專利名稱：枳實(shí)總黃酮提取物在制備用于治療哮喘藥物中的應(yīng)用的制作方法
枳實(shí)總黃酮提取物在制備用于治療哮喘藥物中的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于中藥研制領(lǐng)域，涉及一種治療支氣管哮喘疾病的藥物，具體地說是從中藥材枳實(shí)中提取的枳實(shí)總黃酮提取物及其制劑，有效地治療支氣管哮喘疾病。
背景技術(shù)：
支氣管哮喘(bronchial asthma,簡稱哮喘)是由多種細(xì)胞(如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等)和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。WHO估計，全球哮喘病的患者高達(dá)3億人。近10年，哮喘癥的發(fā)病率和死亡率呈上升勢態(tài)，全球范圍內(nèi)，每年有超過25萬人死于哮喘。隨著全球范圍內(nèi)的空氣污染和環(huán)境惡化，哮喘的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)逐年上升態(tài)勢。因而，預(yù)防和治療哮喘疾病愈來愈被人們所重視和關(guān)注。雖然目前支氣管哮喘藥物種類較多，但目前仍未能有效遏制哮喘病的發(fā)病率的上升趨勢，為此研究與開發(fā)高效安全的抗哮喘藥物仍是當(dāng)務(wù)之急。
近年來，隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和病理學(xué)等技術(shù)的深入發(fā)展，哮喘的發(fā)病機(jī)制研究逐步闡明，發(fā)現(xiàn)白三烯、血栓素、血小板活化因子等炎癥介質(zhì)所引起的氣道粘膜水腫、炎性細(xì)胞浸潤、管腔內(nèi)粘液栓阻塞等是哮喘發(fā)病的重要機(jī)制，氣道炎癥學(xué)說已獲得世界各國的廣泛認(rèn)可，因此，抑制炎癥細(xì)胞的遷移和活化，抑制細(xì)胞因子的生成以及炎癥介質(zhì)的釋放，有可能成為新的治療方向，哮喘發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的現(xiàn)代藥物治療學(xué)在某些領(lǐng)域仍難以有效地發(fā)揮治療作用，而中成藥治療以其副作用小，能與支氣管哮喘疾病不同病理環(huán)節(jié)發(fā)揮多組分、多靶點(diǎn)、多層次的整體治療優(yōu)勢，因此從天然植物中尋找抗哮喘藥物是目前藥物研究的熱點(diǎn)。
積實(shí)為蕓香科植物酸橙(Citrus aurantium L)及其栽培變種或甜橙(Citrus sinensis Osbeck)的干燥幼果。性味苦、辛、酸、溫；歸脾、胃經(jīng)。具有破氣除痞，化痰消積的功效。是中醫(yī)臨床常用藥物。哮喘發(fā)作期的基本病理變化為“伏痰”遇感引觸，痰隨氣什， 氣因痰阻，相互博結(jié)，雍塞氣道，肺管狹窄，通暢不利，肺氣宣降失常，引動停積之痰，而致痰鳴如吼，氣息喘促。哮證的病理因素以痰為主，發(fā)作時的病理環(huán)節(jié)為痰阻氣閉，以邪實(shí)為主， 故以呼吸困難，自覺呼出為快。此時用枳實(shí)破氣化痰，改善氣道痙攣，從而達(dá)到祛痰、平喘之效。枳實(shí)主要含有黃酮類、生物堿類、揮發(fā)油類等成分，其中黃酮類成分含量較高?，F(xiàn)已從枳實(shí)中分離出來的黃酮類成分主要為橙皮苷、柚皮苷、柚皮素、新橙皮苷等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明枳實(shí)對心血管系統(tǒng)、胃腸平滑肌、支氣管平滑肌具有廣泛的藥理作用。枳實(shí)中黃酮類成分具有良好的抗氧化、抗炎、抗過敏等活性，對基質(zhì)金屬蛋白酶、NF-κ B、TNF_a的釋放具有顯著抑制活性，能夠抑制由脂多糖刺激大鼠的整個脾細(xì)胞引起的白細(xì)胞介素4(IL-4)的產(chǎn)生。枳實(shí)水提物體外檢測對大鼠腹膜肥大細(xì)胞釋放組胺的能力亦顯示較強(qiáng)的抗過敏活性。 目前還沒有以中藥材枳實(shí)的總黃酮提取物在治療哮喘方面應(yīng)用的研究。發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是針對目前的不足，提供一種枳實(shí)總黃酮提取物在治療哮喘方面的應(yīng)用，以使能夠有效治療地哮喘疾病，并且產(chǎn)生較小的副作用。
針對上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下
—方面，本發(fā)明提供一種枳實(shí)總黃酮提取物在制備用于治療哮喘藥物中的應(yīng)用。
優(yōu)選地，所述枳實(shí)總黃酮提取物包括以柚皮苷計重量百分比為70%的總黃酮，優(yōu)選地，所述枳實(shí)總黃酮提取物含有以柚皮苷計重量百分比為80%的總黃酮。
優(yōu)選地，所述總黃酮包括柚皮苷和新橙皮苷，所述柚皮苷含量占所述枳實(shí)總黃酮提取物的25% (重量百分比)以上，優(yōu)選地，所述柚皮苷含量占所述枳實(shí)總黃酮提取物的 30% (重量百分比)以上，所述新橙皮苷含量占所述枳實(shí)總黃酮提取物的25% (重量百分比)以上，優(yōu)選地，所述新橙皮苷含量占所述枳實(shí)總黃酮提取物的30% (重量百分比)以上。
優(yōu)選地，所述枳實(shí)總黃酮提取物中還含有占所述枳實(shí)總黃酮提取物重量百分比為 8 10%的橙皮苷、密桔黃素、柑桔黃酮等其它黃酮類化合物，該類化合物具有抗過敏、抗氧化、抗炎、平喘等藥理活性，在治療哮喘中與柚皮苷、新橙皮苷等主要黃酮類物質(zhì)發(fā)揮著協(xié)同作用。
優(yōu)選地，所述枳實(shí)總黃酮提取物通過以下方法制得
I)取枳實(shí)藥材，加適量的水提取，收集所有提取液，將其濃縮；
2)將濃縮后的提取液加乙醇置含醇量為50 % 90% (體積/體積)后靜置，離心，上清液濃縮或回收乙醇后過大孔吸附樹脂，先用水或5 10% (體積/體積)的低濃度乙醇洗脫，除去溶于極性溶劑的雜質(zhì),棄去；
3)再用30 95% (體積/體積)的高濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇后干燥，即得總黃酮。
優(yōu)選地，在步驟I)中，所述提取方法具體為加10 12倍量(重量)的水提取三次，每次提取lh。
優(yōu)選地，所述藥物為含有枳實(shí)總黃酮提取物的藥物，所述藥物中還含有生理學(xué)上可接受的賦形劑。
優(yōu)選地，所述賦形劑為淀粉、糊精、乳糖、微晶纖維素、羥丙甲基纖維素、低取代羥丙基纖維素、交聯(lián)聚維酮、羧甲基淀粉鈉、聚乙二醇、硬脂酸鎂、微粉硅膠中的一種或任意幾種的混合物。
優(yōu)選地，所述藥物的劑型為片劑、顆粒劑、膠囊、液體劑型、氣體劑型或滴丸。
優(yōu)選地，所述片劑為緩釋片、控釋片、分散片、口腔崩解片、咀嚼片或口含片，所述膠囊為軟膠囊，所述液體劑型為糖漿、乳劑或口服液；所述氣體劑型為氣霧劑或噴霧劑。
本發(fā)明所述的枳實(shí)總黃酮含量測定如下
(I)上述總黃酮提取物中柚皮苷和新橙皮苷的含量測定(高效液相色譜法)
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鏈合硅膠為填充劑；乙腈-O. 5%甲酸水(15 85)為流動相；檢測波長為283nm ;柱溫30。。。
對照品溶液的制備精密稱柚皮苷對照品、新橙皮苷對照品適量，加流動相分別制成每ImL含柚皮苷60 μ g，新橙皮苷70 μ g的溶液。
供試品溶液的制備精密稱取本品約10mg，置50mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取5mL置IOmL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。
測定法分別精密吸取對照品溶液及供試品溶液各10 μ L，注入液相色譜儀，測定，即得。
(2)上述總黃酮提取物中總黃酮的含量測定(紫外分光光度法)
對照品溶液的制備精密稱取柚皮苷對照品，加流動相制成每ImL含O. IOmg的溶液。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精密量取對照品溶液I. OmL,2. OmL,2. 5mL、3. OmL,4. OmL,5.OmL,置IOmL量瓶中，各加甲醇稀釋至刻度，搖勻。以甲醇為空白，照紫外_可見分光光度法，在283nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
供試品溶液的制備精密稱取本品約10mg，置50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取2mL，置IOmL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得。
測定法精密量取供試品溶液lmL，置IOmL具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項下的方法，依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中含柚皮苷的量，計算，即得。
本發(fā)明的枳實(shí)總黃酮提取物可以與任何一種或一種以上藥劑學(xué)上可接受的賦形劑如淀粉、糊精、乳糖、微晶纖維素、羥丙甲基纖維素、低取代羥丙基纖維素、交聯(lián)聚維酮、羧甲基淀粉鈉、聚乙二醇、硬脂酸鎂、微粉硅膠等混合制成的各種劑型，例如，可制成片劑、緩釋片、控釋片、分散片、口腔崩解片、膠囊劑、軟膠囊劑、顆粒劑、滴丸、糖漿、乳劑、口服液中、 氣霧劑、噴霧劑任何一種現(xiàn)有藥物口服劑型。
本發(fā)明的有益效果是提供了一種從中藥材枳實(shí)中提取的枳實(shí)總黃酮，該提取物具有顯著的抗炎、平喘藥理活性，經(jīng)藥效學(xué)試驗證明其療效顯著。提取的總黃酮占總黃酮提取物重量百分比的70%以上，活性部位含量大于提取物的50% (重量百分比)，滿足中藥五類有效部位新藥的要求，同時能夠更好的發(fā)揮枳實(shí)黃酮類藥效物質(zhì)的藥理活性；試驗結(jié)果表明其能夠用于治療哮喘，枳實(shí)總黃酮提取物具有顯著降低哮喘持續(xù)時間、嗜酸性粒細(xì)胞的比例以及血清IgE水平的作用；能夠改善支氣管與肺組織的炎癥形態(tài)學(xué)變化，與模型組比較具有顯著性差異。本提取物來源于傳統(tǒng)中藥枳實(shí)，副作用少，在控制氣道炎癥因子的同時，改善氣道的高反應(yīng)性，從而達(dá)到治療哮喘的目的。本發(fā)明枳實(shí)提取物原料來源易得，易于產(chǎn)業(yè)化，可根據(jù)需要制成各種劑型，為臨床提供更加方便、更加有效、質(zhì)量更加可控的現(xiàn)代中藥，為患者帶來更多的利益，從而產(chǎn)生巨大的社會效益。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例I
取枳實(shí)飲片2kg，用水回流提取三次，加水倍量(重量)依次為12、10、10倍量，每次lh，濾過，合并三次提取液，回收溶劑，濃縮至相對密度I. 15，加乙醇使其含醇量達(dá)75% (體積/體積)，靜置12小時，離心，上清液回收乙醇后過HPD300型大孔吸附樹脂，依次用 4倍體積量(BV)的水洗脫至無色，棄去，再用4倍體積量(BV)的水30% (體積/體積)的乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮，減壓干燥，即得枳實(shí)總黃酮提取物。其中含總黃酮以柚皮苷計含量為86. 47% (重量百分比)。
實(shí)施例2
取枳實(shí)飲片2kg，用水回流提取三次，加水倍量依次為12、10、10倍量，每次lh，濾過，合并三次提取液，回收溶劑，濃縮至相對密度I. 15，加乙醇使其含醇量達(dá)50% (體積/ 體積)，靜置12小時，離心，上清液回收乙醇后過HPD100型大孔吸附樹脂，先用水洗脫至無色,棄去,再用4倍體積量的水95% (體積/體積)的乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液,濃縮,減壓干燥，即得枳實(shí)總黃酮提取物。其中含總黃酮以柚皮苷計含量為72. 45% (重量百分比)。
實(shí)施例3
取枳實(shí)飲片2kg，用水回流提取三次，加10倍量水，每次lh，濾過，合并三次提取液，回收溶劑，濃縮至相對密度I. 15，加乙醇使其含醇量達(dá)65% (體積/體積)，靜置12小時，離心，上清液回收乙醇后過HPD100型大孔吸附樹脂，先用水洗脫至無色，棄去，再用4倍體積量的水50% (體積/體積)的乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮，減壓干燥，即得枳實(shí)總黃酮提取物。其中含總黃酮以柚皮苷計含量為90. 32% (重量百分比)。取制得的總黃酮提取物，加入蔗糖80g，混合均勻，制粒，過篩，干燥，即制得含有枳實(shí)總黃酮的顆粒劑型的藥物。
實(shí)施例4
取枳實(shí)飲片2kg，用水回流提取三次，加10倍量水，每次lh，濾過，合并三次提取液，回收溶 劑，濃縮至相對密度I. 15，加乙醇使其含醇量達(dá)80% (體積/體積)，靜置12小時，離心，上清液回收乙醇后過AB-8型大孔吸附樹脂，先用水洗脫至無色，棄去，再用4倍體積量的70% (體積/體積)的乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮，減壓干燥，即得枳實(shí)總黃酮提取物。其中含總黃酮以柚皮苷計總黃酮含量為87. 28% (重量百分比)，含橙皮苷、密桔黃素和柑桔黃酮等黃酮成分共計占所述枳實(shí)總黃酮提取物的8% (重量百分比)。其中柚皮苷含量占所述枳實(shí)總黃酮提取物的30. 2% (重量百分比)，新橙皮苷含量占所述枳實(shí)總黃酮提取物36.2% (重量百分比)。取制得的總黃酮提取物，加入微晶纖維素200g，羧甲基纖維素鈉50g，微粉硅膠5g，混合均勻，制粒，壓片，即制得含有枳實(shí)總黃酮的分散片劑型的藥物。
實(shí)施例5
取枳實(shí)飲片2kg，用水回流提取三次，加10倍量水，每次lh，濾過，合并三次提取液，回收溶劑，濃縮至相對密度I. 15，加乙醇使其含醇量達(dá)85% (體積/體積)，靜置12小時，離心,上清液回收乙醇后過DA201型大孔吸附樹脂，依次用水、3倍體積量10% (體積 /體積)的乙醇洗脫至無色,棄去,再用4倍體積量的60% (體積/體積)的乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮，減壓干燥，即得枳實(shí)總黃酮提取物。其中含總黃酮以柚皮苷計含量為 92. 33% (重量百分比)。其中柚皮苷含量占所述枳實(shí)總黃酮提取物35. 1% (重量百分比)， 新橙皮苷含量占所述枳實(shí)總黃酮提取物38. 4% (重量百分比)。取制得的總黃酮提取物， 加入乳糖200g，混合均勻，制粒，裝膠囊，即制得含有枳實(shí)總黃酮的膠囊劑型的藥物。
實(shí)施例6
取枳實(shí)飲片2kg，用水回流提取三次，加10倍量水，每次lh，濾過，合并三次提取液，回收溶劑，濃縮至相對密度I. 20，加乙醇使其含醇量達(dá)60% (體積/體積)，靜置12小時，離心，上清液回收乙醇后過DM301型大孔吸附樹脂，先用水洗脫至無色，棄去，再用4倍體積量的75% (體積/體積)的乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮，減壓干燥，即得枳實(shí)總黃酮提取物。其中含總黃酮以柚皮苷計含量為85. 01% (重量百分比)，含橙皮苷、密桔黃素和柑桔黃酮等黃酮成分共計占所述枳實(shí)總黃酮提取物的10% (重量百分比)。其中柚皮苷含量占所述枳實(shí)總黃酮提取物的28. 9% (重量百分比)，新橙皮苷含量占所述枳實(shí)總黃酮提取物的26. 6% (重量百分比)。取制得的總黃酮提取物，加入400g熔融的聚乙二醇6000 中，采用滴丸制備工藝，即制得含有枳實(shí)總黃酮的滴丸劑型的藥物。
實(shí)施例7
取枳實(shí)飲片2kg，用水回流提取三次，加10倍量水，每次lh，濾過，合并三次提取液，回收溶劑，濃縮至相對密度I. 15，加乙醇使其含醇量達(dá)70% (體積/體積)，靜置12小時,離心，上清液回收乙醇后過NKA-9型大孔吸附樹脂，依次用水、3倍體積量的10% (體積 /體積)乙醇洗脫，棄去，再用4倍體積量的65% (體積/體積)的乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮，減壓干燥，即得枳實(shí)總黃酮提取物。其中含總黃酮以柚皮苷計含量為88. 01% (重量百分比)。其中柚皮苷含量占所述枳實(shí)總黃酮提取物的37. 2% (重量百分比)，新橙皮苷含量占所述枳實(shí)總黃酮提取物的34. 1% (重量百分比)。取制得的總黃酮提取物，加入泊洛沙姆適量，乙醇200g，水2kg，采用氣霧劑制備工藝，即制得含有枳實(shí)總黃酮的氣霧劑劑型的藥物。
實(shí)施例8
取枳實(shí)飲片2kg，用水回流提取三次，加10倍量水，每次lh，濾過，合并三次提取液，回收溶劑，濃縮至相對密度I. 20，加乙醇使其含醇量達(dá)75% (體積/體積)，靜置12小時,離心,上清液回收乙醇后過NKA-12型大孔吸附樹脂，依次用水、3倍體積量的5% (體積 /體積)乙醇洗脫，棄去，再用4倍體積量的40% (體積/體積)的乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮，減壓干燥，即得枳實(shí)總黃酮提取物。其中含總黃酮以柚皮苷計含量為97. 24% (重量百分比)。其中柚皮苷含量占所述枳實(shí)總黃酮提取物的57. 7% (重量百分比)，新橙皮苷含量占所述枳實(shí)總黃酮提取物的28. 5% (重量百分比)。取制得的總黃酮提取物，加入焦亞硫酸鈉2g,丙二醇IOOmL,泊洛沙姆40g，水2kg，采用噴霧劑制備工藝，即制得含有枳實(shí)總黃酮的噴霧劑劑型的藥物。
實(shí)施例9
取枳實(shí)飲片2kg，用水回流提取三次，加10倍量水，每次lh，濾過，合并三次提取液，回收溶劑，濃縮至相對密度I. 20，加乙醇使其含醇量達(dá)85% (體積/體積)，靜置12小時，離心，上清液回收乙醇后過NKA型大孔吸附樹脂，用4倍體積量的水洗脫，棄去，再用4 倍體積量的50% (體積/體積)的乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮，減壓干燥，即得枳實(shí)總黃酮提取物。其中含總黃酮以柚皮苷計含量為92. 32% (重量百分比)。其中柚皮苷含量占所述枳實(shí)總黃酮提取物的65. 7% (重量百分比)，新橙皮苷含量占所述枳實(shí)總黃酮提取物的17.3% (重量百分比)。取制得的總黃酮提取物，加入植物油400g，混勻，用明膠作囊殼材料，壓制成軟膠囊，即制得含有枳實(shí)總黃酮軟膠囊劑型的藥物。
具體實(shí)驗實(shí)施例
設(shè)計了灌胃給予本品進(jìn)行如下試驗采用卵蛋白致喘模型考察上述實(shí)施例I制得的枳實(shí)總黃酮提取物藥理活性。以潛伏期、持續(xù)時間、嗜酸性粒細(xì)胞、血中IgE水平等為指標(biāo)，從而考察本品對支氣管哮喘的治療作用。
(一 )實(shí)驗材料
I、藥物及試劑
博利康尼批號0708040,江蘇省阿斯利康制藥有限公司，實(shí)驗前用O. 5% CMC配成合適濃度的混懸液使用。
咳喘寧批號為0705002，天津隆順榕發(fā)展制藥有限公司，實(shí)驗前用O. 5% CMC配成合適濃度的混懸液使用。
2、動物
豚鼠，雌雄兼用，普通級，合格證號SCXK(京)2007-0003，購自北京科宇動物養(yǎng)殖中心。
( 二 )實(shí)驗方法與結(jié)果
2. I模型的制作及分組
適應(yīng)喂養(yǎng)I周后，豚鼠隨機(jī)分為模型組、正常對照組、中藥(咳喘寧)陽性對照組、 西藥(博利康尼)陽性對照組和樣品給藥組，每組8只。正常對照組，腹腔注射ImL生理鹽水，其余各組腹腔內(nèi)注射ImL 10%卵蛋白致敏。
2. 2給藥方法和哮喘激發(fā)
給藥方法豚鼠致敏后第15日開始灌胃給藥，連續(xù)7天，給藥劑量分別為樣品組 (積實(shí)總黃酮提取物)100mg/kg,西藥(博利康尼)陽性對照組I. llg/kg,中藥(咳喘寧) 陽性對照組3. 30g/kg。
激發(fā)激發(fā)時間每天給藥I小時后開始。激發(fā)方法在雙頭式多功能型超聲波霧化器內(nèi)用1%卵蛋白(生理鹽水配制)進(jìn)行激發(fā)，如該豚鼠出現(xiàn)劇烈咳嗽、打噴嚏、呼吸困難、喘息、呼氣費(fèi)力或點(diǎn)頭樣呼吸或聞及喘鳴音，表明哮喘模型制作成功，出現(xiàn)哮喘癥狀立刻停止激發(fā)。如果激發(fā)360秒未出現(xiàn)哮喘則停止激發(fā)，其潛伏期記錄為360秒；激發(fā)后如果不發(fā)生哮喘癥狀的豚鼠則被剔除。對照組霧化吸入生理鹽水，無上述癥狀出現(xiàn)。激發(fā)期間 給藥I小時后開始激發(fā)，共激發(fā)7天，每天記錄潛伏期和哮喘持續(xù)時間，第7天激發(fā)完畢后取材，待測指標(biāo)。
2. 3指標(biāo)測定
①豚鼠激發(fā)后哮喘發(fā)作潛伏期的觀察
記錄從開始激發(fā)到哮喘癥狀出現(xiàn)的時間間隔作為哮喘發(fā)作潛伏期(S)。
②豚鼠激發(fā)后哮喘發(fā)作持續(xù)時間的觀察
記錄從哮喘癥狀出現(xiàn)到哮喘癥狀消失的時間間隔作為哮喘發(fā)作持續(xù)時間(S)。
③豚鼠肺泡灌洗液(BALF)細(xì)胞計數(shù)與分類
取血后，麻醉動物，剪開胸部皮膚，鈍性分離氣管和食道，結(jié)扎左主支氣管，氣管套管插管于右側(cè)主支氣管，行支氣管肺泡灌洗。針管中抽取5mL生理鹽水，每次緩慢注入， 用手指輕輕按摩右肺組織并反復(fù)抽吸，每只大鼠可收集BALF 4mL。取微量BALF置于白細(xì)胞計數(shù)板上進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，在高倍鏡下計數(shù)白細(xì)胞總數(shù)(以每mL回收液的細(xì)胞數(shù)表示)。 將BALF以1500r/min的速率離心lOmin，沉淀的細(xì)胞團(tuán)充分振散，即刻作涂片、吹干，經(jīng) Wright-Giemsa染色,計數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞占白細(xì)胞的比例。
④豚鼠血涂片中嗜酸性粒細(xì)胞的比例
常規(guī)制作血涂片，經(jīng)Wright-Giemsa染色后，嗜酸性粒細(xì)胞胞質(zhì)呈淺紅色，由于其中充滿顆粒，常不易見到細(xì)胞質(zhì)。顆粒呈鮮紅色，核為桿形或分葉形。根據(jù)其形態(tài)確定嗜酸性粒細(xì)胞，并計算嗜酸性粒細(xì)胞占白細(xì)胞總數(shù)的比例。
2. 4實(shí)驗結(jié)果
2.4. I對豚鼠哮喘發(fā)作潛伏期和持續(xù)時間的影響
表I對豚鼠哮喘發(fā)作潛伏期和持續(xù)時間的影響(x±s)
權(quán)利要求
1.枳實(shí)總黃酮提取物在制備用于治療哮喘藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述枳實(shí)總黃酮提取物包括重量百分比以柚皮苷計70% 100%的總黃酮，優(yōu)選地，所述含有重量百分比為總黃酮占總黃酮提取物重量的80%。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述總黃酮包括柚皮苷和新橙皮苷， 所述柚皮苷含量占所述枳實(shí)總黃酮提取物的25% (重量百分比)以上，優(yōu)選地，所述柚皮苷含量占所述枳實(shí)總黃酮提取物的30%以上，所述新橙皮苷含量占所述枳實(shí)總黃酮提取物的25% (重量百分比)以上，優(yōu)選地，所述新橙皮苷含量占所述枳實(shí)總黃酮提取物的30% (重量百分比)以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述枳實(shí)總黃酮提取物中還含有重量百分比為10% 20%黃酮類成分，優(yōu)選地，所述黃酮類成分占所述枳實(shí)總黃酮提取物的重量百分比含量為8 10%，優(yōu)選地，所述黃酮類成分包括的橙皮苷、密桔黃素和柑桔黃酮。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述枳實(shí)總黃酮提取物通過以下方法制得1)取枳實(shí)藥材，加適量的水提取，收集所有提取液，將其濃縮；2)將濃縮后的提取液加乙醇置含醇量為50% 90%(體積/體積)后靜置，離心，上清液濃縮或回收乙醇后過大孔吸附樹脂，先用水或5 10% (體積/體積)的低濃度乙醇洗脫，除去溶于極性溶劑的雜質(zhì)，棄去；3)再用30 95%(體積/體積)的高濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇后干燥， 即得總黃酮。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，在步驟I)中，所述提取方法具體為加 10 12倍量(重量)的水提取三次，每次提取lh。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至6任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物為含有枳實(shí)總黃酮提取物的藥物，所述藥物中還含有藥劑學(xué)上可接受的賦形劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求I至7任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述賦形劑為淀粉、糊精、乳糖、微晶纖維素、羥丙甲基纖維素、低取代羥丙基纖維素、交聯(lián)聚維酮、羧甲基淀粉鈉、聚乙二醇、硬脂酸鎂和微粉硅膠中的一種或任意幾種的混合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求I至8任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物的劑型為片劑、顆粒劑、膠囊、液體劑型、氣體劑型或滴丸。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的總黃酮提取物制劑，其特征在于，所述片劑為緩釋片、控釋片、分散片、口腔崩解片、咀嚼片或口含片，所述膠囊為軟膠囊，所述液體劑型為糖漿、乳劑或口服液；所述氣體劑型為氣霧劑或噴霧劑。
全文摘要
本發(fā)明提供一種枳實(shí)總黃酮提取物在制備用于治療哮喘藥物中的應(yīng)用，試驗結(jié)果表明其能夠用于治療哮喘，枳實(shí)總黃酮提取物具有顯著降低哮喘持續(xù)時間、嗜酸性粒細(xì)胞的比例以及血清IgE水平的作用；能夠改善支氣管與肺組織的炎癥形態(tài)學(xué)變化，與模型組比較具有顯著性差異，并且在治療哮喘的過程中副作用少，治療有效。
文檔編號A61K36/752GK102935131SQ20111023273
公開日2013年2月20日 申請日期2011年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月15日
發(fā)明者張鐵軍, 廖茂梁, 龔蘇曉, 解學(xué)星, 孫衛(wèi), 王麗莉, 鄭雅楠 申請人:天津藥物研究院