專利名稱：：中藥復(fù)方灌注液的制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種中藥灌注液的制備方法，具體為一種中藥復(fù)方提取物制備灌注液的制備工藝及其在治療表淺性膀胱癌上的用途。
背景技術(shù)：
：膀胱癌是較常見的腫瘤之一，約占所有惡性腫瘤的10%左右，是我國泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。本病男性多發(fā)，男女發(fā)病率的比例約為41，發(fā)病年齡多在40歲以上，且隨年齡增大而發(fā)病率增加。但近年來30歲以下發(fā)病者有所增加，20歲左右的患者也時(shí)有所見，總的發(fā)病率有上升趨勢(shì)。初次就診的患者中70%-80%為表淺性膀胱癌(SuperficialTransitionalCellCarcinoma,STCC)。表淺性膀胱癌是指包括原位癌(Tis)、Ta及Tl期的所有膀胱腫瘤，不論腫瘤分化程度的高低，都未侵及膀胱肌層。經(jīng)尿道切除術(shù)或者膀胱部分切除術(shù)雖然可以切除原發(fā)腫瘤，但由于STCC的多中心性和多發(fā)性特點(diǎn)，復(fù)發(fā)率高達(dá)30%-85%，且絕大多數(shù)術(shù)后一年內(nèi)復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)的患者中有30%-40%會(huì)進(jìn)展為浸潤性膀胱癌。為了預(yù)防腫瘤的術(shù)后復(fù)發(fā)，目前普遍采用的方式是在手術(shù)切除原發(fā)病灶后，給予持續(xù)的膀胱抗腫瘤藥物灌注治療。膀胱灌注治療的主要目的如下1、抗癌藥物可以在膀胱內(nèi)較長時(shí)間高濃度直接作用于腫瘤。2、可以殺滅膀胱內(nèi)術(shù)后殘余的腫瘤細(xì)胞，防止腫瘤細(xì)胞種植，降低復(fù)發(fā)的可能。3、可以減少全身用藥的毒副作用。4、可以保留膀胱，不僅生活方便，且可保留性功能。5、阻止腫瘤惡性程度的進(jìn)展。常用的術(shù)后膀胱灌注治療的藥物分為兩大類化療藥物和免疫調(diào)節(jié)劑類藥物。化療藥主要包括絲裂霉素(MMC)、表阿霉素和吡柔比星等，是目前國內(nèi)的一線用藥，國外多中心前瞻性對(duì)照研究證明都能夠不同程度降低近期2年)復(fù)發(fā)率，但對(duì)遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)率(>5年)及生存率的改善不明顯。分析影響效果的重要原因之一就是腫瘤細(xì)胞的耐藥性，包括原發(fā)性耐藥和獲得性耐藥，降低甚至消除了藥物效果?，F(xiàn)國外應(yīng)用較多的藥物為卡介苗(BCG)，是目前治療和預(yù)防表淺性膀胱癌最有效的藥物之一。其優(yōu)勢(shì)在于能夠降低近期復(fù)發(fā)率，同時(shí)阻止腫瘤進(jìn)展，從而提高了遠(yuǎn)期療效。但由于BCG毒副作用大，不能在腫瘤切除后立即使用，從而影響了預(yù)防腫瘤細(xì)胞種植的作用。目前還沒有發(fā)現(xiàn)關(guān)于這種中藥提取物在治療膀胱癌方面的研究報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明為了解決提高蘇木類中藥提取物在治療腫瘤方面的應(yīng)用效果而提供了一種中藥復(fù)方提取物制備灌注液的制備工藝及其在作為治療膀胱癌藥物方面的應(yīng)用。本發(fā)明是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，一種中藥復(fù)方提取物制備灌注液，是由二種中藥制成，三七1-5質(zhì)量份，蘇木5-9質(zhì)量份，生產(chǎn)工藝為水煮提取，石油醚脫脂，乙酸乙脂淬取，減壓干燥，水溶過濾，凍干處理。該提取物對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞有很好的殺傷作用。能夠作為制備治療膀胱癌藥物方面的應(yīng)用?？捎糜诎螂啄[瘤切除術(shù)后創(chuàng)面清洗，能起到殺死殘留膀胱腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)創(chuàng)面愈合，降低術(shù)后膀胱腫瘤復(fù)發(fā)的作用。三七為五加科植物三七(Panaxnotoginseng(Burk)F.H.Chen)的根，含有多種化學(xué)成分，其中三七總皂苷(PNS)為主要有效活性成分之一，其藥理作用非常廣泛。三七水溶性成分能縮短小鼠的凝血時(shí)間，使血小板數(shù)量顯著增加(中國野生植物資源，2000，19(1)10)。還能通過改善血管內(nèi)皮功能，改善血流狀態(tài)，改善血液成分，達(dá)到抑制血小板粘附和聚集，防止血栓形成的目的(三七總皂苷干預(yù)血栓形成研究概況，云南中醫(yī)中藥雜志，2003，24(5):46-47)。三七皂苷RG3能抑制前列腺癌LNCaP細(xì)胞的增生，對(duì)lewis肺癌也有明顯的抑制作用。此外三七總皂苷還有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛作用，能減輕組織水腫、炎癥、變性壞死，加快病灶清除和組織修復(fù)，對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用，是一種常用的創(chuàng)傷外用藥，適合于術(shù)后清創(chuàng)，力口速創(chuàng)傷修復(fù)。蘇木(LignumSappan)為豆禾斗(Leguminosae)云實(shí)屬植物蘇木(CaesalpiniasappanL.)的干燥心材，產(chǎn)于我國廣西、云南等地，有行血祛瘀、消腫止痛的功能，其水提物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用。我們?cè)痛松陥?bào)了名為“具有抗腫瘤作用的灌洗液的制備方法”的專利，申請(qǐng)?zhí)?200910074345.0。在之后的研究中我們發(fā)現(xiàn)一定比例的三七與蘇木的混合提取物具有更為有效的抗腫瘤作用。兩者合用能起到減毒增效的作用。膀胱腫瘤術(shù)后使用具有消炎止痛，活血止血，促進(jìn)創(chuàng)傷組織修復(fù)，降低術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)率的作用。制備工藝為1、將兩種藥材粉碎，按比例稱??；2、加入4-5倍重量的純化水浸泡2-3小時(shí)；3、煮沸提取60分鐘后，傾出提取液，再加3-4倍體積量純化水煮沸保持50分鐘，傾出提取液，再加3-4倍體積量純化水煮沸保持40分鐘，傾出提取液；4、合并三次提取液，減壓濃縮(60-80°C)到干藥材重量的1.5-1.6倍；5、將濃縮后的藥液置4°C，放置24-36小時(shí)，過濾，去掉沉渣；6、濃縮液中加入等體積量石油醚，充分搖勻，靜置，取水相；7、分5次加入等體積量的乙酸乙脂淬取。8、減壓揮去乙酸乙脂(30_40°C)，加入與藥材等重量的純化水溶解，置4°C放置24小時(shí)；9、過濾除去沉淀，加入1.5倍藥材重量的純化水混勻，灌裝，高壓滅菌后即可使用(液體型)或過濾除去沉淀后冷凍干燥；無菌分裝，封口，即成(干粉型)。使用時(shí)用蒸餾水融化即可成為灌注液直接使用。細(xì)胞學(xué)研究資料不同比例混合提取物對(duì)膀胱癌細(xì)胞株T24的殺傷作用比較本實(shí)驗(yàn)采用活細(xì)胞拒染法檢測(cè)藥物對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用，其原理是正常活細(xì)胞對(duì)臺(tái)盼蘭染料有拒染性，細(xì)胞死亡后可以被染成蘭色。藥物與細(xì)胞混合培養(yǎng)一定時(shí)間后，細(xì)胞與染液混合，顯微鏡下觀察，可以根據(jù)細(xì)胞是否著色來判斷細(xì)胞的死活。材料1、靶細(xì)胞人膀胱癌細(xì)胞株T24，購于中科院上海生命科學(xué)院。2、染液臺(tái)盼蘭染料(TrypanBlue)，sigma公司產(chǎn)品，以生理鹽水配制成含量為0.4%的溶液。3、藥物組方(1)三七50g、蘇木50g。(2)三七40g蘇木60g。(3)三七30g、蘇木70g。(4)三七20g、蘇木80g。(5)三七10g、蘇木90g。(6)三七0g、蘇木100g。4、藥物提取方法藥材適當(dāng)粉碎，加水浸泡2小時(shí)，煮沸提取3次，每次加水量分別是藥材總量的4倍、3倍、3倍，合并提取液，濃縮成含量為100%的水提取液，加等量石油醚淬取一次，取水相，加等量乙酸乙脂淬取5次，合并乙酸乙脂相，減壓干燥，收集干粉，用生理鹽水配制成含量為2mg/ml的溶液，用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。5、實(shí)驗(yàn)方法消化收集處于對(duì)數(shù)生長期的靶細(xì)胞，以不含血清的RPMI1640調(diào)整細(xì)胞密度為ιχIOVml。取細(xì)胞懸液0.Iml加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入各種待測(cè)藥液0.9ml，對(duì)照組不加藥，每組藥液均設(shè)4個(gè)復(fù)孔，置37°C，5%C02飽和溫度恒溫培養(yǎng)箱中，分別于0、20、40、60、80、100分鐘時(shí)，取細(xì)胞懸液0.1ml，加等量臺(tái)盼蘭染液，輕輕混勻，滴加到細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，置100倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)4個(gè)大格內(nèi)(約150-200個(gè))的細(xì)胞總數(shù)，分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞(未著色的細(xì)胞)和死細(xì)胞(染成蘭黑色的細(xì)胞)數(shù)，按公式(細(xì)胞總數(shù)_活細(xì)胞數(shù))/細(xì)胞總數(shù)X100，求出細(xì)胞殺傷百分率。按不同時(shí)間點(diǎn)繪制細(xì)胞殺傷率曲線圖，進(jìn)行比較。6、結(jié)果對(duì)照組細(xì)胞活性良好，平均活細(xì)胞率大于98%，實(shí)驗(yàn)各組按照對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用由強(qiáng)到弱排列依次為5#、6#、4#、3#、2#、1#，綜合比較，以5#、6#、4#、組方對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用較好(見表1、圖1)表1各組藥物不同時(shí)間對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用(X士S)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究資料復(fù)方洗液對(duì)荷瘤小鼠的生命延長作用1、細(xì)胞株小鼠肝癌細(xì)胞H22購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，小鼠肉瘤S180購自中國藥品生物制品鑒定所，細(xì)胞株置液氮中冷凍保存。2、動(dòng)物清潔級(jí)KM小鼠，雌雄兼用，體重18_22g，購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK(晉)2009-0001。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在山西省腫瘤研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)室許可證號(hào)SYXK(晉)2007-0002。3、實(shí)驗(yàn)方法無菌抽取接種后第7-8天小鼠腹水，以PBS調(diào)整細(xì)胞密度為5XIO7/ml,臺(tái)盼蘭檢測(cè)活細(xì)胞率大于98%，每只動(dòng)物腹腔內(nèi)接種0.2ml細(xì)胞懸液。接種后動(dòng)物隨機(jī)分組，每組10只，分別設(shè)空白對(duì)照組、順鉬組、復(fù)方高劑量組(簡(jiǎn)稱復(fù)方高)、復(fù)方中劑量組(簡(jiǎn)稱復(fù)方中)、復(fù)方低劑量組(簡(jiǎn)稱復(fù)方低)。藥物按實(shí)驗(yàn)1方法提取，制備成含量為2%的灌注液使用。接種后24小時(shí)開始腹腔注射給藥，每天給藥一次，連續(xù)給藥6天，給藥劑量見表2，觀察動(dòng)物生存時(shí)間，每隔3天記錄體重，觀察時(shí)間為60天，生存時(shí)間大于60天者按60天統(tǒng)計(jì)，分別計(jì)算各組動(dòng)物平均生存時(shí)間，進(jìn)行組間比較。4、結(jié)果(1)對(duì)荷肝癌H22小鼠的生命延長作用對(duì)照組動(dòng)物平均生存時(shí)間為17.3士5.1天，各給藥組動(dòng)物按生命延長率由高到低依次為復(fù)方高一順鉬一復(fù)方中一復(fù)方低。綜合比較復(fù)方高劑量組對(duì)H22腫瘤細(xì)胞有較好的抑制作用(見表2)。表2復(fù)方灌注液對(duì)H22荷瘤小鼠生命延長率作用(X士S)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注與對(duì)照組比較，#P<0.001(2)對(duì)荷肉瘤S180小鼠的生命延長作用對(duì)照組動(dòng)物平均生存時(shí)間為19.2士4.1天，各給藥組按照生存時(shí)間由長到短依次為復(fù)方高一順鉬一復(fù)方中一復(fù)方低。綜合比較復(fù)方高效果較好，復(fù)方中、低效果較差(見表3)，表明復(fù)方洗液在適當(dāng)劑量下對(duì)S180有顯著的抑制作用。表3復(fù)方灌注液對(duì)S180荷瘤小鼠生命延長率作用(X士S)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注與對(duì)照組比較，#P<0.001臨床研究資料本灌注液在臨床使用過程中，采用與傳統(tǒng)方療藥物相同的灌注方式，即表淺性膀胱癌術(shù)后6-8小時(shí)開始灌注，每次40ml，藥液在膀胱內(nèi)保留80-100分鐘，然后自行排出。術(shù)后連續(xù)灌注6-8次，然后改為每周灌注一次，連續(xù)灌注8周，然后改為每月灌注一次，連灌8次，即總計(jì)一年內(nèi)灌注22-24次。灌注期間每隔3月作一次膀胱鏡檢查，如果發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)即改用其它藥物灌注，同時(shí)按復(fù)發(fā)記錄，并記錄不良反應(yīng)發(fā)生情況，共觀察患者50例，觀察時(shí)間為12個(gè)月，結(jié)果如下(見表4)。表4復(fù)灌注液的初步臨床療效觀察<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>觀察結(jié)果表明，復(fù)方灌注液對(duì)表淺性膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)有顯著的治療效果，用藥后初發(fā)組一年的復(fù)發(fā)率僅為3.4%，復(fù)發(fā)組為10.7%。兩組合計(jì)術(shù)后1年的復(fù)發(fā)率僅為13.56%，明顯低于傳統(tǒng)治療方法的35-45%年復(fù)發(fā)率，而且患者的不良反應(yīng)發(fā)生率也較化療藥物組明顯降低，是一種有很好臨床應(yīng)用價(jià)值的藥物。圖1為各組藥物不同時(shí)間對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、一種中藥復(fù)方提取物制備灌注液，是由二種中藥制成，三七1份，蘇木9份，制備工藝為1、將兩種藥材粉碎，按比例稱?。?、加入5倍重量的純化水浸泡2小時(shí)；3、煮沸提取60分鐘后，傾出提取液，再加4倍體積量純化水煮沸保持50分鐘，傾出提取液，再加3倍體積量純化水煮沸保持40分鐘，傾出提取液；4、合并三次提取液，減壓濃縮(60-80°C)到干藥材重量的1.5-1.6倍；5、將濃縮后的藥液置4°C，放置36小時(shí)，過濾，去掉沉渣；6、濃縮液中加入等體積量石油醚，充分搖勻，靜置，取水相；7、分5次加入等體積量的乙酸乙脂淬取。8、減壓揮去乙酸乙脂(30_40°C)，加入與藥材等重量的純化水溶解，置4°C放置24小時(shí)；9、過濾除去沉淀，加入1.5倍藥材重量的純化水混勻，灌裝，高壓滅菌后即可使用(液體型)或過濾除去沉淀后冷凍干燥；無菌分裝，封口，即成(干粉型)。實(shí)施例2、一種中藥復(fù)方提取物制備灌注液，是由二種中藥制成，三七5份，蘇木5份，制備工藝為1、將兩種藥材粉碎，按比例稱?。?、加入4倍重量的純化水浸泡3小時(shí)；3、煮沸提取60分鐘后，傾出提取液，再加4倍體積量純化水煮沸保持50分鐘，傾出提取液，再加3-4倍體積量純化水煮沸保持40分鐘，傾出提取液；4、合并三次提取液，減壓濃縮(60-80°C)到干藥材重量的1.5-1.6倍；5、將濃縮后的藥液置4°C，放置24小時(shí)，過濾，去掉沉渣；6、濃縮液中加入等體積量石油醚，充分搖勻，靜置，取水相；7、分5次加入等體積量的乙酸乙脂淬取。8、減壓揮去乙酸乙脂(30_40°C)，加入與藥材等重量的純化水溶解，置4°C放置24小時(shí)；9、過濾除去沉淀，加入1.5倍藥材重量的純化水混勻，灌裝，高壓滅菌后即可使用(液體型)或過濾除去沉淀后冷凍干燥；無菌分裝，封口，即成(干粉型)。實(shí)施例3、一種中藥復(fù)方提取物制備灌注液，是由二種中藥制成，三七4份，蘇木8份，制備工藝為1、將兩種藥材粉碎，按比例稱取；2、加入5倍重量的純化水浸泡3小時(shí)；3、煮沸提取60分鐘后，傾出提取液，再加3倍體積量純化水煮沸保持50分鐘，傾出提取液，再加3-4倍體積量純化水煮沸保持40分鐘，傾出提取液；4、合并三次提取液，減壓濃縮(60-80°C)到干藥材重量的1.5-1.6倍；5、將濃縮后的藥液置4°C，放置24-36小時(shí)，過濾，去掉沉渣；6、濃縮液中加入等體積量石油醚，充分搖勻，靜置，取水相；7、分5次加入等體積量的乙酸乙脂淬取。8、減壓揮去乙酸乙脂(30_40°C)，加入與藥材等重量的純化水溶解，置4°C放置24小時(shí)；9、過濾除去沉淀，加入1.5倍藥材重量的純化水混勻，灌裝，高壓滅菌后即可使用(液體型)或過濾除去沉淀后冷凍干燥；無菌分裝，封口，即成(干粉型)。權(quán)利要求一種中藥復(fù)方提取物制備灌注液，作為制備治療膀胱癌藥物方面的應(yīng)用。2.—種中藥復(fù)方提取物制備灌注液，其特征在于是由二種中藥，三七1-5份，蘇木5-9份，通過水提取制成。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的中藥復(fù)方提取物制備灌注液，其特征在于制備工藝為(1)、將兩種藥材粉碎，按比例稱??；(2)、加入4-5倍重量的純化水浸泡2-3小時(shí)；(3)、煮沸提取60分鐘后，傾出提取液，再加3-4倍體積量純化水煮沸保持50分鐘，傾出提取液，再加3-4倍體積量純化水煮沸保持40分鐘，傾出提取液；(4)、合并三次提取液，減壓濃縮到干藥材重量的1.5-1.6倍；(5)、將濃縮后的藥液置4°C，放置24-36小時(shí)，過濾，去掉沉渣；(6)、濃縮液中加入等體積量石油醚，充分搖勻，靜置，取水相；(7)、分5次加入等體積量的乙酸乙脂淬取；(8)、減壓揮去乙酸乙脂，加入與藥材等重量的純化水溶解，置4°C放置24小時(shí)；(9)、過濾除去沉淀，加入1.5倍藥材重量的純化水混勻，灌裝，高壓滅菌后即可使用或過濾除去沉淀后冷凍干燥。全文摘要本發(fā)明涉及一種中藥灌注液的制備方法，具體為一種中藥復(fù)方提取物制備灌注液的制備工藝及其在治療表淺性膀胱癌上的用途。解決提高蘇木類中藥提取物在治療腫瘤方面的應(yīng)用效果。是由二種中藥制成，三七1-5份，蘇木5-9份，生產(chǎn)工藝為水煮提取，石油醚脫脂，乙酸乙脂淬取，減壓干燥，水溶過濾，凍干處理。該提取物對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞有很好的殺傷作用。能夠作為制備治療膀胱癌藥物方面的應(yīng)用?？捎糜诎螂啄[瘤切除術(shù)后創(chuàng)面清洗，能起到殺死殘留膀胱腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)創(chuàng)面愈合，降低術(shù)后膀胱腫瘤復(fù)發(fā)的作用。文檔編號(hào)A61P35/00GK101822711SQ20101018363公開日2010年9月8日申請(qǐng)日期2010年5月22日優(yōu)先權(quán)日2010年5月22日發(fā)明者任連生,張蕻,王晉芬申請(qǐng)人:山西省腫瘤醫(yī)院