專利名稱:Sca-1<sup>+</sup>/CD34<sup>-</sup>子宮干細胞及其分離方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種干細胞,特別是涉及一種從子宮中提取的干細胞。本發(fā)明還涉及該子宮干細胞的分離方法,以及該子宮干細胞的用途。
背景技術(shù):
隨著人們生活方式的改變,缺血性疾病已經(jīng)成為近年來全球發(fā)病率最高的疾病之一,而且發(fā)病率一直在不斷上升。缺血性疾病是一種由于血管狹窄或閉塞導致組織灌注不良,最終造成器官功能障礙甚至衰竭的疾病,可累及全身各個器官,造成嚴重后果,甚至危及生命,例如急性心肌梗死、缺血性心肌病,腦梗死等。在正常狀態(tài)下,血管新生是機體對缺血、缺氧損傷的自身代償性機制。在心肌缺血早期,毛細血管密度代償性增加,在阻塞或狹窄的冠狀動脈周圍形成新生血管以建立側(cè)支循環(huán),從而改善局部缺血狀態(tài)。但這種代償往往不足以徹底恢復組織灌注,糾正缺血的病理生理改變,以致臨床不得不采取外源性干預措施,以挽救患者的生命。對于缺血性疾病,藥物治療、介入治療和外科手術(shù)治療是目前國際上公認的三大主要治療干預措施。藥物治療主要應用于缺血性疾病的預防和早期治療。 而介入及外科手術(shù)治療主要針對較嚴重的缺血性疾病,能夠較為徹底的解決主干或較大血管的梗死,然而其對遠端微灌注的影響有限,且針對血管彌漫性狹窄的患者很難達到理想的治療效果。所以,目前的治療手段并不能徹底恢復受損組織的灌注,從根本上解決缺血性疾病的病理生理改變,以達到根治的目的。治療性血管新生是目前國際公認的針對缺血性疾病的治療新理念,通過促進新生血管的形成,建立有效的側(cè)支供血循環(huán),從根本上改善組織缺血的狀態(tài),恢復器官功能,以達到標本兼治的持續(xù)性臨床療效。細胞移植是目前臨床及基礎(chǔ)研究界公認的針對缺血性疾病最有希望的治療手段之一,在基礎(chǔ)及臨床研究領(lǐng)域廣受重視。雖然大量的研究已經(jīng)證實細胞移植對于缺血性疾病具有一定的治療作用,但受到不同細胞類型、細胞特點及功能的限制,其治療效果并不穩(wěn)定。如何選擇移植靶細胞,是保證細胞移植治療效果的關(guān)鍵。以缺血性心臟病為例,早期細胞移植關(guān)于靶細胞的選擇多集中在肌原性細胞,如平滑肌細胞,希望可以通過增加壞死區(qū)肌細胞的數(shù)量來增加心肌的收縮力,改善心臟的功能。但后來的研究發(fā)現(xiàn),單純增加肌細胞的數(shù)量,而不從根本上改善梗死區(qū)組織的灌注狀態(tài),獲得的治療效果是極其有限的。那么如何通過細胞移植的方法,增加梗死區(qū)新生血管的形成,從根本上改善組織的灌注狀態(tài),恢復心臟功能呢?這正是目前世界范圍內(nèi)細胞移植研究界最熱點的研究問題。干細胞是一類具有自我更新和分化潛能的細胞系,能夠在一定的條件下分化為血源性細胞、肌源性細胞和間充質(zhì)原性細胞等,也就是說干細胞是最有可能具有在一定條件下形成新生血管潛力的細胞系。干細胞按其存在的不同時期可分為胚胎干細胞和成體干細胞。目前胚胎干細胞已可成功的在體外培養(yǎng),并在特定的培養(yǎng)條件下定向誘導分化為各種功能細胞,用于修復受損病變的組織或器官。然而胚胎干細胞培養(yǎng)難度大,成本高,存在潛在的成瘤性風險,同時受到移植排斥和倫理學限制,使其很難應用于臨床治療。成體干細胞是存在于各種已分化組織中的未分化細胞。在多數(shù)情況下可分化為相同組織類型的細胞,但另一方面,其分化又具有一定的可塑性,能打破胚層界限,分化成與其來源不同的其它類型的組織細胞。目前,已在多種組織中發(fā)現(xiàn)成體干細胞的存在。由于分離和使用成體(自體) 干細胞不存在倫理學問題,在體外培養(yǎng)時可以根據(jù)需要大量擴增,便于臨床應用,且不存在免疫排斥反應等優(yōu)勢,因此,成體干細胞顯示出更為廣泛的應用前景。子宮是一種具有高度增殖活性和強大血管形成能力,且具有周期性更新特點的組織。30多年前就有學者推測子宮內(nèi)可能存在干細胞。2004年,Gargett和Chan等發(fā)表文章首次提出子宮干細胞存在的概念。近年來,亦有大量基礎(chǔ)及臨床研究證實了子宮組織中存在具有自我更新、高度增殖和分化潛能的干細胞。然而目前的研究仍僅限于通過克隆形成實驗、標記滯留技術(shù)等方法來推測子宮干細胞的存在,多數(shù)學者都依靠在造血、神經(jīng)、表皮或其它系統(tǒng)中的干細胞標記去研究子宮內(nèi)膜干細胞,所以子宮干細胞的特異性標志物仍在探索中。分離和鑒定子宮內(nèi)膜干細胞成了一項非常具有挑戰(zhàn)性的工作。另外,這類子宮干細胞在血管再生及其對缺血性疾病的治療機制和效果也未見有報道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的干細胞一Sca-I+/⑶;34—子宮干細胞。提供所述^^-1+/⑶34—子宮干細胞的分離方法,是本發(fā)明的另一發(fā)明目的。本發(fā)明的發(fā)明目的還在于提供所述^^_1+/^034—子宮干細胞的用途,特別是在缺血性疾病治療方面的用途。首先,本發(fā)明提出了一種Sca-l7CD34—子宮干細胞,該子宮干細胞從哺乳動物的子宮分離得到,以⑶34 — jca-l+的形式表達⑶34和ka-Ι,具有誘導內(nèi)皮細胞形成血管結(jié)構(gòu)的能力。其次,本發(fā)明提供了一種上述^^-17⑶34一子宮干細胞的分離方法,該方法使用對CD34、Sca-I兩種標志蛋白具有特異親和性的物質(zhì)進行,首先自子宮組織中篩選出對 ⑶34陰性表達的細胞,再從上述⑶34陰性表達的細胞中進一步篩選出對ka-Ι陽性表達的細胞,即為上述ka-Γ/⑶;34一子宮干細胞。進一步地,所述對⑶34、Sca-I兩種標志蛋白具有特異親和性的物質(zhì)是⑶34、 Sca-I兩種標志蛋白的各自抗體。本發(fā)明提供了一種典子宮干細胞的分離方法,該方法包括以下順序的步驟
1)獲取消化的子宮組織;
2)應用磁珠標記的抗CD34抗體,以磁珠篩選法從消化的子宮組織中篩選出CD34一細
胞;
3)再次應用磁珠標記的抗SCa-I抗體,以磁珠篩選法從2)中CD34—細胞中分離出 Sca-I+細胞,得到ka-l+/CD34 —子宮干細胞。本發(fā)明還提供了上述分離得到的&&-1+/^034—子宮干細胞的培養(yǎng)方法,其方法是在分離得到的ka-l7CD34 一子宮干細胞中加入1%甲基纖維素基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10%胎牛血清、 4. 5 XlO4M硫代甘油、25 μ g/mL抗壞血酸、2mM谷氨酰胺、200 μ g/mL飽和轉(zhuǎn)鐵蛋白,在濕度彡95%,溫度37°C,(X)2濃度5%的環(huán)境下培養(yǎng)。本發(fā)明也提供了一種Sca-I+/⑶34 —子宮干細胞的分化方法,是將分離得到的ka-l7CD34—子宮干細胞加入到分化培養(yǎng)基中,對臍帶血內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞分別進行培養(yǎng),其中,所述分化培養(yǎng)基的組成為IMDM培養(yǎng)基、10%胎牛血清和25%內(nèi)皮細胞原代培養(yǎng)基。本發(fā)明分離、培養(yǎng)、分化獲取一子宮干細胞具有血管再生能力,可以應用于制備預防或治療缺血性疾病的藥物。本發(fā)明首先開展了對子宮干細胞分離、鑒定、培養(yǎng)和分化方法的研究,首次從子宮內(nèi)膜組織分離出具有ka-l+/CD34—表面標記物的細胞,并鑒定其是具有干細胞各種特性的子宮干細胞。體外細胞分化實驗證明,Sca-I+/⑶;34—表面標記物的子宮干細胞能夠分化成具有分泌多種促血管生成的細胞因子,與ka-1— /⑶34—細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞(MSC)的細胞提取物相比,能夠誘導更多的血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞遷移(/7<0. 05)并形成血管結(jié)構(gòu); 體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn),將ka-l7CD34 一子宮干細胞移植于小鼠缺血后腿及冠狀動脈結(jié)扎后的心梗組織,與生理鹽水對照組及骨髓MSC組相比,缺血區(qū)的后腿組織再灌注、肌肉缺失及心肌功能情況明顯改善OX0. 05)。所以,本發(fā)明首次證實了 Sca-I+/⑶34一子宮干細胞的血管再生能力及其對缺血性疾病的治療效果,為缺血性疾病患者帶來了希望。
圖1是富集的ka-Γ/⑶;34—子宮干細胞的流式鑒定結(jié)果圖。圖2是ka-l7CD34—子宮干細胞與—/CD34 ―、骨髓間充質(zhì)干細胞(MSC)相比誘導人臍帶血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的遷移結(jié)果圖。圖3是^^-1+/⑶34一子宮干細胞與骨髓間充質(zhì)干細胞(MSC)誘導人臍帶血管內(nèi)皮細胞形成血管結(jié)構(gòu)的能力比較圖。圖4是^^-1+/⑶34一子宮干細胞與骨髓間充質(zhì)干細胞(MSC)分別種植在小鼠缺血后腿組織對再灌注和肌肉缺失的效果比較結(jié)果圖。圖5是^^-1+/⑶34—子宮干細胞與骨髓間充質(zhì)干細胞(MSC)分別種植在心肌梗死區(qū)組織對心臟功能影響效果評價比較圖。
具體實施例方式實施例1 =Sca-I+/⑶34—子宮干細胞的分離。1)異氟醚麻醉8-10周齡小鼠,氣管插管,呼吸機維持呼吸,2-3%異氟醚維持麻醉。2)已麻醉小鼠仰臥位,正中開胸,撕開心包,切開右心房,從主動脈內(nèi)持續(xù)以生理壓力灌注0. 9%生理鹽水,沖洗組織,直至從右心房中流出干凈(無血液污染)的生理鹽水。3)開腹,取出子宮,并將其充分切碎。4)用0. 25%胰蛋白酶、2mg/ml膠原酶、0. 01%DNA酶,37°C消化1小時,以盡量減少
細胞表面標志物的破壞。5)從上述消化的組織中,應用磁珠標記的抗⑶34抗體(stemcell公司,加拿大), 以磁珠篩選法篩選出CD34—細胞。步驟為收集消化液,用200目過濾網(wǎng)過濾細胞到圓底聚苯乙烯管內(nèi),計數(shù)板計數(shù),將細胞數(shù)控制在IO7-IO8之間,然后按照分選試劑盒說明書操作。6)再次應用磁珠標記的抗ka-Ι抗體(stemcell公司,加拿大),以磁珠篩選法從上步篩選出的細胞中分離出ka-Γ細胞,分離步驟參照試劑盒說明書,得到ka-l7CD34 — 子宮干細胞。7)用培養(yǎng)基清洗篩選出的細胞后,鋪盤培養(yǎng)。8)用流式細胞儀技術(shù)鑒定篩選后^^-1+/⑶34—子宮干細胞的純度,結(jié)果顯示,提取的ka-Γ/⑶;34—子宮干細胞純度可以達到96. 3% (結(jié)果見圖1)。實施例2 =Sca-I+/⑶34 —子宮干細胞的培養(yǎng)。將實施例1篩選出的細胞接種于35mm培養(yǎng)盤中,加入1%甲基纖維素基礎(chǔ)培養(yǎng)基、 10%胎牛血清、4. 5 X IO4M硫代甘油、25 μ g/mL抗壞血酸、2mM谷氨酰胺、200 μ g/mL飽和轉(zhuǎn)鐵蛋白,培養(yǎng)環(huán)境保持在濕度> 95%,溫度37 °C,CO2濃度5%。實施例3 =Sca-I+/⑶34 —子宮干細胞的分化。分化培養(yǎng)基組成IMDM培養(yǎng)基、10%胎牛血清和25%內(nèi)皮細胞原代培養(yǎng)基。Sca-I+/⑶34—子宮干細胞、Sca-I— /⑶34—細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞(MSC)的細胞提取物分別加入到基質(zhì)膠中,對人臍帶血內(nèi)皮細胞(HUVEC)和平滑肌細胞(SMC)分別進行培養(yǎng),并用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)作為對照組,以形成新生血管的長度來評價HUVECs形成血管結(jié)構(gòu)的能力。結(jié)果顯示,Sca-I+/⑶34—子宮干細胞誘導內(nèi)皮細胞形成血管結(jié)構(gòu)的能力較ka-Ι 一 /⑶34—和骨髓MSC為強,具體見圖2、圖3。圖2A-B說明的是ka-Γ/⑶;34一子宮干細胞誘導人臍帶血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)遷移結(jié)果。圖2A顯示的是HUVEC遷移的染色結(jié)果。計數(shù)細胞從圖2B可知,與^^-廠/⑶34 一對照細胞和骨髓MSC相比,Sca-l7CD34—子宮干細胞能夠誘導更多的內(nèi)皮細胞遷移,細胞數(shù)目有顯著性差異0X0. 01或/7<0.05)。圖2C-D說明的是^^-1+/0)34—子宮干細胞誘導平滑肌細胞(SMC)遷移結(jié)果。圖2C顯示的是SMC遷移細胞的染色結(jié)果。計數(shù)細胞從圖2D可知,與ka-Ι — /⑶34 —細胞和骨髓MSC誘導能力比較,ka-Γ/⑶34 —子宮干細胞能夠誘導更多的平滑肌細胞遷移0X0. 01或/7<0. 05),即Sca-I+/⑶;34—子宮干細胞具有更大的誘導血管形成的能力。圖3顯示的是^^-1+/⑶;34一子宮干細胞誘導內(nèi)皮細胞形成血管結(jié)構(gòu)的的長度圖, ka-l7CD34—子宮干細胞誘導內(nèi)皮細胞形成血管結(jié)構(gòu)的的長度與生理鹽水及骨髓MSC對照組相比,有顯著性差異0X0. 01或/7<0. 05)。所以說,Sca-17CD34—子宮干細胞的分化趨勢及分化功能均與血管的形成密切相關(guān),子宮干細胞的這種分化趨勢,最終決定了其具有強大的新生血管形成能力。
實施例4 Sca-I+/⑶;34—子宮干細胞體內(nèi)血管再生能力的鑒定。1)異氟醚持續(xù)吸入麻醉實驗小鼠,固定仰臥位。脫毛和消毒后,分別分離左、右腿股動脈,雙側(cè)股動脈分別在分支以上用手術(shù)線結(jié)扎。2)小鼠后肢缺血模型建立M小時后,分別將^^-1+/⑶;34—子宮干細胞和骨髓MSC 種植在股動脈結(jié)扎后的缺血后腿組織中,對側(cè)下肢缺血部位注射單純培養(yǎng)基作為對照。3)股動脈結(jié)扎前和移植后1小時、1天、4天、7天、14天、21天對缺血區(qū)組織的再灌注情況進行評價。缺血區(qū)組織的再灌注評價采用激光多普勒血流灌注成像分析儀測量 (PeriScan PIM 3 Systems,瑞典)。4)結(jié)果計算缺血區(qū)和非缺血區(qū)血流比例比較。
結(jié)果見圖4,ka-Γ/⑶;34—子宮干細胞移植組的組織再灌注情況明顯好于骨髓MSC 組,并且在細胞移植21天后對兩組動物缺血區(qū)肌肉缺失的情況進行評價,Sca-I+/⑶;34一子宮干細胞組的肌肉缺失要顯著少于骨髓MSC組(/7<0. 05)和生理鹽水對照組(/7<0. 01),說明子宮干細胞確實能夠形成大量有功能的血管,并能夠在一定程度上恢復組織灌注,減少組織損傷。實施例5 =Sca-I+/⑶34 —子宮干細胞對缺血性心臟疾病的治療效果。1)實驗小鼠氣管插管二%異氟醚持續(xù)吸入麻醉。實驗鼠左側(cè)開胸,用7-0普理靈線結(jié)扎小鼠冠狀動脈左前降支,至30%左心室壁梗死。2)分別將ka-Γ/⑶;34—子宮干細胞和骨髓MSC細胞種植在冠狀動脈結(jié)扎后的心肌梗死區(qū)組織內(nèi),用單純培養(yǎng)基注射作為對照。3)分別在細胞移植后0天、7天、14天和35天應用超聲心動圖評價實驗小鼠心臟功能。在細胞移植后35天,壓力容積導管測定儀進一步評價實驗小鼠的心臟功能。結(jié)果見圖5,其中圖5A-B應用超聲心動圖來評價心臟功能(縮短分數(shù)FS),可以看出在細胞移植后的0天、7天、14天和35天,Sca-I+/⑶;34—子宮干細胞移植組小鼠的心臟功能較骨髓MSC細胞移植組明顯提高。圖5C-D應用壓力容積導管測定儀來評價細胞移植后實驗動物的心臟功能,發(fā)現(xiàn)ka-l7CD34 —子宮干細胞移植組動物的射血分數(shù)高于其他兩組 (/7<0. 05)??傊?,實驗組小鼠的心臟功能明顯高于對照組。所以,子宮干細胞通過新生血管形成,改善了缺血區(qū)心肌的灌注,在一定程度上恢復了心臟功能,對缺血性心臟病有較為明顯的治療作用。同時也進一步證明了子宮干細胞的增生、分化功能和新生血管形成的能力。在體內(nèi)水平證實了子宮干細胞對缺血性疾病的治療作用。
權(quán)利要求
1.一種Sca-r/CD34 —子宮干細胞,該子宮干細胞從哺乳動物的子宮分離得到,以 CD34 —、Sca-Γ 的形式表達 CD34 和 。
2.—種ka-Γ/⑶;34—子宮干細胞的分離方法,該方法使用對⑶34、Sca-I兩種標志蛋白具有特異親和性的物質(zhì)進行。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ka-l7CD34—子宮干細胞的分離方法,其特征是對CD34、 Sca-I兩種標志蛋白具有特異親和性的物質(zhì)是CD34、Sca-I兩種標志蛋白的抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的ka-l7CD34—子宮干細胞的分離方法,其特征是包括以下順序的步驟1)獲取消化的子宮組織;2)應用磁珠標記的抗CD34抗體,以磁珠篩選法從消化的子宮組織中篩選出CD34一細胞;3)再次應用磁珠標記的抗SCa-I抗體,以磁珠篩選法從2)中CD34—細胞中分離出 Sca-I+細胞,得到ka-l+/CD34 —子宮干細胞。
5.一種ka-Γ/⑶34—子宮干細胞的培養(yǎng)方法,其特征是在分離得到的ka-Γ/⑶34 — 子宮干細胞中加入1%甲基纖維素培養(yǎng)基、10%胎牛血清、4. 5 XlO4M硫代甘油、25 μ g/mL抗壞血酸、2mM谷氨酰胺、200 μ g/mL飽和轉(zhuǎn)鐵蛋白,在濕度彡95%,溫度37°C,0)2濃度5%的環(huán)境下培養(yǎng)。
6.一種ka-Γ/⑶34—子宮干細胞的分化方法,其特征是將分離得到的ka-Γ/⑶34 — 子宮干細胞加入到分化培養(yǎng)基中,其中,所述的分化培養(yǎng)基組成為IMDM培養(yǎng)基、10%胎牛血清和25%內(nèi)皮細胞原代培養(yǎng)基。
7.權(quán)利要求1的Sca-17CD34—子宮干細胞在制備預防或治療缺血性疾病的藥物中的應用。
全文摘要
Sca-1+/CD34-子宮干細胞,從哺乳動物的子宮分離得到,以CD34-、Sca-1+的形式表達CD34和Sca-1,其分離方法是應用磁珠標記的抗CD34抗體從消化的子宮組織中篩選出CD34-細胞;再應用磁珠標記的抗SCa-1抗體從CD34-細胞中分離出Sca-1+細胞,得到Sca-1+/CD34-子宮干細胞。實驗證實,Sca-1+/CD34-子宮干細胞具有誘導內(nèi)皮細胞形成血管結(jié)構(gòu)的能力,能夠形成大量有功能的血管,并能夠在一定程度上恢復組織灌注,減少組織損傷;體內(nèi)水平證實Sca-1+/CD34-子宮干細胞對缺血性疾病有治療效果,可以用于制備預防或治療缺血性疾病的藥物。
文檔編號A61K35/48GK102229911SQ20111015475
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月8日
發(fā)明者劉志貞, 孫卓, 李仁科, 解軍 申請人:山西醫(yī)科大學