專利名稱：由牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及有關(guān)牙本質(zhì)的再生醫(yī)療的領(lǐng)域。具體地說，涉及位點特異性地誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的方法，還涉及由牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑。進而，涉及含有上述分化誘導(dǎo)劑作為有效成分的蓋髓材料。本申請要求用以參考在此引用的日本申請?zhí)卦?009-262378號優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
以往，在齲齒(蟲牙)的治療中，采用如下治療的方法齲齒部分通過切削而去棹，用樹脂或石膏充填該切削的部分，以使其人工恢復(fù)。在齲齒引起的齲洞大時，將軟化牙本質(zhì)留下一部分的情況下暫時中止牙髓的切削，使用氫氧化鈣作為蓋髓材料。 牙髓是填滿存在于牙內(nèi)部的稱作牙髓腔的空洞的血管性結(jié)合組織，是由來自中胚層的牙乳頭形成的非鈣化組織。相對于此，牙本質(zhì)是存在于牙髓腔周圍的硬的鈣化組織。一直以來，根據(jù)牙髓為軟組織、牙本質(zhì)為硬組織這樣的結(jié)構(gòu)特征，二者作為完全不同的物質(zhì)被處理。但是，近年來，牙髓和牙本質(zhì)無論是在胚胎學(xué)上還是在功能上都是相同的組織，在臨床上，理解為牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體(Dentin-Pulp Complex)的傾向也較強。牙患齲齒吋，根據(jù)其程度，實施不去除牙髓而進行保護的治療(直接牙髓覆蓋)、僅去除牙髓的一部分(冠部牙髓)而保存根部牙髓的治療(活髓切斷)、去除全部牙髓后用金屬或樹脂添堵空洞的治療(拔髓)等。但是存在如下問題去除牙髓后，由于向牙的營養(yǎng)供給被斷絕，因而牙本質(zhì)產(chǎn)生脆化，并且由于沒有傳達(dá)疼痛的神經(jīng)，因而再次齲齒進行時得不到自覺癥狀而惡化。因此，近年來人們認(rèn)為，為了維持牙的健康狀態(tài)，優(yōu)選盡可能保存牙髓。為了保存牙髓并維持其功能，根據(jù)牙本質(zhì)的破損狀態(tài)和牙髓的病理狀態(tài)，使用間接蓋髓材料或直接蓋髓材料。間接蓋髓材料用于牙本質(zhì)破損但牙髓未露出的狀態(tài)，直接蓋髓材料在牙髓露出的情況或通過治療切斷牙髓的一部分的情況下使用。作為直接蓋髓材料，以往使用了氫氧化鈣制劑、甲醛甲酚制劑。然而，氫氧化鈣沒有誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞的作用，不能期待促進牙本質(zhì)形成。目前，作為具有促進牙本質(zhì)形成作用的物質(zhì)，報道了牛血液提取物(專利文獻I)、N-こ酰-葡萄糖胺等多糖類(專利文獻2)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BoneMorphogenetic Protein BMP)等。氫氧化鈣在三個月左右對牙髓內(nèi)的成牙本質(zhì)細(xì)胞給予刺激，從而促進牙髓腔內(nèi)的第二牙本質(zhì)的生成。其結(jié)果是，在軟化牙本質(zhì)和牙髓之間形成健全的牙本質(zhì)，其后軟化牙本質(zhì)被去除。但在該方法中，氫氧化鈣沒有促進牙髓細(xì)胞増殖的作用或誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞的作用，因此在與氫氧化鈣接觸的牙髓面上產(chǎn)生強堿引起的壞死層。另外，在該方法中，使牙髓組織變性壞死，在其后的修復(fù)過程中使牙本質(zhì)再生，因此存在需要時間、效率差、預(yù)后不確定等的問題。牙本質(zhì)是占牙的大部分的硬組織，其以支持內(nèi)部的牙髓或周圍的牙釉質(zhì)和牙骨質(zhì)的形式存在。牙本質(zhì)通過從成牙本質(zhì)細(xì)胞合成、分泌的有機性基質(zhì)進行鈣化而形成。該有機性基質(zhì)大部分是膠原，剩余的約10%為非膠原蛋白(noncollagenous protein :NCP)。已知，NCP中最多的是牙本質(zhì)涎磷蛋白(dentin sialophosphprotein :Dspp,以下簡稱為“Dspp”。)，其在成牙本質(zhì)細(xì)胞中合成后，由該蛋白質(zhì)生成牙本質(zhì)涎蛋白(DSP)、牙本質(zhì)糖蛋白(DGP)、牙本質(zhì)磷蛋白(DPP)。關(guān)于由牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法以及牙本質(zhì)的再生方法，正在進行各種研究。作為代替氫氧化鈣的物質(zhì)，公開了以BMP為有效成分的牙本質(zhì)形成蓋髓劑(材料)(專利文獻3)。BMP等骨誘導(dǎo)因子的使用是著眼于形成牙本質(zhì)的鈣化基質(zhì)的成分與骨非常相似這一點，是在產(chǎn)生牙本質(zhì)的應(yīng)用中進行的嘗試。然而，如B MP這樣的因子雖然在促進已分化的成牙本質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生鈣化基質(zhì)的方面上有效果，但不是促進牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的物質(zhì)，因此在患部組織中誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞這一點上效果非常有限。有人提出了使天然的牙本質(zhì)再生而用于治療的方法，并進行研究。例如有下述報道將在羥基磷灰石和磷酸三鈣的復(fù)合體的粉體中接種了培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞的試樣移植到裸鼠皮下6周后摘出，由摘出后的蘇木精/伊紅染色圖確認(rèn)到硬組織的形成(非專利文獻I)。 還有下述報道對于由該試樣提取的RNA使用RT-PCR進行評價，其結(jié)果是表達(dá)了成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化標(biāo)志的mRNA、S卩，得到的硬組織為牙本質(zhì)樣組織。但是，所形成的硬組織的量非常少，在臨床應(yīng)用中需要更大量的牙本質(zhì)再生。作為關(guān)于牙本質(zhì)再生的其他技術(shù)，公開了含有使膠原固定化的こ烯ー醋酸こ烯酯共聚物皂化物(A)以及粘合劑(B)而形成的牙本質(zhì)再生蓋髓劑(材料)(專利文獻4)。所述牙本質(zhì)再生用蓋髓劑(材料)，在確保具有再生牙本質(zhì)能力的細(xì)胞増殖的支架的功能方面優(yōu)異。進而，作為使牙本質(zhì)再生的方法，公開了如下方法通過將人牙髓細(xì)胞在1，25( ニ羥基)維生素D3、地塞米松和甘油磷酸鈉的存在下進行培養(yǎng)而使其分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞，將該細(xì)胞與載體等一起培養(yǎng)和/或移植，由此使牙本質(zhì)再生(專利文獻5、6)。另外，作為其他的方法，公開了使用多聚磷酸的牙本質(zhì)形成蓋髓劑(材料)(專利文獻7)。但是，這些都是示出涉及由成牙本質(zhì)細(xì)胞向牙本質(zhì)再生的技術(shù)，并不是誘導(dǎo)牙髓向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的技術(shù)。已知牙的發(fā)育是通過牙源性上皮和牙源性間充質(zhì)組織的緊密的相互作用而進行的?？梢哉J(rèn)為，神經(jīng)嵴來源的間充質(zhì)細(xì)胞接受來自外胚層系的上皮組織的信號而向牙髓細(xì)胞分化，且各種生長因子參與該過程。作為與牙的發(fā)育有關(guān)的信號，已知的有BMP、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、Wnt、音猬因子(Shh)等。另外，還有啟示T GF(transforming growth factor、轉(zhuǎn)化生長因子)-β參與成熟牙髓的成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的報道。在上皮和間充質(zhì)組織之間存在基底膜，該基底膜的構(gòu)成要素之ー為蛋白聚糖。由最近的研究表明，基底膜的蛋白聚糖的糖鏈在fct信號的傳導(dǎo)中起著重要的作用(非專利文獻2)。有文獻報道，在發(fā)育的階段中，Wnt在神經(jīng)嵴細(xì)胞中誘導(dǎo)Dspp的分泌(非專利文獻3)。即，在非專利文獻3中，雖然對牙的發(fā)育階段中的Wnt進行報道，但是沒有在已形成的牙中，fc參與由牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化或再生的報道。有文獻報道，對于小鼠P 14下頜磨牙組織，使用し_35S]UTP標(biāo)記RNA探針，并利用原位雜交(in situ hybridization)進行確認(rèn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)WntlOa在基底膜上表達(dá),并且發(fā)現(xiàn)作為成牙本質(zhì)細(xì)胞特異性細(xì)胞外基質(zhì)的Dspp與WntlOa同樣地在基底膜上表達(dá)(參見非專利文獻4 :圖I)。另外還有報道，使WntlOa針對作為未分化間充質(zhì)系細(xì)胞的C310T1/2強制表達(dá)，在基質(zhì)膠(基底膜成分提取物)中進行培養(yǎng)，結(jié)果在10天后顯示Dspp mRNA的表達(dá)。(參見非專利文獻4:圖2)。Wnt信號逾越生物種而被保存下來，其控制發(fā)育初期時的體軸形成或器官形成、細(xì)胞的増殖或分化。已知在fct信號傳導(dǎo)途徑中至少存在如下3種途徑1)通過β-連鎖蛋白的細(xì)胞內(nèi)蓄積而控制轉(zhuǎn)錄因子的β_連鎖蛋白途徑、2)藉由作為低分子量G蛋白質(zhì)的Rho家族而控制平面內(nèi)細(xì)胞極性(planar cell polarity)的P CP途徑、3)藉由三聚體G蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)引起Ca2+的動員，激活蛋白激酶C(PKC;pr0tein kunase C)或CaMK II (Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II、I丐調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II)等的Ca2+途徑(非專利文獻5)。但是，誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化來形成牙本質(zhì)的方法尚未闡明。現(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻
專利文獻I :日本特開2002-363084號公報專利文獻2 :日本特開平06-256132號公報專利文獻3 :日本特開平06-340555號公報專利文獻4 日本特開2004-292433號公報專利文獻5 :日本特開2005-341961號公報專利文獻6 :日本特開2006-211957號公報專利文獻7 :日本特開2005-263681號公報非專利文獻非專利文獻I Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 (25)，13625-30 (2000)非專利文獻2 J Cell Biol.，162 (2)，34ト51 (2003)非專利文獻3 differentiation，75 (5)，52-62 (2007)非專利文獻4 :European Cells and Materials, Vol. 14, Suppl. 2,140 (2007)非專利文獻5 :蛋白質(zhì)核酸酵素，Vol. 49 (10) ,1421-1427 (2004)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的課題在于提供高效的由牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法，還提供能夠高效地向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化誘導(dǎo)的分化誘導(dǎo)劑。本發(fā)明人等為了解決上述課題，著眼于Wnt信號在成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化中的參與，反復(fù)進行深入研究，結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)，如果使用能夠激活fct信號傳導(dǎo)途徑的物質(zhì)，具體使用選自氯酸鈉、高氯酸鈉、氯化鋰、Norrin和R_Spondin2中的任一種培養(yǎng)牙髓細(xì)胞,貝Ij在培養(yǎng)的牙髓細(xì)胞中生成作為成牙本質(zhì)細(xì)胞特異性細(xì)胞外基質(zhì)的Dspp，從而完成本發(fā)明。SP，本發(fā)明包括以下內(nèi)容。I. 一種由牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法，其特征在于，使用能夠激活Wnt信號傳導(dǎo)途徑的物質(zhì)。2.根據(jù)前項I所述的分化誘導(dǎo)方法，其中，能夠激活Wnt信號傳導(dǎo)途徑的物質(zhì)為能夠直接或間接激活fct信號傳導(dǎo)途徑的物質(zhì)。3.根據(jù)前項2所述的分化誘導(dǎo)方法，其中，能夠間接激活fct信號傳導(dǎo)途徑的物質(zhì)為能夠調(diào)節(jié)硫酸こ酰肝素蛋白聚糖和fct的相互作用的物質(zhì)。4.根據(jù)前項3所述的分化誘導(dǎo)方法，其中，能夠調(diào)節(jié)硫酸こ酰肝素蛋白聚糖和Wnt的相互作用的物質(zhì)為能夠從硫酸こ酰肝素蛋白聚糖中去除硫酸基的物質(zhì)。5.根據(jù)前項I 4中任一項所述的分化誘導(dǎo)方法，其中，能夠激活Wnt信號傳導(dǎo)途徑的物質(zhì)為選自氯酸鈉、高氯酸鈉、氯化鋰、Norrin和R_Spondin2中的任ー種。6.根據(jù)前項I 5中任一項所述的分化誘導(dǎo)方法，其中，Wnt為WntlOa。7. 一種由牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑，其包含能夠激活Wnt信號傳導(dǎo)途徑的物質(zhì)。8.根據(jù)前項7所述的分化誘導(dǎo)劑，其中，能夠激活Wnt信號傳導(dǎo)途徑的物質(zhì)為選自氯酸鈉、高氯酸鈉、氯化鋰、Norrin和R_Spondin2中的任ー種。9. 一種蓋髓材料，其以前項7或8所述的分化誘導(dǎo)劑為有效成分。10.根據(jù)前項9所述的蓋髓材料，其進ー步含有纖維連接蛋白。(發(fā)明效果)如果使用能夠激活Wnt信號傳導(dǎo)途徑的物質(zhì)，具體使用選自氯酸鈉、高氯酸鈉、氯化鋰、Norrin和R_Spondin2中的任ー種，貝U在牙髓來源的細(xì)胞株中，作為成牙本質(zhì)細(xì)胞特異性細(xì)胞外基質(zhì)的Dspp的表達(dá)有意義地增強。其結(jié)果是，能夠激活fct信號傳導(dǎo)途徑的物質(zhì)、具體地說選自氯酸鈉、高氯酸鈉、氯化鋰、Norrin和R_Spondin2中的任一種可以成為由牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑。進而，含有本發(fā)明的分化誘導(dǎo)劑作為有效成分的蓋髓材料不僅保護露出的牙髓面，而且具有誘導(dǎo)牙髓向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化并促進其后的牙本質(zhì)形成的作用。


圖I為顯示在作為牙髓來源細(xì)胞株的MEDP細(xì)胞中添加各濃度的氯酸鈉進行培養(yǎng)時的D spp的表達(dá)的圖。(實施例I)圖2為顯示在作為牙髓來源細(xì)胞株的MEDP細(xì)胞中添加各濃度的氯化鋰進行培養(yǎng)時的Dspp的表達(dá)的圖。(實施例2)
具體實施例方式本發(fā)明涉及的是由牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法，其特征在于，使用能夠激活fct信號傳導(dǎo)途徑的物質(zhì)。本發(fā)明人等確認(rèn)到，Dspp的誘導(dǎo)僅限于將WntlOa表達(dá)細(xì)胞在由基底膜成分提取的成分制備的基質(zhì)膠上培養(yǎng)時的情況，并發(fā)現(xiàn)了向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化需要基于fct信號、以及同時包含在基底膜中的某些成分的控制。本發(fā)明人等基于該發(fā)現(xiàn)，對作為硫酸基轉(zhuǎn)移酶的Sulfl和Sulf2雙基因敲除小鼠牙的表型進行觀察，結(jié)果確認(rèn)到，與野生型相比，雙基因敲除小鼠的牙本質(zhì)的形成被有效地抑制。基于上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人等使能夠激活Wnt信號傳導(dǎo)途徑的物質(zhì)作用于牙髓來源細(xì)胞株，而首次確認(rèn)到向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用。其結(jié)果確認(rèn)到，在使能夠激活fct信號傳導(dǎo)途徑的物質(zhì)起作用的牙髓來源細(xì)胞株中生成Dspp，該Dspp作為非膠原蛋白在由成牙本質(zhì)細(xì)胞合成、分泌的有機性基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)最多。在本發(fā)明中，能夠激活Wnt信號傳導(dǎo)途徑的物質(zhì)，既可以是能夠直接激活fct信號傳導(dǎo)途徑的物質(zhì)，也可以是能夠間接激活fct信號傳導(dǎo)途徑的物質(zhì)。作為能夠直接激活的物質(zhì)，例如可以舉出選自氯化鋰、Norrin和R_Spondin2中的任ー種,作為能夠間接激活的物質(zhì)，例如可以舉出氯酸鈉、高氯酸鈉或硫酸基轉(zhuǎn)移酶。在此，能夠直接激活Wnt信號傳導(dǎo)途徑的物質(zhì)，是指直接作用于經(jīng)典的fct信號傳導(dǎo)途徑中起作用的物質(zhì)，而激活fct信號傳導(dǎo)途徑的物質(zhì)。經(jīng)典的Wnt信號傳導(dǎo)途徑、具體地說Wnt/ β -連鎖蛋白途徑調(diào)節(jié)脊椎動物和無脊椎動物發(fā)育中的細(xì)胞命運決定。Wnt配體是與分泌性Frizzled受體結(jié)合的糖蛋白，由此引起信號級聯(lián)，結(jié)果是使多功能激酶GSK-3 β從APC/Axin/GSK-3 β復(fù)合體中解離。在此，GSK-3在Wnt信號傳導(dǎo)途徑中具有抑制性作用是公知的(Cell Research, 15 (I) :28-32 (2005))。氯化鋰被認(rèn)為具有抑制GSK-3的作用(J Biol Chem. ,27 5(21) : 15765-72 (2000))。從上述的觀點考慮，作為能夠直接激活Wnt信號傳導(dǎo)途徑的物質(zhì)，具體可以舉出氯化鋰。GSK-3在Wnt信號傳導(dǎo)途徑中具有抑制性作用，因此通過加入氯化鋰，能夠激活fct信號傳導(dǎo)途徑。Norrin和R_Spondin2都被認(rèn)為是能夠直接激活fct信號傳導(dǎo)途徑的蛋白質(zhì)。在此，能夠間接激活Wnt信號傳導(dǎo)途徑的物質(zhì)，可以舉出能夠調(diào)節(jié)硫酸こ酰肝素蛋白聚糖和fct的相互作用的物質(zhì)。由最近的研究表明，基底膜的蛋白聚糖的糖鏈在fct信號的傳導(dǎo)中起著重要的作用。fct與硫酸こ酰肝素蛋白聚糖的糖鏈非常緊密地結(jié)合，但在硫酸基轉(zhuǎn)移酶的作用下硫酸こ酰肝素的硫酸基解離時糖鏈對于fct的親和性下降，Wnt從與硫酸こ酰肝素蛋白聚糖的結(jié)合中解離而傳遞到fct受體，其結(jié)果是Wnt信號被激活。在本發(fā)明中，能夠調(diào)節(jié)硫酸こ酰肝素蛋白聚糖和fct的相互作用的物質(zhì)，可以舉出能夠使硫酸こ酰肝素蛋白聚糖和fct的親和性下降的物質(zhì)。作為這樣的物質(zhì)，可以舉出能夠從硫酸こ酰肝素蛋白聚糖中去除硫酸基的物質(zhì)。具體地說，可以舉出氯酸鈉、高氯酸鈉或硫酸基轉(zhuǎn)移酶等，優(yōu)選為氯酸鈉、高氯酸鈉。氯酸鈉具有能夠從硫酸こ酰肝素蛋白聚糖中去除硫酸基的作用(J Biol Chem.，263 (26) : 12886-92 (1988))。通過從硫酸こ酰肝素蛋白聚糖中去除硫酸基，糖鏈對于fct的親和性下降，其結(jié)果是Wnt從與硫酸こ酰肝素蛋白聚糖的結(jié)合中解離而傳遞到fct受體，從而Wnt信號傳導(dǎo)途徑被激活。Wnt是細(xì)胞間信號分子之一，作為Wnt家族，目前已知的有17種以上。發(fā)現(xiàn)WntlOa在基底膜上表達(dá)，在fctlOa以外的Wnt分子中，發(fā)現(xiàn)Wnt5a和WntlOb在成釉質(zhì)細(xì)胞或成牙骨質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。在本發(fā)明中，在fct信號傳導(dǎo)途徑中被激活的Wnt的種類沒有特別限定，但是為了誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，特別適合的是激活包含fctlOa的途徑。牙是由牙胚形成，經(jīng)過蕾狀期、帽狀期、鐘狀期這樣的過程進行生長，而在口腔內(nèi)萌出。牙胚是牙及牙周組織的原基，來源于外胚層間充質(zhì)組織。另外，牙胚分為成釉器、牙乳頭、牙囊的三個組織。牙由牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)、牙骨質(zhì)的3大硬組織構(gòu)成。在這些硬組織的內(nèi)部(牙髓腔)有牙髓，在牙髓的外側(cè)存在有牙本質(zhì)。牙髓的來源與牙囊細(xì)胞相同。在此，牙囊細(xì)胞是來源于發(fā)育期中可見的牙乳頭的間充質(zhì)組織，認(rèn)為其分化成牙周膜、牙骨質(zhì)、牙槽骨等的牙周組織細(xì)胞。成牙本質(zhì)細(xì)胞存在于牙髓的最外層，成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化僅在上皮和間充質(zhì)組織的邊界部產(chǎn)生。在所有的組織或器官的上皮中存在支持它們的被稱為基底膜的特殊的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)?；啄ご嬖谟谘烙再|(zhì)等的上皮細(xì)胞層和間質(zhì)細(xì)胞層(牙髓細(xì)胞層)等之間。作為構(gòu)成基底膜的物質(zhì)，可以舉出IV型膠原、層粘連蛋白、硫酸こ酰肝素蛋白聚糖等。硫酸こ酰肝素蛋白聚糖以在被稱為核心蛋白質(zhì)的成為核的蛋白質(zhì)，例如在基底膜蛋白聚糖、多配體聚糖、磷脂酰肌醇蛋白聚糖、集聚蛋白等的蛋白聚糖上加成有硫酸こ酰肝素的形式存在。硫酸こ酰肝素具有N-こ酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸的ニ糖単元的重復(fù)結(jié)構(gòu)，根據(jù)糖鏈上的硫酸基的數(shù)量，顯示多祥性。在本發(fā)明中，硫酸こ酰肝素蛋白聚糖是指這樣的加成有硫酸こ酰肝素的糖胺聚糖的總稱，并沒有特別限定。本發(fā)明還涉及包含能夠激化Wnt信號傳導(dǎo)途徑的物質(zhì)的由牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑。如上述說明，能夠激化fct信號傳導(dǎo)途徑的物質(zhì)，具體可以舉出氯酸鈉、高氯酸鈉、氯化鋰、硫酸基轉(zhuǎn)移酶、Norrin或R_Spondin2等,優(yōu)選為氯酸鈉、高氯酸鈉或氯化鋰。、
本發(fā)明還涉及以上述分化誘導(dǎo)劑為有效成分的蓋髓材料。本發(fā)明的蓋髓材料不僅保護所露出的牙髓面，而且具有誘導(dǎo)牙髓向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化并促進牙本質(zhì)形成的作用。本發(fā)明的蓋髓材料可以通過通常的齲齒治療，例如通過在開髓、拔髓后的空洞部牙髓切斷面上涂敷或充填而使用。本發(fā)明的蓋髓材料可以與直接蓋髓材料或間接蓋髓材料并用，其可以在使用直接蓋髓材料或間接蓋髓材料之前或之后使用，也可以與直接蓋髓材料或間接蓋髓材料混合使用。在本說明書中，“直接蓋髓材料”是指在牙髓的一部分露出時保護牙髓組織的藥劑，例如可以使用氫氧化鈣制劑等?！伴g接蓋髓材料”是指在牙本質(zhì)雖然變薄但牙髓未露出時以阻斷外來刺激、殺菌等為目的而使用的藥劑，例如可以使用氧化鋅丁香酚制齊U、氧化鋅雜酚油制劑等。本發(fā)明的蓋髓材料中的分化誘導(dǎo)劑、例如氯酸鈉、高氯酸鈉或氯化鋰的含量沒有特別限定。在氯酸鈉或高氯酸鈉的情況下，例如以5 500mM為宜，優(yōu)選為50 lOOmM。另夕卜，在氯化鋰的情況下，例如以2 200mM為宜，優(yōu)選為5 50mM，更優(yōu)選為約50mM。本發(fā)明的蓋髓材料中的分化誘導(dǎo)劑、例如氯酸鈉、高氯酸鈉或氯化鋰可以以其單質(zhì)制成各種制劑，或者與藥理學(xué)以及制劑學(xué)上可允許的添加物混合制成各種制劑，其形態(tài)適于患部使用。作為適于本發(fā)明的蓋髓材料的制劑形態(tài)，例如可以舉出注射劑、外用液劑(注入劑、涂敷劑)、固體制劑(顆粒劑、細(xì)粒劑、散剤、軟膏劑、片劑)、軟膏劑等。本發(fā)明的分化誘導(dǎo)劑例如可以含有纖維連接蛋白(FN)。作為藥理學(xué)以及制劑學(xué)上可允許的添加物，例如可以使用賦形劑、崩解劑或崩解助劑、粘結(jié)劑、潤滑劑、包衣劑、色素、稀釋劑、基劑、溶解劑或溶解助劑、等滲劑、PH調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、防腐剤、保存劑、分散劑、乳化劑、膠凝劑、增粘劑、粘合劑、矯味劑等。膠凝劑可以是例如吸收牙的溢出液進行凝膠化的物質(zhì)。另外，作為由粉劑和液劑形成的形態(tài)，可以臨用時混合以及混煉后使用。本發(fā)明的蓋髓材料可以進一歩含有殺菌劑、抗生物質(zhì)、抗炎劑等其他的有效成分。在能夠使藥劑的有效成分容易用于患部、在充分地向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化誘導(dǎo)的期間內(nèi)使有效成分保留在患部的方面，本發(fā)明的蓋髓材料可以負(fù)載于載體上。因此，本發(fā)明的蓋髓材料可以是將本發(fā)明的分化誘導(dǎo)劑、例如氯酸鈉、高氯酸鈉或氯化鋰與適當(dāng)?shù)闹鷦┅`起固定或浸潰在具有單絲、膜、纖維集合體、海綿、微粒等形狀的結(jié)構(gòu)體上的牙科材料的形態(tài)。本發(fā)明的蓋髓材料的用量沒有特別限定，可根據(jù)患者的癥狀(齲齒的進展率)、年齡、劑型等來適當(dāng)調(diào)節(jié)。實施例以下，基于實施例更具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于下述實施例的范圍。(實施例I)使用氯酸鈉(NaClO3)時的向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)在本實施例中，確認(rèn)了將作為牙髓來源細(xì)胞株的MEDP細(xì)胞在含有NaClO3的體系中培養(yǎng)時的細(xì)胞中的DsPP的表達(dá)。Dspp的表達(dá)是利用PCR來確認(rèn)的。MEDP 細(xì)胞使用含有 10% v/v 胎牛血清(Fetal bovine serum ；FBS)的 DMEM 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。將細(xì)胞按照細(xì)胞數(shù)為3. 7X105cells/ml的方式懸浮于上述培養(yǎng)基中，并將5ml細(xì)胞懸液加入到直徑6cm的培養(yǎng)容器內(nèi)，進行培養(yǎng)。培養(yǎng)使用涂覆有纖維連接蛋白(FN)的培養(yǎng)容器，在37±0. 5°C下進行。培養(yǎng)第一天，添加NaClO4直至最終濃度為50mM或IOOmM,進ー步培養(yǎng)7天。使用RNeasy Mini Kit (商標(biāo))(QIAGEN制)，由上述培養(yǎng)的細(xì)胞提取mRNA后，使用 PrimeScript (商標(biāo))Reverse Transcriptase (TAKARA 制)進行反轉(zhuǎn)錄而得到 cDNA,并將其作為PCR用試樣。mRNA的提取以及cDNA的制備按照各公司的說明書進行。作為DSPP擴增用引物，使用由序列表的序列編號I和2所示的堿基序列形成的引物，作為對照基因的GADPH的擴增用引物，使用由同序列編號3和4所示的堿基序列形成的引物。PCR使用Light Cycler (商標(biāo))(ライトサイクラ一(商標(biāo)))(Roche制)來進行。DSPP的表達(dá)量以DSPP的擴增產(chǎn)物與GADPH的擴增產(chǎn)物的相對比來確認(rèn)。A. DSPP擴增用弓丨物(序列編號I)正向 5' -AGCCGTGGAGATGCTTCTTA-3'(序列編號2)反向 5' -TCACTCTGGCTGTCACCATC-3'B. GADPH擴增用弓丨物(序列編號3)正向 5' -TGCACCACCAACTGCTTAG-3' (序列編號4)反向 5' -GGATGCAGGGATGATGTTC-3'由上述結(jié)果確認(rèn)到，在含有NaClO3的體系中進行培養(yǎng)時，Dspp的表達(dá)有意義地增強，誘導(dǎo)未分化牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化。NaClO3的加入能夠阻止硫酸こ酰肝素蛋白聚糖的硫酸化，將fct從細(xì)胞膜或基底膜解離，并與Wnt受體結(jié)合，而能夠間接激活fct信號傳導(dǎo)途徑。其結(jié)果是，可以認(rèn)為促進未分化的牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化(圖I)。(實施例2)使用氯化鋰(LiCl)時的向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)在本實施例中，確認(rèn)了將作為牙髓來源細(xì)胞株的MEDP細(xì)胞在含有LiCl的體系中培養(yǎng)時的細(xì)胞中的Dspp的表達(dá)。Dspp的表達(dá)是利用PCR來確認(rèn)的。使用Li Cl來代替NaClO3,培養(yǎng)第一天，添加LiCl直至最終濃度為5mM或50mM，除此以外，利用與實施例I同樣的方法進行分化誘導(dǎo)處理，并確認(rèn)了 Dspp的表達(dá)。由上述結(jié)果確認(rèn)到，在含有LiCl的體系中培養(yǎng)牙髓細(xì)胞吋，Dspp的表達(dá)有意義地增強，誘導(dǎo)未分化牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化。LiCl被認(rèn)為具有抑制GSK-3的作用。GSK-3雖然在Wnt信號傳導(dǎo)途徑中具有抑制性作用，但是LiCl通過抑制GSK-3，能夠直接激活Wnt信號傳導(dǎo)途徑。其結(jié)果是，可以認(rèn)為促進未分化的牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化(圖2)。(實施例3)使用高氯酸鈉(NaClO4)時的向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)在本實施例中，確認(rèn)了將作為牙髓來源細(xì)胞株的MEDP細(xì)胞在含NaClO4的體系中培養(yǎng)時的細(xì)胞中的D spp的表達(dá)。D spp的表達(dá)是利用PCR來確認(rèn)的。使用NaClO4來代替NaClO3，除此以外，利用與實施例I同樣的方法進行分化誘導(dǎo)處理，并確認(rèn)了 Dspp的表達(dá)。(實施例4)使用Norrin時的向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)在本實施例中，確認(rèn)了將作為牙髓來源細(xì)胞株的MEDP細(xì)胞在含Norrin的體系中培養(yǎng)時的細(xì)胞中的Dspp的表達(dá)。Dspp的表達(dá)是利用PCR來確認(rèn)的。使用Norrin(R&D systems公司商品編號3014_NR)來代替NaClO3,除此以外,利用與實施例I同樣的方法進行分化誘導(dǎo)處理，并確認(rèn)了 D spp的表達(dá)。對Norrin的添加濃度進行研究。 (實施例5)使用R_Spondin2時的向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)在本實施例中，確認(rèn)了將作為牙髓來源細(xì)胞株的MEDP細(xì)胞在含有R-Spondin2的體系中培養(yǎng)時的細(xì)胞中的Dspp的表達(dá)。Dspp的表達(dá)是利用PCR來確認(rèn)的。使用R-Spondin2 (R&D systems 公司商品編號3266_RS/CF)來代替 NaClO3,除此以外，利用與實施例I同樣的方法進行分化誘導(dǎo)處理，并確認(rèn)了 Dspp的表達(dá)。對R-Spondin2的添加濃度進行研究。(エ業(yè)應(yīng)用性)如以上詳細(xì)說明，使用本發(fā)明的能夠激活Wnt信號傳導(dǎo)途徑的物質(zhì)，具體使用氯酸鈉、高氯酸鈉或氯化鋰，則在牙髓來源的細(xì)胞株中，確認(rèn)到作為成牙本質(zhì)細(xì)胞特異性細(xì)胞外基質(zhì)的Dspp的表達(dá)有意義地增強。其結(jié)果是，能夠激活fct信號傳導(dǎo)途徑的物質(zhì)可以成為由牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑。進而，含有本發(fā)明的分化誘導(dǎo)劑作為有效成分的蓋髓材料不僅保護露出的牙髓面，而且具有誘導(dǎo)牙髓向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化并促進牙本質(zhì)形成的作用。本發(fā)明的由牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑直接作用于牙髓而具有促進牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化誘導(dǎo)的效果。因此，在臨床上，通過將該分化誘導(dǎo)劑直接涂敷在齲齒的患部，或者通過將含有該分化誘導(dǎo)劑的糊劑充填到齲齒的患部，可以期待在齲齒的正下面牙本質(zhì)活躍再生。在確認(rèn)形成足夠的繼發(fā)性(修復(fù))牙本質(zhì)后，消除齲齒部位，進行利用樹脂或金屬的修復(fù)治療。
權(quán)利要求
1.一種由牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法，其特征在于，使用能夠激活fct信號傳導(dǎo)途徑的物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分化誘導(dǎo)方法，其中，能夠激活fct信號傳導(dǎo)途徑的物質(zhì)為能夠直接或間接激活fct信號傳導(dǎo)途徑的物質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分化誘導(dǎo)方法，其中，能夠間接激活fct信號傳導(dǎo)途徑的物質(zhì)為能夠調(diào)節(jié)硫酸こ酰肝素蛋白聚糖和fct的相互作用的物質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分化誘導(dǎo)方法，其中，能夠調(diào)節(jié)硫酸こ酰肝素蛋白聚糖和Wnt的相互作用的物質(zhì)為能夠從硫酸こ酰肝素蛋白聚糖中去除硫酸基的物質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I 4中任一項所述的分化誘導(dǎo)方法，其中，能夠激活Wnt信號傳導(dǎo)途徑的物質(zhì)為選自氯酸鈉、高氯酸鈉、氯化鋰、Norrin和R_Spondin2中的任ー種。
6.根據(jù)權(quán)利要求I 5中任一項所述的分化誘導(dǎo)方法，其中，Wnt為WntlOa。
7.一種由牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑，其包含能夠激活fct信號傳導(dǎo)途徑的物質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的分化誘導(dǎo)劑，其中，能夠激活Wnt信號傳導(dǎo)途徑的物質(zhì)為選自氯酸鈉、高氯酸鈉、氯化鋰、Norrin和R_Spondin2中的任ー種。
9.一種蓋髓材料，其以權(quán)利要求7或8所述的分化誘導(dǎo)劑為有效成分。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的蓋髓材料，其進ー步含有纖維連接蛋白。
全文摘要
本發(fā)明的課題在于提供高效的由牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法，還提供能夠高效地向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化誘導(dǎo)的分化誘導(dǎo)劑；所述由牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法使用能夠激活Wnt信號傳導(dǎo)途徑的物質(zhì)；另外，所述分化誘導(dǎo)劑包含能夠激活Wnt信號傳導(dǎo)途徑的物質(zhì)；具體地說，所述物質(zhì)是選自氯酸鈉、高氯酸鈉、氯化鋰、Norrin和R-Spondin2中的任一種。
文檔編號A61K33/14GK102686720SQ20108005187
公開日2012年9月19日 申請日期2010年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月17日
發(fā)明者山城隆, 川邊紀(jì)章, 黑坂寬 申請人:國立大學(xué)法人岡山大學(xué)