專利名稱：：急性子抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及天然藥物領(lǐng)域，具體涉及一種急性子用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的用途。
背景技術(shù)：
：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis,RA)是一種以關(guān)節(jié)病變?yōu)橹鞯穆匀硇缘淖陨砻庖咝约膊。壳捌浒l(fā)病機制尚不明了，臨床認為RA的發(fā)病主要是由于患者自身免疫功能失調(diào)，導(dǎo)致不正當?shù)倪^敏反應(yīng)，使抗炎細胞變質(zhì)變性，沉積于關(guān)節(jié)部位并使關(guān)節(jié)組織畸形、致殘。據(jù)調(diào)查，世界范圍內(nèi)RA的發(fā)病率大約為l-2X，我國RA患者總數(shù)已超過400萬，且發(fā)病率仍呈上升趨勢。目前RA的治療以藥物為主，包括糖皮質(zhì)激素、非甾體抗炎藥(NSAIDs，如雙氯酚酸、阿司匹林、布洛芬等)、改善病情的抗風(fēng)濕藥(DMARDs，如甲氨喋呤、金鹽、柳氮磺胺吡啶等)等三大類，前兩者只能緩解癥狀而不能阻止病情進展；多種DMARDs的聯(lián)合治療成為當前RA治療的主流，但該類藥物需長期使用且毒副作用較大。近年來，國內(nèi)外學(xué)者在植物藥治療RA方面進行了廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)許多天然藥物如雷公藤多苷、白芍總苷、毒藤堿等具有較好的RA治療作用。因此，從中藥中開發(fā)出安全高效的RA治療藥物具有廣闊的市場前景。急性子為我國歷版藥典收載品種，其藥材來源為鳳仙花科植物鳳仙花ImpatiensbalsaminaL.的干燥成熟種子。夏、秋季果實即將成熟時采收，曬干，除去果皮及雜質(zhì)。味微苦，性溫，有小毒，具有破血軟堅，消積之功效。用于經(jīng)閉，噎膈，腹部腫塊，骨哽咽喉，外瘍堅塊等癥。(國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.化學(xué)工業(yè)出版社，2005，一部186)。鳳仙萜四醇苷類三萜皂苷為急性子所含有的特征性化學(xué)成分，目前已從中分離得到鳳仙萜四醇苷A，B，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，J，K，L，M，N，0等十多種三萜皂苷，此外急性子還含蛋白質(zhì)、脂肪油類(脂肪油含量17.9%)等成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，急性子具有興奮子宮平滑肌、促透皮、抗生育、抗腫瘤、抗菌、抗癌等藥理作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明公開了急性子的醫(yī)藥用途，即用于制備治療抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物的用途。藥理學(xué)試驗表明，急性子總皂苷具有優(yōu)異的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的用途。本發(fā)明急性子總皂苷經(jīng)口服給藥，在30iimol/L濃度時即對刀豆蛋白A誘導(dǎo)的T淋巴細胞增殖有明顯的抑制作用。本發(fā)明的急性子總皂苷可用下列方法提取得到取急性子藥材，用乙醇回流提取，提取液濃縮，過濾或離心，濾液或上清液上大孔樹脂，用水洗脫后再用乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮，蒸干或減壓干燥，即得急性子總皂苷。3上述制備方法中提取時乙醇的濃度優(yōu)選50-90%。更優(yōu)選70-80%。上述制備方法中大孔樹脂優(yōu)選為DiaionHP-10型、DiaionHP-20型、DiaionHP-20型、DiaionHP-30型、AB_8型或D101型大孔樹脂。更優(yōu)選的大孔樹脂為AB_8型或D101型大孔樹脂。上述制備方法中洗脫時乙醇的濃度優(yōu)選50-90%。更優(yōu)選的濃度是5070%。采用上述方法制備的急性子總皂苷提取物，其中總皂苷含量高達50-85%。本發(fā)明的急性子總皂苷主要由風(fēng)仙萜四醇苷類三萜皂苷組成，包括鳳仙萜四醇苷A，B，C，D，F(xiàn)，G，K，L，M等。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>HosenkosidesA-Glc--Glc-Glc_HHosenkosidesD-Glc--Glc-Glc_HHosenkosidesK-Glc--Glc-Glc-GlcHosenkosides-Glc--Xyl-Glc_HHosenkosidesM-Glc--Xyl-Glc-Glc<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>HosenkosidesB-Glc-Glc-GlcHosenkosidesF-Glc-Xyl-GlcCN101780125AHosenkosidesC_Glc_Glc_GlcHosenkosidesG_Glc_Xyl_Glc本發(fā)明的急性子總皂苷提取物可以作為藥物活性成分制備成各種臨床用藥物制劑，其中含有治療有效量的急性子總皂苷提取物及藥學(xué)上可接受的載體。還可以作為活性部位與其他中藥提取物/有效部位或相關(guān)化學(xué)合成藥物與藥學(xué)上可接受的賦形劑或輔料一起用于制備藥物組合物。上述兩種藥物組合物均可采用制劑學(xué)的常規(guī)方法制備成各種劑型，如片劑、丸劑、膠囊、顆粒劑、酊劑、口服液等胃腸道給藥劑型及注射劑、外用制劑等胃腸道外給藥劑型。下面是部分急性子的藥效學(xué)試驗及數(shù)據(jù)—、急性子總皂苷提取物的對刀豆蛋白A誘導(dǎo)的T淋巴細胞增殖的影響藥物實施例1所得的急性子總皂苷提取物，用蒸餾水溶解。試劑氫化可的松琥珀酸鈉，天津市生物化學(xué)制藥廠，批號20071008;刀豆蛋白A(ConA)、噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMS0)(均為Sigma公司);RPM1-1640培養(yǎng)基(Gibco公司)、小牛血清(杭州四季青生物制品研究所)。儀器MultiskanspectrumMSS1500-320酶標儀、3111型細胞培養(yǎng)箱(ThermoElectron公司)；SW-CJ-IF超凈臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；XSZ-D2倒置顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠);H5K低溫離心機(Sigma公司)。動物清潔級雄性BALB/c小鼠，體重20-22g，由揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，合格證號SCXK(蘇)2007-0001。實驗方法1、脾細胞制備無菌條件下取出小鼠脾臟，研磨脾臟，過200目篩網(wǎng)，RPMI-1640培養(yǎng)液沖洗，收集分離的脾細胞懸液，1000r/min離心，棄上清，加入紅細胞裂解液(0.155MNH4C1和16.5mMTris，pH7.2)溶解紅細胞，用RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%小牛血清)將細胞洗滌2次，再用培養(yǎng)液重懸細胞，臺盼藍染色，細胞活力在99%以上。2、化合物對ConA誘導(dǎo)的T淋巴細胞增殖的影響將脾細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板(4Xl(fcell/孔)內(nèi)，實驗分組如下正常組為脾淋巴細胞的自然培養(yǎng)，模型組為脾淋巴細胞與ConA(5iig/mL)共培養(yǎng)，化合物組(3、10、30、60、100iimol/L)為化合物與脾淋巴細胞及ConA共培養(yǎng)，陽性藥組為氫化可的松(10iimol/L)與脾淋巴細胞及ConA共培養(yǎng)。各組細胞置于37°C、5%0)2培養(yǎng)4811后，加入含0.5%MTT的培養(yǎng)基20iiL，再培養(yǎng)4h后，棄培養(yǎng)液，加入150yL的DMS0，振蕩10min，待結(jié)晶完全溶解后，用酶聯(lián)免疫儀于570nm波長處測定吸光值。實驗重復(fù)3次，每次3個復(fù)5孔。細胞增殖的抑制率用以下公式計算抑制率=(模型組0D57。_化合物組0D57。)/(模型組0D57。_正常組0D57。)X100%抑制率數(shù)據(jù)以均值±SD表示，n=3。采用t檢驗進行組間比較。結(jié)果見表l。表1急性子總皂苷對ConA誘導(dǎo)的T淋巴細胞增殖的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*P<0.05，**P<0.01，vs.空白對照組(抑制率0.0%)，。結(jié)論急性子總皂苷濃度30iimol/L即對ConA誘導(dǎo)的T淋巴細胞增殖有顯著抑制作用。二、急性子總皂苷提取物的大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的影響藥物實施例3所得的急性子總皂苷提取物，用蒸餾水溶解，大鼠低、中、高劑量分別為30mg/kg、60mg/kg、120mg/kg。試劑雷公藤多苷片(湖南一格制藥有限公司，批號200803118)，大鼠劑量12mg/kg;弗氏完全佐劑(Sigma公司)。動物SD大鼠，雄性，體重180-220g，第二軍醫(yī)大學(xué)大學(xué)實驗動物中心。實驗方法大鼠54只，隨機分為空白組、模型組、急性子總皂苷組(低、中、高劑量)及陽性對照組(雷公藤多苷片)，每組9只，每天l次ig給藥，連續(xù)6天，于第6天(致炎前)用玻璃容積法測量大鼠右后足體積，并于末次給藥后30分鐘給大鼠右后足注射0.05mL弗氏完全佐劑致炎，16小時后測量大鼠右后足體積，并計算腫脹率和抑制率。腫脹率=(致炎后足趾容積_致炎前足趾容積)/致炎前足趾容積X100%腫脹抑制率=(對照組平均腫脹率-給藥組平均腫脹率)/對照組平均腫脹率X100%各組數(shù)據(jù)作組間t檢驗。結(jié)果見表2。表2急性子總皂苷對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>**P<0.01，vs.空白組(腫脹率0.0%);AP<0.05，vs.模型組(抑制率0.0%)。結(jié)論急性子總皂苷給藥低劑量30mg/kg時即可顯著降低由弗氏完全佐劑引起的大鼠原發(fā)性右后足趾腫脹(P<0.05)，其作用強度與陽性藥物雷公藤多苷片相當。具體實施方式實施例1急性子總皂苷提取物的制備稱取急性子藥材20kg，粉碎，加10倍量的70%乙醇，IO(TC回流提取3次，每次3小時。合并提取液，得浸膏A。將浸膏A以適量蒸餾水溶解，上DiaionHP-20型大孔樹脂柱，分別以蒸餾水、10%、50%、70%、95%乙醇洗脫，合并50%乙醇洗脫液，蒸干得急性子總皂苷提取物968g，該提取物含總皂苷為53.47%。實施例2急性子總皂苷提取物的制備稱取急性子藥材20kg，粉碎，加12倍量的95X乙醇，9(TC提取3次，每次3小時。合并提取液，得浸膏A。將浸膏A以適量蒸餾水溶解，上D-101型大孔樹脂柱，分別以蒸餾水、30%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇洗脫，合并50-70%乙醇洗脫液，蒸干得浸膏B，將浸膏B以甲醇溶解，加硅藻土拌勻，硅藻土與浸膏比例為2:1，以無水乙醇熱回流提取3次，所得提取液蒸干，得急性子總皂苷提取物792g，該提取物含總皂苷達74.53%。實施例3急性子總皂苷提取物的制備稱取急性子藥材25kg，粉碎，加IO倍量的100X乙醇，8(TC提取3次，每次3小時。合并提取液，得浸膏A。將浸膏A以適量蒸餾水溶解，上AB-8型大孔樹脂柱，分別以蒸餾水、30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇洗脫，合并50-100%乙醇洗脫液，蒸干得浸膏B。將浸膏B以甲醇溶解，加硅藻土拌勻，硅藻土與浸膏比例為2:1，以無水乙醇熱回流提取3次，所得提取液蒸干，得急性子總皂苷提取物643g，該提取物含總皂苷達85.06%。實施例4急性子總皂苷提取物的含量測定(HPLC-ELSD法)儀器與試劑高效液相色譜儀Aglientll00系列，二元泵G1312A，自動進樣器，Alltech2000蒸發(fā)光散射檢測器，AgilentChemstation6.01化學(xué)工作站，色譜柱島津Shim-packCLC-0DS(6.OmmX150mm)，超純水(自制)，甲醇為色譜純。色譜條件流動相水-甲醇(47:53)，維持0-10min;在10_25min流動相比例線性改變至(40:60)，25-40min流動相比例改變至(20:80);在40_42min線性改變至(0:100);在42-50min流動相比例線性維持在(0:100);流速為0.8mL/min，柱溫20°C。檢測器條件漂移管溫度為98.5t:，載氣流速為2.7L/min，放大系數(shù)為1。對照品溶液的制備取對照品鳳仙萜四醇苷K5mg，精密稱定，置2mL錐形瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即得。供試品溶液的制備取實施例1、2、3所制備的急性子總皂苷提取物各20mg，精密稱定，分別置2mL錐形瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即得。標準曲線的制備精密量取對照品溶液2，4，6，8，10iiL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積的對數(shù)(Y)對進樣量的對數(shù)(X)進行線性回歸，得回歸方程為Y=1.025X+3.246。測定法分別精密吸取對照品溶液5iiL與供試品溶液5-10iiL，注入液相色譜儀，記錄各三萜皂苷色譜峰的峰面積，代入對照品鳳仙萜四醇苷K的標準曲線，計算含量，得實施例1、2、3所制備的急性子總皂苷提取物中總皂苷含量分別為53.47%，74.53%，85.06%。8權(quán)利要求急性子用于制備抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物的用途。2.急性子總皂苷用于制備抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物的用途。3.權(quán)利要求2的用途，其中急性子總皂苷用以下方法制備取急性子藥材，用乙醇回流提取，提取液濃縮，過濾或離心，濾液或上清液上大孔樹脂，用水洗脫后再用乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮，蒸干或減壓干燥，即得急性子總皂苷。4.權(quán)利要求3的用途，其中乙醇濃度為50-90%，為重量百分比。5.權(quán)利要求3的用途，其中大孔吸附樹脂為DiaionHP-10型、DiaionHP-20型、DiaionHP-20型、DiaionHP-30型、AB-8型或D101型大孔樹脂。全文摘要本發(fā)明涉及天然藥物領(lǐng)域，具體涉及一種急性子的醫(yī)藥用途，即其急性子抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的醫(yī)藥用途。藥理學(xué)試驗表明，急性子總皂苷具有較好的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的用途。在30μmol/L濃度時即對刀豆蛋白A誘導(dǎo)的T淋巴細胞增殖有明顯的抑制作用。文檔編號A61P19/02GK101780125SQ20101012633公開日2010年7月21日申請日期2010年3月18日優(yōu)先權(quán)日2010年3月18日發(fā)明者于俊杰,李會軍,李萍申請人:中國藥科大學(xué)