專利名稱：基于人tlr9受體功能區(qū)片段lrr11的新型多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型多肽及其應(yīng)用，具體地說，涉及一種基于人TLR9受體功能區(qū) 片段LRRll及基于LRRll的新型多肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
炎癥是由大量炎性細胞產(chǎn)生的介質(zhì)參與的復(fù)雜現(xiàn)象，其中值得注意的是細胞因 子的作用。細胞因子是由機體的免疫細胞及非免疫細胞合成和分泌的小分子多肽類因 子，它既是機體應(yīng)激反應(yīng)的需要，又是應(yīng)激組織損傷發(fā)生和發(fā)展的病理基礎(chǔ)。由單核/ 吞噬細胞分泌的細胞因子包括腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、白細胞介 素(interleukin，IL)等，廣泛參與多種炎癥反應(yīng)過程，如細菌性感染因素引起的膿毒癥 (Sepsis)和自身免疫缺陷引起的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)。膿毒癥(s印sis)是由感染因素引起的全身炎癥反應(yīng)綜合癥(Systemic inflammatory response sydrome，SIRS)，病死率高達50%-60%，至今尚無有效治療藥物。 大量研究表明，細菌菌體上或菌體內(nèi)的病原分子通過被機體免疫細胞，尤其是單核/吞噬 細胞系統(tǒng)相關(guān)模式識別受體識別，激活單核/吞噬細胞系統(tǒng)大量釋放TNF- α、IL-I、IL_6和 IL-12等多種炎性細胞因子，導(dǎo)致膿毒癥的發(fā)生。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種常見的以關(guān)節(jié)病變?yōu)橹髯陨?免疫性疾病，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛腫脹、功能下降，致殘率高達40%以上。RA的發(fā)病機制與 多種因素有關(guān)，細菌或病毒的感染可能是誘發(fā)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的首要因素，機體免疫機制尤 其是細胞免疫在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制起著突出作用，在炎癥部位的關(guān)節(jié)積液和滑膜組 織中，可檢測到大量T淋巴細胞和單核/吞噬細胞產(chǎn)生的多種細胞因子，如TNF-α、IL-I、 IL-2、IL-4、IL-5IL-6、IL-8、IFN等。大量研究表明，TNF-α是RA免疫反應(yīng)及病理過程中的 關(guān)鍵因子。RA病人TNF-α水平明顯高于正常對照，與疾病的活動期呈正相關(guān)，同時TNF-α 水平也可在病變關(guān)節(jié)滑膜液中升高。體外實驗證明TNF-α在免疫級聯(lián)反應(yīng)中通過促進 IL-I和其他細胞因子分泌，以及刺激免疫細胞活化，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)的破壞。綜上所述，膿毒癥和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制中TNF-α等炎性細胞因子發(fā)揮了重 要作用，因此尋找能夠特異抑制TNF-α等釋放的藥物，對于防治膿毒癥和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具 有重要意義。細菌菌體上或菌體內(nèi)的病原分子主要包括內(nèi)毒素(lipopolysacchride，LPS)、肽 聚糖(ρ印tidoglycan，PG)、細菌DNA(CpG DNA)等，識別LPS、PG、CpG DNA等病原分子的模 式識別受體是Toll樣受體(Toll-like rec印tors，TLRs)。目前認為，CpG DNA在革蘭陽性 菌或革蘭陰性菌所引起的感染和炎癥反應(yīng)中均起著重要作用，而TLR9是CpG DNA的模式識 別受體。TLR9為I型跨膜受體，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成，胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域有25個富含 亮氨酸的重復(fù)序列(leucine-rich repeats, LRRs)，與識別CpG DNA有關(guān)，目前發(fā)現(xiàn)，其中 最有可能的與CpG DNA結(jié)合有關(guān)的關(guān)鍵位點的是LRR2、LRR5、LRR8和LRRl 1。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于人TLR9受體功能區(qū)片段LRRll及基于LRRll的 新型多肽(LRMs)，其具有抑制CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬細胞釋放TNF-α的作用，可以降 低CpG DNA攻擊小鼠的血清TNF- α濃度，提高被攻擊小鼠生存率。本發(fā)明提供的基于人TLR9受體功能區(qū)片段LRRll及基于LRRll的新型多肽 (LRMs)，其具有抑制TNF-α等細胞因子釋放的作用，可以緩解RA模型大鼠關(guān)節(jié)病變癥狀， 提高大鼠生存質(zhì)量。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供的基于人TLR9受體功能區(qū)片段LRRll及基于 LRRl 1的新型突變多肽(LRMs)，具有LRRl 1及SEQ ID NO 1-10所示氨基酸序列中的至少一
種
QLRKLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLVLRRll
QLSKLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLVLRM1
QLRNLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLVLRM2
QLRKLNLSFNYQNRVSFAHLSLAPSFGSLVLRM3
QLRKLNLSFNYQKSVSFAHLSLAPSFGSLVLRM4
QLRKLNLSFNYQKRVSFAQLSLAPSFGSLVLRM5
QLDKLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLVLRM6
QLRELNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLVLRM7
QLRKLNLSFNYQERVSFAHLSLAPSFGSLVLRM8
QLRKLNLSFNYQKDVSFAHLSLAPSFGSLVLRM9
QLRKLNLSFNYQKRVSFADLSLAPSFGSLVLRM10
本發(fā)明所述的基于人TLR9受體功能區(qū)片段LRRll及基于LRRll的新型突變多肽
(LRMs)具有抑制CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬細胞釋放TNF- α的作用，可以降低CpG DNA攻 擊小鼠的血清TNF-α濃度，提高被攻擊小鼠生存率，其可用于制備防治細菌膿毒癥藥物。 所述藥物優(yōu)選為注射劑。本發(fā)明所述的一種基于人TLR9受體功能區(qū)片段LRRll及基于LRRll的新型突變 多肽(LRMs)還具有緩解類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)病變癥狀的作用，其可用于制備防治類風(fēng) 濕關(guān)節(jié)炎藥物。所述藥物優(yōu)選為注射劑，所述注射劑可以經(jīng)肌肉、靜脈、皮下注射或關(guān)節(jié)腔 內(nèi)局部注射給藥。為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例， 并配合附圖，作詳細說明如下。


圖1表示LRR多肽(200 μ M)與CpG DNA2006的結(jié)合能力測定；圖 2 表示 LRR 多肽(0. 15 μ Μ、0· 45 μ MU. 5 μ Μ)對 CpG DNA (1. 5 μ Μ)刺激小鼠腹 腔巨噬細胞釋放TNF- α的影響，*ρ < 0. 05，**ρ < 0. OlvsCpG DNA組。
具體實施例方式下面實施例為進一步描述本發(fā)明，但所述實施例僅用于說明本發(fā)明而不是限制本
4發(fā)明。為了獲得基于人TLR9受體功能區(qū)片段LRRll及基于LRRll的新型突變多肽 (LRMs)，發(fā)明人從人TLR9受體功能區(qū)的結(jié)構(gòu)入手進行。人TLR9受體為I型跨膜受體，由1032個氨基酸殘基組成，分為胞外區(qū)(aa 1 818)、跨膜區(qū)(aa 819 839)和胞內(nèi)區(qū)(aa 840 1032)。其中，胞外區(qū)由信號肽(aa 1 25)和25個富含亮氨酸的重復(fù)序列(leucine-rich repeats, LRRs, aa 26 818)組成，與 識別、結(jié)合配體有關(guān)；胞內(nèi)區(qū)則含有TIR同源區(qū)(Toll/IL-lrec印tor domain, TIR)，TIR能 夠招募銜接蛋白MyD88及其它含有TIR結(jié)構(gòu)域的銜接蛋白，激活MyD88依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通 路，最終活化核轉(zhuǎn)錄因子NF κ B和AP-I，導(dǎo)致細胞因子的大量釋放，這也是膿毒癥產(chǎn)生的分 子機制。對人TLR9受體一級結(jié)構(gòu)的分析表明，TLR9胞外段含有25個LRRs ；空間構(gòu)象分析 表明TLR9胞外段25個LRRs形成一個馬蹄形彎曲的螺線管結(jié)構(gòu)，內(nèi)徑約5nm，外徑約8nm， 形成較大的空間。其中LRR2、LRR5、LRR8、LRRll后跟隨的氨基酸序列在TLR9胞外段馬蹄 形凹面形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，推測可能與TLR9結(jié)合CpG DNA有關(guān)。理論上說，如果有藥物可以干 擾CpG DNA與TLR9結(jié)合位點的結(jié)合，將能夠抑制CpG DNA介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制炎癥因子 釋放，治療細菌膿毒癥。發(fā)明人合成了 LRR2、LRR5、LRR8、LRRll的多肽，利用生物傳感器技術(shù)分別與CpG DNA 2006(5' -TCG TCG TTA AGT CGT TAAGTC GTT-3‘)進行了親和力測定，結(jié)果顯示 LRRll與CpG DNA結(jié)合能力最高，親和峰值達4000arc second(角秒或者弧度/秒)，Kd值 為 13. 2 μ M ；LRR2、LRR5 與 CpG DNA 親合力相對較低，約在 500arc second ；LRR8 與 CpG DNA 幾無結(jié)合能力。我們初步認為LRRll最有可能是CpG DNA的結(jié)合位點，并進行了一系列功 能實驗。首先，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)LRRll多肽量效依賴性抑制CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬細胞釋 放TNF-α。LRRll多肽與CpG DNA (1. 5 μ Μ)按摩爾濃度比分別為0. 1 1,0. 3 1和1 1 混合后，在摩爾比為0. 1 1時，LRRll多肽(0. 15 μ Μ)對CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬細胞 釋放TNF-α無抑制作用；在摩爾比為0. 3 1和1 1時，LRRll多肽對CpG DNA刺激小 鼠腹腔巨噬細胞釋放TNF-α有顯著抑制作用，并且具有明顯的量效依賴性。在體外實驗的基礎(chǔ)上，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)LRRll多肽可降低CpG DNA攻擊小鼠動物死亡 率，并降低血清TNF-α水平。小鼠先腹腔注射D-氨基半乳糖溶液(600mg/kg)進行敏化， Ih后取出小鼠，先尾靜脈注射CpG DNA(4mg/kg)，然后立即尾靜脈注射LRRll (3mg/kg)，于 尾靜脈注射4h后小鼠眼眶靜脈叢取血，測定TNF-α釋放水平。生存率實驗為給藥完畢后給 予正常飲食和飲水，觀察3天內(nèi)小鼠一般情況及死亡率。結(jié)果顯示，LRRll可明顯降低CpG DNA攻擊小鼠動物死亡率，并可明顯降低血清TNF- α水平。發(fā)明人進一步發(fā)現(xiàn)LRRll多肽可降低熱滅活大腸桿菌(含有天然CpG DNA)攻擊小 鼠動物死亡率，并降低血清TNF-α水平。先尾靜脈注射熱滅活大腸桿菌，然后立即尾靜脈 注射LRR11，于尾靜脈注射4h后小鼠眼眶靜脈叢取血，測定TNF-α釋放水平。生存率實驗 為給藥完畢后給予正常飲食和飲水，觀察3天內(nèi)小鼠一般情況及死亡率。結(jié)果顯示，LRRll 可明顯降低熱滅活大腸桿菌攻擊小鼠動物死亡率，并可一定程度降低血清TNF-α水平。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)LRRll多肽可明顯減輕II型膠原皮內(nèi)注射誘導(dǎo)形成的RA模型大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度，對RA模型大鼠具有一定的保護作用。在上述工作基礎(chǔ)上，發(fā)明人擬采用生物信息學(xué)技術(shù)和定點突變技術(shù)對LRRll多肽 進行結(jié)構(gòu)改造，以獲得作用更強的LRRll新型多肽。結(jié)合國內(nèi)外文獻和生物信息學(xué)分析，發(fā)明人推測LRRll多肽序列中含有的5個堿 性氨基酸最可能與TLR9結(jié)合CpG DNA結(jié)構(gòu)域功能相關(guān)。將其中一個位點突變后并人工合 成了突變多肽LRM1 (多肽序列為QLSKLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV)，功能實驗表明LRM1 具有較LRRll更強的抑制CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬細胞釋放TNF-α的作用，體內(nèi)實驗結(jié) 果也表明LRmi較LRRll對CpG DNA攻擊小鼠的保護作用更強。該結(jié)果初步證實了研究人員 的推測，即上述幾個堿性氨基酸位點與其功能密切相關(guān)。篩選基于上述幾個堿性氨基酸位 點的一系列LRRll突變體(LRMs)，可以獲得具有抑制CpGDNA刺激小鼠腹腔巨噬細胞釋放 TNF-α作用的新型多肽序列。發(fā)明人經(jīng)過篩選，獲得了 LRRll及10條基于人TLR9受體功能區(qū)片段的新型多肽 (LRMs)，其氨基酸序列如下QLRKLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV ；
QLSKLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV ；
QLRNLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV ；
QLRKLNLSFNYQNRVSFAHLSLAPSFGSLV ；
QLRKLNLSFNYQKSVSFAHLSLAPSFGSLV ；
QLRKLNLSFNYQKRVSFAQLSLAPSFGSLV ；
QLDKLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV ；
QLRELNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV ；
QLRKLNLSFNYQERVSFAHLSLAPSFGSLV ；
QLRKLNLSFNYQKDVSFAHLSLAPSFGSLV ；
QLRKLNLSFNYQKRVSFADLSLAPSFGSLV。
本發(fā)明所述的基于人TLR9受體功能區(qū)片段的新型多肽可采用本領(lǐng)域常規(guī)方法合
成，比如固相Fmoc法(具體請參照實施例2)。實施例1通過生物信息學(xué)技術(shù)和基因定點突變技術(shù)，獲取基于人TLR9受體功能區(qū) 片段的新型多肽基因序列及其編碼的氨基酸序列1、從 Genbank 數(shù)據(jù)庫中獲取人 TLR9 受體(Toll-like receptor 9，簡稱 TLR9)基 因序列(Genbank Accession Number :NM 017442)。2、采用生物信息學(xué)技術(shù)結(jié)合文獻分析，從人TLR9受體胞外段中獲得4條LRR序列 (leucine-rich repeats)，分別為 LRR2 (SLRHLNLKWNCPPVGLSPMHFPCHMTIEPSTFLAVP)、LRR5 (ALRFLFMDGNCYYKNPCRQALEVAPGALLGLG)、LRR8 (ALRVLDVGGNCRRCDHAPNPCMECPRHFPQLHPDTFS HLS)、LRRll (QLRKLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV)，這 4 條 LRR 序列后跟隨的氨基酸序列在 TLR9胞外段馬蹄形凹面形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，推測可能與TLR9結(jié)合CpG DNA有關(guān)。3、人工合成了 LRR2、LRR5、LRR8、LRRll多肽。生物傳感器的生物素樣品池上CpG DNA 2006(5' -TCG TCG TTA AGT CGT TAAGTC GTT-3‘)的包被按照 Thermo 公司樣品池 包被流程進行。應(yīng)用生物傳感器技術(shù)檢測LRR2、LRR5、LRR8、LRRll多肽與CpG DNA的結(jié) 合能力。結(jié)果顯示LRRll與CpG DNA結(jié)合能力最高，親和峰值達4000arc second，Kd值為13. 2 μ M ；LRR2、LRR5 與 CpG DNA 親合力相對較低，約在 500arc second ；LRR8 與 CpG DNA 幾 無結(jié)合能力(圖1)。4、采用小鼠腫瘤壞死因子α (TNF-a)ELISA檢測試劑盒ELISA法測定LRR2、LRR5、 LRR8、LRRll多肽對CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬細胞釋放TNF-α的影響。LRR多肽與CpG DNA (1. 5 μ M)按摩爾濃度比分別為0. 1 1,0. 3 1和1 1混合后，在摩爾比為0. 1 1 時，LRR多肽(0. 15 μ Μ)對CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬細胞釋放TNF-α無抑制作用(ρ > 0.05)；在摩爾比為0.3 1和1 1時，LRR2多肽對CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬細胞釋放 TNF- α有顯著抑制作用(ρ < 0. 05)，LRRll多肽抑制作用更為顯著(ρ < 0. 01)，而LRR5、 LRR8多肽則無抑制作用。結(jié)果說明LRR5和LRR8多肽在各個濃度對CpGDNA刺激小鼠腹腔 巨噬細胞釋放TNF-α均無抑制作用，LRR2和LRRll多肽均能顯著抑制CpG DNA刺激小鼠 腹腔巨噬細胞釋放TNF- α，呈量效關(guān)系(圖2)。5、采用CpG DNA攻擊小鼠模型觀察LRRll多肽對小鼠的保護作用。小鼠先腹腔注 射D-氨基半乳糖溶液(600mg/kg)進行敏化，Ih后取出小鼠，先尾靜脈注射CpG DNA(4mg/ kg))，然后立即尾靜脈注射LRRl 1 (3mg/kg)，對照組給予無菌生理鹽水(NS)，于尾靜脈注射 4h后小鼠眼眶靜脈叢取血，4000rpm離心5min，取上清_20°C保存，待測TNF- α釋放水平。 生存率實驗為給藥完畢后給予正常飲食和飲水，觀察3天內(nèi)小鼠一般情況及死亡率。結(jié)果 顯示，LRRll可明顯降低CpG DNA攻擊小鼠動物死亡率(表1)，并可明顯降低血清TNF- a 水平(表2)。表1. LRRl 1對CpG DNA攻擊小鼠的保護作用 6、采用熱滅活大腸桿菌攻擊小鼠模型觀察LRRll多肽對小鼠的保護作用。先尾靜 脈注射熱滅活大腸桿菌，然后立即尾靜脈注射LRR11，對照組給予無菌生理鹽水(NS)，于尾 靜脈注射4h后小鼠眼眶靜脈叢取血，4000rpm離心5分鐘，取上清_20°C保存，待測TNF- a 釋放水平。生存率實驗為給藥完畢后給予正常飲食和飲水，觀察3天內(nèi)小鼠一般情況及死 亡率。結(jié)果顯示，LRRll可明顯降低熱滅活大腸桿菌攻擊小鼠動物死亡率(表3)，并可一定 程度降低血清TNF- α水平(表4)。
表3. LRRll對熱滅活大腸桿菌攻擊小鼠的保護作用
表4. LRRll可降低熱滅活大腸桿菌攻擊小鼠血清TNF-α水平 7、采用II型膠原皮內(nèi)注射誘導(dǎo)大鼠RA模型，觀察LRRll多肽對RA模型大鼠的保 護作用。將乳化的II型膠原以7ml/kg的劑量在大鼠的背部或尾根部進行多點皮內(nèi)注射， 一周后加強免疫一次，誘導(dǎo)RA模型形成。選取腫脹度大于50%的大鼠，隨機分組后于大鼠 右后踝關(guān)節(jié)滑囊局部注射LRRll多肽，對照組給予注射用生理鹽水(NS)。用游標卡尺測量 大鼠右后踝關(guān)節(jié)前后徑與左右徑之和，從而分別計算腫脹度。結(jié)果顯示，LRRll多肽治療組 大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度較對照組明顯減輕(表5)。上述治療效果不僅在LRRll關(guān)節(jié)腔注射中 被觀察到，在LRRll經(jīng)肌肉注射(im)、靜脈注射(iv)或皮下注射(ihyp)等全身給藥方式中 也可觀察到類似治療效果(表6)。表5. LRRll關(guān)節(jié)囊局部給藥對II型膠原誘導(dǎo)的RA模型大鼠的保護作用 表6. LRRll全身給藥對II型膠原誘導(dǎo)的RA模型大鼠的保護作用
8 8、采用生物信息學(xué)技術(shù)分析，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)LRRll中含有5個堿性氨基酸位點，分別 為3-R、4-K、13-K、14-R及19-H，這5個位點很可能是LRRll關(guān)鍵功能位點。對上述位點進 行單位點突變和多位點組合突變，設(shè)計獲得LRRll及10條基于LRRll的新型多肽(LRMs)。
序列如下
QLRKLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLVLRRll
QLSKLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLVLRM1
QLRNLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLVLRM2
QLRKLNLSFNYQNRVSFAHLSLAPSFGSLVLRM3
QLRKLNLSFNYQKSVSFAHLSLAPSFGSLVLRM4
QLRKLNLSFNYQKRVSFAQLSLAPSFGSLVLRM5
QLDKLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLVLRM6
QLRELNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLVLRM7
QLRKLNLSFNYQERVSFAHLSLAPSFGSLVLRM8
QLRKLNLSFNYQKDVSFAHLSLAPSFGSLVLRM9
QLRKLNLSFNYQKRVSFADLSLAPSFGSLVLRM10
實施例2新型多肽的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明所述的方法采用固相Fmoc法，簡單地說，是固相支持物上被Fmoc (9-芴甲氧羰基)保護的單體氨基酸去保護后暴露出氨基，通過縮合反應(yīng)與溶液中氨基酉髮的羧基形
成肽鍵，從而將后者連接到固相支持物上，使肽鏈從C-端向N-端延伸。1、基本材料(1)固相支持物與連接分子固相FMOC法通常選擇的支持物為羧基樹脂如王氏樹 脂。載體樹脂的溶脹狀況對縮合試劑及羧基組分的自由擴散，對肽鏈之間的聚集等與縮合 反應(yīng)有關(guān)的因素有明顯影響。采用 2%交聯(lián)度的王氏樹脂，可以使載體有較好的溶脹 性，且有較大的網(wǎng)絡(luò)空間足以容納不斷增長的肽鏈，而且利于反應(yīng)物在載體中擴散。羧基樹 脂通常采用二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)或羧基二咪唑作為連接分子，使反應(yīng)溶液中被保護的 氨基酸與其形成共價鍵，從而固定到樹脂上。(2)單體合成所用單體為經(jīng)化學(xué)修飾的α -氨基酸，含下面幾個功能基團。①α-氨基上9-芴甲氧羰基(Fmoc)，保護基，縮合前脫去。②羧基上酯基，保護基，縮合前脫去。③精氨酸側(cè)鏈上金剛烷氧羰基(Adoc)，保護基，肽鏈裂解時脫去。
④組氨酸咪唑環(huán)上2，2，2-三氟-1-芐氧羰基，保護基，肽鏈裂解時脫去。2、反應(yīng)步驟合成的第一步，將第一個氨基酸共價連接到固相支持物上。加入適當?shù)目s合劑如 DCC或羧基二咪唑，使被保護氨基酸的羧基端與樹脂形成共酯以完成氨基酸的固定。合成的第二步，去保護。采用堿性溶劑如哌啶-CH2Cl2或哌啶-DMF去除氨基上的 Fmoc,暴露出氨基。合成的第三步，激活和交聯(lián)。采用活化劑DCC暴露出下一個氨基酸的羧基，活化的 單體與固相支持物上游離的氨基反應(yīng)交聯(lián)，形成肽鍵。重復(fù)第二步和第三步，反復(fù)循環(huán)添加單體氨基酸，直到合成完成。3、合成后處理(1)洗脫和脫保護用脫保護劑三氟乙酸(TFA)將肽鏈從固相支持物上洗脫下來， 并脫除保護基。(2)粗品的HPLC分析采用HPLC法分析粗品純度，分析柱粒徑3_10 μ m,在幾分鐘 內(nèi)即可分析粗品純度。(3)純化反相HPLC法純化粗品。多肽通過疏水作用連到柱填料上，漸次降低離 子強度進行洗脫。(4)定量采用紫外分光光度法測定多肽紫外吸收來定量。(5)凍干洗脫下來的多肽用冷凍干燥機進行凍干處理，可延長保存時間。(6)儲存凍干的多肽可以在-70°C條件下可以保存一年以上。需要注意的是避免 紫外線等劇烈的物理環(huán)境，避免反復(fù)凍融。實施例310條LRMs新型多肽抑制CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬細胞釋放細胞因子 的活性鑒定分離并培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細胞，調(diào)整細胞懸液濃度為lX106/ml，加入48孔板內(nèi)， 每孔400 μ 1，置37°C CO2孵箱培養(yǎng)6h。預(yù)先將LRMs多肽與CpG DNA按照1 1比例混合， 加入培養(yǎng)孔內(nèi)(CpG DNA終濃度1. 5 μ M)，在37°C CO2孵箱培養(yǎng)4h。取培養(yǎng)上清，采用小鼠 腫瘤壞死因子α (TNF-α) ELISA檢測試劑盒ELISA法測定細胞培養(yǎng)上清終TNF-α的濃度， 明確上述10條LRMs多肽抑制CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬細胞釋放細胞因子的能力。此次 實驗結(jié)果表明上述10條LRMs多肽均有不同程度抑制CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬細胞釋放 細胞因子的能力(見下表7)。表7. LRMs對CpG DNA誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細胞釋放TNF- α的影響 *p < 0. 05，**p < 0. 01 vs CpG DNA實施例410條LRMs新型多肽對CpG DNA攻擊膿毒癥模型小鼠的保護作用清潔級昆明種小白鼠120只(第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供)，體重20士0.5g/ 只，雌雄各半，隨即分為對照組、CpG DNA攻擊組、LRM^CpG DNA組、LRM2+CpG DNA組、 LRM3+CpG DNA 組、LRM4+CpG DNA 組、LRM5+CpG DNA 組、LRM6+CpG DNA 組、LRM7 組+CpG DNA 組、 LRM8組+CpG DNA組、LRM9組+CpG DNA組、LRMltl組+CpG DNA組。小鼠先腹腔注射D-氨基 半乳糖溶液(600mg/kg)進行敏化，Ih后取出小鼠，先尾靜脈注射CpG DNA(4mg/kg)，對照組 給與注射用生理鹽水，其余組尾靜脈注射LRMs新型多肽(3mg/kg)，于尾靜脈注射4h后小 鼠眼眶靜脈叢取血，4000rpm離心5min，取上清-20°C保存，待測血清TNF- α水平。生存率 實驗為給藥完畢后給予正常飲食和飲水，觀察3天內(nèi)小鼠一般情況及死亡率。結(jié)果顯示，10 條LRMs新型多肽可不同程度地降低CpG DNA攻擊小鼠動物死亡率(表8)，并可明顯降低血 清TNF-a水平(表9)，其中以!^!^和！^冊^呆護作用最強。上述治療效果不僅在靜脈注射 中，而且在經(jīng)肌肉注射或皮下注射中也被觀察到。表8. LRMs對CpG DNA攻擊小鼠的保護作用 表9. LRMs可降低CpG DNA攻擊小鼠血清TNF-(I水平 **p < 0. 01 vs CpG DNA實施例510條LRMs新型多肽對CpG DNA誘導(dǎo)的大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜細胞釋放細胞因 子的影響無菌取出大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜組織，剪成1 2mm3大小，貼壁法培養(yǎng)。每隔1 2d換培養(yǎng)液1次，待滑膜成纖維細胞長出組織塊較多后，棄除組織塊，待細胞長滿后，用胰 酶消化細胞傳代培養(yǎng)2次后進行實驗。調(diào)整細胞懸液濃度為lX106/ml，加入48孔板內(nèi)，每孔400μ 1，置37°C CO2孵箱培 養(yǎng)6h。預(yù)先將LRMs多肽與CpG DNA按照1 1比例混合，加入培養(yǎng)孔內(nèi)(CpG DNA終濃度 1.511|1)，在3710)2孵箱培養(yǎng)411。取培養(yǎng)上清，采用小鼠腫瘤壞死因子a (TNF-a)ELISA 檢測試劑盒ELISA法測定細胞培養(yǎng)上清終TNF-α的濃度，明確上述10條LRMs多肽抑制CpGDNA刺激大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜細胞釋放細胞因子的能力。此次實驗結(jié)果表明上述10條LRMs多 肽均可明顯抑制CpG DNA刺激大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜細胞釋放細胞因子的能力(見下表10)。表10. LRMs對CpG DNA誘導(dǎo)大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜細胞釋放TNF- α的影響 *p < 0. 05，**p < 0. 01 vs CpG DNA實施例610條LRMs新型多肽對II型膠原誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠的保護作 用清潔級近交系wistar大白鼠(第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供)，體重 150士 10g，雌性。首先建立II型膠原誘導(dǎo)的RA大鼠模型將乳化的II型膠原以7ml/kg的 劑量在大鼠的背部或尾根部進行多點皮內(nèi)注射，一周后加強免疫一次，同樣在背部或尾根 部多點皮內(nèi)注射乳化的Π型膠原，劑量為3ml/kg。用游標卡尺測量大鼠右后踝關(guān)節(jié)前后徑 與左右徑之和，從而分別計算腫脹度，計算公式為(發(fā)病后所測值_發(fā)病前所測值)/發(fā)病 前所測值X 100%。選取55只腫脹度大于50%的大鼠，隨機分為對照組和LRM1-LRMltl治 療組，每組5只。LRM1 LRMltl治療組分別于大鼠右后踝關(guān)節(jié)滑囊局部注射LRM1 LRMltl多 肽(3mg/kg)，對照組給予注射用生理鹽水，給藥后每8h加強注射一次，劑量與第一次給藥 相同。給藥3天后用游標卡尺測量大鼠右后踝關(guān)節(jié)前后徑與左右徑之和，計算保護率(消 腫度)，計算公式為(給藥前所測值_給藥后所測值)/給藥前所測值X 100 %。結(jié)果顯 示，LRM1 LRMltl多肽治療組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度較對照組均有一定程度減輕，其中以LRMn LRM2,LRM6和LRM7治療效果較強。上述結(jié)果提示，LRM1 LRMltl多肽對RA模型大鼠具有治療 作用，可減輕其關(guān)節(jié)腫脹程度，提高實驗動物生存質(zhì)量(表11)。上述治療效果不僅在LRMs 關(guān)節(jié)腔注射中被觀察到，在LRMs經(jīng)肌肉注射、靜脈注射或皮下注射等全身給藥方式中也可 觀察到類似治療效果。表11. LRMs對II型膠原誘導(dǎo)的RA模型大鼠的保護作用 實施例710條LRMs新型多肽對CpG DNA皮下注射誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠 的保護作用清潔級近交系wistar大白鼠(第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供)，體重 150 士 10g，雌性。首先建立CpG DNA1826誘導(dǎo)的大鼠RA模型大鼠于右后足跖皮下注射CpG DNA1826 (lmg/kg)，一周后加強免疫一次，誘發(fā)AA發(fā)生。用游標卡尺測量大鼠右后踝關(guān)節(jié)前 后徑與左右徑之和，從而分別計算腫脹度，計算公式為(發(fā)病后所測值_發(fā)病前所測值)/ 發(fā)病前所測值X 100%。選取55只腫脹度大于50%的大鼠，隨機分為對照組和LRM1 LRMltl 治療組，每組5只。LRM1 LRMltl治療組分別于大鼠右后踝關(guān)節(jié)滑囊局部注射LRM1 LRMltl 多肽(3mg/kg)，對照組給予注射用生理鹽水，給藥后每8h加強注射一次，劑量與第一次給 藥相同。給藥3天后用游標卡尺測量大鼠右后踝關(guān)節(jié)前后徑與左右徑之和，計算保護率(消 腫度)，計算公式為(給藥前所測值_給藥后所測值)/給藥前所測值X 100%。結(jié)果顯示， LRM1 LRMltl多肽治療對CpG DNA誘導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠有更好的保護作用，大鼠踝關(guān) 節(jié)腫脹程度較對照組均明顯減輕，其中仍以LRMrLRM2IRM6和LRM7治療效果較強(表12)。 上述治療效果不僅在LRMs關(guān)節(jié)腔注射中被觀察到，在LRMs經(jīng)肌肉注射、靜脈注射或皮下注 射等全身給藥方式中也可觀察到類似治療效果。表12. LRMs對CpG DNA皮下注射誘導(dǎo)的RA模型大鼠保護作用 實施例810條LRMs新型多肽對CpG DNA關(guān)節(jié)腔內(nèi)局部注射誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 模型大鼠的保護作用清潔級近交系wistar大白鼠(第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供)，體重 150士 10g，雌性。首先建立CpG DNA1826誘導(dǎo)的大鼠RA模型大鼠于右后踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)單次 注射CpG DNA1826(0.3mg/kg)，誘發(fā)AA發(fā)生。用游標卡尺測量大鼠右后踝關(guān)節(jié)前后徑與左 右徑之和，從而分別計算腫脹度，計算公式為(發(fā)病后所測值_發(fā)病前所測值)/發(fā)病前 所測值X 100%。選取55只腫脹度大于50%的大鼠，隨機分為對照組和LRM1-LRMltl治療 組，每組5只。LRM1 LRMltl治療組分別于大鼠右后踝關(guān)節(jié)滑囊局部注射LRM1 LRMltl多肽 (3mg/kg)，對照組給予注射用生理鹽水，給藥后每8h加強注射一次，劑量與第一次給藥相 同。給藥3天后用游標卡尺測量大鼠右后踝關(guān)節(jié)前后徑與左右徑之和，計算保護率(消腫 度)，計算公式為(給藥前所測值-給藥后所測值)/給藥前所測值X 100%。結(jié)果顯示， LRM1 LRMltl多肽治療對CpG DNA關(guān)節(jié)腔內(nèi)局部注射誘導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠同樣有良 好的保護作用，保護效果較CpG DNA皮下注射誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型保護效果更加明顯， 其中LRM” LRM2, LRM3> LRM4, LRM6, LRM7和LRM9治療效果均達到30%以上(表13)。上述治 療效果不僅在LRMs關(guān)節(jié)腔注射中被觀察到，在LRMs經(jīng)肌肉注射、靜脈注射或皮下注射等全 身給藥方式中也可觀察到類似治療效果。表13. LRMs對CpG DNA關(guān)節(jié)腔內(nèi)局部注射誘導(dǎo)的RA模型大鼠的保護作用
權(quán)利要求
一種基于人TLR9受體功能區(qū)片段LRR11的新型多肽，其特征在于，具有LRR11序列及SEQ ID NO1 10所示氨基酸序列中的至少一種
2.權(quán)利要求1所述的基于人TLR9受體功能區(qū)片段LRRll及基于LRRll的新型多肽在 制備防治細菌膿毒癥藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物為注射劑。
4.權(quán)利要求1所述的基于人TLR9受體功能區(qū)片段LRRll及基于LRRll的新型多肽在 制備防治類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物為注射劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述注射劑經(jīng)肌肉、靜脈、皮下注射或關(guān) 節(jié)腔內(nèi)局部注射給藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于人TLR9受體功能區(qū)片段LRR11的新型多肽，其具有LRR11序列及SEQ ID NO1-10所示氨基酸序列中的至少一種。本發(fā)明所述的基于人TLR9受體功能區(qū)片段的新型多肽(LRMs)具有抑制CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬細胞釋放TNF-α的作用，可以降低CpG DNA攻擊小鼠的血清TNF-α濃度，提高被攻擊小鼠生存率，其可用于制備防治細菌膿毒癥藥物。本發(fā)明所述的基于人TLR9受體功能區(qū)片段LRR11及基于LRR11的新型多肽(LRMs)還具有緩解類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)病變癥狀的作用，其可用于制備防治類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物。
文檔編號A61P31/04GK101899108SQ20101021257
公開日2010年12月1日 申請日期2010年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月29日
發(fā)明者丁國富, 周紅, 李斌, 潘夕春, 鄭江 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)