伊頓肌無力綜合征、Reynaud氏綜合征、Sjorgen氏綜合征、史-約綜合征(Stevens-Johnsonsyndrome)、實(shí)體器官移植排斥(包括高群體反應(yīng)性抗體滴度的預(yù)處理、組織中的IgA沉積等)、移植物抗宿主疾病(GVHD)、大皰性類天皰瘡、天皰瘡(均包括尋常天皰瘡和落葉狀天皰瘡)、自身免疫性多內(nèi)分泌腺病、萊特爾氏病(Reiter’sdisease)、僵人綜合征、巨細(xì)胞動(dòng)脈炎、免疫復(fù)合物性腎炎、IgA腎病、IgM多神經(jīng)病或IgM介導(dǎo)的神經(jīng)病、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板減少癥、睪丸和卵巢自身免疫性疾病包括自身免疫性睪丸炎和卵巢炎、原發(fā)性甲狀腺功能減退癥、自身免疫性內(nèi)分泌性疾病包括自身免疫性甲狀腺炎、慢性甲狀腺炎(橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto’sThyroiditis))、亞急性甲狀腺炎、特發(fā)性甲狀腺功能減退癥、阿狄森氏病(Addison’sdisease)、格雷夫氏病(Grave’sdisease)、自身免疫性多腺體綜合征(或多腺體內(nèi)分泌病綜合征)、I型糖尿病又稱胰島素依賴型糖尿病(IDDM)和席漢氏綜合癥(Sheehan’ssyndrome)、自身免疫性肝炎、淋巴間質(zhì)性肺炎(HIV)、閉塞性細(xì)支氣管炎(非移植)與NSIP、格林-巴利綜合癥(Guillain-Barre’Syndrome)、大血管血管炎(包括風(fēng)濕性多肌痛和巨細(xì)胞(高安氏)動(dòng)脈炎)、中血管血管炎(包括川崎病和結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎)、強(qiáng)直性脊柱炎、貝格爾氏病(Berger’sDisease)(IgA腎病)、急進(jìn)性腎小球腎炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、口炎性腹瀉(麩質(zhì)腸病)、冷球蛋白血癥、ALS或冠狀動(dòng)脈疾病。在具體實(shí)施方案中，通過減少受試者的炎癥，治療或預(yù)防心臟病癥。如本文所使用的心臟病癥包括但不限于心力衰竭(包括但不限于心臟肥大、左心衰竭和右心衰竭)、缺血性心臟病(包括但不限于心絞痛、心肌梗死、慢性缺血性心臟病和心臟性猝死)、高血壓性心臟病(包括但不限于全身性(左側(cè))高血壓性心臟病和肺部(右側(cè))高血壓性心臟病)、瓣膜性心臟病(包括但不限于鈣化引起的瓣膜變性，例如鈣化性主動(dòng)脈瓣狹窄、先天性二葉主動(dòng)脈瓣鈣化、二尖瓣環(huán)鈣化、二尖瓣粘液瘤樣變性(二尖瓣脫垂)、風(fēng)濕熱、風(fēng)濕性心臟病、感染性心內(nèi)膜炎、和非感染的贅生物例如非細(xì)菌性血栓性心內(nèi)膜炎和全身性紅斑狼瘡心內(nèi)膜炎(Libman-Sacks疾病)、類癌性心臟病和人工瓣膜并發(fā)癥)、心肌病(包括但不限于擴(kuò)張型心肌病、肥厚型心肌病、限制型心肌病和心肌炎)、心包疾病(包括但不限于心包積液、心包積血、心包炎包括急性心包炎和愈合性心包炎(healedpericarditis)、類風(fēng)濕性心臟病)、贅生物性心臟病(neoplasticheartdisease)(包括但不限于原發(fā)性心臟腫瘤,例如粘液瘤、脂肪瘤、乳頭狀纖維彈性組織瘤、橫紋肌瘤、肉瘤,和非心臟贅生物的心臟效應(yīng))、先天性心臟病(包括但不限于左向右分流-晚發(fā)紺，例如房間隔缺損、室間隔缺損、動(dòng)脈導(dǎo)管未閉、和房室間隔缺損；右向左分流-早發(fā)紺，例如法洛四聯(lián)癥、大動(dòng)脈易位、動(dòng)脈干、三尖瓣閉鎖、和完全性肺靜脈異常連接；阻塞性先天異常，例如主動(dòng)脈縮窄、肺動(dòng)脈狹窄和閉鎖、主動(dòng)脈狹窄和閉鎖)以及心臟移植相關(guān)病癥。藥物組合物在一些實(shí)施方案中，將LTA展示減少的細(xì)菌菌株以營養(yǎng)藥物組合物(nutraceuticalcomposition)例如營養(yǎng)補(bǔ)劑和/或食品添加劑的形式給予受試者。在具體的實(shí)施方案中，藥物組合物包含已經(jīng)修飾以降低編碼磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸或多肽(例如SEQIDNO:1和2中所示多核苷酸和多肽)表達(dá)的重組細(xì)菌。在其它實(shí)施方案中，將提取物以藥物組合物的形式給予受試者。如本文其它部分所述，給予可包括單劑量或多劑量給予。藥物組合物可以是液體制劑或固體制劑。當(dāng)藥物組合物是固體制劑時(shí)，其可配制成片劑、口含片(suckingtablet)、咀嚼片、口香糖、膠囊劑、小藥囊劑、散劑、顆粒劑、包衣顆粒、包衣片、腸包衣片、腸包衣膠囊、口溶條(meltingstrip)或膜。如果藥物組合物是液體制劑，則其可配制成口服溶液劑、混懸劑、乳劑或糖漿劑。所述組合物還可包含獨(dú)立選自(但不限于)以下的載體材料:乳酸發(fā)酵食品、發(fā)酵乳制品、抗性淀粉、膳食纖維、碳水化合物、蛋白質(zhì)和糖基化蛋白質(zhì)。本文所用術(shù)語“藥物組合物”可配制成食物組合物、膳食補(bǔ)充劑、功能食品、醫(yī)藥用食品或營養(yǎng)制品，只要達(dá)到所需作用，即治療或預(yù)防胃腸道炎性病癥。所述食物組合物可選自飲料、酸奶、果汁、冰淇淋、面包、餅干、薄脆餅干、谷類食物、健康條(healthbar)、涂味品(spreads)和營養(yǎng)制品。食物組合物還可包含載體材料，其中所述載體材料選自乳酸發(fā)酵食品、發(fā)酵乳制品、抗性淀粉、膳食纖維、碳水化合物、蛋白質(zhì)和糖基化蛋白質(zhì)。按照本發(fā)明使用的或按照本發(fā)明產(chǎn)生的本發(fā)明的藥物組合物還可包含眾所周知的其它物質(zhì)，例如惰性溶媒或藥學(xué)上可接受的輔助劑、載體、防腐劑等。本公開內(nèi)容還包括重組細(xì)菌彼此的組合，和/或與一種或多種可用于治療胃腸道炎性病癥的其它藥劑的組合。例如，本發(fā)明細(xì)菌可與有效劑量的治療胃腸道炎性病癥的常規(guī)抗炎劑例如潑尼松(prednisone)、美沙拉秦(mesalamine)、硫唑嘌呤、TNF抑制劑、氨甲喋呤或6-巰嘌呤組合給予。術(shù)語“組合給予”指活性劑的同時(shí)給予和序貫給予兩者。組合療法當(dāng)然并不限于本文提供的藥劑，而是包括用于治療炎性病癥的任何組合物。治療有效量“治療有效劑量”、“治療有效量”或“有效量”意指給予受試者時(shí)減少炎性反應(yīng)或防止炎性反應(yīng)增加的LTA展示減少的重組細(xì)菌的量?！瓣栃灾委煼磻?yīng)”指，例如，改善炎性胃腸病癥的至少一種癥狀的病況。有效量的治療劑根據(jù)預(yù)定目的確定。術(shù)語“單位劑量“是指適用于受試者的物理獨(dú)立單位，各單位含有經(jīng)計(jì)算產(chǎn)生所需的與其給予(即合適的途徑和治療方案)相關(guān)的反應(yīng)的治療組合物的預(yù)定量。按照治療次數(shù)和單位劑量兩者的待給予的量，取決于待治療的受試者、受試者的狀態(tài)和所需保護(hù)。治療組合物的確切量還取決于從業(yè)人員的判斷，并且為每個(gè)個(gè)體所特有。一般而言，重組細(xì)菌的劑量可隨例如患者的年齡、體重、身高、性別、一般醫(yī)學(xué)狀況和既往病史等因素而變化。在具體的實(shí)施方案中，可合乎需要的是，給予細(xì)菌的范圍為約IO4-約IO12CFUUO5-1O11CFUUO6-1O10CFUUO8-1O10CFU或IO8-1O12CFU。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述方法包括給予多劑量的細(xì)菌。所述方法可包括給予1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或更多治療有效劑量的包含本文所述細(xì)菌的組合物。在一些實(shí)施方案中，在I天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天、30天或超過30天的時(shí)程內(nèi)給予劑量。多劑量組合物的給予頻率和持續(xù)時(shí)間是這樣的，使得降低或預(yù)防炎性反應(yīng)，從而治療或預(yù)防胃腸病癥。此外，用治療有效量的本發(fā)明的重組細(xì)菌治療受試者可包括單一治療或可包括系列治療。還應(yīng)理解的是，可在具體治療進(jìn)程中增加或減少用于治療的細(xì)菌的有效劑量。劑量的改變可起因于本領(lǐng)域已知的和本文描述的用于檢測(cè)炎癥的診斷測(cè)定結(jié)果，并且從該結(jié)果來看是顯然的。保藏物申請(qǐng)人:于2011年I月10日在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC)，馬納薩斯，VA20110USA對(duì)營麼黑/f朦NCK2025進(jìn)行了保藏，ATCC保藏號(hào)為PTA-11587。自本申請(qǐng)?zhí)峤蝗掌谥埃?011年I月10日保藏在ATCC的細(xì)菌培養(yǎng)物取自由北卡羅來納州立大學(xué)，100SchaubHall，校園郵箱(CampusBox)7624，羅利(Raleigh)，北卡羅來納州，27695維持的保藏物。在本申請(qǐng)未決期間，向?qū)＠虡?biāo)局局長及局長授權(quán)而定的人員提出請(qǐng)求時(shí)，可獲得該保藏物。在本申請(qǐng)任何權(quán)利要求的許可時(shí)，申請(qǐng)人將依照37C.F.R.§1.808使公眾可獲得該保藏物。嗜酸乳桿菌保藏物將在作為公共保藏機(jī)構(gòu)的ATCC保藏機(jī)構(gòu)維持達(dá)30年的時(shí)間，或在最新要求后5年，或?qū)＠蓪?shí)施期限(哪個(gè)期限較長就維持該較長的期限)，且如果保藏物在該期限內(nèi)變得非存活的，則將更換。另外，申請(qǐng)人已符合或?qū)⒎?7C.F.R.§§1.801-1.809的全部要求，包括在保藏時(shí)提供樣品存活性的說明。申請(qǐng)人無權(quán)免除有關(guān)生物材料轉(zhuǎn)移或其商業(yè)運(yùn)輸時(shí)法律所強(qiáng)加的任何限制。根據(jù)上文提供的描述，提供下列實(shí)施方案:已編號(hào)的實(shí)施方案:1.重組或分離的細(xì)菌，其已經(jīng)被遺傳修飾以減少所述細(xì)菌表面上脂磷壁酸(LTA)的展示。2.實(shí)施方案I的重組或分離的細(xì)菌，其中所述重組或分離的細(xì)菌已經(jīng)被遺傳修飾以降低磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶表達(dá)。3.實(shí)施方案I或2的重組或分離的細(xì)菌，其中所述重組或分離的細(xì)菌已經(jīng)被遺傳修飾以降低包含與SEQIDNO:1所示核酸序列具有至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一'I"生的核苷酸序列的多核苷酸表達(dá)。4.實(shí)施方案I或2的重組或分離的細(xì)菌，其中所述重組或分離的細(xì)菌已經(jīng)被遺傳修飾以降低包含SEQIDNO:1所不核苷酸序列的多核苷酸表達(dá)。5.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的重組或分離的細(xì)菌，其中所述重組或分離的細(xì)菌為益生菌細(xì)菌。6.實(shí)施方案5的重組或分離的細(xì)菌，其中所述益生菌細(xì)菌為乳酸細(xì)菌。7.實(shí)施方案6的重組或分離的細(xì)菌，其中所述乳酸細(xì)菌為乳桿菌。8.實(shí)施方案7的重組細(xì)菌，其中所述乳桿菌為嗜酸乳桿菌。9.實(shí)施方案8的重組或分離的細(xì)菌，其中所述遺傳修飾對(duì)嗜酸乳桿菌NCFM實(shí)施。10.實(shí)施方案8的重組或分離的細(xì)菌，其中所述嗜酸乳桿菌為以ATCC登記號(hào)PTA-11587保藏的嗜酸乳桿菌NCK2025。11.制備重組或分離的細(xì)菌的方法，所述方法包括遺傳修飾細(xì)菌以減少所述細(xì)菌表面上脂磷壁酸(LTA)展示。12.實(shí)施方案11的方法，其中所述重組或分離的細(xì)菌已經(jīng)被修飾以降低磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)。13.實(shí)施方案11或12的方法，其中所述重組或分離的細(xì)菌已經(jīng)被遺傳修飾以降低包含與SEQIDNO:1所示核苷酸序列具有至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸表達(dá)。14.實(shí)施方案11-13中任一個(gè)的方法，其中所述重組細(xì)菌為益生菌細(xì)菌。15.實(shí)施方案14的方法，其中所述益生菌細(xì)菌為乳酸細(xì)菌。16.實(shí)施方案15的方法，其中所述乳酸細(xì)菌為乳桿菌。17.實(shí)施方案16的方法，其中所述乳桿菌為嗜酸乳桿菌。18.實(shí)施方案17的方法，其中所述遺傳修飾對(duì)嗜酸乳桿菌NCFM實(shí)施。19.實(shí)施方案17的方法，其中所述嗜酸乳桿菌為以ATCC登記號(hào)PTA-11587保藏的嗜酸乳桿菌NCK2025。20.實(shí)施方案17-19中任一個(gè)的方法，其中所述嗜酸乳桿菌已經(jīng)被修飾以降低包含SEQIDNO:1所示核苷酸序列的多核苷酸表達(dá)。21.減少受試者炎癥的方法，包括給予所述受試者治療有效量的實(shí)施方案1-10中任一個(gè)的重組或分離的細(xì)菌。22.治療或預(yù)防受試者胃腸道炎性病癥的方法，包括給予受試者治療有效量的實(shí)施方案1-10中任一個(gè)的重組或分離的細(xì)菌。23.實(shí)施方案21或22中任一個(gè)的方法，其中所述受試者為動(dòng)物。24.實(shí)施方案23的方法，其中所述受試者為哺乳動(dòng)物。25.實(shí)施方案24的方法，其中所述受試者為人。26.實(shí)施方案23的方法，其中所述受試者為馴養(yǎng)動(dòng)物。27.實(shí)施方案23的方法，其中所述受試者為農(nóng)用動(dòng)物。28.實(shí)施方案21-27中任一個(gè)的方法，其中所述受試者患有胃腸病癥。29.實(shí)施方案28的方法，其中所述胃腸病癥選自炎性腸病、克羅恩病、腸易激綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎、肥胖癥、腹瀉、胃氣脹、腸胃氣脹、腹部絞痛、腹痛、便秘及其任何組合。30.實(shí)施方案21-29中任一個(gè)的方法，其中所述細(xì)菌增加所述受試者中一種或多種抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。31.實(shí)施方案30的方法，其中所述抗炎細(xì)胞因子為IL-10。32.實(shí)施方案21-31中任一個(gè)的方法，其中所述細(xì)菌降低所述受試者中一種或多種促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。33.實(shí)施方案32的方法，其中所述促炎細(xì)胞因子選自IL-12、IL-6、IFNY、TNFa及其任何組合。34.實(shí)施方案21-33中任一個(gè)的方法，其中所述細(xì)菌的治療有效量為約IO8-1O12CFU/天。35.包含實(shí)施方案1-10中任一個(gè)的重組或分離的細(xì)菌的藥物組合物。36.實(shí)施方案1-10中任一個(gè)的重組或分離的細(xì)菌，其用作藥物。37.實(shí)施方案1-10中任一個(gè)的重組或分離的細(xì)菌，其用于治療或預(yù)防受試者例如實(shí)施方案23-27中任一個(gè)的受試者的胃腸道炎性病癥。38.實(shí)施方案36或37的重組或分離的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌導(dǎo)致所述受試者中抗炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的增加。39.實(shí)施方案38的重組或分離的細(xì)菌，其中所述抗炎細(xì)胞因子為IL-10。40.實(shí)施方案36-39中任一個(gè)的重組或分離的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌降低所述受試者中一種或多種促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。41.實(shí)施方案40的重組或分離的細(xì)菌，其中所述促炎細(xì)胞因子選自IL-12、IL_6、IFNY,TNFa及其任何組合。42.實(shí)施方案36-41中任一個(gè)的重組或分離的細(xì)菌，其中將所述細(xì)菌配制為以治療有效量給予受試者，其中所述細(xì)菌的治療有效量為約IO8-1O12CFU/天。43.實(shí)施方案36-42中任一個(gè)的重組或分離的細(xì)菌，其中所述胃腸病癥選自炎性腸病、克羅恩病、腸易激綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎、肥胖癥、腹瀉、胃氣脹、腸胃氣脹、腹部絞痛、腹痛、便秘及其任何組合。44.實(shí)施方案1-10中任一個(gè)的細(xì)菌在制造藥物中的用途。45.44中的細(xì)菌在制造用于治療或預(yù)防受試者例如實(shí)施方案23-27中任一個(gè)的受試者的胃腸道病癥的藥物中的用途。46.實(shí)施方案44或45中的細(xì)菌在制造用于治療炎性病癥的藥物中的用途。47.實(shí)施方案46的細(xì)菌的用途，其中所述病癥選自炎性腸病、克羅恩病、腸易激綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎、肥胖癥、腹瀉、胃氣脹、腸胃氣脹、腹部絞痛、腹痛、便秘及其任何組口ο48.實(shí)施方案1-10中任一個(gè)的細(xì)菌作為藥物的用途。49.實(shí)施方案48中細(xì)菌的用途，其中所述藥物用于治療或預(yù)防受試者例如實(shí)施方案23-27中任一個(gè)的受試者的胃腸道病癥。50.實(shí)施方案48或49中的細(xì)菌的用途，其中所述病癥為炎性病癥。51.實(shí)施方案50的細(xì)菌的用途，其中所述胃腸病癥選自炎性腸病、克羅恩病、腸易激綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎、肥胖癥、腹瀉、胃氣脹、腸胃氣脹、腹部絞痛、腹痛、便秘及其任何組合。未編號(hào)的實(shí)施方案根據(jù)第一個(gè)方面，提供重組或分離的細(xì)菌，其經(jīng)遺傳修飾以減少所述細(xì)菌表面上脂磷壁酸(LTA)的展示。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組或分離的細(xì)菌已被遺傳修飾以降低磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)。在具體實(shí)施方案中，重組或分離的細(xì)菌已被遺傳修飾以使磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)與未修飾的對(duì)照相比降低約3%-15%、10%-25%、20%-35%、30%-45%、40%-55%、50%-65%、60%-75%、70%-90%、70%-80%、70%-85%、80%-95%、90%-100%。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，重組或分離的細(xì)菌以被遺傳修飾以降低包含與SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13或15中任一所示核酸序列或其片段或變體具有至少70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸表達(dá)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，重組或分離的細(xì)菌已被遺傳修飾以降低包含SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13或15的核苷酸序列或其片段或變體的多核苷酸表達(dá)。根據(jù)第二個(gè)方面，提供制備重組或分離的細(xì)菌的方法，所述方法包括遺傳修飾細(xì)菌以減少該細(xì)菌表面上脂磷壁酸的展示。在具體實(shí)施方案中，通過定向誘變修飾細(xì)菌。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述重組或分離的細(xì)菌已被修飾以降低磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)。將理解的是，降低磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)可由DNA、RNA或翻譯后水平的破壞導(dǎo)致，獲得這種表達(dá)降低的合適方法在本領(lǐng)域是已知的，并在本文中進(jìn)一步詳細(xì)討論。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組或分離的細(xì)菌已被遺傳修飾以降低包含與SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13或15中任一個(gè)所示核酸序列或其片段或變體具有至少70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸表達(dá)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，嗜酸乳桿菌已被修飾以降低包含SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13或15所示核苷酸序列或其片段或變體的多核苷酸表達(dá)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述重組或分離的細(xì)菌為益生菌細(xì)菌。特別地，乳酸細(xì)菌。更特別地，乳桿菌特別是嗜酸乳桿菌。甚至更特別地，遺傳修飾對(duì)嗜酸乳桿菌NCFM實(shí)施。在具體實(shí)施方案中，重組或分離的細(xì)菌為以ATCC登記號(hào)PTA-11587保藏的嗜酸乳桿菌NCK2025。第三方面，提供減少受試者炎癥的方法，包括給予所述受試者治療有效量的本文別處所述重組或分離的細(xì)菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，炎癥的減少治療或預(yù)防心臟疾病例如冠狀動(dòng)脈疾病或心力衰竭。第四方面，提供治療或預(yù)防胃腸道炎性病癥的方法，包括給予受試者治療有效量的本文別處所述重組或分離的細(xì)菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者為動(dòng)物，更特別地哺乳動(dòng)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中受試者為人。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中受試者為馴養(yǎng)動(dòng)物。在又進(jìn)一步的實(shí)施方案中，受試者為農(nóng)用動(dòng)物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，受試者患有胃腸病癥。在具體實(shí)施方案中，所述胃腸病癥選自炎性腸病、克羅恩病、腸易激綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎、肥胖癥、腹瀉、胃氣脹、腸胃氣脹、腹部絞痛、腹痛、便秘及其任何組合。將理解的是，細(xì)菌可增加受試者中一種或多種抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。在具體實(shí)施方案中，抗炎細(xì)胞因子為IL-10。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)菌降低受試者中一種或多種促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，促炎細(xì)胞因子選自:IL-12、IL_6、IFNY、TNFa或其任何組合。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，細(xì)菌以治療有效量給予，其中所述細(xì)菌的治療有效量為約IO8-1O12CFU/天。根據(jù)第五個(gè)方面，提供包含本文所述重組或分離的細(xì)菌的藥物組合物。根據(jù)第六個(gè)方面，提供用作藥物的本文所述重組或分離的細(xì)菌。根據(jù)第七個(gè)方面，提供用于治療或預(yù)防受試者胃腸道病癥的本文所述重組或分離的細(xì)菌。特別地，所述病癥為炎性病癥。更特別地，所述胃腸病癥選自炎性腸病、克羅恩病、腸易激綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎、肥胖癥、腹瀉、胃氣脹、腸胃氣脹、腹部絞痛、腹痛、便秘及其任何組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于本文所述方法的重組或分離的細(xì)菌增加受試者抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗炎細(xì)胞因子為IL-10。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于本文所述方法的重組或分離的細(xì)菌降低受試者一種或多種促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。`在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，促炎細(xì)胞因子選自:IL-12、IL_6、IFNY、TNFa或其任何組合。將理解的是，細(xì)菌以治療有效量提供，其中所述細(xì)菌的治療有效量為約IO8-1O12CFU/天。根據(jù)第八個(gè)方面，提供本文別處所述細(xì)菌在制造藥物中的用途。在具體實(shí)施方案中，所述藥物用于治療或預(yù)防受試者胃腸道病癥。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述病癥為炎性病癥。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述胃腸病癥選自炎性腸病、克羅恩病、腸易激綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎、肥胖癥、腹瀉、胃氣脹、腸胃氣脹、腹部絞痛、腹痛、便秘及其任何組合。根據(jù)第九個(gè)方面，提供本文所述細(xì)菌作為藥物的用途。在具體實(shí)施方案中，所述藥物用于治療或預(yù)防受試者的胃腸道病癥。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述病癥為炎性病癥。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述病癥選自炎性腸病、克羅恩病、腸易激綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎、肥胖癥、腹瀉、胃氣脹、腸胃氣脹、腹部絞痛、腹痛、便秘及其任何組合。將顯而易見的是，關(guān)于本文所述任何方面的受試者可為任何合適的受試者，例如關(guān)于上述第四方面所描述的受試者。進(jìn)一步的方面如上所述。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見的是，關(guān)于一個(gè)特定方面所描述的任何特征同樣適用于所有其它方面，除非另外特別說明或明顯不相容。下列實(shí)施例以說明的方式而非限制的方式提供。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1減少嗜酸乳桿菌的LTA展示。在嗜酸乳桿菌wm(NCK56)中，鑒定基因LBA0444-LBA0447并注釋其在LTA生物合成中的推定作用(圖1B)?；騆BA0444和LBA0448兩側(cè)為推定的rho非依賴性終止子(KingsfordC，AyanbuleK,&SalzbergS(2007)GenomeBiology8(2):R22)，提示此兩基因?yàn)楣厕D(zhuǎn)錄的并起操縱子作用。雖然LBA0444-LBA0447基因在LTA生物合成中具有推定的作用，但LBA0448為在該級(jí)聯(lián)中似乎不發(fā)揮作用的假定蛋白。乳桿菌物種可有效激活DC中的多種信號(hào)，其繼而誘發(fā)T細(xì)胞免疫反應(yīng)(MohamadzadehM,等(2005)ProcNatlAcacISciUSA102(8):2880-2885;KonstantinovSR,等(2008)ProcNatlAcacISciUSA105(49):19474-19479)。為了進(jìn)一步研究修飾DC功能涉及的分子機(jī)制，我們特別刪除了嗜酸乳桿菌NCK56的磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶基因(LBA0447)。該基因組區(qū)域的PCR分析顯示該缺失突變體NCK2025失去2kbp(圖1C-D)0該區(qū)域內(nèi)的測(cè)序確定了LBA0447的消除。親本NCK56和突變體NCK2025的細(xì)胞壁提取物的色譜分析證明磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶基因已缺失的突變體中不存在LTA。NCK2025處理的DC。DC與NCK56或LTA-陰性突變體(NCK2025)的共培養(yǎng)顯示NCK2025下調(diào)DC表面上的MHCI1、CD40、CD80和CD86(圖2A)。此外，用NCK56處理DC誘導(dǎo)TLRl和2的轉(zhuǎn)錄，而在NCK2025處理的DC中此兩種模式識(shí)別受體(PRR)未活化(圖2B)。兩個(gè)菌株均誘導(dǎo)DC中IL-10的產(chǎn)生；然而，該細(xì)胞因子的產(chǎn)生在與NCK2025共培養(yǎng)的DC中顯著增加(圖2C)。伴隨地，IL-12和TNFα在NCK2025處理的DC中顯著減少(圖2C)。通過共培養(yǎng)腸系膜LN來源的T細(xì)胞與用NCK56或NCK2025處理的骨髓來源的DC來測(cè)定T細(xì)胞增殖。相對(duì)于NCK56，與T細(xì)胞共培養(yǎng)的NCK2025處理的DC中T細(xì)胞增殖顯著消除(圖2D)。有趣的是，向NCK2025處理的DC上清液中加入抗IL-10抗體部分地恢復(fù)了T細(xì)胞的增殖，提示IL-10可為DC:T細(xì)胞共培養(yǎng)物中調(diào)節(jié)T細(xì)胞增殖的關(guān)鍵因子。對(duì)收集的DC:T細(xì)胞共培養(yǎng)物上清液的分析顯示T細(xì)胞中IL-10被高度誘導(dǎo)，而IFNY、IL-2和TNFa自NCK2025處理的小鼠的T細(xì)胞中最小程度地釋放(圖2E)。NCK2025對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的改善。為確定NCK2025在體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)，在3%DSS暴露前(預(yù)防的)或后(治療)用NCK56或NCK2025連續(xù)處理四天的小鼠中分析DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。數(shù)據(jù)顯示相對(duì)于基線(圖3B)DSS在未處理的C57BL/6小鼠(圖3A、C)中誘導(dǎo)臨床和組織學(xué)結(jié)腸炎。臨床上，小鼠在第9天后開始減輕體重，且到第13天為約10%的總體重?fù)p失并在約10-11天發(fā)生嚴(yán)重的血性腹瀉(圖3A)。相比之下，經(jīng)口接種NCK2025的小鼠顯著防止體重?fù)p失、減少腹瀉和潛血檢測(cè)陽性(圖3A)?？傮w而言，從第2天起“疾病活性指數(shù)”(DAI)—直顯著降低。此外，用NCK2025預(yù)處理小鼠降低組織學(xué)結(jié)腸炎評(píng)分多達(dá)90%(21.5±1.4至2.3±0.5)(圖3B-F)。相應(yīng)地，圖3E表示具有限制在粘膜的有限炎癥的完整、未成為潰瘍的上皮。為明確論述LTA缺失在NCK2025對(duì)結(jié)腸炎的預(yù)防中的作用，第三組小鼠用NCK56處理。野生型嗜酸乳桿菌NCK56不預(yù)防結(jié)腸炎發(fā)病(圖3A和3D)，并且小鼠出現(xiàn)與未處理小鼠相似的臨床和組織學(xué)結(jié)腸炎。為闡明結(jié)腸組織表達(dá)的細(xì)胞因子，從各組小鼠中提取結(jié)腸并培養(yǎng)過夜。結(jié)腸細(xì)胞因子分析顯示來源于NCK56和DSS處理小鼠的結(jié)腸中IL-6、IL-12、TNFa和IFNy水平較高(圖3G)。相比之下，來源于NCK2025處理小鼠的結(jié)腸培養(yǎng)物中IL-10產(chǎn)生顯著上升。經(jīng)NCK2025處理的小鼠結(jié)腸中IL_12、IL_6、IFNY和TNFa顯著減少(圖3G)。此外，在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中，對(duì)接種NCK56與NCK2025的小鼠遠(yuǎn)端和近端區(qū)域基因的研究顯示免疫刺激的(即⑶40、CCLlI)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(即StatUStat4)和增殖/凋亡/血管發(fā)生/蛋白水解酶(即TMP1、FASL、ICAM1)基因的上調(diào)，提示NCK56而非NCK2025處理的小鼠中有活性的炎性反應(yīng)(圖7A和7B)。有趣的是，多種調(diào)節(jié)的、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗炎基因[即血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)、血清應(yīng)答因子(SRF)、TGFi3、(p21-活化激酶PAKURAF1、基質(zhì)金屬蛋白酶(ΜΡ1)的組織抑制劑、Tyk2]在NKC2025而非NCK56或DSS單獨(dú)處理的小鼠結(jié)腸遠(yuǎn)端(非近端)區(qū)域被高度調(diào)節(jié)(圖7A)。這暗示這些基因在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎更嚴(yán)重的遠(yuǎn)端結(jié)腸變得顯著活化以發(fā)揮其調(diào)節(jié)功能。NCK2025對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的治療作用。為了論述已建立結(jié)腸炎的小鼠中NCK2025暴露的作用，用NCK56或NCK2025處理前先將小鼠暴露在3%DSS中。一旦疾病癥狀發(fā)生，小鼠接受NCK56或NCK2025連續(xù)四天(圖4A)。數(shù)據(jù)顯示NCK56和NCK2025二者均減弱已建立的結(jié)腸炎，但減弱程度明顯不同。用NCK2025處理小鼠導(dǎo)致體重穩(wěn)定化以及腹瀉和失血的快速消退，而NCK56處理的小鼠持續(xù)失去體重,但速率較慢,并且腹瀉和失血的消退明顯較慢(圖4A)。組織學(xué)分析顯示第13天DSS處理的小鼠中持續(xù)的活性結(jié)腸炎和潰瘍形成，且結(jié)腸炎評(píng)分為16.8土2.2(圖4B、E)。NCK2025處理的小鼠具有明顯改善的結(jié)腸炎評(píng)分(8.4±2.2，p=0.01)，表明加速的愈合，包括稀少的潰瘍形成、再生的隱窩結(jié)構(gòu)和炎癥主要限制在粘膜(圖4D、E)。再次，NCK56處理輕度改善組織學(xué)結(jié)腸炎評(píng)分(14.7±2.0，P=NS),伴隨表皮恢復(fù)，但有限的隱窩再生以及粘膜和粘膜下層的持續(xù)性活性炎癥(圖4C，E)。有趣的是，NCK2025處理的小鼠的細(xì)胞因子分析顯示IL-10的上調(diào)和這些小鼠結(jié)腸中IL-12、TNFa、IL-6和IFNY的最小程度釋放(圖4F)。相比之下，NCK56或DSS單獨(dú)處理的小鼠結(jié)腸中IL-12、TNFa,IFNy和IL-6被高度誘導(dǎo)，并且在這些組的小鼠中IL-10最小程度釋放(圖4F)。NCK2025對(duì)結(jié)腸⑶4+FoxP3+T細(xì)胞的誘導(dǎo)。⑶4+Treg細(xì)胞的作用近來已經(jīng)在抑制對(duì)自身和共生小型生物群的免疫反應(yīng)失調(diào)方面特別關(guān)注(FontenotJD,GavinMA,&RudenskyAY(2003)NatImmunol4(4):330-336)。因此，對(duì)NCK2025(其在經(jīng)處理小鼠的DC和結(jié)腸微環(huán)境中誘導(dǎo)IL-10)進(jìn)行研究以確定與NCK56相比其是否增加結(jié)腸⑶4+FoxP3+Treg細(xì)胞。實(shí)際上，圖5A&B顯示與NCK56相比經(jīng)NCK2025處理小鼠的結(jié)腸中Treg細(xì)胞被顯著誘導(dǎo)，提示這些細(xì)胞的抑制劑作用可影響DSS誘導(dǎo)的粘膜過度炎癥。IL-10的調(diào)節(jié)作用。體外研究的數(shù)據(jù)以及體內(nèi)細(xì)胞因子分析提示NCK2025改善結(jié)腸炎的作用依賴于粘膜IL-1O的誘導(dǎo)(KuhnR,LohlerJ,RennickD,RajewskyK,&MullerW(1993)Cell75(2):263-274)。為證實(shí)這些觀測(cè)結(jié)果，如上在IL-10+小鼠中實(shí)施“預(yù)防性”和治療性研究。IL-1O+小鼠在暴露于共生細(xì)菌時(shí)出現(xiàn)自發(fā)的Thl介導(dǎo)的結(jié)腸炎，具有與人克羅恩病類似的深的、透壁的潰瘍損傷(BergDJ,等(1996)JClinInvest98(4):1010-1020)。在結(jié)腸炎發(fā)病前，小鼠連續(xù)四天接種NCK56或NCK2025(或不處理作為對(duì)照組)。如上所述結(jié)腸炎的發(fā)病通過吡羅昔康處理誘導(dǎo)。臨床上，在28天內(nèi)監(jiān)測(cè)體重減輕，處死后分離結(jié)腸以評(píng)估組織結(jié)腸炎的程度。在誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的起初兩周期間，未觀察到NCK56或NCK2025對(duì)預(yù)期的體重減輕的防護(hù)(圖6A)。總起來說，全部三組出現(xiàn)相似的組織學(xué)結(jié)腸炎和結(jié)腸炎評(píng)分(圖6B-E)，提示NCK2025的免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)需要內(nèi)源性IL-10。討論控制腸免疫耐受的免疫機(jī)制損壞導(dǎo)致慢性IBD(MacdonaldTT&MonteleoneG(2005)Science307(5717):1920-1925;MacDonaldTT&GordonJN(2005)GastroenterolClinNorthAm34(3):401-412,vi1-viii)。CD患者固有層中IFNγ+T細(xì)胞數(shù)目的增加有力地提示IBD發(fā)病機(jī)制中Thl極化的參與(FussIJ,攀(1996)JImmunol157(3):1261-1270;25-27;NeurathMF,DuchmannR,&MeyerzumBuschenfeldeKH(1996)DtschMedVochenschr121(22):735-741(inger);NeurathMF,等(1996)JExpMed183(6):2605-2616)導(dǎo)致失控的腸炎癥和組織破壞(PowrieF(1995)Immunity3(2):171-174)。當(dāng)被高度活化DC釋放的炎性細(xì)胞因子(即IL-12)外周激活時(shí)，CD8+(CheroutreH(2006)Gastroenterology131(2):667-670;VezysV&LefrancoisL(2002)JImmunol169(12):6677-668)和CD4+T細(xì)胞(ElsonCO,等(2005)IimunolRev206:260-276;WirtzS&NeurathMF(2000)IntJColorectalDis15(3):144-160)均觸發(fā)腸炎癥。因此，有效的免疫療法需要深入理解引起免疫耐受(通常由調(diào)節(jié)信號(hào)維持)損壞的免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(WirtzS,攀(1999)JIwmunol162(4):1884-1888)。近來，對(duì)嗜酸乳桿菌基因組的測(cè)序和注解允許對(duì)該細(xì)菌細(xì)胞表面的可影響粘膜細(xì)胞和分子事件的組分進(jìn)行基因操作，最終導(dǎo)致治療應(yīng)用(KonstantinovSR,攀(2008)ProcNatlAcacISciUSA105(49):19474-19479;AltermannE,等(2005)ProcNatlAcadSciUSA102(11):3906-3912)。嗜酸乳桿菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞表面蛋白包含維持細(xì)胞形狀和激活免疫細(xì)胞(包括DC)的關(guān)鍵組分(KonstantinovSR等(2008)ProcNatlAcadSciUSA105(49):19474-19479)。為了研究細(xì)菌與先天細(xì)胞(即DC)之間的復(fù)雜通訊(crosstalk)及其與結(jié)腸炎的關(guān)聯(lián)，刪除嗜酸乳桿菌中編碼磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶(其合成LTA的甘油鏈)的基因。數(shù)據(jù)顯示嗜酸乳桿菌LTA陰性突變體，NCK2025，在小鼠DC中誘導(dǎo)調(diào)節(jié)信號(hào)(即IL-10)和較少的協(xié)同刺激分子(⑶40，⑶86)，有效將這些細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)檎{(diào)節(jié)性DC(BelkaidY&OldenhoveG(2008)Immunity29(3):362-371)。這些調(diào)節(jié)性DC隨后與⑶4+T細(xì)胞的相互作用明顯改變T細(xì)胞活化。此外，NCK2025處理改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎，提示用該細(xì)菌菌株預(yù)處理動(dòng)物誘導(dǎo)如結(jié)腸組織學(xué)所證實(shí)的抵抗DSS攻擊的調(diào)節(jié)免疫、體重減輕、減少的腹瀉和潛血檢測(cè)陽性。調(diào)節(jié)粘膜內(nèi)明顯炎性反應(yīng)的一個(gè)機(jī)制為IL-10(KrausTA,攀(2005)JClinInvest115(8):2234-2243;KrausTA&MayerL(2005)CurrOpinGastroenterol21(6):692-696)。我們的數(shù)據(jù)清楚地顯示該細(xì)胞因子不僅由DC，而且還由經(jīng)NCK2025處理小鼠的結(jié)腸組織高度分泌，此現(xiàn)象在治療DSS結(jié)腸炎的預(yù)防性和治療性策略中均可見至IJ。先前已經(jīng)表明IL-1O通過其發(fā)揮抗炎作用的能力調(diào)節(jié)先天和獲得性免疫反應(yīng)兩者(MooreKff,deWaalMalefytR,CoffmanRL,&O'GarraA(2001)AnnuRevImmunol19:683-765;TrinchieriG(2007)JExpMed204(2):239-243)。該細(xì)胞因子通過下調(diào)MHCI1、協(xié)同刺激分子和DC中IL-12的產(chǎn)生(其全部強(qiáng)烈參與T細(xì)胞分化和活化)功能上抑制T細(xì)胞(MooreKff,deWaalMalefytR,CoffmanRL,&O'GarraA(2001)AnnuRevImmunol19:683-765;deWaalMalefytR,AbramsJ,BennettB,FigdorCG,&deVriesJE(1991)JExpMed174(5):1209-1220)。此夕卜，IL-10還通過其啟動(dòng)淋巴細(xì)胞中多重信號(hào)級(jí)聯(lián)(包括Jakl，Tyk2和Stat3通路)的活化的IL-10受體(FinbloomDS&WinestockKD(1995)JImmunol155(3):1079-1090)調(diào)節(jié)CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)、B細(xì)胞和Thl極化(MooreKff,deWaalMalefytR,CoffmanRL,&O’GarraA(2001)AnnuRevImmunol19:683-765)。這些觀測(cè)結(jié)果證明粘膜耐受性的調(diào)節(jié)和維持由強(qiáng)烈修飾致病CD4+T免疫反應(yīng)的IL-10嚴(yán)格控制，與本文給出的結(jié)果一致。此外，近來使用發(fā)生嚴(yán)重結(jié)腸炎的IL-10缺陷小鼠證明了IL-10在對(duì)良性抗原的反應(yīng)中的關(guān)鍵作用(KuhnR,LohlerJ,RennickD,RajewskyK,&MullerW(1993)Cell75(2):263-274)。如上所見，NCK2025的免疫調(diào)節(jié)作用不足以完全逆轉(zhuǎn)IL-10+中已建立的結(jié)腸炎，然而，當(dāng)以預(yù)防/治療性方式給予時(shí)其確實(shí)消除了結(jié)腸炎的誘導(dǎo)，突出了IL-10在調(diào)節(jié)炎癥發(fā)病中的關(guān)鍵作用。重要地，不斷增加的證據(jù)支持以下觀念:IL-10分泌型Treg細(xì)胞控制DC炎性性質(zhì)(LundJM,HsingL,PhamTT,&RudenskyAY(2008)Science320(5880):1220-1224)，其繼而調(diào)節(jié)有效的T細(xì)胞免疫的誘導(dǎo)，以控制繼發(fā)的組織損傷(MatareseG,DeRosaV,&LaCavaA(2008)TrendsImmunol29(I):12-17)。在此方面,我們證明嗜酸乳桿菌LTA陰性突變體處理增加小鼠結(jié)腸中⑶4+FOXP3+Treg細(xì)胞的數(shù)量。這些觀測(cè)結(jié)果有力支持Treg細(xì)胞在炎性病癥中的關(guān)鍵作用，如先前在人和嚙齒動(dòng)物模型(其中FoxP3基因突變導(dǎo)致失控的增殖以及Thl和Th2細(xì)胞因子信號(hào)的顯著增加)中所證實(shí)的(FontenotJD,GavinMA,&RudenskyAY(2003)NatImmunol4(4):330-336)。可調(diào)節(jié)IL-10及其隨后對(duì)先天和T細(xì)胞的作用的其它機(jī)制仍有待確定。涉及嗜酸乳桿菌中LTA合成的整個(gè)基因的完全缺失產(chǎn)生衍生細(xì)菌，其顯著影響腸道微環(huán)境、誘導(dǎo)調(diào)節(jié)信號(hào)(即IL-10、Treg細(xì)胞)并能在誘導(dǎo)的炎性免疫反應(yīng)期間修復(fù)細(xì)胞共存。嗜酸乳桿菌呈現(xiàn)獨(dú)特的徹底改變DC功能的S層蛋白展示(KonstantinovSR,等(2008)ProcNatlAcacISciUSA105(49):19474-19479,MohamadzadehM,DuongT,SandwickSJ,HooverΤ,&KlaenhammerTR(2009)ProcNatlAcadSciUSA106(11):4331-4336)。嗜酸乳桿菌的S層由三個(gè)S層A、B和X基因組成(GohYX等(2009)ApplEnvironMicrobiol75(10):3093-3105,GohYJ&KlaenhammerTR(2009)FrontBiosci14:1362-1386)，其中“自組裝”的S層蛋白A或B為覆蓋該細(xì)菌表面的主要蛋白。當(dāng)免疫反應(yīng)通過給予益生菌微生物調(diào)節(jié)(即活性IBD)或保持不受干擾(即腸道感染)時(shí)，非永久寄居腸中的外來細(xì)菌的遺傳修飾可提供更多治療選擇。其將有助于開發(fā)可優(yōu)化口腔免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)的治療媒介物。因此，建立這樣一種針對(duì)自身免疫疾病的益生菌干預(yù)必須從多個(gè)免疫角度精心協(xié)調(diào)以取得較好的臨床結(jié)果。首先，炎癥的主導(dǎo)調(diào)控不應(yīng)保持不變，這是因?yàn)檠装Y是常規(guī)免疫的一部分(NathanC(2002)Nature420(6917):846-852)。寄居腸道的細(xì)菌可損害維持腸道調(diào)節(jié)/協(xié)同刺激免疫平衡所需的免疫反應(yīng)。例如，感染期間，免疫過程允許識(shí)別病原體，并激活促進(jìn)從感染中恢復(fù)的先天和獲得性免疫反應(yīng)。因此，協(xié)調(diào)一系列事件的炎癥必須進(jìn)行適當(dāng)分期和調(diào)節(jié)以實(shí)現(xiàn)微生物消除，但仍防止由于多種免疫級(jí)聯(lián)和病原體存在所致的不必要的組織損傷。這樣的炎性過程可通過可引起炎性反應(yīng)的擴(kuò)大、抑制或調(diào)節(jié)的反饋回路和特定檢查點(diǎn)控制。所述正和負(fù)反饋回路依賴于介導(dǎo)炎性反應(yīng)的多種分子，最終在其控制中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。重要地，調(diào)動(dòng)信號(hào)向細(xì)菌清除的活性免疫需要調(diào)節(jié)信號(hào)(即IL-10)(其部分地由炎性信號(hào)誘導(dǎo))控制的最佳細(xì)胞協(xié)同控制。第二，為了達(dá)到瞬時(shí)調(diào)節(jié)性免疫，必須謹(jǐn)慎選擇和使用工具，包括細(xì)菌種類。在此方面，廣泛使用的減少炎癥的益生菌微生物，嗜酸乳桿菌NCFM的LTA缺失衍生物的遺傳構(gòu)建在我們的方法中可作為工具。由于該細(xì)菌不含有新的基因或DNA序列，且不在腸道永久寄居，其可用作經(jīng)口接種時(shí)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性免疫反應(yīng)的理想媒介物。這暗示一旦下調(diào)炎癥的目標(biāo)實(shí)現(xiàn)，可停止任何益生菌補(bǔ)充劑以重新建立“正常的”腸道免疫。最后，這些研究確定了在疾病例如感染中不忽略有效免疫活化所需的協(xié)同刺激信號(hào)的情況下，嗜酸乳桿菌LTA缺失如何啟動(dòng)先天細(xì)胞的調(diào)節(jié)機(jī)制?？傮w而言，當(dāng)深入了解細(xì)胞相互作用并確定最終導(dǎo)致自身免疫、炎癥或抗炎反應(yīng)的關(guān)鍵分子時(shí)，靶向的預(yù)防性或治療性策略將是有效的。方法試劑。卩比羅昔康和舒林酸獲自Sigma(St.Louis,MO)。葡聚糖硫酸鈉(DSS)獲自MPBiochemicals(Solon,OH)。NS-398獲自Cayman化學(xué)公司(AnnArbor,MI)。CD4、CD25、FoxP3、CD3、CDllc、CDllb、CD40、CD80、CD86、IL-10和小鼠GM-CSF的單克隆抗體購自Invitrogen(Carlsbad,California)和eBioscience(SanDiego,CA)。細(xì)菌菌株。嗜酸乳桿菌NCK56和NCK2025以1%接種并在deMan,Rogosa和Sharpe肉湯(MRS,Difco)中37°C繁殖15h。隨后，將Iml的各培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至50ml新MRS中，37°C孵育18小時(shí)。嗜酸乳桿菌菌株的集落形成單位(CFU)數(shù)目通過在600nm處測(cè)量光密度確定(GreeneJD&KlaenhammerTR(1994)ApplEnvironMicrobiol60(12):4487-4494)。離心收集細(xì)胞，用無菌PBS洗兩次，以5xl08CFU/ml包含20%甘油的PBS重懸，隨后-80儲(chǔ)存直至用于體外刺激未成熟DC(1:1)。對(duì)于經(jīng)口接種小鼠，生長48小時(shí)的細(xì)菌用無菌PBS洗兩次，以5X109/mlPBS重懸，并用于小鼠經(jīng)口接種(5xl08cfu/100μPBS/小鼠)。小鼠。6-8周齡C57BL/6和IL-10+(C57BL/6背景)小鼠購自Jackson實(shí)驗(yàn)室(BarHarbor,ME),和Germantown,NY。小鼠在西北大學(xué)動(dòng)物護(hù)理所微隔離籠中在無特定病原、無螺桿菌條件下飼養(yǎng)。我們未觀察到IL-1O+小鼠結(jié)腸中的任何自發(fā)炎癥征兆。實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南中的NIH指導(dǎo)方針(NIH-72-23)在可信任機(jī)構(gòu)進(jìn)行，并且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)地方倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。靶向磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶。使用標(biāo)準(zhǔn)整合和切除方法、工具和菌株構(gòu)建磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶(LBA0447)缺失的嗜酸乳桿菌NCK56的突變體菌株(PfeilerEA&KlaenhammerTR(2009)ApplEnvironMicrobiol75(18):6013-6016,RussellWM&KlaenhammerTR(2001)ApplEnvironMicrobiol67(9):4361-4364)。構(gòu)建p0RI28缺失載體，其包含兩個(gè)靶向片段，在LBA0447兩側(cè)的Dell_SphI和Del2_Bgl11。雙交換整合和切除事件后，NCK2025恢復(fù)為基因組中LBA0447含有1，984bp的缺失。NCK2025中LBA0447區(qū)域內(nèi)的PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序證實(shí)了Ikbp的丟失，并顯示缺失周圍的基因無另外的突變。LTA生化分析。嗜酸乳桿菌NCK56(5xl08/cfu/10ml)和NCK2025(5xl08/cfu/10ml)從冷凍的原種(-80°C)在不含ERM的deMan、Rogosa和Sharpe肉湯(MRS,Difco,Lawrence,KS)中37°C繁殖。隨后，如前所述分析NCK56和NCK2025中的LTA表達(dá)(MorathS，GeyerA,&HartungT(2001)JExpMed193(3):393-397)。簡單來說，將兩菌株NCK56和NCK2025的冷凍提取物溶解在pH4.7的檸檬酸鹽緩沖液(0.5M)，隨后聚合(syndication)15分鐘。將細(xì)菌裂解液(30ml)與等體積正丁醇混合,室溫?cái)嚢?0分鐘。隨后，離心(17，200Xg)40分鐘，收集水相，然后加入新鮮檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行第二次萃取。進(jìn)行兩次再萃取，將三次的水相合并并凍干。用色譜起始緩沖液(35ml，15%正丙醇/0.1M醋酸銨，pH4.7)重懸樣品后，將所有樣品離心(26,900xg，Ih)并過濾(0.2Mm)。將來自兩種細(xì)菌菌株的凍干物質(zhì)溶解在0.7%三氟乙酸中，HPLC分析0.45mg各菌株提取物。色譜通過連續(xù)監(jiān)測(cè)260nm的吸光度獲得。細(xì)胞培養(yǎng)。從周圍組織中除去小鼠股骨并機(jī)械純化，骨髓用冷PBS沖洗。細(xì)胞用Tris緩沖的氯化銨處理以溶解紅細(xì)胞。隨后，通過抗⑶19、⑶3、MHCII和Gr-1的特異性抗體陽性(positively)除去B細(xì)胞、T細(xì)胞、IA+細(xì)胞和Gr-Γ粒細(xì)胞(PharMingen,SanDiego,CA)。剩余的細(xì)胞為Ι-A—，并在加上10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640完全培養(yǎng)基(只含GM-GSF(25ng/ml))的6孔板中培養(yǎng)6天。每隔一天用含GM-CSF的新鮮培養(yǎng)基飼養(yǎng)培養(yǎng)物。第六天收集細(xì)胞用于不同實(shí)驗(yàn)。為研究T細(xì)胞活化和增殖，連續(xù)四天給予C57BL/6小鼠NCK56或NCK2025(以5xl08CFU/100μ/小鼠)。一周后，處死小鼠以分離各組小鼠的腸系膜LN。通過負(fù)磁珠損耗(negativemagneticbeaddepletion)富集腸系膜T細(xì)胞。為了測(cè)定T細(xì)胞活化和增殖，將梯度劑量的NCK56或NCK2025處理和未處理的DC(104/96孔板孔)與分離的腸系膜LNCD4+T細(xì)胞(105/孔)在不含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天。然后，96孔板各孔收集25μ并冷凍用于細(xì)胞因子分析。然后在最后16h內(nèi)每孔用0.5MCi[3H]胸苷給予細(xì)胞脈沖(NewEnglandNuclear)(PulendranB,等(2004)EurJImmunol34(1):66-73)。在一些實(shí)施方案中，在DC:T細(xì)胞共培養(yǎng)物中分別使用抗IL-10抗體(終濃度100ng/ml)。DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。對(duì)于接種/預(yù)防研究，給幾組C57BL/6小鼠(10小鼠/組)連續(xù)四天經(jīng)口接種NCK56或NCK2025(5xl08cfu/100μPBS/小鼠)。這些組的小鼠和對(duì)照小鼠接受6天一周期的飲用水中的3%DSS,隨后接受I天的常規(guī)飲用水，然后在第8天處死。未接種組中第一個(gè)DSS周期后觀察到急性結(jié)腸炎。研究期間監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展，包括體重減輕、腹瀉和糞便潛血檢測(cè)血液陽性(FOB)。其后，處死小鼠，將結(jié)腸橫斷面瑞士卷固定在10%甲醛中，并嵌入石蠟。組織切片(4Mm)用蘇木精和伊紅(H&E)染色，如前所述無分別地(blindly)評(píng)分(CooperHS,等(1993)LabInvest69(2):238-249，MurthySN,等(1993)DigDisSci38(9):1722—1734)?；?_28范圍的分級(jí)考慮炎性浸潤的程度、糜爛的存在情況、潰瘍形成或壞死，以及損傷的深度和表面延伸。對(duì)于治療研究，3組C57BL/6小鼠(10/組)首先接受5天周期的3%DSS以引發(fā)結(jié)腸炎，其中2組隨后連續(xù)四天通過口腔管飼法用NCK56或NCK2025(5xl08cfu/100μPBS/小鼠)治療。監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展直至實(shí)驗(yàn)方案的第13天，此時(shí)小鼠被處死，并如上評(píng)估結(jié)腸。結(jié)腸組織培養(yǎng)。結(jié)腸組織培養(yǎng)如前文所述進(jìn)行(Sellon攀(1998)InfectIirnun66(11):5224-5231)。簡單來說，3%DSS施用前或后用嗜酸乳桿菌菌株處理的各小鼠組的結(jié)腸組織用冷PBS徹底清洗。將組織切成Icm小塊并在包含慶大霉素(50μ§Μ)的完全RPMI1640中280rpm振搖30分鐘。結(jié)腸組織在添加5%胎牛血清(FCS)、50μδ/πι1慶大霉素和1%青霉素/鏈霉素/兩性霉素B的RPMI1640培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)18小時(shí)。然后收集上清液，-80°C保存直至用于細(xì)胞因子分析。IL-10-/-結(jié)腸炎。幾組C57BL/6IL-10+(10/組)從不含病原體的房間轉(zhuǎn)移至常規(guī)房間，并允許適應(yīng)I周。隨后小鼠連續(xù)四天接種NCK56或NCK2025(5xl08cfu/100μPBS/小鼠)，然后喂食低劑量吡羅昔康I周，隨后喂食高劑量吡羅昔康I周，以加速和同步化結(jié)腸炎的發(fā)病，如前所述(BergDJ,攀(2002)Gastroenterology123(5):1527-1542)。2周的標(biāo)準(zhǔn)食物后(第28天)，處死小鼠，將結(jié)腸橫斷面瑞士卷固定在10%甲醛中，并嵌入石蠟。組織切片(4Mm)用H&E染色，在0-4的范圍內(nèi)無分別評(píng)分，如前所述(BergDJ,等(2002)Gastroenterology123(5):1527-1542)。流式細(xì)胞術(shù)。嗜酸乳桿菌處理和未處理的DC(5x10s)用表面標(biāo)記單克隆抗體在4°C孵育30分鐘，用加0.1%FCS的PBS充分洗滌，用0.1%多聚甲醛固定，通過FACSCalibur四激光細(xì)胞計(jì)量術(shù)使用標(biāo)準(zhǔn)CELLQUEST獲取分析軟件(BectonDickinson)進(jìn)行分析。每個(gè)條件至少獲得IO4個(gè)門控事件。在一些實(shí)驗(yàn)中，為了取得結(jié)腸淋巴細(xì)胞，幾組小鼠(5小鼠/組)連續(xù)4天接種NCK56或NCK2025(5xl08cfu/100μ無菌PBS/小鼠)。將小鼠處死，清洗結(jié)腸，如前所述從固有層分離單細(xì)胞(Haddad%等(2003)JExpMed198(3):369-377)。淋巴細(xì)胞使用Percol富集，并用抗⑶4FITC,⑶25APC抗體和7AAD染色。隨后，將染色的細(xì)胞固定、透化、用抗FoxP3PE或同種型抗體染色,并通過FACSCalibur分析。實(shí)時(shí)PCR。使用RNeasyMini試劑盒(Qiagen，MD)從骨髓DC分離總RNA。使用大容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒從5ugRNA合成cDNA，通過實(shí)時(shí)半定量PCR使用ABI7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)和PowerSybergreen2XPCRmaster混合物(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)測(cè)定TLRl和TLR2基因的表達(dá)。對(duì)于跨越內(nèi)含子結(jié)點(diǎn)的區(qū)域選擇TLRl的引物(正向-TTAATGAGTGTTTGTGAATGCAGHG;反向-'GAGCATrGCCAC'ATGGGTATAG)和TLR2的弓I物(正向-CAAAGC'GTC'AAATCTC'AGAGGAT；反向-ACACCX'C:AGAAGC'ATCACATG)以排除基因組DNA的擴(kuò)增。使用ddCT方法用Gapdh作為內(nèi)源對(duì)照(正向-GTTCTGGATCTG/\C:GTG(:r;反向-TGC.TTGC'B_CACr/\C:C+TTT)，結(jié)果反映相對(duì)于對(duì)照樣品的倍數(shù)增加。低密度cDNA微陣列。DSS單獨(dú)、NCK56-DSS或NCK2025-DSS處理的各組小鼠(5x/組)的結(jié)腸遠(yuǎn)端和近端區(qū)域用PBS沖洗,并立即浸入RNALater(Qiagen,MD)中穩(wěn)定RNA。用RNeasyMini試劑盒(Qiagen,MD)提取RNA,使用AgilentNanochip生物分析(Agilent,SantaClara,CA)評(píng)估其質(zhì)量。所有使用的樣品具有大于7的RNA完整數(shù)(RIN)。如制造商(EppendorfDualChipmicroarray,Germany)所述實(shí)施反轉(zhuǎn)錄和微陣列的雜交。簡單來說，如下將6ugRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄:通過將樣品首先用01igo(dT)12_18引物(Invitrogen)在70°C孵育10分鐘然后加入RT混合物(SuperscriptIII)、dNTP(Invitrogen)、生物素標(biāo)記的ATP和CTP并在42°C孵育90分鐘接著70°C15分鐘。加入RNaseH，樣品在37°C孵育20分鐘，接著95°C3分鐘以終止反應(yīng)。將所得cDNA加入雜交室,在Eppendorfthermomixer中在6(TC混合以1400rpm孵育過夜。清洗載玻片，如制造商(Eppendorf,Germany)所述使用Silverquant檢測(cè)系統(tǒng)通過檢測(cè)生物素?fù)饺霚y(cè)定RNA水平。通過比較樣品與來自相同結(jié)腸區(qū)域的對(duì)照使用Silverquant分析軟件(Eppendorf,Germany)進(jìn)行分析。說明書中提到的所有出版物和專利申請(qǐng)表明本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。所有出版物和專利申請(qǐng)通過引用通過引用結(jié)合到本文中，并且在某種程度上如同各個(gè)出版物或?qū)＠暾?qǐng)明確且單獨(dú)地指出通過引用結(jié)合。雖然已通過說明和用于清楚理解目的的實(shí)施例的方式描述了前述發(fā)明的一些細(xì)節(jié)，但將顯而易見的是，某些變更和修飾可在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)實(shí)施。權(quán)利要求1.重組或分離的細(xì)菌，其已經(jīng)被遺傳修飾以減少所述細(xì)菌表面上脂磷壁酸(LTA)的展/Jnο2.權(quán)利要求1的重組或分離的細(xì)菌，其中所述重組或分離的細(xì)菌已經(jīng)被遺傳修飾以降低磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)。3.權(quán)利要求1或2的重組或分離的細(xì)菌，其中所述重組或分離的細(xì)菌已經(jīng)被遺傳修飾以降低包含與SEQID勵(lì):1所示核酸序列具有至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一'I"生的核苷酸序列的多核苷酸表達(dá)。4.權(quán)利要求1或2的重組或分離的細(xì)菌，其中所述重組或分離的細(xì)菌已經(jīng)被遺傳修飾以降低包含SEQIDNO:1所示核苷酸序列的多核苷酸表達(dá)。5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的重組或分離的細(xì)菌，其中所述重組或分離的細(xì)菌為益生菌細(xì)菌。6.權(quán)利要求5的重組或分離的細(xì)菌，其中所述益生菌細(xì)菌為乳酸細(xì)菌。7.權(quán)利要求6的重組或分離的細(xì)菌，其中所述乳酸細(xì)菌為乳桿菌。8.權(quán)利要求7的重組細(xì)菌，其中所述乳桿菌為嗜酸乳桿菌。9.權(quán)利要求8的重組或分離的細(xì)菌，其中所述遺傳修飾對(duì)嗜酸乳桿菌NCFM實(shí)施。10.權(quán)利要求8的重組或分離的細(xì)菌，其中所述嗜酸乳桿菌為以ATCC登記號(hào)PTA-11587保藏的嗜酸乳桿菌NCK2025。11.制備重組或分離的細(xì)菌的方法，所述方法包括遺傳修飾細(xì)菌以減少所述細(xì)菌表面上脂磷壁酸(LTA)的展示。12.權(quán)利要求11的方法，其中所述重組或分離的細(xì)菌已經(jīng)被修飾以降低磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)。13.權(quán)利要求11或12的方法，其中所述重組或分離的細(xì)菌已經(jīng)被遺傳修飾以降低包含與SEQIDNO:1所示核苷酸序列具有至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸表達(dá)。14.權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)的方法，其中所述重組細(xì)菌為益生菌細(xì)菌。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述益生菌細(xì)菌為乳酸細(xì)菌。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述乳酸細(xì)菌為乳桿菌。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述乳桿菌為嗜酸乳桿菌。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述遺傳修飾對(duì)嗜酸乳桿菌NCFM實(shí)施。19.權(quán)利要求17的方法，其中所述嗜酸乳桿菌為以ATCC登記號(hào)PTA-11587保藏的嗜酸乳桿菌NCK2025。20.權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)的方法，其中所述嗜酸乳桿菌已經(jīng)被修飾以降低包含SEQIDNO:1所示核苷酸序列的多核苷酸表達(dá)。21.減少受試者炎癥的方法，包括給予所述受試者治療有效量的權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的重組或分離的細(xì)菌。22.治療或預(yù)防受試者胃腸道炎性病癥的方法，包括給予受試者治療有效量的權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的重組或分離的細(xì)菌。23.權(quán)利要求21或22中任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者為動(dòng)物。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述受試者為哺乳動(dòng)物。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述受試者為人。26.權(quán)利要求23的方法，其中所述受試者為馴養(yǎng)動(dòng)物。27.權(quán)利要求23的方法，其中所述受試者為農(nóng)用動(dòng)物。28.權(quán)利要求21-27中任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者患有胃腸病癥。29.權(quán)利要求28的方法，其中所述胃腸病癥選自炎性腸病、克羅恩病、腸易激綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎、肥胖癥、腹瀉、胃氣脹、腸胃氣脹、腹部絞痛、腹痛、便秘及其任何組合。30.權(quán)利要求21-29中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)菌增加所述受試者中一種或多種抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。31.權(quán)利要求30的方法，其中所述抗炎細(xì)胞因子為IL-10。32.權(quán)利要求21-31中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)菌降低所述受試者中一種或多種促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。33.權(quán)利要求32的方法，其中所述促炎細(xì)胞因子選自IL-12、IL-6、IFNY、TNFa及其任何組合。34.權(quán)利要求21-33中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)菌的治療有效量為約IO8-1O12CFU/天。35.包含權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的重組或分離的細(xì)菌的藥物組合物。36.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的重組或分離的細(xì)菌，其用作藥物。37.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的重組或分離的細(xì)菌，其用于治療或預(yù)防受試者例如權(quán)利要求23-27中任一項(xiàng)的受試者的胃腸道炎性病癥。38.權(quán)利要求36或37的重組或分離的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌導(dǎo)致所述受試者中抗炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的增加。39.權(quán)利要求38的重組或分離的細(xì)菌，其中所述抗炎細(xì)胞因子為IL-10。40.權(quán)利要求36-39中任一項(xiàng)的重組或分離的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌降低所述受試者中一種或多種促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。41.權(quán)利要求40的重組或分離的細(xì)菌，其中所述促炎細(xì)胞因子選自IL-12、IL-6、IFNY,TNFa及其任何組合。42.權(quán)利要求36-41中任一項(xiàng)的重組或分離的細(xì)菌，其中將所述細(xì)菌配制為以治療有效量給予受試者，其中所述細(xì)菌的治療有效量為約IO8-1O12CFU/天。43.權(quán)利要求36-42中任一項(xiàng)的重組或分離的細(xì)菌，其中所述胃腸病癥選自炎性腸病、克羅恩病、腸易激綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎、肥胖癥、腹瀉、胃氣脹、腸胃氣脹、腹部絞痛、腹痛、便秘及其任何組合。44.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的細(xì)菌在制造藥物中的用途。45.44中的細(xì)菌在制造用于治療或預(yù)防受試者例如權(quán)利要求23-27中任一項(xiàng)的受試者的胃腸道病癥的藥物中的用途。46.權(quán)利要求44或45的細(xì)菌在制造用于治療炎性病癥的藥物中的用途。47.權(quán)利要求46的細(xì)菌的用途，其中所述病癥選自炎性腸病、克羅恩病、腸易激綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎、肥胖癥、腹瀉、胃氣脹、腸胃氣脹、腹部絞痛、腹痛、便秘及其任何組合。48.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的細(xì)菌作為藥物的用途。49.權(quán)利要求48的細(xì)菌的用途，其中所述藥物用于治療或預(yù)防受試者例如權(quán)利要求23-27中任一項(xiàng)的受試者的胃腸道病癥。50.權(quán)利要求48或49的細(xì)菌的用途，其中所述病癥為炎性病癥。51.權(quán)利要求50的細(xì)菌的用途，其中所述胃腸病癥選自炎性腸病、克羅恩病、腸易激綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎、肥胖癥、腹瀉、胃氣脹、腸胃氣脹、腹部絞痛、腹痛、便秘及其任何組合。全文摘要提供用于治療或預(yù)防炎性病癥的方法和組合物。本發(fā)明組合物包含經(jīng)遺傳修飾以減少細(xì)胞表面上脂磷壁酸展示的重組細(xì)菌。本發(fā)明方法包括給予受試者經(jīng)修飾以減少細(xì)胞表面上脂磷壁酸展示的重組細(xì)菌。給予所述重組細(xì)菌促進(jìn)所需的治療反應(yīng)。所述重組細(xì)菌可以以單獨(dú)劑量或系列劑量給予。本發(fā)明方法在治療或預(yù)防多種炎性病癥包括，例如，治療或預(yù)防炎性腸病、結(jié)腸炎或克羅恩病中得到應(yīng)用。文檔編號(hào)A61K35/74GK103189504SQ201180039874公開日2013年7月3日申請(qǐng)日期2011年6月16日優(yōu)先權(quán)日2010年6月18日發(fā)明者T.R.克萊恩哈默,E.普菲勒,M.莫哈馬扎德申請(qǐng)人:北卡羅萊納州立大學(xué),西北大學(xué)