專利名稱：脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液及其制備工藝的制作方法
脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液及其制備工藝
(-)發(fā)明領(lǐng)域本專利發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種口服胰島素脂質(zhì)體新劑型，具體說(shuō)是涉 及脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液及其制備工藝和藥學(xué)用途。同時(shí)，本發(fā)明專利的工 藝設(shè)計(jì)和制備技術(shù)，為其它蛋白多肽類生物工程藥物的口服給藥或其它給藥方式提供制備 技術(shù)方法，從而為其發(fā)展新藥劑型和開辟給藥新途徑。
(二)技術(shù)背景糖尿病是繼心血管疾病、癌癥之后致殘率、致死率最高的全球第三大疾病。國(guó)際糖 尿病聯(lián)盟大會(huì)估計(jì)全球糖尿病患者約達(dá)一億八千萬(wàn)，每年以2-3%的速度增長(zhǎng)，各國(guó)都大力 開發(fā)糖尿病治療的新劑型研究。糖尿病分I型和II型。I型糖尿病患者胰臟不能產(chǎn)生胰島素，青少年為主，約占 10-15%。II型患者以中老年為主，是由于體內(nèi)胰島素釋放延遲，受體數(shù)量減少或其敏感性 降低所引起的胰島素相對(duì)缺乏，約占85-90%。臨床證明I型患者絕對(duì)依賴胰島素治療才 能維持生命；II型患者中約占50%的下列嚴(yán)重類型也需胰島素治療；包括(1)感染嚴(yán)重、 中度創(chuàng)傷、精神受刺激和手術(shù)治療的患者，他們體內(nèi)抗胰島素激素增多口服降糖藥無(wú)效； (2)肝、腎功能損害者需長(zhǎng)期使用胰島素；(3) 口服降糖藥無(wú)效需改用胰島素治療；(4)糖 尿病眼底病變出血時(shí)需用胰島素治療；(5)糖尿病急性病發(fā)癥時(shí)需用胰島素控制；(6)線粒 體糖尿病是新發(fā)現(xiàn)的II型糖尿病特殊亞型(我國(guó)患病率中約占0. 5-1 % )，比一般II型 糖尿病預(yù)后差，慢性并癥發(fā)生率高，需用胰島素治療。因此，胰島素是約60%糖尿病患者不 可替代的核心藥物。目前胰島素治療糖尿病仍是注射等外周給藥為主，包括長(zhǎng)期使用的肌 肉注射、皮下注射、靜脈注射等，它雖能暫時(shí)控制外周血糖，但外周給藥的三大嚴(yán)重弊端始 終存在并危及患者康復(fù)和生命(1)除了不便和痛苦，主要是不能避免并發(fā)癥，包括心腦血 管病變，腎病視網(wǎng)膜病變等；約90%糖尿病患者最后都可能死于心腦血管并發(fā)癥。注射還 會(huì)產(chǎn)生紅腫、皮下小結(jié)和脂肪萎縮，甚至引起肌肉壞死和造成終生殘疾；( 靜脈注射造成 血液中胰島素水平相對(duì)過(guò)高(circulationhyperinsulinezation)和肝內(nèi)胰島素濃度過(guò)低 (hepatic hypoinsulinezation),造成高血胰島素癥(hyperinsulinemia)弓I發(fā)低血糖及 視力模糊等嚴(yán)重不適，違背了生理?xiàng)l件下肝內(nèi)胰島素濃度比外周血中大3-11倍的正常需 求[曾明德等，肝臟與內(nèi)分泌，1995，plll-119] ； (3)注射胰島素只使肌肉和脂肪吸收外周 血糖并以糖原沉積；但肝臟得不到高濃度胰島素，難以發(fā)揮其調(diào)控血糖和血脂的主導(dǎo)作用， 不能清除血清HbAcl、氧自由基、多元醇等對(duì)肝器官等的損傷，不能避免并發(fā)癥。因此，國(guó) 際糖尿病聯(lián)盟號(hào)召發(fā)展非注射型胰島素等口服新藥劑型，來(lái)代替外周注射。Lichtenberg， D. (1988)總結(jié)了 40多年脂質(zhì)體技術(shù)與其它學(xué)科技術(shù)相互關(guān)系及其生產(chǎn)基本原理，為解決 這一世界難題提供了理論依據(jù)和可行性生產(chǎn)技術(shù)基礎(chǔ)[Lichtenberg，D. (1988) Liposomes preparation, characterisation, and preservation. Methods Biochem. Anal. ,33, 337-362.]。首先，胰島素口服給藥途徑必要性及其理論依據(jù)。胰島素是在胰腺β-細(xì)胞內(nèi)合成的一種蛋白質(zhì)激素，在生物體內(nèi)生理活動(dòng)時(shí)限(半壽期)為70分鐘。胰島素在細(xì) 胞內(nèi)合成后在體內(nèi)的運(yùn)輸和轉(zhuǎn)移，多以被包裹在脂質(zhì)膜泡內(nèi)(Membrane vesicle)的形式， 通過(guò)與細(xì)胞質(zhì)膜融合外吐(Exocytosis)從胰腺分泌進(jìn)入腸系膜-胰靜脈匯入肝門靜脈， 再與細(xì)胞膜表面受體蛋白結(jié)合形成膜泡以膜融合內(nèi)吞(Endocytosis)等方式進(jìn)入肝臟，以 及再以膜融合外吐(Exocytosis)入血。大量文獻(xiàn)證明，胰島素在肝臟內(nèi)停留63分鐘(占 其生理活動(dòng)時(shí)限的90% )，首先起著調(diào)控血糖、脂和蛋白等代謝的主導(dǎo)和核心作用；包括 (1)促進(jìn)外周血糖吸收和糖原合成，抑制肝糖原降解和糖原異生，降低肝內(nèi)葡萄糖生成的 基礎(chǔ)速率(HGP，Hepatic Glucose Production)。此種‘短期效應(yīng)’約能控制血糖總量的 60-70% ； (2)調(diào)控脂質(zhì)代謝的‘中期效應(yīng)’，抑制脂解(lipolysis)、脂肪酸和甘油酯動(dòng)用 (FFA mobolization)以及血酮體癥生成(ketogenesis) ； (3)調(diào)控肝內(nèi)蛋白代謝以及細(xì)胞 生長(zhǎng)和分裂的‘長(zhǎng)期效應(yīng)’，對(duì)免疫功能重要。此外⑷胰島素在肝中促進(jìn)庫(kù)否’(Kupffer) 細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞及肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞大量吸收外周血糖和清除血清糖化蛋白終末產(chǎn)物(AGEsjn HbAlc)的‘獨(dú)特效應(yīng)’，以及清除氧自由基，多元醇等有害物質(zhì)，對(duì)保護(hù)肝功能和預(yù)防糖尿病 并發(fā)癥有特別意義；(5)胰島素在肝中‘滅活’(‘首過(guò)效應(yīng)’)后余下約50%胰島素再?gòu)母?細(xì)胞中以‘外吐’膜融合途徑流入外周血，在血中循環(huán)6-7分鐘，促進(jìn)肝外的肌肉和脂肪等 攝取外周血糖(Extra-h印atic GlucoseUptake，E⑶)達(dá)到控制外周血糖總量的25%左右， 從而使HGP < EGU,導(dǎo)致外周血糖的穩(wěn)定。胰島素在血循環(huán)中還抑制脂解、抑制脂肪酸和甘 油酯動(dòng)用及其引起的血酮體癥等。因此，只有口服脂質(zhì)體胰島素劑型才能模擬以膜泡形式 使包裹的胰島素進(jìn)入腸道和肝臟，模擬生理?xiàng)l件下，胰島素在肝內(nèi)在肝外血循環(huán)兩個(gè)時(shí)段 能發(fā)揮作用，以治療糖尿病高血糖，高血脂，高血酮體，高HbAlc和恢復(fù)肝臟調(diào)控代謝功能， 達(dá)到肝內(nèi)HGP <肝外E⑶，以維持血糖穩(wěn)定，并防止并發(fā)癥的發(fā)生。這是發(fā)揮胰島素藥效作 用的最佳途徑選擇。 第二，‘脂質(zhì)體包裹胰島素’是‘ 口服胰島素’各劑型中的最佳選擇。80年代世 界各國(guó)實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的包裹胰島素的口服制劑有脂質(zhì)體、微囊劑、納米材料微粒、油乳劑等 多種非注射的口服劑型。但是，唯有脂質(zhì)體口服劑型有下述特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)(1)脂質(zhì)體與生 物體內(nèi)天然磷脂雙分子層膜泡結(jié)構(gòu)完全相似，有生物組織相溶性，無(wú)毒性及免疫原性；(2) 可制成不同粒徑大小，不同電荷，膜脂流動(dòng)性、穩(wěn)定性和壽命以及靶向性等[Lichtenberg， D. (1988)Liposomes preparation, characterisation, andpreservation. Methods Biochem. Anal.，33，337-362. ] ； (3)可完全生物降解，安全性好；(4)最為重要的是，脂質(zhì) 體膜泡與胰島素類活性蛋白在體內(nèi)存儲(chǔ)和運(yùn)轉(zhuǎn)的膜泡形式完全相同或相似，能模擬胰島素 進(jìn)入肝臟和血循環(huán)中調(diào)控外周血糖，維持肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)和正常代謝功能。因此各國(guó)都寄 希望于脂質(zhì)體。事實(shí)上，口服脂質(zhì)體胰島素劑型也是最早經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明成功的事例之 一。1976年，英國(guó)著名脂質(zhì)體研究先驅(qū)Gregoriadis報(bào)道它可降低大鼠血糖[Dapergolas， G. &GregoriadisG.，1976，Lancet，2，824-827]。直到上世紀(jì)末，全球十多家實(shí)驗(yàn)室研究進(jìn)一 步證實(shí)口服脂質(zhì)體胰島素具有抵抗胃腸道消化和降低外周血糖的效果證明口服脂質(zhì)體胰 島素能通過(guò)內(nèi)吞(Endocytosis)的膜融合方式被小腸上皮細(xì)胞微絨膜吸收，然后在小腸細(xì) 胞內(nèi)以小膜胞運(yùn)動(dòng)到腸細(xì)胞另一側(cè)，再以胞吐(Exocytosis)膜融合方式釋放出胰島素；后 者以自由分子溢出和進(jìn)入血流匯入腸系靜脈和肝門靜脈，再與肝細(xì)胞膜受體結(jié)合形成膜泡 進(jìn)入肝臟。但也可能在腸細(xì)胞內(nèi)融合于Endosomes膜或溶酶體膜而被降解，或者通過(guò)淋巴管體系進(jìn)入肝臟；如果高濃度的自由胰島素分布在細(xì)胞表面，也可以胞飲方式進(jìn)入腸細(xì)胞。 多種試驗(yàn)證明，脂質(zhì)體通過(guò)適當(dāng)修飾，可對(duì)胃酸、膽酸鹽和胃腸道消化酶穩(wěn)定；口服脂質(zhì)體 胰島素在降低外周血糖同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)糖尿病動(dòng)物外周血有外源胰島素出現(xiàn)，而無(wú)平行的胰 島素C肽。這也是口服脂質(zhì)體胰島素通過(guò)腸道和肝臟細(xì)胞膜再進(jìn)入外周血循環(huán)，模擬生理 條件下胰島素在肝臟和血循環(huán)中發(fā)揮降糖作用的進(jìn)一步證明。脂質(zhì)體膜結(jié)構(gòu)研究的這些優(yōu) 勢(shì)奠定了生產(chǎn)技術(shù)可靠性和臨床應(yīng)用可行性的堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，是其它口服方式和非生物磷脂膜 材料包裹胰島素的口服劑型不可能具備的！第三，但是，直到目前，“口服脂質(zhì)體胰島素”和其它“ 口服胰島素”新劑型 一樣者β 尚未成功問(wèn)世[Adel Pinhasi Mila Gomeberg, Patent application title SolidComposition for Intra-Oral Delivery Insulin, Patent No :20090274756, USPC, Class :424484 ；Martin fferle, et al.，Sci Pharm. (2008)76 :751-760, doi :10.3797/ scipharm. 0806-04 ；Τ. Morpol, et al. , International Journal ofPharmaceutics 277 (2004)91-97 ；El-Sayed Khafagy, et al. , Advanced DrugDelivery Reviews 59(2007) 1521-1546 ；Takahiro Goto, et al. , PharmaceuticalResearch, Volume 23,2, p384, February (2006), DOI :10. 1007/sll095-005-9175_7 ；Fude Cui et al.，Journal of Controlled Release 114(2006)242-250 ；臧洪梅等，胰島素脂質(zhì)體制劑治療糖尿病的研究 進(jìn)展，安徽醫(yī)藥(A nhui Medical andPharmaceutical Journal) (2004) Apr, 8 (2), p81-82 ； Zelihagql Degim ；et al. , LifeSciences 75(2004)2819-2827 ；Gerardo P.Carino, et al. , Oral insulin delivery, Advanced Drug Delivery Reviews 35(1999)249-257]。對(duì)口服脂質(zhì)體胰島素而言，存在的主要問(wèn)題有(1)多種制備工藝和各種大、中、 小單室或多室脂質(zhì)體包裹水溶性蛋白多肽等技術(shù)問(wèn)題都未獲穩(wěn)定解決，胰島素包裹率都較 低00-40%) ； (2)脂質(zhì)體小單室脂質(zhì)體在懸液中容易相互融合，大室脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)很不穩(wěn) 定，因而工業(yè)化產(chǎn)品劑型均化及其貯存和運(yùn)輸問(wèn)題無(wú)法解決；(3)脂質(zhì)體的凍干制劑雖然 可以保持制劑結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，但在水化和重建中，最易導(dǎo)致凍干脂質(zhì)體膜結(jié)構(gòu)破裂造成胰 島素大量泄漏，泄漏率常達(dá)30-50%以上；(4)脂質(zhì)體凍干制劑制成非懸液的各種口服凍干 脂質(zhì)體劑型，則其口服胰島素計(jì)量難以確定，也未解決口服胰島素在腸內(nèi)穩(wěn)定性問(wèn)題，以及 如何進(jìn)入腸細(xì)胞和肝臟以及再入血循環(huán)問(wèn)題；(5)最重要問(wèn)題，目前已知的口服脂質(zhì)體胰 島素劑型和相關(guān)口服胰島素劑型，其相對(duì)生物利用度都很低(1-5%以內(nèi))，生產(chǎn)成本高，難 以達(dá)到10%的可開發(fā)要求。這些關(guān)鍵問(wèn)題可能涉及脂質(zhì)體劑型結(jié)構(gòu)本身及其在胃腸內(nèi)穩(wěn)定性和‘吸收效率 低’等因素。同時(shí)，國(guó)際上目前暫都以一次外周注射胰島素血糖降低值作為唯一參照標(biāo)準(zhǔn)， 沒(méi)有‘現(xiàn)成的口服胰島素的降血糖指標(biāo)’作為‘標(biāo)準(zhǔn)’和‘客觀陽(yáng)性對(duì)照’來(lái)評(píng)價(jià)“口服脂質(zhì) 體胰島素”各種制劑的藥效也是尚未解決的一個(gè)問(wèn)題。日本學(xué)者K. Ozawa (1992)實(shí)驗(yàn)證明， 外周注射胰島素僅起到表面降低血糖效果，但不能恢復(fù)肝臟的ATP的合成能力和能量代謝 正?；Ｏ喾?，同一劑量胰島素進(jìn)入肝門靜脈不但可使嚴(yán)重糖尿病大鼠的血糖恢復(fù)正常化， 而且還會(huì)使肝臟ATP的合成能力和能量代謝正常化[Ozawa，k.，MedicalTribune, Tokyo, Japan, 1992，p35_37]。因此采用包括降血糖在內(nèi)的多指標(biāo)治療糖尿病病癥來(lái)全面評(píng)價(jià)口服 胰島素劑型的綜合藥效，以便能符合胰島素在生物體內(nèi)有多途徑，多時(shí)相，多部位的生理功 能，包括抗脂解、抗血酮癥、降血糖、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育、降低糖化血紅蛋白等；也可符合治療糖尿病需要降低高血糖，高血清糖基化血紅蛋白，高血脂，高血酮體，肥胖等多種病癥指標(biāo)的 客觀病理實(shí)際。但目前尚很少見到用多病癥指標(biāo)和長(zhǎng)期多次口服胰島素劑型來(lái)評(píng)價(jià)其治療 糖尿病藥效標(biāo)準(zhǔn)的研發(fā)報(bào)道。第四，本發(fā)明專利的目的是提高口服脂質(zhì)體胰島素包裹率，增加脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)在體 內(nèi)外的穩(wěn)定性，促進(jìn)口服脂質(zhì)體胰島素進(jìn)入肝臟和血循環(huán)及提高其生物利用度，拓寬口服 胰島素包括降血糖在內(nèi)的多指標(biāo)綜合治療糖尿病的效果范圍，從治本治標(biāo)兩方面達(dá)到治療 糖尿病要求。因此，集中解決下述關(guān)鍵技術(shù)(1)模擬生物體內(nèi)胰島素以單室膜囊泡形式進(jìn) 行分泌，融合和運(yùn)轉(zhuǎn)規(guī)律和特點(diǎn)，(2)根據(jù)磷脂在水化反應(yīng)中形成封閉單室膜囊泡和相互融 合，及其與蛋白相互作用的物理化學(xué)機(jī)制和環(huán)境條件，(3)采用了相應(yīng)周全的配制單室脂質(zhì) 體組成比例和工藝設(shè)計(jì)，(4)創(chuàng)新地應(yīng)用了真空冷凍‘控制去水化/保濕’制備工藝和程序， 制備了 ‘脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑(SCLI) ’，使其小單室脂質(zhì)體(平均粒徑為30-120納 米)在水化力改變過(guò)程中相互融合增大為大單室脂質(zhì)體(平均粒徑為1000納米)[圖1，圖 2]，胰島素包裹率提高達(dá)80%以上，(5)新創(chuàng)了 ‘分別定容/分步液化’制備程序和工藝，在 液化SCLI時(shí)能保護(hù)大單室磷脂脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)完整使其平均粒徑保持1000納米[圖2]，胰 島素不泄漏，使大單室磷脂脂質(zhì)體的胰島素包裹率80%以上；相反，通常一次直接水化的 脂質(zhì)體胰島素包裹率僅在40%。本專利發(fā)明克服了普遍存在的脂質(zhì)體包裹率和生物利用度低，劑型生產(chǎn)穩(wěn)定性 差等諸多難題，提供了的一種全新的大單室磷脂脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液，即 O-SCULI ；其脂質(zhì)體胰島素包裹率高，生物利用度高，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性好，工藝簡(jiǎn)便新穎，既解決 了 ‘脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑’儲(chǔ)存運(yùn)輸難題，又解決了 O-SCULI劑型的大單室脂質(zhì)體膜 易破裂和胰島素泄漏問(wèn)題及其口服精確定量問(wèn)題，因而，O-S⑶LI 口服懸液具有包括降低外 周血糖(生物利用度高達(dá)22. 2%)以及其它綜合治療糖尿病多指標(biāo)的創(chuàng)新功能；O-SCULI 新藥劑型是口服脂質(zhì)體胰島素劑型的新發(fā)展，其制備程序及工藝方法也為制備其它多肽與 蛋白類生物工程藥物的非注射給藥開辟新途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明專利的目的和解決關(guān)鍵問(wèn)題在于提高口服脂質(zhì)體胰島素包裹率，增加脂 質(zhì)體結(jié)構(gòu)在體內(nèi)外的穩(wěn)定性，促進(jìn)口服脂質(zhì)體胰島素進(jìn)入肝臟和血循環(huán)及提高胰島素的生 物利用度，拓寬口服胰島素包括降血糖在內(nèi)的多指標(biāo)綜合治療糖尿病的效果范圍，從治本 治標(biāo)兩方面達(dá)到治療糖尿病的要求。因此，本發(fā)明專利主要涉及提供一種脂質(zhì)體包裹胰島 素凍干制劑口服懸液O-SCULI新劑型來(lái)集中解決上述長(zhǎng)期存在的口服脂質(zhì)體胰島素制劑 的諸多關(guān)鍵性難題。本發(fā)明專利同時(shí)還提供一種脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液，即O-S⑶Li，新 劑型的制備工藝和藥學(xué)用途。為上述目標(biāo)的全面實(shí)現(xiàn)，本發(fā)明專利的實(shí)施技術(shù)方案是首先提供一種脂質(zhì)體包裹 胰島素凍干制劑口服懸液，即O-S⑶Li，包括以下成分及其在每1升O-S⑶LI 口服懸液中毫 摩爾數(shù)為卵磷脂，5-50;膽固醇，5-50;
聚乙二醇脂肪酸酯(Poly-EthyleneGlycol Fatty Acid Esters), 5-50 ；維生素E，0· 1-0. 5 ；胰島素，1-10;氯化鈉，1-20;磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉緩沖液，1-80 ；在本發(fā)明專利所述的脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液，即O-S⑶LI的上述口 服水懸液也是包括脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑，即SCLI制劑，和特定比例的能使SCLI制劑 液化為O-SCULI 口服水懸液的定容分步液化溶液，所述SCLI制劑的組份為卵磷脂、膽固 醇、聚乙二醇脂肪酸酯、維生素E、生物胰島素和水，所述SCLI制劑中的卵磷脂、膽固醇、聚 乙二醇脂肪酸酯三種脂質(zhì)組份之間的摩爾(mole)比為1-10 1-10 1_10，維生素E和 胰島素與所述三種脂質(zhì)組份重量和之比分別為0. 5-5%和5-50%，水和SCLI的重量比為 0. 01-2. 5%。在本發(fā)明專利所述的脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液，即O-S⑶LI的上述 口服水懸液中尚包含有定容分步液化溶液，所述定容分步液化溶液是由特定配比濃度為 0. 01-0. 3M氯化鈉溶液(液化溶液A)，和濃度為0. 01-0. IM中性pH磷酸鈉緩沖溶液(液化 溶液B)所組成，所述液化溶液A與液化溶液B的用量比為0. 1% -20%，以用于分別定容/ 分步液化技術(shù)將上述SCLI制劑液化成O-S⑶LI 口服懸液。在本發(fā)明專利所述的脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液，即O-S⑶LI中，所 述卵磷脂，是指蛋黃卵磷脂，大豆卵磷脂，牛心卵磷脂或其它生物來(lái)源的卵磷脂中一種或 幾種，所述卵磷脂總量中含有的磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine)和磷脂酰乙醇胺 (phosphatidylethanylamine)的摩爾％比分別為50-95%和5-25%，所述卵磷脂也可以是 與上述生物卵磷脂含有相同比例的合成磷脂酰膽堿和合成磷脂酰乙醇胺組成。在本發(fā)明專利所述的脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液，即O-S⑶LI中，所述 聚乙二醇脂肪酸酯(Poly-Ethylene Glycol Fatty Acid Esters)，其組分中的脂肪酸組 分是二硬脂酸(Distearate)，二異硬脂酸(Diisostearate)、單硬脂酸(Monostearate) 的一種或幾種，其組分中的聚乙二醇組分(Poly-ethylene glycol, PEG)，是二聚衍生物 (PEG-2)，四聚衍生物(PEG-4)、八聚衍生物(PEG-8)、十聚衍生物(PEG-10)或四十聚衍生物 (PEG-40)的一種或幾種；所述聚乙二醇脂肪酸酯可組成包圍磷脂脂質(zhì)體膜雙分子外面保 護(hù)層，能保護(hù)脂質(zhì)體在胃腸道內(nèi)的穩(wěn)定，也能在腸道內(nèi)中性PH條件下，被腸液酯酶水解，使 部分聚乙二醇脂肪酸酯被水解為一硬脂酸、二硬脂酸或異硬脂酸和聚乙二醇，并相應(yīng)釋放 出H+O在本發(fā)明專利所述的脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液，即O-S⑶LI中，經(jīng)冰 刻蝕電子顯微鏡檢查，所述O-SCULI 口服懸液中的胰島素是被包裹在SCLI制劑單室磷脂脂 質(zhì)體內(nèi)，所述被包裹的胰島素多以二(聚)體和六(聚)體的形式排列在脂質(zhì)體內(nèi)膜表面， 顯示其生物大分子天然立體結(jié)構(gòu)的特性[圖1]。在本發(fā)明專利所述的脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液，即O-S⑶LI中，經(jīng) PAGE-SDS凝膠電泳檢查，所述O-S⑶LI 口服懸液中的胰島素是被包裹在SCLI制劑單室磷脂 脂質(zhì)體內(nèi)，與對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)胰島素相比具有完全相同的蛋白區(qū)帶分布，顯示其天然生物化學(xué)結(jié) 構(gòu)和性質(zhì)。
在本發(fā)明專利所述的脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液，即O-S⑶LI中，所述 O-SCULI 口服懸液中被包裹在SCLI制劑單室磷脂脂質(zhì)體內(nèi)的胰島素，按藥典95版二部附 錄XIIG檢定法，經(jīng)用四組昆明小鼠和進(jìn)行三批O-S⑶LI生物測(cè)定，證明被包裹在單室磷脂 脂質(zhì)體內(nèi)的胰島素與對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)胰島素具有完全相同對(duì)昆明小鼠的降血糖生物活性，按照生 物檢定統(tǒng)計(jì)法中量反應(yīng)平行線測(cè)定雙交叉設(shè)計(jì)法計(jì)算效價(jià)及實(shí)驗(yàn)誤差，結(jié)果證明回歸非常 顯著，偏離平行不顯著，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立，從而說(shuō)明，本發(fā)明專利所述的包裹于脂質(zhì)體內(nèi)的胰 島素，仍保留其完好的天然降血糖生物活性。在本發(fā)明專利所述的脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液，即O-S⑶LI中，所述 胰島素是生物來(lái)源經(jīng)人工純化的豬胰島素或牛胰島素，也可以是基因重組人胰島素，或其 各種長(zhǎng)效，中效或速效的藥用胰島素衍生物。在本發(fā)明專利所述的脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液，即O-S⑶LI中，所述 O-S⑶LI 口服懸液中含有的SCLI制劑單室磷脂脂質(zhì)體，是經(jīng)O-S⑶LI制備程序第一步獨(dú)特 的真空冷凍控制去水化/保濕工藝制成，所述單室磷脂脂質(zhì)體平均粒徑為1000納米[圖 2]，其胰島素包裹率為80%以上。本發(fā)明專利還提供一種脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液，即O-S⑶LI制備程 序第一步的獨(dú)特的真空冷凍控制去水化/保濕工藝，即用于制備所述脂質(zhì)體包裹胰島素凍 干制劑，即SCLI制劑工藝，包含如下各步驟(a)將本發(fā)明專利所述的SCLI制劑的組成配比，選用任何一種制備小單室脂質(zhì)體 方法，包括用有機(jī)溶劑完全溶解、減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、充份干燥和加水充份水化，最后制成卵磷 脂濃度為0. 01-0. 15摩爾(M)的小單室磷脂脂質(zhì)體及其平均粒徑為30-120納米的懸液A ；(b)將選用的胰島素干粉，用重蒸去離子水制成胰島素水溶液為溶液B ；(c)將上述方法步驟(a)和(b)制備的懸液A和溶液B，相互充份混合制成懸液A 和溶液B的小單室磷脂脂質(zhì)體懸液和胰島素溶液混合懸液C ；(d)所述混合懸液C經(jīng)定容分裝、充氮、真空冷凍控制去水化/保濕以制成大單室 磷脂脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑，即SCLI制劑。在本發(fā)明專利所述的脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液，即O-S⑶LI中，所述 制備脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑，即SCLI制劑的真空冷凍控制去水化/保濕工藝中，所述 步驟(a)包括(al)，用精制氯仿或氯仿甲醇有機(jī)溶劑在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中完全溶解卵磷脂、膽固醇、 聚乙二醇脂肪酸酯，維生素E ；其在有機(jī)溶劑中相應(yīng)含量，mg/ml，分別為5-50、5-50、5-50、 0. 1-0. 5 ；(a2)，將上述完全溶解的有機(jī)溶劑，在其沸點(diǎn)溫度下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至有機(jī)溶劑完 全回收；(a3)，將上述有機(jī)溶劑完全回收后的卵磷脂脂質(zhì)膜置于室溫下充份干燥，加重蒸 去離子水充份水化制成水化液，使卵磷脂脂質(zhì)濃度為0.01-0. 15摩爾(M)；(a4)用超聲法或其它方法將上述卵磷脂脂質(zhì)水化液制成平均粒徑為30-120納米 的小單室磷脂脂質(zhì)體懸液為懸液A ；所述步驟(b)包括(bl)胰島素干粉置于pH調(diào)到2. 0-2. 5的鹽酸水溶液中完全溶解，濃度為5_50mg/ml ；(b2)再用氫氧化鉀溶液將胰島素酸性溶液調(diào)回到pH為7. 2以制成溶液B，所述步 驟(c)包括(cl)將上述(a4)步驟制成的懸液A與( )步驟制成的胰島素溶液B按兩者體積 比例為0.5-5.0 1.0-10.0相互混合制成小單室磷脂脂質(zhì)體懸液和胰島素溶液混合懸液 C ；(c2)將上述混合懸液C進(jìn)行定容分裝；(c3)定容分裝后混合懸液C置于零下10-20°C下，經(jīng)小時(shí)真空冷凍控制去 水/保濕程序，使SCLI制劑中保濕水分逐步達(dá)標(biāo)到0. 01-2. 5%，使其小單室脂質(zhì)體相互融 合逐步增大為大單室脂質(zhì)體；所述步驟(d)包括(dl)將上述SCLI制劑進(jìn)行充N氣、壓蓋、密封后，零下10-20°C保存待用；(d2)在SCLI制劑保存的三年時(shí)期內(nèi)，對(duì)SCLI制劑脂質(zhì)體大單室膜結(jié)構(gòu)及胰島素 包裹率和胰島素活性進(jìn)行定期測(cè)定和檢查。本發(fā)明專利還提供一種脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液，即O-S⑶LI制備程 序第二步的分別定容/分步液化工藝，即用所述定容分步液化溶液對(duì)所述SCLI制劑進(jìn)行液 化處理以完成O-S⑶LI 口服懸液的工藝，包括下述步驟(a)所述定容分步液化溶液，是氯化鈉溶液和中性PH磷酸緩沖液，所述分別定容/ 分步液化，其第一步液化是用一定容量氯化鈉溶液對(duì)SCLI制劑進(jìn)行液化處理；(b)其第二步液化是再加入一定容量的中性pH磷酸緩沖液對(duì)SCLI制劑進(jìn)行液化 稀釋，最終使SCLI制劑完全制成O-S⑶LI 口服懸液；(c)對(duì)SCLI制劑進(jìn)行第二步液化后制成的O-S⑶LI 口服懸液進(jìn)行脂質(zhì)體胰島素包 裹率測(cè)定，以計(jì)算單位體積口服懸液?jiǎn)问抑|(zhì)體胰島素包裹量作為口服用量參照；在本發(fā)明專利所述脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液制備程序第二步將SCLI 制劑制成O-S⑶LI 口服懸液工藝中，所述步驟(a)包括(al)所述先用一定量氯化鈉溶液對(duì)SCLI制劑進(jìn)行第一步液化，是指加入的氯化 鈉溶液容量與用中性PH磷酸鈉緩沖溶液第二步液化的容量的比為0. 1% -20% ；所述步驟(b)包括(bl)所述再加入一定容量的中性pH磷酸緩沖液對(duì)SCLI制劑進(jìn)行第二步液化，是 指所加中性PH磷酸鈉緩沖溶液容量為兩步液化所用溶液總?cè)萘康?0-99. 9% ；(b2)所述SCLI制劑總重量與被所述定容分步液化兩步液化溶液的總?cè)萘勘葹?5-80mg/ml ；(b3)所述SCLI制劑中胰島素總重量與被所述定容分步液化溶液兩步液化的總?cè)?量比為 2-20mg/ml ；(b4)所述SCLI制劑中胰島素總重量與(b!3)步驟所述定容分步液化溶液兩步液化 的總?cè)萘勘?，亦即與O-S⑶LI 口服懸液的總?cè)萘勘葹?-20mg/ml ；所述步驟(C)包括(cl)所述對(duì)O-S⑶LI 口服懸液進(jìn)行脂質(zhì)體胰島素包裹率測(cè)定，即首先將4毫升最 終制成的O-S⑶LI 口服懸液進(jìn)行35000rpm超速離心60分鐘，使包裹胰島素脂質(zhì)體完全沉淀與離心上清液完全分開；(c2)再取出一定量離心上清溶液，平行三份，各加等量水和3毫升考馬斯亮蘭溶 液，室溫下測(cè)定595nm的OD值，計(jì)算脂質(zhì)體胰島素平均包裹率和平均精確度；(c3)同時(shí)再取出一定量離心上清溶液和沉淀脂質(zhì)體的甲醇溶液，各平行三份，用 紫外分析法分別讀取278nm的OD值和279nm的OD值，即A278 (代表不含脂質(zhì)體的離心上 清溶液)和A279 (代表沉淀脂質(zhì)體)，按A279/A279+A278 X 100 %來(lái)計(jì)算脂質(zhì)體胰島素平均 包裹率及其平均精確度，與步驟(^)進(jìn)行對(duì)比，根據(jù)本發(fā)明專利所述步驟(^)和步驟(c3) 的脂質(zhì)體胰島素平均包裹率都在80%以上，其平均精確度都在96-103%，兩種方法結(jié)果完 全吻合和一致；(c4)，按上述步驟(c 2)和步驟(c 3)的脂質(zhì)體胰島素平均包裹率，根據(jù)每單位體 積的O-SCULI 口服懸液的脂質(zhì)體包裹的胰島素平均總量的IU數(shù)，來(lái)計(jì)算和標(biāo)定口服用量。本發(fā)明專利所述脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液，即O-S⑶LI經(jīng)過(guò)對(duì)本發(fā)明 專利設(shè)計(jì)建立的具有多項(xiàng)糖尿病病癥的糖尿病大鼠進(jìn)行急性口服實(shí)驗(yàn)，證明同時(shí)具有降血 糖(Hypoglycemic effect)，降游離脂肪酸(free fatty acids)和降血酮體(bloodKetone body)的明顯效果，與注射胰島素對(duì)照的降血糖相比，相對(duì)藥理生物等效性最高達(dá)22. 2%, 具量效關(guān)系，其降低血游離脂肪酸效果明顯優(yōu)于注射胰島素，降低血酮體效果比注射胰島 素更為明顯和持久[圖3A，圖3B ；圖4A，圖4B ；圖5A，圖5B]。本發(fā)明專利所述脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液，即O-S⑶LI經(jīng)對(duì)本發(fā)明專 利設(shè)計(jì)建立的具多項(xiàng)糖尿病病癥的糖尿病大鼠連續(xù)六周長(zhǎng)期口服實(shí)驗(yàn)，證明其綜合治療效 果有降低血糖化血紅蛋白(HbAlc)，降低甘油三脂(TG)和轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，降低氧自由基生 成(R0Q和氧化應(yīng)激(Oxidative Mress)，降低MDA，提高清蛋白(Alb)合成和清/球蛋白 比(A/G)，提高GSH-Px活性和GSH-Px/MDA比值；明顯恢復(fù)肝臟細(xì)胞和肝線粒體的顯微和亞 顯微結(jié)構(gòu)，維持健康體重，避免長(zhǎng)期注射胰島素引起的肥胖，其中多項(xiàng)指標(biāo)的改善顯著優(yōu)于 胰島素注射外周給藥[圖6，圖7，圖8]。本發(fā)明專利所述脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液，即O-S⑶LI及其制備工藝 同樣應(yīng)用于包裹胰島素以外的其它生物活性多肽和蛋白，包括細(xì)胞色素C，干擾素，清蛋白?？傊?，本發(fā)明專利首先是根據(jù)生物磷脂在水化反應(yīng)中形成膜雙分子層封閉膜囊泡 的原理和環(huán)境條件，膜脂和蛋白互動(dòng)和膜融合的分子機(jī)制，為模擬生理?xiàng)l件下胰島素包裹 在單室磷脂膜泡內(nèi)的形式在體內(nèi)儲(chǔ)存和運(yùn)行，口服后脂質(zhì)體能抵抗胃腸道的蛋白酶水解， 并以膜融合‘內(nèi)吞’和‘外吐’方式使脂質(zhì)體內(nèi)的胰島素進(jìn)入腸細(xì)胞和肝門靜脈，并靶向肝 臟和部分再?gòu)母闻K分泌進(jìn)入血循環(huán)這一生理過(guò)程作為所述脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口 服懸液，即O-SCULI及其制備工藝的全面參照指標(biāo)。其次，本發(fā)明專利設(shè)計(jì)的特定配比的磷 脂膜組份，由于使用真空冷凍控制去水化/保濕的制備工藝，因而在使脂質(zhì)體和胰島素混 合懸液體系中疏水力逐步減弱過(guò)程中，小單室磷脂脂質(zhì)體間相互融合增加，其單室磷脂脂 質(zhì)體粒徑加大約十倍，使平均粒徑100納米增大至1000納米[圖2]；在此過(guò)程中脂質(zhì)體與 分散的胰島素分子之間相互接觸加強(qiáng)，導(dǎo)致胰島素包裹率穩(wěn)定增高達(dá)80%以上(這比通常 脂質(zhì)體胰島素包裹率為20-40%要高出1-2倍)，這是本發(fā)明專利所述的控制去水化/保濕 的制備工藝的創(chuàng)新性。同時(shí)，由于SCLI制劑組分配比合理使脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和安全性 好，包裹在脂質(zhì)體內(nèi)胰島素分子結(jié)構(gòu)及生化和藥學(xué)活性保持完好，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便新穎，SCLI制劑易于長(zhǎng)期儲(chǔ)存和運(yùn)輸，優(yōu)越性突出。再者，由于使用于分別定容/分步液化技術(shù)的液化 溶液為生理濃度的無(wú)機(jī)鹽溶液，其離子強(qiáng)度較大，可使磷脂脂質(zhì)體分散，平均粒徑保持1000 納米左右[圖2]，保持O-S⑶LI 口服懸液中的單室膜囊泡結(jié)構(gòu)穩(wěn)定不易破裂，封閉性好，因 而胰島素不瀉漏，使胰島素包裹率保持80% (比通常凍干脂質(zhì)體直接水化時(shí)泄漏率高達(dá) 40%，胰島素包裹率高一倍)；第三，本發(fā)明專利的分別定容/分步液化技術(shù)，可將SCLI制 劑液化成O-SCULI 口服懸液，便于精確計(jì)算口服定量，克服了脂質(zhì)體胰島素凍干制劑不好 精確定量口服的缺點(diǎn)。上述O-SCULI脂質(zhì)體劑型的單室膜囊泡結(jié)構(gòu)方面的獨(dú)特創(chuàng)新，既與本發(fā)明專利的 上述特定制備程序和工藝有關(guān)，也與單室脂質(zhì)體劑型口服懸液含有特定組份配比有關(guān)首先，本發(fā)明專利的權(quán)利要求4所述，脂質(zhì)體磷脂組成中的磷脂酰膽堿(PC)和磷 脂酰乙醇胺(PE)能組成脂質(zhì)體膜雙分子層封閉膜囊泡的基本結(jié)構(gòu)；在O-S⑶LI的磷脂組成 特定配比中，PC和PE的比例分別占卵磷脂總量的摩爾比％為50-90%和5-50% ；該兩種磷 脂特定配比既保證單室脂質(zhì)體膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，又利于在生理?xiàng)l件下單室脂質(zhì)體膜表面有一定 比例PE頭部結(jié)構(gòu)，易于與腸肝組織的細(xì)胞膜相互作用和發(fā)生膜融合等‘內(nèi)吞’和‘外吐’方 式實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)運(yùn)，從而有利于胰島素在體內(nèi)的分泌和運(yùn)輸和進(jìn)入腸細(xì)胞和肝臟。其次，在膜磷脂的特定配比中，卵磷脂和膽固醇的摩爾(mole)比為1-10 1-10； 維生素E和膜磷脂的總重量比為0. 5-5% ；加入的膽固醇由于與PC的親和性高，加入的維 生素E由于其脂溶性和抗脂質(zhì)過(guò)氧化功能，兩者都能起到長(zhǎng)時(shí)間加強(qiáng)和保護(hù)單室脂質(zhì)體膜 囊泡雙分子層膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)固的作用。再者，本發(fā)明專利的權(quán)利要求5所述，在膜磷脂的特定配比中，聚乙二醇脂肪酸酯 (Poly-Ethylene Glycol Fatty Acid Esters)和卵磷脂的摩爾(mole)比為:1-10 1-10 ； 聚乙二醇脂肪酸酯由于其脂肪酸鏈的疏水性能固定在脂質(zhì)體膜雙分子層結(jié)構(gòu)中；其聚乙二 醇的多羥基糖鏈的親水性能保護(hù)脂質(zhì)體膜外表面水化層，因而在控制去水化/保濕的制備 過(guò)程中，既有利于水溶性胰島素分子與磷脂膜的結(jié)合和在脂質(zhì)體形成和脂質(zhì)體融合中增加 胰島素包裹量；也能起到在脂質(zhì)體形成后有效保護(hù)和固定單室脂質(zhì)體膜外表面結(jié)構(gòu)，故能 在口服后抵抗胃腸道蛋白酶類和膽汁等對(duì)脂質(zhì)體膜的消化破壞；本發(fā)明專利內(nèi)容中的相關(guān) 實(shí)驗(yàn)證明，小鼠腸溶液中的酯酶可使O-SCULI脂質(zhì)體中平均17%的聚乙二醇脂肪酸酯水解 為聚乙二醇和質(zhì)子(H+)，質(zhì)子能造成膜表面局部酸化和增加正電荷，聚乙二醇能改變水相 的結(jié)構(gòu)性，兩者都可能誘發(fā)和促進(jìn)脂質(zhì)體外表面與腸細(xì)胞膜負(fù)電性表面接觸，易于發(fā)生內(nèi) 吞等膜融合[S-s,Liu. Current Biochemical Research inChina, (Ed. C. L. Tsou) ,Academic Press, Inc. New York, 1989, pp : 161-172]，從而有利脂質(zhì)體釋放與轉(zhuǎn)運(yùn)胰島素的獨(dú)特效果， 并有利于促進(jìn)胰島素進(jìn)入腸-胰系靜脈匯入肝門靜脈入肝和入血，能發(fā)揮胰島素控制糖代 謝等多種生理功能的整合作用。最后，口服懸液中的生理濃度氯化鈉和中性pH磷酸鈉緩沖液，保持懸液中較強(qiáng)的 離子鍵力的作用，適合于包裹胰島素的磷脂脂質(zhì)體膜泡在體內(nèi)運(yùn)行的生理內(nèi)環(huán)境，故能保 護(hù)和利于單室脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定。因此，按本專利說(shuō)明書內(nèi)的‘實(shí)施方案三’制備的具上述特點(diǎn)的O-S⑶LI 口服懸 液，及其對(duì)本專利申請(qǐng)書中所述對(duì)糖尿病大鼠模型急性口服O-SCULI實(shí)驗(yàn)證明，口服2，5， 10，20，40IU/kg的口服O-S⑶LI劑量與引起糖尿病大鼠血糖下降效果，分別相當(dāng)于注射胰島素陽(yáng)性對(duì)照組降糖效果的23.8%，32. 2%，42. 1% -87%, 78%, 103% ；呈良好量效關(guān)系 [圖3A，圖: ]. 口服后6-9小時(shí)內(nèi)的藥理相對(duì)生物學(xué)等效性，分別達(dá)到注射胰島素陽(yáng)性對(duì) 照組的 21.0-21.6% (2IU/kg B. W.), 7. 5-22.2% (5IU/kg B. W.), 5. 4-13.9% (10IU/kg B. W. ),4. 0% (20IU/kg B. W. )4. 3% (40IU/kg B. W.)，與 口服劑量呈反向的量效關(guān)系[圖 4A，4B]。這與生理?xiàng)l件下胰島素對(duì)外周血糖反應(yīng)的分泌量(胰島素分泌反應(yīng)μ U/ml -hr) 和胰島素在血循環(huán)中刺激外周組織攝取血糖量(胰島素降外周血糖效應(yīng):mg/m7min)的反 向量效關(guān)系十分吻合[Robert, Μ. Berne, Matthew. N. Levy =Physiology, 3rd, 1993, p867, USA]。用正常大鼠作預(yù)備實(shí)驗(yàn)證明口服O-S⑶LI后引起血糖下降的同時(shí)，也檢測(cè)到血中胰 島素含量的同步升高，但C肽水平不變；口服空白脂質(zhì)體陰性對(duì)照則未見任何降血糖作用； 從而更進(jìn)一步證明口服O-S⑶LI的降血糖效果是由于胰島素經(jīng)過(guò)肝臟到血循環(huán)過(guò)程都發(fā) 揮了調(diào)控糖脂代謝作用的結(jié)果。本專利發(fā)明所述的O-S⑶LI劑型的另一創(chuàng)新性功能和優(yōu)越性還表現(xiàn)為急性口服 O-S⑶LI實(shí)驗(yàn)還證明，在降血糖的同時(shí)還明顯降低血游離脂肪酸和血酮體，后者還顯著優(yōu)于 注射胰島素[圖5A，圖5B]。本發(fā)明專利所述的O-SCULI劑型的其它創(chuàng)新性功能和優(yōu)越性還表現(xiàn)為長(zhǎng)期(六 周每日兩次)連續(xù)口服O-S⑶Li，降低糖尿病大鼠血清糖基化血紅蛋白(HbAlc)[附圖6]、 血清甘油三脂(TG)[附圖7]、轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、體內(nèi)氧化應(yīng)激(MDA)、心臟和肝臟線粒體氧自由 基(ROS)生成等；同時(shí)提高肝臟蛋白合成(Alb、TP)和白/球(A/G)比、GSH-Px/MDA比、血 清高密度脂蛋白(HDL-C)等；改善與恢復(fù)糖尿病動(dòng)物肝細(xì)胞顯微和亞顯微結(jié)構(gòu)和肝損傷， 保持健康體重等；避免注射胰島素副作用和表現(xiàn)更佳綜合療效[附圖8]?？傊?，本發(fā)明專利的O-S⑶LI經(jīng)過(guò)對(duì)昆明小鼠的LD5tl測(cè)定，證明0_S⑶LI 口服劑型 非常安全可靠；在克服口服脂質(zhì)體劑型普遍存在的包裹率和生物利用度低，生產(chǎn)穩(wěn)定性三 大難題的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)了胰島素包裹率高，生物利用度高，生產(chǎn)工藝新穎簡(jiǎn)便，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性 好，便于儲(chǔ)存運(yùn)輸和口服精確定量，能模擬生理?xiàng)l件下胰島素以膜泡包裹的形式和多種膜 融合的機(jī)制進(jìn)入腸-胰系靜脈匯入肝門靜脈入肝和入血，因此具有包括降血糖在內(nèi)的綜合 治療糖尿病多指標(biāo)的創(chuàng)新功能；是口服脂質(zhì)體胰島素劑型的新突破，可應(yīng)用于糖尿病I型 和嚴(yán)重II型患者的綜合治療，明顯優(yōu)于注射胰島素外周給藥途徑。第五，本專利發(fā)明的O-S⑶LI 口服懸液新制劑的制備程序和生產(chǎn)工藝也為其它多 肽與蛋白類生物工程藥物開辟非注射給藥新途徑和新用途，前景十分顯著。


下面將結(jié)合附圖及實(shí)施案例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，附圖中圖1，脂質(zhì)體包裹胰島素制劑口服懸液，O-S⑶LI樣品及空白脂質(zhì)體電鏡圖片小單室脂質(zhì)體，示鋨酸固定口服懸液O-SCULI的單室脂質(zhì)體電鏡切片，平均粒徑 1000納米；負(fù)染圖片，示口服懸液O-S⑶LI單室脂質(zhì)體的磷鎢酸負(fù)染圖片，平均粒徑1000納 米hsulin，示O-S⑶LI樣品的冰凍蝕刻電鏡圖片，圖上部?jī)蓚€(gè)單室脂質(zhì)體內(nèi)膜上分 布的胰島素顆粒，
多為二體和六體的排列(放大150，000X，其粒徑在620納米左右)；空白脂質(zhì)體，圖下部為空白單室脂質(zhì)體，內(nèi)膜無(wú)胰島素顆粒(放大150，000X，其 粒徑在600納米左右)；圖2脂質(zhì)體包裹胰島素制劑口服懸液中的單室脂質(zhì)體粒徑測(cè)定(單室脂質(zhì)體平均 粒徑1000納米的常態(tài)分布)圖3A，3B，口服0_S⑶LI和注射胰島素對(duì)糖尿病大鼠降血糖作用比較(實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng) 計(jì)見說(shuō)明書)圖4A，4B，口服0_S⑶LI劑量對(duì)糖尿病大鼠降血糖生物等效性(實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)見說(shuō) 明書)圖5A，口服O-S⑶LI和注射胰島素對(duì)糖尿病大鼠降血糖和游離脂肪酸的比較(實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)見說(shuō)明書)圖5B，口服O-S⑶LI和注射胰島素對(duì)糖尿病大鼠降血酮體的比較(實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)見說(shuō)明書)圖6，六周長(zhǎng)期連續(xù)口服O-S⑶LI和注射胰島素對(duì)糖尿病大鼠降糖基化血紅蛋白 的比較Normal Ref，正常大鼠血糖基化血紅蛋白(HbAIc)值％Control，糖尿病大鼠血糖基化血紅蛋白(HbAIc)值％0. 5IU/kg SC. hs，注射胰島素的糖尿病大鼠血糖基化血紅蛋白(HbAIc)值％10IU/kg oral LEI，口服10IU/kg 0-SCULI的糖尿病大鼠血糖基化血紅蛋白 (HbAIc)值％5IU/kg oral LEI，口服5IU/kg0_SCULI的糖尿病大鼠血糖基化血紅蛋白(HbAIc)
值Emp. Oral lipo，口服空白脂質(zhì)體的糖尿病大鼠血糖基化血紅蛋白(HbAIc)值圖7，六周長(zhǎng)期連續(xù)口服O-S⑶LI和注射胰島素對(duì)糖尿病大鼠降甘油三酯(TG)的 比較Untreated，對(duì)照組為未給藥的糖尿病大鼠血甘油三酯(TG值121. 1 士42. 9mg/dl (η = 19)( 口服等量空白脂質(zhì)體對(duì)照糖尿病大鼠血TG值109. 9士30. 4mg/dl,n = 6圖5未 示)S. C.，注射胰島素(0. 5IU/kg 2次/日)的糖尿病大鼠TG值80. 9士34. 6mg/dl (η =20)Oral LEI 20U,六周口服 0-SCULI (10IU/kg 2 次 / 日)的糖尿病大鼠 TG 值 63. 8 士 19. 0mg/dl (η = 21)Oral LEI 10U,六周口服 0-SCULI (5IU/kg 2 次 / 日)糖尿病大鼠 TG 值 92. 0 士 40. 2mg/dl (η = 11)圖8六周長(zhǎng)期口服O-S⑶LI和注射胰島素對(duì)糖尿病大鼠體重的變化比較(*P < 0. 05，t test,與對(duì)照 control 比較)Control，未處理對(duì)照(n = 19)；0. 5IU/kg SC ins，每日兩次皮下注射胰島素 0. 5IU/kg(n = 20)；Eqm. Liposomes，每日兩次口服等molar空白脂質(zhì)體(n = 6)10IU/kg Oral, 口服 10IU/kg0-SCULI (η = 19)；
5IU/kg Oral, 口服 5IU/kgO_SCULI (η = 19)
具體實(shí)施例方式實(shí)施案例一，(1)小單室脂質(zhì)體懸液的制備大豆卵磷脂1563. ang，膽固醇2(Mmg，二硬脂酰酸 聚乙二醇122. 76mg，加入內(nèi)含210mg維生素E的80ml精制氯仿中溶解，置于250ml的圓底 燒瓶?jī)?nèi)，45°C，200rpm旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)3. 5小時(shí)蒸發(fā)至干，室溫下充分干燥后加入蒸餾水80ml充分 水化過(guò)夜，多次震蕩后，用探頭超聲儀超聲5-22分鐘，用激光散射儀(Particle Sizer)測(cè) 量小單室脂質(zhì)體粒徑為40-120納米后停止，室溫靜置；(2)胰島素溶液制備將天然生物胰島素干粉700mg(豬胰島素)溶于80ml的酸 性(pH = 2. 5)水溶液中，后再用NaOH溶液調(diào)至pH為7. 2 ；(3)制備小單室磷脂脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑小單室脂質(zhì)體溶液(步驟1)與 胰島素溶液(步驟幻按比例充分混合，制成小單室磷脂脂質(zhì)體溶液和胰島素混合懸液，定 容分裝，放置在Virtis冷凍機(jī)零下(10-20°C )冷凍真空干燥M-48小時(shí)后，脂質(zhì)體包裹胰 島素凍干制劑SCLI制成后經(jīng)充N氣后壓蓋密封.零下低溫(如-20°C)可長(zhǎng)期保存待用。 臨用前經(jīng)分別定容/分步液化技術(shù)分別加入氯化鈉和磷酸緩沖溶液分別進(jìn)行定容分步液 化液制成O-S⑶LI 口服懸液。(4)脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液O-S⑶LI的胰島素包裹率測(cè)定。其方法 是將細(xì)1定容分步液化溶液液化的O-S⑶LI 口服懸液進(jìn)行35000rpm超速離心60分鐘，取一 定量上清溶液，平行三份，各加等容量水和考馬斯亮藍(lán)試劑:3ml，混勻室溫下測(cè)定595nm OD 值計(jì)算胰島素平均包裹率及其平均準(zhǔn)確度。同時(shí)也用紫外分析法在進(jìn)行上清溶液和沉殿脂 質(zhì)體的甲醛溶液，分別讀取278nm的OD值(A278)和279nm的OD值(A279)，按A279 (沉殿 脂質(zhì)體)/A279+A278(上清)X 100%計(jì)算脂質(zhì)體胰島素包裹率進(jìn)行對(duì)比。兩種方法測(cè)定結(jié) 果完全吻合。實(shí)施案例二，(1)小單室脂質(zhì)體的制備大豆卵磷脂647. 56mg，膽固醇15;3mg，聚乙二醇二硬脂 酸368. ^mg,加入內(nèi)含73mg維生素E的40ml精制氯仿中溶解，置于250ml的圓底燒瓶?jī)?nèi)， 45°C，200rpm旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)3. 5小時(shí)蒸發(fā)至干，室溫下充分干燥后加入蒸餾水40ml充分水化過(guò) 夜，多次震蕩后，用探頭超聲儀超聲5-22分鐘，用激光散射儀(Particle Sizer)測(cè)量小單 室脂質(zhì)體粒徑至40-120納米后停止，室溫靜置；(2)胰島素溶液制備將胰島素干粉400mg (豬胰島素)溶于40ml的酸性水溶液 中，后再用NaOH溶液調(diào)至pH為7. 2 ；(3)制備小單室脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑。小單室脂質(zhì)體溶液(1)與胰島素溶 液(2)按比例充分混合，制成小單室脂質(zhì)體懸液和胰島素水溶液的混合懸液，定容分裝，放 置在Virtis冷凍機(jī)零下(10-20°C )冷凍真空干燥M-48小時(shí)后，制成單室脂質(zhì)體包裹胰 島素凍干制劑，經(jīng)充N氣后壓蓋密封.零下低溫(如-20°C)可長(zhǎng)期保存待用。臨用前經(jīng) 分別定容/分步液化技術(shù)分別加入氯化鈉和磷酸緩沖溶液分別進(jìn)行定容分步液化液制成 O-SCULI 口服懸液。(4)脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液的胰島素包裹率測(cè)定。取定容分步液化的口服懸進(jìn)行35000rpm超速離心60分鐘，取一定量上清溶液，平行三份，各加水等容 量和考馬斯亮藍(lán)試劑:3ml，混勻室溫下測(cè)定595nm OD值計(jì)算胰島素平均包裹率及其平均準(zhǔn) 確度。同時(shí)也用紫外分析法在進(jìn)行上清溶液和沉殿脂質(zhì)體的甲醛溶液，分別讀取278nm的 OD 值(A278)和 279nm 的 OD 值(A279)，按 A279 (沉殿脂質(zhì)體)/A279+A278 (上清)X 100% 計(jì)算脂質(zhì)體胰島素包裹率進(jìn)行對(duì)比。兩種方法測(cè)定結(jié)果十分吻合實(shí)施案例三(1)小單室脂質(zhì)體的制備大豆卵磷脂781.6mg，膽固醇lOang，二硬脂酰聚乙二醇 245. 6mg,加到內(nèi)含80mg維生素E的40ml精制氯仿中溶解，置于250ml的圓底燒瓶?jī)?nèi)，45°C， 200rpm旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)2小時(shí)蒸發(fā)至干，室溫下充分干燥后加入蒸餾水40ml充分水化過(guò)夜，多次 震蕩后，用探頭超聲儀超聲5-20分鐘，用激光散射儀(ParticleSizer)測(cè)量小單室脂質(zhì)體 粒徑為40-120納米后停止，室溫靜置；(2)胰島素溶液制備將天然生物胰島素干粉400mg(豬胰島素)溶于40m]的酸 性水溶液中，后再用NaOH溶液調(diào)至pH為7. 2 ；(3)制備小單室磷脂脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑。上述小單室脂質(zhì)體溶液(1)與 胰島素溶液( 按比例充分混合，制成小單室脂質(zhì)體懸液和胰島素水溶液的混合懸液，定 容分裝，放置在Virtis冷凍機(jī)零下10-20°C冷凍真空干燥M-48小時(shí)后，制成單室磷脂包裹 脂質(zhì)體胰島素凍干制劑，經(jīng)充N氣后壓蓋密封.零下低溫(如-20°C)長(zhǎng)期保存待用。臨用 前經(jīng)分別定容/分步液化技術(shù)分別加入氯化鈉和磷酸緩沖溶液分別進(jìn)行定容分步液化液 制成O-SCULI 口服懸液。(4)脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液的胰島素包裹率測(cè)定。取定容分步 技術(shù)液化的口服懸液進(jìn)行35000rpm超速離心60分鐘，取一定量上清溶液，平行三份，各加 水等容量和考馬斯亮藍(lán)試劑:3ml，混勻室溫下測(cè)定595nm OD值計(jì)算胰島素平均包裹率和平 均準(zhǔn)確度。同時(shí)也用紫外分析法在進(jìn)行上清溶液和沉殿脂質(zhì)體的甲醛溶液，分別讀取278nm 的 OD 值(A278)和 279nm 的 OD 值(A279)，按 A279 (沉殿脂質(zhì)體)/A279+A278 (上清)X100% 計(jì)算脂質(zhì)體胰島素包裹率進(jìn)行對(duì)比。兩種方法測(cè)定結(jié)果完全吻合。實(shí)施案例四脂質(zhì)體干擾素牛血清蛋白凍干口服懸液(1)小單室脂質(zhì)體的制備大豆卵磷脂781.6mg，膽固醇lOang，二硬脂酰聚乙二醇 245. 6mg,加到內(nèi)含80mg維生素E的40ml精制氯仿中溶解，置于250ml的圓底燒瓶?jī)?nèi)，45°C， 200rpm旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)2小時(shí)蒸發(fā)至干，室溫下充分干燥后加入蒸餾水40ml充分水化過(guò)夜，多次 震蕩后，用探頭超聲儀超聲5-20分鐘，用激光散射儀(ParticleSizer)測(cè)量小單室脂質(zhì)體 粒徑為40-120納米后停止，室溫靜置；(2)干擾素牛血清蛋白溶液制備將比例為1-10 5-50的干擾素牛血清蛋白干 粉(400mg)溶于40ml的水溶液中，調(diào)至pH為7. 2 ；(3)制備凍干小單室脂質(zhì)體干擾素牛血清蛋白。上述小單室脂質(zhì)體溶液(1)與干 擾素牛血清蛋白溶液( 按比例充分混合，制成小單室脂質(zhì)體素混合懸液，定容分裝，放置 在Virtis冷凍機(jī)零下10-20°C冷凍真空干燥M-48小時(shí)后，制成凍干單室脂質(zhì)體干擾素牛 血清蛋白，經(jīng)充N氣后壓蓋密封.零下低溫(如-20°C)可長(zhǎng)期保存待用。臨用前經(jīng)分別定 容/分步液化技術(shù)分別加入氯化鈉和磷酸緩沖溶液分別進(jìn)行定容分步液化液制成脂質(zhì)體 干擾素牛血清蛋白凍干口服懸液。
(4)脂質(zhì)體包裹干擾素牛血清蛋白凍干制劑口服懸液的干擾素牛血清蛋白包裹率 測(cè)定。取4ml定容液化.的口服懸液進(jìn)行進(jìn)行35000rpm超速離心60分鐘，取一定量上清 溶液，平行三份，各加等容量水:3ml，混勻室溫下測(cè)定清蛋白的OD值計(jì)算干擾素牛血清蛋白 平均包裹率及其平均準(zhǔn)確度。實(shí)施案例五本發(fā)明專利上述實(shí)施案例一，實(shí)施案例二和實(shí)施案例三所制成的脂質(zhì)體包裹胰島 素凍干制劑口服懸液，即0-SCULI，包括用于本實(shí)施案例五所述的治療糖尿病藥學(xué)效的實(shí)施 案例，均包括以下成分及其在每1升O-SCULI 口服懸液中毫摩爾數(shù)為卵磷脂，5-50 ；膽固 醇，5-50 ；聚乙二醇脂肪酸酯(Poly-Ethylene Glycol Fatty Acid Esters)，5-50 ；維生素 E，0. 1-0. 5 ；胰島素，1-10 ；氯化鈉，1-20 ；磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉緩沖液，1_80。(I)O-SCULI 口服懸液的安全性按‘實(shí)施案例三’制備三個(gè)批號(hào)口服O-SCULi，經(jīng)過(guò)對(duì)昆明小鼠的LD5tl測(cè)定，證明本 口服O-SCLI非常安全可靠。以55只昆明小鼠，雌雄兼用體重18-20g，隨機(jī)分6組，禁食4小 時(shí)后分別 ig 等容量胰島素 26000U/kg，18200u/kg, 12700u/kg,8900u/kg5242u/kg 0. 8ml. 各組間劑量比為0. 7。用改良寇氏法，檢查記數(shù)各組小鼠7天內(nèi)死亡率，中毒反應(yīng)及死亡時(shí) 間。結(jié)果；LD50的50%可信度=14326. 83士3060. 7u/kg.對(duì)比的一組11只昆明小鼠(雌雄 兼用)，ig空白脂質(zhì)體22. 4g/kg(相當(dāng)于口服脂質(zhì)體胰島素急性實(shí)驗(yàn)所用最大劑量組所含 空白脂質(zhì)體的量)，計(jì)數(shù)小鼠7天內(nèi)死亡率和給藥后反應(yīng)，結(jié)果是11只小鼠全部生存，且無(wú) 明顯中毒反應(yīng)。另一組同樣按‘實(shí)施案例三’制備口服O-SCULi，對(duì)四氧嘧啶誘發(fā)的SD糖尿病大 鼠(體重200克左右，病程三周，雄性，血糖值大于300mg/dl)進(jìn)行的急性降血糖的實(shí)驗(yàn)； 在40IU/kg B. W.的最高口服計(jì)量的實(shí)驗(yàn)組中，口服后1小時(shí)的血糖下降接近正常血糖值 (< 140mg/dl)，相當(dāng)于1. 0IU/kg注射胰島素降糖效果的104%，并保持3小時(shí)血糖不變，三 小時(shí)出現(xiàn)2/8大鼠低血糖20mg/dl)死亡。但是，40IU/kg B. W.以下口服計(jì)量，包括2-25IU/ kg B. W各計(jì)量組180只糖尿病大鼠的一次急性實(shí)驗(yàn)，以及連續(xù)六周每日20IU/kg B. W，即 早晚兩次各口服10IU/kg B. W 口服計(jì)量試驗(yàn)組中，均未發(fā)現(xiàn)死亡，或低血糖和中毒反應(yīng)；而 且，與注射胰島素組大鼠體重不斷增加(+18% )和口服空脂質(zhì)體組對(duì)照大鼠體重不斷下降 (-12% )相比，連續(xù)六周口服O-SCULI組大鼠個(gè)體保持體重不變[圖8]，毛色光亮，健康活 潑。證明2-25IU/kg B. W范圍口服劑量安全可靠。(2)本發(fā)明專利所述口服O-SCULI對(duì)糖尿病大鼠模型的綜合藥效檢查包括降血 糖、血脂、血酮體、和血清糖基化血紅蛋白等多項(xiàng)病癥指標(biāo)和恢復(fù)肝臟結(jié)構(gòu)和功能損傷本專利所述口服O-SCULI藥效檢查是用四氧嘧啶建立糖尿病大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜑閷?shí) 驗(yàn)對(duì)象，所述糖尿病大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒊绦蛉缦逻x200 士 IOg SD雄性大鼠，停食一夜 后尾靜脈注射四氧嘧啶40mg/kg體重，三周后用血糖試劑盒檢查血糖在250-500mg/dl之 間者確定為糖尿病模型，同時(shí)也全面檢查糖尿病模型大鼠的糖基化血紅蛋白(HbAlc)，血 脂(TG，LDL-C，HDL-C，)，血酮體(AC+β-Hb)，以及反映糖尿病肝臟功能多項(xiàng)相關(guān)病理指標(biāo) (A/g，ALT, Alb)，氧應(yīng)激指標(biāo)(GSH-Px、MDA、GSH-Px/MDA比)，肝線粒體超氧產(chǎn)生和肝臟細(xì) 胞的顯微和亞顯微結(jié)構(gòu)的損傷。結(jié)果證明，由于四氧嘧啶產(chǎn)生的氧自由基特別迅速損害胰 島β-細(xì)胞合成胰島素功能，建模三周后，胰島β-細(xì)胞已受損并導(dǎo)致血循環(huán)和肝臟減少和缺乏胰島素，除了引起血糖升高至420士50mg/dl (正常140mg/dl)外，其它相關(guān)病變損 傷也同樣十分明顯HbAlc，3. 98士0. 51% of Hb (對(duì)照，1.86%) ；Serum TG，84. 3士39. 9mg/ dl(對(duì)照，63. 8 士 19);皿1^-(，43.2士1611^/(11(對(duì)照，32.7士8.9) ；Serum ALT 74. 4士 22. 8U/ L,(對(duì)照，45. 8士9. 8) ；Serum AC+β Hb，0. 295-0. 803 (對(duì)照，< 0. 2) ；A/G，0. 81 士0. 17 (對(duì) 照，1.19士0.13) ；Serum Alb，3. 02士0. 8g/dl (對(duì)照，4. M士0. 41)；肝線粒體超氧自由基生 成(μ mol/min/mgprotein)，1.5-1.8(對(duì)照，0.8-1. 2) ；GSH-Px/MDA 比，8.0士2.0(對(duì)照， 19. 0士2. 5)。此外，肝臟組織的顯微和亞顯微結(jié)構(gòu)，特別是線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜有明顯病變。(3)本發(fā)明專利所述急性口服O-SCULI能同時(shí)明顯降低糖尿病大鼠的外周血糖、 血清自由脂肪酸和血酮體，降血酮體作用明顯優(yōu)于注射胰島素本項(xiàng)藥效實(shí)驗(yàn)以本發(fā)明專利說(shuō)明中所述‘實(shí)施案例三’制備的口服O-S⑶Li，用上 述的四氧嘧啶誘發(fā)的病程已三周的糖尿病模型大鼠，在斷食3小時(shí)后尾尖取血，經(jīng)抗凝后 取血清，葡萄糖氧化法測(cè)定血糖作為零時(shí)血糖值，依此血糖值為標(biāo)準(zhǔn)將糖尿病模型大鼠分 成匹配5組，每組8只大鼠，以皮下注射胰島素0. 5-1. 0IU/kg體重為陽(yáng)性對(duì)照，以等體積 含有口服空白脂質(zhì)體的緩沖溶液進(jìn)行一次口服灌胃為陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)各組分別為含有2，5， 10，20，40IU/kg的口服OSCLI灌胃。灌胃前取血作零時(shí)血糖值測(cè)定，灌胃后每隔一小時(shí)采血 測(cè)定血糖，持續(xù)3-6小時(shí)內(nèi)大鼠自由飲水。[圖3A，3B]內(nèi)的 5 組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示口服 2，5，10，(10)，20，40IU/kg 的口服 0-SCULI 劑量與引起糖尿病大鼠血糖下降效果，分別相當(dāng)于注射胰島素陽(yáng)性組降糖效果的23.8%， 32.2%,42. 1% -87%,78%,103% ；呈量效關(guān)系.按5次實(shí)驗(yàn)組降糖曲線外推與陰性對(duì)照 和陽(yáng)性對(duì)照曲線交叉時(shí)間點(diǎn)(6-9小時(shí))曲線下的面積計(jì)算，所用各口服O-SCULI劑量的 藥理學(xué)相對(duì)生物學(xué)等效性，分別達(dá)到注射胰島素對(duì)照組的21. 0-21. 6% (2IU/kg B. W.), 7.5-22.2 % (5IU/kg B. W.), 5. 4-13. 9 (10IU/kg B. W.), 4. 0 (20IU/kg B. W.) 4. 3 (40IU/kg B. W.)；與注射胰島素對(duì)照組相比，口服O-S⑶LI降低外周血糖效果隨口服O-S⑶LI劑量呈 反方向量效關(guān)系[圖4A，4B]。口服O-SCULI劑量20IU/kg B. W. 1小時(shí)后，大鼠血糖可降到正 常值范圍(< 140mg/dl)，3小時(shí)降血糖仍呈平穩(wěn)趨勢(shì)，但注射胰島素1. 0IU/kg體重組的血 糖下降到1小時(shí)后即開始明顯回升；口服空白脂質(zhì)體陰性對(duì)照組則未見任何降血糖作用。 從而證明口服O-S⑶LI是經(jīng)過(guò)肝臟到血循環(huán)而緩慢起作用。正常大鼠作預(yù)備實(shí)驗(yàn)證明口服 O-SCULI后在引起血糖下降的同時(shí)，血中胰島素含量同步升高，但C肽水平不變。上述口服 O-S⑶LI降低外周血糖效果隨口服O-S⑶LI劑量呈反方向量效關(guān)系，與生理?xiàng)l件下胰島素 對(duì)外周血糖反應(yīng)的分泌量(胰島素分泌反應(yīng)μ u/ml · hr)和胰島素在血循環(huán)中刺激外周 組織攝取血糖量(胰島素降外周血糖效應(yīng)mg/m2/min)的反向量效關(guān)系十分吻合[Robert， Μ. Berne,Matthew,N. Levy, Physiology, 3rd,Mosby-New book,Inc.，USA,1993，p，867，]。更 進(jìn)一步證明口服O-SI⑶L是經(jīng)過(guò)肝臟到血循環(huán)過(guò)程發(fā)揮了互相整合和調(diào)控的降血糖效果?？诜﨩-S⑶LI對(duì)糖尿病大鼠有明顯降血糖同時(shí)，還明顯同步降低血清游離脂肪酸 [圖5A]和血酮體[圖5B]。以‘實(shí)施案例三’制備的口服O-SCULI，進(jìn)行急性口月艮O-SCULI 實(shí)驗(yàn)取四氧嘧啶誘發(fā)病程已三周的糖尿病雄性大鼠，體重200士 10g，按空腹血糖值和體 重相匹配分三組，早晨斷食3小時(shí)后開始實(shí)驗(yàn)，皮下注射胰島素1. 0IU/kg體重為陽(yáng)性對(duì)照， 口服等體積含空白脂質(zhì)體緩沖溶液為陰性對(duì)照，口服O-S⑶LI灌胃20IU/kg體重作為實(shí)驗(yàn) 組。實(shí)驗(yàn)期間大鼠禁食，自由飲水。糖尿病大鼠在灌胃給藥后的0，1，2，4，6小時(shí)分別從大鼠眼框放血0. 25毫升用于測(cè)定血糖以及血游離脂肪酸；在0，2，4，6小時(shí)取大鼠眼框血1毫 升用于測(cè)定血酮體。血清游離脂肪酸用銅離子結(jié)合顯色用比色1法測(cè)定，酮體用酶法測(cè)定 AcAC和β-HB的濃度。[圖5Α]降血糖和血自由脂肪酸組實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析經(jīng)Mudent't檢驗(yàn)，陰性對(duì) 照組，注射胰島素組和口服O-S⑶LI三組給藥0時(shí)的血糖和血清自由脂肪酸水平無(wú)差別；口 服O-SCULI和注射胰島素兩組在給藥后1，和2小時(shí)以及4小時(shí)的血清自由脂肪酸水平都 明顯低于陰性對(duì)照(P <0.001)；在6小時(shí)，注射胰島素與陰性對(duì)照組已無(wú)明顯差別，但口 服O-SCULI組給藥6小時(shí)的血清自由脂肪酸仍然明顯低于注射胰島素組和陰性對(duì)照組(P < 0. 001)?？诜﨩-S⑶LI組糖尿病大鼠血清自由脂肪酸，給藥后0時(shí)為0. 548士0. 088mmol/ L，2小時(shí)下降到0. 309士0. 067mmol/L，然后回升到6小時(shí)為0. 446士0. 065mmol/L。同時(shí)，血 糖也由0時(shí)420mg/dl，2小時(shí)下降到^Omg/dl和4小時(shí)的^Omg/dl達(dá)最大降血糖效果，到 6小時(shí)后略回升到^Omg/dl ；此時(shí)口服O-S⑶LI組大鼠的血清自由脂肪酸和血糖水平都明 顯低于陰性對(duì)照組和注射胰島素組。[圖5A]提示，口服O-S⑶LI不僅在降低血糖同時(shí)能降低血清自由脂肪酸和血酮體 體，而且在口服后4-6小時(shí)的效果還明顯優(yōu)于注射胰島素組。因?yàn)椋诜﨩-S⑶LI降血酮體 的作用機(jī)制可能與注射胰島素不同，不僅降低血中自由脂肪酸(FFA)，而且使胰島素直接作 用于肝臟，更為持久地抑制肝內(nèi)酮體生成。證明急性一次口服O-SCULI可相當(dāng)多次注射胰 島素的降低血酮體癥的療效，證明口服O-SCULI多指標(biāo)的治療糖尿病的優(yōu)越性。[圖5B]降血酮體實(shí)驗(yàn)組結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析經(jīng)Mudent’t檢驗(yàn)，陰性對(duì)照，注射胰島 素和口服O-S⑶LI三組給藥0時(shí)的血酮體總濃度無(wú)差別，2小時(shí)后，口服O-SI⑶L和注射胰 島素兩組都明顯低于陰性對(duì)照，4小時(shí)，注射胰島素組與對(duì)照已無(wú)差別，6小時(shí)，反而更顯著 高于對(duì)照組(P < 0. 001)?？诜﨩-S⑶LI組血酮體總濃度4小時(shí)和6小時(shí)都顯著低于對(duì)陰 性照組。說(shuō)明.與口服空脂質(zhì)體陰性組和皮下注射胰島素組相比，口服O-S⑶LI糖尿病大 鼠組血酮體總濃度降低效果為，從給藥0時(shí)的0. 329mmol/L到2小時(shí)下降為0. 198mmol/L, 后緩慢上升到6小時(shí)為0. 62mmol/L，血酮體總濃度仍低于陰性對(duì)照，血酮體下降效果也遠(yuǎn) 優(yōu)于注射胰島素組。(4)長(zhǎng)期(六周)連續(xù)口服O-SCULI有改善糖尿多項(xiàng)病癥指標(biāo)和恢復(fù)肝臟細(xì)胞結(jié) 構(gòu)和功能損傷的綜合療效。本項(xiàng)六周長(zhǎng)期連續(xù)口服O-S⑶LI對(duì)糖尿病療效檢驗(yàn)仍以‘實(shí)施案例三’制備的‘口 服OSCLI ’劑型，以前述四氧嘧啶誘發(fā)，病程三周具糖尿病多種病理指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)大鼠為動(dòng)物 模型，分下列各組口服緩沖液陰性對(duì)照組，胰島素(0.5IU/kg B. W.)皮下注射陽(yáng)性對(duì)照 組，口服O-SCULI (5IU/kg B.ff,10IU/kg B. W.)，和口服空白脂質(zhì)體對(duì)照組三組試驗(yàn)灌胃。每 日兩次給藥，早晚各一次。每日早晨斷食，3小時(shí)后給藥，每晚給藥1小時(shí)后給食物，各組同 步。大鼠自由飲水，保持18-25°C室溫和12小時(shí)交替光照。另設(shè)一組健康大鼠作正常參照。 在開始治療前，治療第三周和第六周，三批分別從各組動(dòng)物取血樣或取肝臟樣本作生物化 學(xué)分析和顯微和亞顯微組織處理之用。6周連續(xù)口服O-S⑶LI的療效如下(4-1)血清糖化血紅蛋白(HbAlc)[圖6]治療前糖尿病大鼠各組血清HbAlc值在3. 98 士0. 51 % %，健康大鼠血清HbAlc正 常值1.86% (η = 8)，顯著高(p<0.001，t test)。六周治療前后HbAlc值非給藥陰性對(duì)照由3. 98士0. 51%升高到4. 63士0. 17%，升高15.8% 注射胰島素組由3. 81 士0.41% 降為 3. 75士0.54% (n = 8)，下降 1.6% ；口服 OSCULI (10IU/kg B. W)組由 3. 81 士0.37% χ降為3. 72士0. 45 % (n = 8),下降2. 4% ；兩給藥組比陰性對(duì)照組降低HbAlc效果都明 顯(P < 0.05，t test)。但口服O-SCULI (5 IU/kg B. W)組(n = 7)與陰性對(duì)照組無(wú)顯著 差異。口服空白脂質(zhì)體組與非給藥陰性對(duì)照組無(wú)差異，無(wú)降低血清HbAlc作用；證明口服 O-S⑶LI(10IU/kg B. W)的效果不是由于脂質(zhì)體本身，而是被包裹的胰島素經(jīng)過(guò)腸道吸收進(jìn) 入肝臟和入血發(fā)揮降糖的結(jié)果。這是國(guó)內(nèi)外都未見報(bào)道的首次新成果。(4-2)血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT)正常大鼠血清ALT = 45. 8 士9. 8u/L(n = 19)，糖尿病組血清治療前ALT明顯升高 至74. 4士22. 8u/L) (η = 77)，各組組間治療前無(wú)差異。六周后，非給藥陰性對(duì)照組上升到 97. 7士31. 9U/L ；六周給藥治療后，口服 O-SCULI (10u/kg B. W)組下降至 64. 7士21. lu/L，注 射胰島素組下降至80士 lOu/L ；兩給藥組比非給藥陰性對(duì)照組血清ALT降低效果都明顯(P
<0.05)，但口服O-SI⑶L(10u/kg)組更佳；口服空白脂質(zhì)體組與非給藥對(duì)照差異不明顯， 口服O-SICUL (5IU/kg B. W)組與之有差異，但不夠顯著。(4-3)血清白蛋白(ALB)正常大鼠血清ALB = 4.M士0.41g/dl(n = 8)；各糖尿病組治療前血清ALB下 降至3.02士0.8g/dl(n = 56)，組間無(wú)明顯差異。六周給藥治療后血清ALB水平口服 0-SICUL(10u/kg B. W)組提高至 3. 71 士0. 82g/dl，注射胰島素組提高至 3. 52士0. 36g/dl。 兩給藥組比非給藥對(duì)照組血清ALB水平(3. 02 士0. 8g/dl)提高效果都明顯(P < 0. 05) ； 口 服O-SCULI (5IU/kg B. W)組血清ALB水平(3. 42士0. 76g/dl)與非給藥陰性對(duì)照組也有顯 著差異(P <0.05) ；口服空白脂質(zhì)體組(3.09±0J6g/dl)與非給藥對(duì)照無(wú)差異。(4-4)血清球蛋白比A/G:正常大鼠血清白/球蛋白比A/G = 1. 19士0. 13 (n = 8)，各糖尿病組治療前A/ G <1.0。六周治療后，口服 O-SCULI (10u/kg B. W)組 1. 17士0.洸(η = 15)，注射胰島素 1.07士 1.0 (15)；兩給藥組比非給藥陰性對(duì)照組(0.98士0. 15 (n = 14)提高效果都明顯(P
<0.05)，但口服O-SCULI (10u/kg B. W)組A/G比已提高至正常比值，優(yōu)于注射胰島素組； 口服 O-SCULI (5IU/kg B. W)組也與之有顯著差異(1. 11 士 0.20 (η = 6) (P < 0. 05)。但空脂 質(zhì)體組(0. 99士0. 17 (n = 6)與非給藥陰性對(duì)照組無(wú)差異。(4-5)血清三甘油脂TG [圖7]正常大鼠血清三甘油脂TG = 63. 8士 19. 0mg/dl (η = 8)，糖尿病各組治療前組間 無(wú)差異 84. 3 士 39. 9mg/dl (η = 77)。六周給藥治療后，口服 O-SCULI (10u/kg B. W)組 TG 值 為59. 2士33. 3mg/dl (η = 21)；注射胰島素組為80. 9士34. 6mg/dl (η = 20)；兩給藥組比非 給藥陰性對(duì)照組(121. 1 士42. 9mg/dl (η = 19)和空白脂質(zhì)體組(109. 9士30. 4mg/dl (η = 6)的降低血清三甘油脂效果都明顯(？<0.05)，但口服0-5^1^(1011/1^ B. W)組已達(dá)正常 值(63. 8士 19. 0mg/dl) ；口服 0-SCULI (5IU/kg B. W)組也與之有顯著差異(92. 0士40. 2mg/ dl(n= 11)，雖比非給藥陰性對(duì)照有所降低，但仍高于正常值，差異明顯(P<0.05)?？瞻?脂質(zhì)體組仍明顯高于正常值(P < 0. 05)，但與非給藥對(duì)照無(wú)明顯差異。說(shuō)明口服O-SI⑶L 的降血清TG的作用不是由于脂質(zhì)體的磷脂成分，而主要是被包裹的胰島素進(jìn)入肝臟和血 循環(huán)的治療效果，明顯優(yōu)于注射胰島素組。
(4-6)血清高密度脂蛋白HDL-C 正常大鼠血清HDL-C正常值=32. 7士8.9mg/dl(n = 8)，糖尿病各組血清HDL-C 值無(wú)差異。六周給藥治療后，非給藥陰性對(duì)照組為27. 3士 10. 8(n= 19)；注射胰島素 組為 32. 3 士 9. 5 (n = 20) ； 口 月艮 OSCULI (10u/kg B. W)組為 34. 3 士 10. 2 (n = 21) ； 口 服 OSCULI (5IU/kg B. W)組31. 1 士 10。5 (n = 11)；空脂質(zhì)體組為沈.9士4. 6，與非給藥陰性對(duì) 照組無(wú)差異；3組給藥組都有提高血清HDL-C值的作用。(4-7)肝功能和體重[圖8]六周口服O-S⑶LI(10u/kg B. W)與注射胰島素具有相同水平降低糖尿病大鼠 HbAlc含量效果條件下，口服OSI⑶L除了上述改善脂代謝(血清TG降低)外，并使總膽固 醇、低密度脂蛋白膽固醇、血清磷脂、高密度脂蛋白磷脂含量維持正常，使糖尿病大鼠保持 健康體重的良好效果[附圖8]，相反，注射胰島素組引起過(guò)度肥胖；非給藥陰性對(duì)照組則使 體重下降，從而說(shuō)明口服O-SCULI新劑型具有治療II型糖尿病優(yōu)于注射胰島素的良好前景。(4-8)肝細(xì)胞顯微亞顯微結(jié)構(gòu)6周口服O-S⑶LI (10u/kg B. W)除了上述有效地改善糖尿病大鼠肝功能(下降血 清ALT，降低超氧自由基生成，升高肝細(xì)胞GSH-Px/MDA比值，提高血清ALB，和TP以及G/A 比)，還能使糖尿病大鼠受損傷的肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常，肝細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、滑面內(nèi) 質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核、線粒體、糖原顆粒等超微結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，顯示比注射胰島素更好的明顯 效果。本發(fā)明專利的O-S⑶LI上述結(jié)果再次證明，口服O-S⑶LI可以經(jīng)消化道進(jìn)入腸細(xì) 胞和肝贓后轉(zhuǎn)運(yùn)入血，能模擬生理狀態(tài)下胰島素分泌后首先進(jìn)入肝門靜脈的分配途徑，使 多量胰島素直接作用于肝臟，發(fā)揮肝臟調(diào)節(jié)糖、脂代謝等的主導(dǎo)作用，并且有效治療糖尿病 肝損害。因此，脂質(zhì)體胰島素口服給藥途徑優(yōu)越于外周注射胰島素。
權(quán)利要求
1.一種脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液，亦稱口服胰島素單室脂質(zhì)體懸液，即 O-S⑶Li，其特征在于含有下述特定組份及其在每1升O-S⑶LI 口服水懸液中的毫摩爾 (mmole)數(shù)卵磷脂，5-50;膽固醇，5-50 ；聚乙二醇脂肪酸酯(Poly-Ethylene Glycol Fatty Acid Esters), 5-50 ；維生素 E，0. 1-0. 5 ；胰島素，1-10 ；氯化鈉，1-20 ；磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉緩沖液，1-80 ；其中所述O-S⑶LI 口服水懸液也是包括脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑，即SCLI制劑，和 特定比例的能使SCLI制劑液化為O-S⑶LI 口服水懸液的定容分步液化溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液，即0-SCULI，其特征在 于，所述SCLI制劑的組份為卵磷脂、膽固醇、聚乙二醇脂肪酸酯、維生素E、生物胰島素和 水，所述SCLI制劑的組份配比為，其中卵磷脂、膽固醇、聚乙二醇脂肪酸酯三種脂質(zhì)組份之 間的摩爾(mole)比為1-10 1-10 1_10，維生素E和胰島素與該所述三種脂質(zhì)組份重 量和之比分別為0. 5-5%和5-50%，水和SCLI的重量比為0. 01-2. 5%0
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液，即0-SCULI，其特 征在于，所述定容分步液化溶液是由特定配比濃度為0.01-0. 3M氯化鈉溶液和濃度為 0. 01-0. IM中性PH磷酸鈉緩沖溶液所組成，所述該兩溶液之間的用量比為0. 1% -20%，用 于分別定容/分步液化技術(shù)將所述SCLI制劑制成O-S⑶LI 口服懸液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液，即O-S⑶Li，其特 征在于，所述卵磷脂，是指蛋黃卵磷脂，大豆卵磷脂，牛心卵磷脂或其它生物來(lái)源的卵磷脂 中一種或幾種，所述卵磷脂總量中含有的磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine)和磷脂酰乙 醇胺(phosphatidylethanylamine)的摩爾％比分別為50-90%和5-50%，所述卵磷脂也可 以是與上述生物卵磷脂含有相同比例的合成磷脂酰膽堿和合成磷脂酰乙醇胺組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液，即O-S⑶Li， 其特征在于，所述聚乙二醇脂肪酸酯(Poly-Ethylene Glycol Fatty Acid hters)，其 組分中的脂肪酸組分是二硬脂酸(Distearate)，二異硬脂酸(Diisostearate)、單硬脂酸 (Monostearate)的一種或幾種，其組分中的聚乙二醇組分(Poly-ethylene glycol, PEG), 是二聚衍生物(PEG-幻，四聚衍生物(PEG-4)、八聚衍生物(PEG-8)、十聚衍生物(PEG-10)或 四十聚衍生物(PEG-40)的一種或幾種；所述聚乙二醇脂肪酸酯可組成包圍磷脂脂質(zhì)體膜 雙分子外面保護(hù)層，能保護(hù)脂質(zhì)體在胃腸道內(nèi)的穩(wěn)定，也能在腸道內(nèi)中性PH條件下，被腸 液酯酶水解，使部分聚乙二醇脂肪酸酯被水解為一硬脂酸、二硬脂酸或異硬脂酸和聚乙二 醇，并相應(yīng)釋放出礦。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液，即O-S⑶Li，其特 征在于，所述O-S⑶LI 口服懸液中的胰島素是被包裹在SCLI制劑單室磷脂脂質(zhì)體內(nèi)，經(jīng)冰 刻蝕電子顯微鏡檢查，被包裹的胰島素多以二(聚)體和六(聚)體的形式排列在脂質(zhì)體內(nèi) 膜表面，顯示其生物大分子天然立體結(jié)構(gòu)的特性；經(jīng)PAGE-SDS凝膠電泳檢查，被包裹的胰島素與對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)胰島素相比具有完全相同的蛋白區(qū)帶分布，顯示其天然生物化學(xué)結(jié)構(gòu)的特 性；經(jīng)按藥典95版二部附錄XIIG檢定法進(jìn)行昆明小鼠生物測(cè)定，證明被包裹的胰島素與對(duì) 照標(biāo)準(zhǔn)胰島素具有完全相同對(duì)昆明小鼠的降血糖生物活性，按照生物檢定統(tǒng)計(jì)法中量反應(yīng) 平行線測(cè)定雙交叉設(shè)計(jì)法計(jì)算效價(jià)及實(shí)驗(yàn)誤差，結(jié)果證明回歸非常顯著，偏離平行不顯著， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立，從而說(shuō)明，經(jīng)本發(fā)明專利所述的包裹于脂質(zhì)體內(nèi)的胰島素，仍保留其完好的 天然降血糖生物活性。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液，即O-S⑶Li，其特 征在于，所述胰島素是生物來(lái)源經(jīng)人工純化的豬胰島素或牛胰島素，也可以是基因重組人 胰島素，或其各種長(zhǎng)效，中效或速效的藥用胰島素衍生物。
8.一種制備如權(quán)利要求1-7所述脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液，即O-S⑶LI的 方法，其特征在于，包含下列步驟(1)經(jīng)O-S⑶LI獨(dú)特的真空冷凍控制去水化/保濕工藝制成所述O-S⑶LI口服懸液中 含有的SCLI制劑單室磷脂脂質(zhì)體，所述單室磷脂脂質(zhì)體平均粒徑為1000納米，其胰島素包 裹率為80%以上。(2)用定容分步液化溶液對(duì)SCLI制劑進(jìn)行分別定容/分步液化，以制成O-SCULI口服懸液。
9.如權(quán)利要求8所述方法，其特征在于，所述步驟(1)包含如下各步驟(a)將權(quán)利要求2所述的SCLI制劑的組成配比，選用任何一種制備小單室脂質(zhì)體方法， 包括用有機(jī)溶劑完全溶解、減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、充份干燥和加水充份水化，最后制成卵磷脂濃度 為0. 01-0. 15摩爾(M)的小單室磷脂脂質(zhì)體及其平均粒徑為30-120納米的懸液A ；(b)將所述胰島素干粉，用重蒸去離子水制成胰島素水溶液為溶液B；(c)將上述方法步驟(a)和(b)制備的懸液A和溶液B，相互充分混合制成懸液A和溶 液B的小單室磷脂脂質(zhì)體懸液和胰島素溶液混合懸液C ；(d)所述混合懸液C經(jīng)定容分裝、充氮、真空冷凍控制去水化/保濕以制成大單室磷脂 脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑，即SCLI制劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述方法所述步驟(a)包括(al)，用精制氯仿或氯仿甲醇有機(jī)溶劑在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中完全溶解卵磷脂、膽固醇、聚 乙二醇脂肪酸酯，維生素E ；其在有機(jī)溶劑中相應(yīng)含量，mg/ml，分別為5-50、5-50、5-50、 0. 1-0. 5 ；(a2)，將上述完全溶解的有機(jī)溶劑，在其沸點(diǎn)溫度下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至有機(jī)溶劑完全回收；(a3)，將上述有機(jī)溶劑完全回收后的卵磷脂脂質(zhì)膜置于室溫下充份干燥，加重蒸去離 子水充份水化制成水化液，使卵磷脂脂質(zhì)濃度為0. 01-0. 15摩爾(M)；(a4)用超聲法或其它方法將上述卵磷脂脂質(zhì)水化液制成平均粒徑為30-120納米的小 單室磷脂脂質(zhì)體懸液為懸液A ； 所述步驟(b)包括(bl)胰島素干粉置于pH調(diào)到2. 0-2. 5的鹽酸水溶液中完全溶解，濃度為5-50mg/ml ； (b2)再用氫氧化鉀溶液將胰島素酸性溶液調(diào)回到pH為7. 2以制成溶液B，所述步驟 (c)包括(Cl)將上述(a4)步驟制成的懸液A與( )步驟制成的胰島素溶液B按兩者體積比例 為0. 5-5. 0 1. 0-10. 0相互混合制成小單室磷脂脂質(zhì)體懸液和胰島素溶液混合懸液C ； (c2)將上述混合懸液C進(jìn)行定容分裝；(c3)定容分裝后混合懸液C置于零下10-20°C下，經(jīng)M-48小時(shí)真空冷凍控制去水/ 保濕程序，使SCLI制劑中保濕水分逐步達(dá)標(biāo)到0. 01-2. 5 %，使其小單室脂質(zhì)體相互融合逐 步增大為大單室脂質(zhì)體； 所述步驟(d)包括(dl)將上述SCLI制劑進(jìn)行充N氣、壓蓋、密封后，零下10-20°C保存待用； (d2)在SCLI制劑保存的三年時(shí)期內(nèi)，對(duì)SCLI制劑脂質(zhì)體大單室膜結(jié)構(gòu)及胰島素包裹 率和胰島素活性進(jìn)行定期測(cè)定和檢查。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述方法，其特征在于，所述步驟( 包括下述步驟(a)所述定容分步液化溶液，是指氯化鈉溶液和中性pH磷酸緩沖液，所述分別定容/分 步液化，其第一步液化是用一定容量氯化鈉溶液對(duì)SCLI制劑進(jìn)行液化處理；(b)所述分別定容/分步液化，其第二步液化是再加入一定容量的中性pH磷酸緩沖液 對(duì)SCLI制劑進(jìn)行液化稀釋，最終使SCLI制劑完全制成O-S⑶LI 口服懸液；(c)對(duì)SCLI制劑進(jìn)行第二步液化后制成的O-S⑶LI口服懸液進(jìn)行脂質(zhì)體胰島素包裹率 測(cè)定，以計(jì)算單位體積口服懸液?jiǎn)问抑|(zhì)體胰島素包裹量作為口服用量參照。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述方法，其特征在于，所述步驟(a)包括(al)所述先用一定量氯化鈉溶液對(duì)SCLI制劑進(jìn)行第一步液化，是指加入的氯化鈉溶 液容量與用中性PH磷酸鈉緩沖溶液第二步液化的容量的比為0. 1% -20% ； 所述步驟(b)包括(bl)所述再加入一定容量的中性pH磷酸緩沖液對(duì)SCLI制劑進(jìn)行第二步液化，是指所 加中性PH磷酸鈉緩沖溶液容量為兩步液化所用溶液總?cè)萘康?0-99. 9% ；(b2)所述SCLI制劑總重量與被所述定容分步液化兩步液化溶液的總?cè)萘勘葹?5-80mg/ml ；(b3)所述SCLI制劑中胰島素總重量與被所述定容分步液化溶液兩步液化的總?cè)萘勘?為 2-20mg/ml ；(b4)所述SCLI制劑中胰島素總重量與(b!3)步驟所述定容分步液化溶液兩步液化的總 容量比，亦即與O-S⑶LI 口服懸液的總?cè)萘勘葹?-20mg/ml ； 所述步驟(c)包括(cl)所述對(duì)O-S⑶LI 口服懸液進(jìn)行脂質(zhì)體胰島素包裹率測(cè)定，即將4毫升最終制成的 O-S⑶LI 口服懸液進(jìn)行35000rpm超速離心60分鐘，使包裹胰島素脂質(zhì)體完全沉淀與離心上 清液完全分開；(c2)再取出一定量離心上清溶液，平行三份，各加等量水和3毫升考馬斯亮蘭溶液，室 溫下測(cè)定595nm的OD值，計(jì)算脂質(zhì)體胰島素平均包裹率和平均精確度；(c3)同時(shí)再取出一定量離心上清溶液和沉淀脂質(zhì)體的甲醇溶液，各平行三份，用紫外 分析法分別讀取278nm的OD值和279nm的OD值，即A278 (代表不含脂質(zhì)體的離心上清溶 液)和A279 (代表沉淀脂質(zhì)體)，按A279/A279+A278 X 100 %來(lái)計(jì)算脂質(zhì)體胰島素平均包裹 率及其平均精確度，與步驟(^)進(jìn)行對(duì)比，根據(jù)本發(fā)明專利所述步驟(^)和步驟(c3)的脂質(zhì)體胰島素平均包裹率都在80%以上，其平均精確度都在96-103%，兩種方法結(jié)果完全 吻合和一致；(c4)，按上述步驟(U)和步驟(c!3)的脂質(zhì)體胰島素平均包裹率，根據(jù)每單位體積的 O-SCULI 口服懸液的脂質(zhì)體包裹的胰島素平均總量的IU數(shù)，來(lái)計(jì)算和標(biāo)定口服用量。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-7所述脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液，即O-S⑶Li，其特 征在于該O-SCULI 口服懸液，經(jīng)過(guò)對(duì)本發(fā)明專利設(shè)計(jì)建立的具有多項(xiàng)糖尿病病癥的糖尿 病大鼠進(jìn)行急性口服實(shí)驗(yàn)，證明同時(shí)具有降血糖(Hypoglycemic effect)，降游離脂肪酸 (free fatty acids)和降血酮體(blood Ketone body)的明顯效果，與注射胰島素對(duì)照的 降血糖相比，相對(duì)藥理生物等效性最高達(dá)22. 2%，具量效關(guān)系，其降低血游離脂肪酸效果明 顯優(yōu)于注射胰島素，降低血酮體效果比注射胰島素更為明顯和持久；該O-S⑶LI 口服懸液， 經(jīng)對(duì)本發(fā)明專利設(shè)計(jì)建立的具多項(xiàng)糖尿病病癥的糖尿病大鼠連續(xù)六周長(zhǎng)期口服實(shí)驗(yàn)，其綜 合治療效果有降低血糖化血紅蛋白(HbAlc)，降低甘油三脂(TG)和轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，降低氧 自由基生成(R0Q和氧化應(yīng)激(Oxidative Mress)，降低MDA，提高清蛋白(Alb)合成和清 /球蛋白比(A/G)，提高6SH-I^活性和GSH-Px/MDA比值；明顯恢復(fù)肝臟細(xì)胞和肝線粒體的 顯微和亞顯微結(jié)構(gòu)，維持健康體重，避免長(zhǎng)期注射胰島素引起的肥胖，其中多項(xiàng)指標(biāo)的改善 顯著優(yōu)于胰島素注射外周給藥。
14.根據(jù)權(quán)利要求8-12之一所述制備脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液，即 O-SCULI的方法，同樣能夠應(yīng)用于包裹胰島素以外的其它生物活性多肽和蛋白，包括細(xì)胞色 素C，干擾素，清蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑口服懸液，稱O-SCULI，含有卵磷脂、膽固醇、聚乙二醇脂肪酸酯、維生素E、胰島素、水、氯化鈉和磷酸緩沖液。本發(fā)明還提供制備O-SCULI兩步工藝1.控制去水/保濕工藝制備脂質(zhì)體包裹胰島素凍干制劑，SCLI，使脂質(zhì)體融合增大胰島素包裹率達(dá)80％；2.分別定容/分步液化工藝將SCLI制成O-SCULI口服懸液，保持SCLI脂質(zhì)體不泄漏和胰島素包裹率不變。本發(fā)明通過(guò)急性口服O-SCULI，使脂質(zhì)體胰島素有效進(jìn)入腸-肝門靜脈和肝臟及血循環(huán)，能高利用度地降血糖、降血脂肪酸和血酮體；六周連續(xù)口服降血糖化血紅蛋白、甘油三脂、轉(zhuǎn)氨酶、氧應(yīng)激及恢復(fù)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷、提高肝功能多指標(biāo)治療糖尿病的綜合療效。本發(fā)明也為活性多肽蛋白如細(xì)胞色素C、清蛋白和干擾素等非注射給藥開辟新途徑。
文檔編號(hào)A61P3/10GK102144968SQ20101918501
公開日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2010年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月8日
發(fā)明者劉樹森 申請(qǐng)人:劉樹森