專利名稱：抗脂肪細胞特異膜蛋白單克隆抗體用于減少豬皮下脂肪沉積的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種抗脂肪細胞特異膜蛋白單克隆抗體用于減少豬皮下脂肪沉積，屬于養(yǎng)殖業(yè)中對豬胴體品質進行改良的技術。
背景技術：
動物脂肪的過度沉積不僅降低畜產品質量，而且威脅人類健康，已成為動物生產領域亟待解決的問題。降低動物體脂肪沉積的一種途徑是在飼料中添加化學藥物，但化學藥物的使用會帶來許多問題，如降低肉品的質量、縮短貯藏期、藥物殘留等；另一種途徑是使用激素類物質，如β-腎上腺素能興奮劑和生長激素等，這類物質雖然能促進動物生長，提高飼料轉化效率，減少體脂，增加蛋白質含量，改善胴體品質，但其在畜產品中的殘留及安全性已引起公眾的擔憂，目前已被禁用或限量使用。針對動物體脂肪過度沉積的問題，1986年Flint首先提出了用脂肪細胞膜蛋白制備抗體并將這種抗體注射到動物體內調控脂肪沉積的設想，發(fā)表了用大鼠全脂肪細胞膜蛋白制備多克隆抗體的文章，結果發(fā)現(xiàn)抗脂肪細胞膜蛋白抗體應用于動物，可顯著減少脂肪沉積，這種作用可保持數(shù)月不產生任何副作用；這種方法不僅使動物脂肪沉積減少，而且可以使體重增加，飼料轉化效率提高。隨后Flint在“肥胖能否控制”一文中報道了羊和豬抗脂肪細胞膜蛋白的多克隆抗體，這種抗體在體內可有效地抑制脂肪細胞分化。此后Moloney和Pantonet相繼詳細報道了抗脂肪細胞膜蛋白多克隆抗體對脂肪細胞作用的效果。由于多克隆抗體特異性較差，可與其它組織細胞膜產生交叉反應，于是1990年Killefer首次報道了抗豬脂肪細胞膜蛋白的單克隆抗體，但沒有該單克隆抗體能夠抑制脂肪細胞分化的實驗數(shù)據(jù)。同年Wright報道了抗2周齡仔豬脂肪細胞膜蛋白的單克隆抗體，其抗原的相對分子量為77.0kDa和90.0kDa，直接證實了膜表面蛋白是脂肪細胞分化的標志。其后1995年和1997年Wright和Declercq分別制備了抗豬脂肪細胞膜蛋白單克隆抗體，Wu于2000年制備了抗雞脂肪細胞膜蛋白單克隆抗體。單克隆抗體由于能特異地識別脂肪細胞膜蛋白，與其它組織細胞無交叉反應，因此在減少脂肪沉積的作用效果上比多克隆抗體有更大的優(yōu)勢，同時還可用作探針研究脂肪細胞的分化和代謝以及膜蛋白的組成和結構等，但目前研究制備單克隆抗體所用抗原并非為脂肪細胞特異膜蛋白，因此其特異性有待進一步證實。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就是提供一種能有效減少豬皮下脂肪沉積、提高胴體品質的技術方法，在不降低生長速度和飼料報酬的前提下明顯減少豬皮下脂肪沉積、提高胴體品質，可杜絕在飼料中使用化學合成藥物，提高豬肉產品的安全性。
上述目的是這樣實現(xiàn)的從豬皮下脂肪組織細胞分離純化分子量為40.0kDa特異膜蛋白，以該蛋白為抗原免疫BALB/c小鼠，通過雜交瘤細胞技術獲得3株陽性雜交瘤細胞株，分別為2A3、3H7和3A6，采用小鼠體內誘生方法制備了3株單克隆抗體?？贵w為無色透明液體，濃度為1.0mg/ml，將抗脂肪細胞特異膜蛋白單克隆抗體作用于15～90Kg生長肥育豬，在15Kg仔豬階段腹腔注射一次，劑量為0.5～1.0mg/Kg。3株單抗分別屬IgA、IgM和IgG1亞類，分子量分別為160kDa、190kDa和150kDa，抗體效價分別為104以上、105以上和106以上，抗體親和力Ka分別為4.86×108L/mol、1.86×109L/mol和2.46×109L/mol，Wstern-blot檢測證明，3株單抗具有很好的抗原結合活性和很強的特異性，僅與皮下脂肪細胞的40.0kDa特異膜蛋白結合，不與其他脂肪及組織細胞膜蛋白結合。以3A6單抗為例Western-blot分析結果見圖1、2，2A3和3H7單抗的結果與3A6相同，省略圖。
獲得單克隆抗體之后，以效價和親和力最高的IgG1亞類單克隆抗體3A6用于動物試驗，檢測單克隆抗體用于減少豬皮下脂肪沉積的效果。首先在15Kg仔豬階段采用腹腔注射一次，劑量為0.1～1.0mg/kg，通過動物飼養(yǎng)試驗檢測單克隆抗體對豬生長性能的影響，至90Kg試驗結束時屠宰，通過屠宰試驗測定豬胴體品質；同時取皮下脂肪組織通過冰凍組織切片測定皮下脂肪細胞的大小，并測定皮下脂肪組織的厚度和甘油三酯的含量；然后將單克隆抗體加入體外培養(yǎng)的豬原代前脂肪細胞，觀察抗體對體外脂肪細胞分化的抑制作用。
抗脂肪細胞膜蛋白單克隆抗體用于減少豬皮下脂肪沉積，將抗脂肪細胞特異膜蛋白單克隆抗體作用于15～90Kg生長肥育豬，在15Kg仔豬階段腹腔注射一次，劑量為0.5～1.0mg/kg。僅作用于豬皮下脂肪細胞，能顯著減少商品豬皮下脂肪沉積，提高胴體品質，對采食量、生長和內臟器官無不良影響，是一種有良好應用前景的減少豬皮下脂肪沉積、提高胴體品質的技術方法。
圖1為單克隆抗體識別抗原的Western-blot分析示意圖，圖中1為40.0kDa純化抗原，2為脂肪細胞全膜蛋白圖2為單克隆抗體組織特異性Western-blot分析示意圖，圖中1為心、2為肝、3為脾、4為腹部脂肪、5為皮下脂肪、6為肺、7為腎、8為肌肉、9為腸系膜脂肪、10為腎周脂肪，從圖中可以看出它僅與豬皮下脂肪和腹部脂肪細胞膜蛋白結合圖3為對照組豬皮下脂肪組織冰凍切片放大4為注射0.1mg/kg體重單克隆抗體豬皮下脂肪組織冰凍切片放大5為注射0.5mg/kg體重單克隆抗體豬皮下脂肪組織冰凍切片放大6為注射1.0mg/kg體重單克隆抗體豬皮下脂肪組織冰凍切片放大7為單克隆抗體對豬皮下脂肪厚度的影響示意8為單克隆抗體對豬皮下脂肪甘油三酯含量影響的示意9為單克隆抗體作用于分化的前脂肪細胞，作用第4天，細胞停止分化，崩解后聚積，釋放出脂滴的放大10為正常分化的前脂肪細胞，培養(yǎng)第8天的放大11為單克隆抗體作用于分化的脂肪細胞，作用第4天，大部分細胞死亡，脂滴蓄積量顯著減少的放大12為正常分化的脂肪細胞，培養(yǎng)第11天的放大13為單克隆抗體作用于成熟的脂肪細胞，作用第6天，大部分細胞崩解或皺縮，脂滴蓄積量顯著減少的放大14為正常生長的成熟脂肪細胞，培養(yǎng)第20天，細胞充滿脂滴，脂滴圓潤，富有光澤的放大15為單克隆抗體作用于成熟的脂肪細胞，作用第6天，細胞崩解，脂滴顯著減少，失去光澤的放大16為正常生長的成熟脂肪細胞，培養(yǎng)第20天，脂滴圓潤，富有光澤的放大圖具體實施方式
從豬皮下脂肪組織細胞分離純化分子量為40.0kDa特異膜蛋白，以該蛋白為抗原免疫BALB/c小鼠，通過雜交廇細胞技術獲得3株陽性雜交瘤細胞株，分別為2A3、3H7和3A6，采用小鼠體內誘生方法制備了3株單克隆抗體?？贵w為無色透明液體，濃度為1.0mg/ml，將抗脂肪細胞特異膜蛋白單克隆抗體作用于15～90Kg生長肥育豬，在15Kg仔豬階段腹腔注射一次，劑量為0.5～1.0mg/Kg。3株單抗分別屬IgA、IgM和IgG1亞類，分子量分別為160kDa、190kDa和150kDa，抗體效價分別為104以上、105以上和106以上，抗體親和力Ka分別為4.86×108L/mol、1.86×109L/mol和2.46×109L/mol，Wstern-blot檢測證明，3株單抗具有很好的抗原結合活性和很強的特異性，僅與皮下脂肪細胞的40.0kDa特異膜蛋白結合，不與其他脂肪及組織細胞膜蛋白結合。以3A6為例，進行了以下試驗檢測，其它2株單抗的試驗檢測結果與3A6相似，略去檢測法。
一、單克隆抗體對豬生長性能的影響在15Kg仔豬階段腹腔注射一次，劑量為0.1mg/Kg、0.5mg/Kg和1.0mg/Kg，至90Kg試驗結束時，每天統(tǒng)計采食量，試驗開始和結束時空腹稱重，計算每組的日增重和料重比。從表1可以看出，在15Kg體重至試驗結束時注射不同劑量的單克隆抗體對豬的生長性能無明顯影響，表明抗脂肪細胞膜蛋白單克隆抗體不影響豬的采食量和生長速度。
二、單克隆抗體對豬胴體品質的影響仔豬15Kg體重時腹腔注射單克隆抗體0.1mg/Kg、0.5mg/Kg和1.0mg/Kg，至90Kg結束時屠宰，測定背膘厚、瘦肉率、脂肪率等胴體組成指標。由表2可以看出，在15Kg體重時注射不同劑量的單克隆抗體對豬的屠宰率和花油重無顯著影響(P＞0.05)；注射0.1mg/Kg體重單克隆抗體瘦肉率、脂肪率、背膘厚、眼肌面積和板油重與對照組差異不顯著(P＞0.05)；注射0.5mg/Kg體重單克隆抗體與對照組相比，瘦肉率提高1039％，脂肪率降低17.98％(P＜0.05)，背膘厚降低12.61％.(P＜0.05)，眼肌面積提高28.08％，(P＜0.05)，板油重降低12.23％(P＜0.05)；注射1.0mg/Kg體重單克隆抗體與對照組相比，瘦肉率提高14.59％，脂肪率降低19.19％(P＜0.05)，背膘厚降低14.85％(P＜0.05)，眼肌面積提高30.52％(P＜0.05)，板油重降低12.84％(P＜0.05)；注射0.5mg/Kg和1.0mg/Kg體重單克隆抗體對豬胴體指標的影響無明顯差異。表明抗脂肪細胞特異膜蛋白單克隆抗體可明顯提高豬的胴體品質。
三、單克隆抗體對豬內臟器官的影響屠宰后測定心、肝、肺、腎等內臟器官的重量。由表3可以看出，在15Kg體重至試驗結束時注射不同劑量的單克隆抗體對豬的內臟器官無影響，表明抗脂肪細胞特異膜蛋白單克隆抗體具有很強的特異性，不與組織器官細胞產生非特異性交叉反應。
四、單克隆抗體對豬皮下脂肪沉積的影響試驗結束時屠宰，測定皮下脂肪組織的厚度，取背部皮下脂肪組織進行組織切片，測定脂肪組織內甘油三酯的含量。
注射不同劑量單克隆抗體后豬皮下脂肪厚度的結果見圖7。注射0.1mg/Kg體重單克隆抗體對豬皮下脂肪厚度無明顯影響，而注射0.5mg/Kg和1.0mg/Kg體重單克隆抗體可顯著降低皮下脂肪組織的厚度，同時脂肪組織甘油三酯的含量明顯減少(見圖8)。皮下脂肪組織的冰凍切片見圖3～6。由圖中可以看出，注射0.5mg/Kg和1.0mg/Kg體重單克隆抗體皮下脂肪細胞的直徑明顯減小，而注射0.1mg/Kg體重單克隆抗體皮下脂肪細胞的變化不明顯。皮下脂肪組織的厚度、甘油三酯的含量和組織切片結果表明，抗脂肪細胞特異膜蛋白單克隆抗體可明顯減少豬皮下脂肪的沉積。
五、單克隆抗體對豬脂肪細胞分化的抑制1、細胞的分離培養(yǎng)仔豬屠宰后無菌條件下取腹股溝脂肪墊和背部皮下脂肪組織各10g，PBS沖洗，分離除去脂肪組織中肉眼可見的纖維成分及血管后，用剪刀將脂肪墊和脂肪組織切成1mm的小塊，分別加入50ml脂肪細胞消化液，37℃振蕩消化6h，1200g離心10min，去除漂浮的脂肪及培養(yǎng)液，沉淀用無血清DMEM培養(yǎng)液懸浮，150目尼龍網過濾未消化的組織塊，濾液用無血清DMEM培養(yǎng)液1000rpm離心10min，洗滌2次，細胞沉積用含20％小牛血清和5％豬血清的DMEM培養(yǎng)液懸浮，按1.5×104個細胞/cm2分別按種至3個24孔培養(yǎng)板，37℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔2d更換一次培養(yǎng)液，用吉姆薩和油紅O分別對前脂肪細胞和脂肪細胞進行染色。
2、單克隆抗體對脂肪細胞分化的抑制作用分別于前脂肪細胞分化至開始蓄積脂肪滴時、前脂肪細胞分化至脂肪細胞時以及脂肪細胞分化至成熟脂肪細胞時，各取9個細胞培養(yǎng)孔，每孔分別加0.1mg/ml單克隆抗體100μl和50μl兔補體，37℃培養(yǎng)至細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化時，油紅O染色拍照。
(1)單克隆抗體對前脂肪細胞分化的抑制從前脂肪細胞開始蓄積脂滴的第5天開始，向細胞培養(yǎng)孔內加入單克隆抗體和補體，在作用的第4天，即培養(yǎng)的第8天時，前脂肪細胞幾乎全部死亡，由于細胞的崩解及不能蓄積甘油三酯，皺縮的細胞呈梭狀或團狀聚積在一起；對照組細胞分化正常(見圖9～10)。
(2)單克隆抗體對脂肪細胞分化的抑制第8～11天前脂肪細胞分化為脂肪細胞和脂肪細胞進一步分化的關鍵時期，在此期間用單克隆抗體處理細胞可檢測抗體對脂肪細胞分化能力的抑制作用。結果顯示，單克隆抗體處理后第4天，脂肪細胞大批死亡，釋放出大部分蓄積的脂滴，細胞破碎或皺縮(見圖11～12)。
(3)單克隆抗體對成熟脂肪細胞分化的抑制第15～20天為成熟脂肪細胞分化和生長時期，此時脂肪細胞分化能力逐漸減弱以至停滯，但甘油三脂仍在不斷蓄積，為檢測抗體對成熟脂肪細胞的影響，在第15天時用單克隆抗體處理。結果顯示，在抗體處理后第6天，即培養(yǎng)第20天時，細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，由于甘油三脂的大量釋放，大部分細胞皺縮，體積明顯減小，一部分細胞發(fā)生崩解，胞質內的脂滴散開，油紅O染色時脂滴失去光澤(見圖13～16)。
抗體對脂肪細胞分化的抑制結果表明，抗脂肪細胞特異膜蛋白單克隆抗體可明顯抑制前脂肪細胞和成熟脂肪細胞的分化，進一步證實了該抗體在體內減少豬皮下脂肪沉積的作用。
表1 單克隆抗體對豬生長性能的影響指標 0.1mg 0.5mg 1.0mg 對照初始體重(kg)14.42±1.0314.39±1.0914.33±1.1214.34±1.07結束體重(kg)91.35±5.1290.73±4.9790.44±5.2389.72±5.03日增重(kg) 0.703±0.030.709±0.040.714±0.010.708±0.03料重比 3.18±0.15 3.15±0.20 3.13±0.16 3.29±0.15表2單克隆抗體對豬胴體組成的影響指標0.1mg 0.5mg 1.0mg 對照屠宰率(％)72.78±3.13 73.15±3.0073.68±3.03 71.46±3.07瘦肉率(％)51.22±1.03a54.38±1.43b56.45±1.13b49.26±1.31a脂肪率(％)24.01±0.83a21.03±0.77b20.72±0.73b25.64±0.79a背膘厚(cm)3.43±0.10a3.12±0.15b3.04±0.13b3.57±0.09a眼肌面積(cm2)29.23±1.03a34.62±1.11b35.28±1.17b27.03±1.14a板油重(kg)2.53±0.13a2.29±0.11b2.24±0.11b2.57±0.11a花油重(kg)2.38±0.11 2.23±0.08 2.36±0.09 2.52±0.10注同行肩標字母不同者差異顯著(p＜0.05)表3單克隆抗體對豬內臟器官的影響單位g指標 0.1mg 0.5mg 1.0mg 對照心臟275.41±14.97 277.13±14.83 278.17±14.91 274.35±14.91脾臟121.06±9.27 121.08±9.32 121.04±9.34 121.05±9.30腎臟266.98±18.32 267.23±18.36 267.35±18.33 267.32±18.33肝臟1419.79±112.261421.32±112.32 1425.41±112.311413.25±112.30肺臟1052.52±88.37 1053.16±88.341054.39±88.32 1052.83±88.3權利要求
1.一種抗脂肪細胞特異膜蛋白單克隆抗體用于減少豬皮下脂肪沉積，其特征在于a、從豬皮下脂肪組織細胞分離純化分子量為40.0kDa特異膜蛋白，以該蛋白為抗原免疫BALB/c小鼠，通過雜交瘤細胞技術獲得3株陽性雜交瘤細胞株，分別為2A3、3H7和3A6，采用小鼠體內誘生方法制備了3株單克隆抗體；抗體為無色透明液體，濃度為1.0mg/ml，3株單抗分別屬IgA、IgM和IgG1亞類，分子量分別為160kDa、190kDa和150kDa，抗體效價分別為104以上、105以上和106以上，抗體親和力Ka分別為4.86×108L/mol、1.86×109L/mol和2.46×109L/mol，b、將抗脂肪細胞特異膜蛋白單克隆抗體作用于15～90Kg生長肥育豬，在15Kg仔豬階段腹腔注射一次，劑量為0.5～1.0mg/Kg。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗脂肪細胞特異膜蛋白單克隆抗體用于減少豬皮下脂肪沉積，屬于養(yǎng)殖業(yè)中對豬胴體品質進行改良的技術。從豬皮下脂肪組織細胞分離純化分子量為40.0kDa特異膜蛋白，以該蛋白為抗原采用雜交瘤細胞技術制備了3株單克隆抗體；抗體為無色透明液體，濃度為1.0mg/ml，適用于15～90kg生長肥育豬，于15kg仔豬階段腹腔注射一次，劑量為0.5～1.0mg/kg?？贵w僅作用于豬皮下脂肪細胞，能顯著減少商品豬皮下脂肪沉積，提高胴體品質，對采食量、生長和內臟器官無不良影響，是一種有良好應用前景的減少豬皮下脂肪沉積、提高胴體品質的技術方法。
文檔編號A61P3/04GK1660423SQ20041007964
公開日2005年8月31日 申請日期2004年12月29日 優(yōu)先權日2004年12月29日
發(fā)明者高士爭, 張曦, 葛長榮, 戴志明 申請人:云南農業(yè)大學