專利名稱：：依地酸鈣鈉與皮質激素復方制劑在制備抑制結締組織生長因子、單胺氧化酶藥物中的應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及依地酸鈣鈉與皮質激素復方制劑在制備治療人類疾病中的藥物中的應用，又涉及一種依地酸鈣鈉與皮質激素復方注射劑。
背景技術：
：依地酸鈣鈉(Ca-Na2EDTA)是一種金屬離子螯合劑，能夠用于能與多種二價、三價金屬螯合，形成穩(wěn)定的可性金屬絡合物，現(xiàn)有的依地酸鈣鈉制劑主要為注射劑(lg，5ml)和片劑(0.5g/片)，在臨床上主要用于治療無機鉛中毒，對銅、鋅、鐵、錳、鎘、釩、鈷及某些放射性元素如釷、鈾、鐳、钚等亦有一定的促排作用，但可以引起腎臟損害，使近曲小管發(fā)生嚴重水腫性退行性變等副作用，最主要的毒性作用是腎小管壞死，尿中出現(xiàn)蛋白、紅白細胞、管型，也可出現(xiàn)腎功能衰竭，及時停藥可以恢復。造成腎損害的原因，可能是由于大量金屬絡合物于短時間內經過腎臟上皮細胞，其中一部分離解，釋出高濃度的金屬離子，影響細胞酶活性所致，由于依地酸鈣鈉可能產生對腎臟的副作用，因此應用受到一定限制，一般被認為不能長期使用。肺纖維化是"彌漫性間質性肺疾病"即"間質性肺疾病"的簡稱。肺纖維化是一大組彌漫性肺實質疾病群，病理特征是肺泡壁(包括呼吸性細支氣管)彌漫性慢性炎癥和間質纖維化。特發(fā)性肺纖維化(idiopathicpulmonaryfibrosis,IPF)是最常見肺纖維化類型，占所有肺纖維化的65%。其它肺纖維化類型主要有矽肺、藥物、中毒等引的肺纖維化。IPF病因不明，發(fā)病機制亦未完全闡明，但已有足夠證據(jù)表明與免疫炎癥損傷有關，多種發(fā)病機理完全不同的自身免疫性疾病如哮喘、慢性阻塞性肺炎、紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化癥均有相當一部分病例會并發(fā)肺纖維化疾病，因此在臨床上多使用糖皮質激素和其它免疫抑制劑如來治療肺部纖維化，然而由于糖皮質激素和其它免疫抑制劑具有很多副作用，并且對于其它類型的肺纖維化治療效果也不明顯，在使用時受到很多限制。其它治療肺纖維化的藥物主要有青霉胺，秋水仙堿等，但由于這些藥物在治療肺纖維化時療效并不確切，并且副作用很大，因此在使用時也受到很大限制。樸紅梅等(結締組織生長因子在支氣管哮喘大鼠肺組織中的表達及其與氣道重塑的關系，中國呼吸和結核雜志，2007.9,705-707)公開了結締組織生長因子CTGF與肺纖維化等多種器官纖維化有關，而單胺氧化酶(MA0)是一種細胞外酶，無FAD而含有磷酸吡哆醛，只對伯胺起作用。血清中MA0和結締組織中的MA0性質相似，能促進結締組織的成熟，在膠原形成過程中，參與膠原成熟的最后階段架橋形成，使膠原和彈性硬蛋白結合。上述CTGF和MAO均是肺纖維化中起重要作用的酶或因子，現(xiàn)有技術中的治療藥物由于不能向針對肺纖維化的致病因子，因此治療效果差。馮立等(肺耙向微粒的研究概況，中國藥業(yè)，2005年第15巻第12期，1-2)公開了，粒徑730iitm的微粒靜脈注射后在肺部蓄積，從而產生肺部靶向作用。因此，找到一種能夠針對肺纖維化致病因子或酶產生治療作用的藥物，更進一步的找到一種成為現(xiàn)有技術中要解決的問題。
發(fā)明內容為解決現(xiàn)有技術問題，我們意外的發(fā)現(xiàn)，依地酸鈣鈉能夠同時抑制結締組織生長因子(CTGF)和單胺氧化酶，治療肺部纖維化。同時更為意外的是依地酸鈣鈉在治療不同病因引起的肺部纖維化還存在一定的差異，依地酸鈣鈉對于由哮喘、慢性阻塞性肺炎引起的肺部纖維化疾病具有更好的療效，目前造成這種情況的原因還不明確，可能是不同疾病引起肺部的結締組織生長因子CTGF、單胺氧化酶(MAO)不同造成的，也有可能是不同疾病引起肺部纖維化機理不同造成的。另外我們還發(fā)現(xiàn)采用糖皮質激素與依地酸鈣鈉制成的復方制劑可以產生更好的治療效果，同時降低依地酸鈣鈉和糖皮質激素的使用量，以降低依地酸鈣鈉的副作用。本發(fā)明提供了一種依地酸鈣鈉與皮質激素制成的復方制劑，由作為活性成分的依地酸鈣鈉與皮質激素和一種或幾種可藥用的輔料組成。本發(fā)明提供了依地酸鈣鈉與皮質激素制成的復方制劑在制備抑制人或哺乳動物結締組織生長因子、單胺氧化酶藥物中的應用。本發(fā)明還提供了依地酸鈣鈉與皮質激素制成的復方制劑在制備治療人或哺乳動物肺部纖維化疾病藥物中的應用。所述的肺部纖維化疾病為系統(tǒng)性硬化癥引起的肺部纖維化疾病，紅斑狼瘡引起的肺部纖維化疾病，慢性阻塞性肺炎引起的肺部纖維化疾病，哮喘引起的肺部纖維化疾病，特發(fā)性肺纖維化以及矽肺引起的肺部纖維化。所述依地酸鈣鈉與皮質激素制成的復方制劑在治療上述疾病時的依地酸鈣鈉的劑量為0.l-lg/日，優(yōu)選為0.1-0.5g/日，糖皮質激素劑量為0.lmg-5mg，優(yōu)選0.5_2mg/日。所述的復方制劑為注射劑，由作為活性成分的依地酸鈣鈉與皮質激素和一種或幾種適用于注射劑的輔料組成。所述的皮質激素優(yōu)選可溶于水的糖皮質激素，優(yōu)選地塞米松磷酸鈉、倍他米松磷酸鈉。所述依地酸鈣鈉與皮質激素制成的復方注射劑，含有重量百分比2_20%的依地酸鈣鈉，重量百分比0.01-0.1%的糖皮質激素以及可用于注射劑的輔料；所述的糖皮質激素優(yōu)選地塞米松磷酸鈉、倍他米松磷酸鈉一種或幾種。所述的輔料優(yōu)選為余量的注射用水；所述輔料還可以含有丙二醇，所述丙二醇的用量為0-30%，優(yōu)選丙二醇含量為0-5%。所述輔料還可以含有作為pH緩沖劑的磷酸鹽。所述用量均為注射劑的重量體積比。所述注射劑還可以制成肺部靶向注射劑，所述制成肺部靶向注射劑為微球劑，微囊劑，脂質體注射劑，所述微球、微囊、脂質體的粒徑優(yōu)選7-30ym，所述肺靶向制劑優(yōu)選為脂質體注射液。本發(fā)明提供了依地酸鈣鈉在抑制人或哺乳動物結締組織生長因子、單胺氧化酶藥物中的應用，治療人或哺乳動物肺部纖維化疾病藥物中的應用，為了克服依地酸鈣鈉在長期使用時對腎臟產生的副作用，本發(fā)明提供了一種依地酸鈣鈉與糖皮質激素復方注射劑，4與現(xiàn)有技術中用于治療肺部纖維化疾病的皮質激素如地塞米松磷酸鈉注射液相比，該復方制劑能夠更好的抑制結締組織生長因子CTGF和單胺氧化酶(MAO)從而對肺部纖維化進行更有針對性的治療，同時我們意外的發(fā)現(xiàn)，與單純的依地酸鈣鈉相比，本發(fā)明提供的復方制劑在較低的依地酸鈣鈉用量下實現(xiàn)了較好的治療效果，更有利于患者較長時間的使用。依地酸鈣鈉在治療于哮喘引起的肺部纖維化時產生了更好的治療效果，與地塞米松等激素類藥相比，本發(fā)明提供的藥物更加適用于治療哮喘引起的肺部纖維化。同時由于實驗表明，依地酸鈣鈉沒有皮質激素的副作用，不會引起體重減少等副作用，更適用于長期治療使用。具體實施例以下具體實施方式僅為對本發(fā)明技術方案實施的說明，不能解釋為對本發(fā)明技術方案的限制，在配制封裝過程中采用充氮方法避免氧化發(fā)生。還可以按照《中國藥典》2005版中附錄158液公開的的pH=6.57.0的磷酸鹽緩沖液的配制方法，實施例1制備注射液地塞米松磷酸鈉lg磷酸氫二鈉lg磷酸二氫鈉0.05g依地酸f丐鈉200g將處方量地塞米松磷酸鈉溶于適量的注射用水中，加入處方量的磷酸鹽，攪拌溶清，加入依地酸鈣鈉。加注射用水至1000ml，溶清，過濾、分裝、得到注射液每ml含有地塞米松磷酸鈉lmg，依地酸^鈉0.2g。實施例2地塞米松磷酸鈉0.5g磷酸氫二鈉lg依地酸鈣鈉200g磷酸二氫鈉0.05g將處方量的地塞米松磷酸鈉原料藥溶于適量的注射用水中加入處方量的磷酸鹽，加注射用水至1000ml，過濾、分裝、滅菌得到注射液每ml含有地塞米松磷酸鈉0.5mg、依地酸牽丐鈉0.2g實施例3地塞米松磷酸鈉磷酸氫二鈉磷酸二氫鈉0.lglg0.lg依地酸鈣鈉200g將處方量的地塞米松磷酸鈉原料藥溶于適量的注射用水加入處方量的磷酸鹽，攪拌溶清，加入依地酸鈣鈉，加注射用水至1000ml，溶清過濾、分裝、滅菌得到注射液每ml含有地塞米松磷酸鈉0.lmg，依地酸鈣鈉0.2g。實施例4地塞米松磷酸鈉lg磷酸氫二鈉lg磷酸二氫鈉0.05g藥用丙二醇10g依地酸鈣鈉20g將處方量的地塞米松磷酸鈉原料藥溶于適量的注射用水加入處方量的磷酸鹽、藥用丙二醇攪拌均勻，加入溶清的依地酸鈣鈉溶液，加注射用水至1000ml，溶清過濾、分裝、滅菌得到注射液每ml含有地塞米松磷酸鈉lmg，依地酸鈣鈉0.02g。實施例5注射液地塞米松磷酸鈉0.磷酸氫二鈉lg磷酸二氫鈉0.05g藥用丙二醇20g依地酸鈣鈉20g注射用水至1000ml，將處方量的地塞米松磷酸鈉原料藥溶于適:的注射用水加入處方量的磷酸鹽、藥用丙二醇攪拌均勻，加入溶清的依地酸鈣鈉溶液，加注射用水至lOOOml，溶清過濾、分裝、注射液每ml含有地塞米松磷酸鈉0.5mg，依地酸鈣鈉0.02g。實施例6倍他米松磷酸鈉0.lg藥用丙二醇10g依地酸f丐鈉20g注射用水至1000ml，將處方量的倍他米松磷酸鈉原料藥溶于適量的注射用水加入處方量的磷酸鹽、藥用丙二醇攪拌均勻，加入溶清的依地酸鈣鈉溶液，加注射用水至1000ml，溶清過濾、分裝、注射液每ml含有倍他米松磷酸鈉0.lmg，依地酸*丐鈉0.02g。實施例7地塞米松磷酸鈉lg依地酸f丐鈉200g注射用水至1000ml，將處方量的地塞米松磷酸鈉原料藥溶于適量的注射用水加入處方量藥用丙二醇攪拌均勻，加入溶清的依地酸鈣鈉溶液，加注射用水至1000ml，溶清過濾、分裝、注射液每ml含有地塞米松磷酸鈉lmg，依地酸鈣鈉0.2g。實施例8倍他米松磷酸鈉0.5g依地酸鈣鈉100g注射用水至lOOOml，將處方量的倍他米松磷酸鈉原料藥溶于適量的注射用水加入處方量藥用丙二醇攪拌均勻，加入溶清的依地酸鈣鈉溶液，加注射用水至1000ml，溶清過濾、分裝、注射液每ml含有倍他米松磷酸鈉0.5mg，依地酸鈣鈉0.lg。實施例9地塞米松磷酸鈉0.lg依地酸鈣鈉lOOg注射用水至lOOOml，將處方量的地塞米松磷酸鈉原料藥溶于適量的注射用水加入處方量藥用丙二醇攪拌均勻，加入溶清的依地酸鈣鈉溶液，加注射用水至1000ml，溶清過濾、分裝、注射液每ml含有地塞米松磷酸鈉0.lmg，依地酸鈣鈉0.lg。藥理實施例1、對肺纖維化模型大鼠的作用6博萊霉素造模組雄性SD大鼠，SPF級，體重(300±20)g，將造模成功后隨機分為模型組、假手術組(陰性對照組)和實驗組i-io組，每組io只。各實驗組給藥情況如下表，表1(地塞米松磷酸鈉，DEX;倍他米松磷酸鈉，BEX;依地酸鈣鈉，EDTA)實驗組1實驗組2實驗組3實驗組4實驗組5實驗組6實驗組7實驗組8實驗組9實驗組10給藥實施例1實施例2實施例3實施例4實施例5實施例7實施例9實施例8日劑量(DEX)mg/kg0.20.10.050.250.250.10.05lmg/kg日劑量(BEX)mg/kg0.25日劑量(EDTA)mg/kg8040100510205050100對照藥物采用市售0.5%地塞米松磷酸鈉注射液(以地塞米松磷酸鈉計)、和市售20%依地酸鈣鈉注射液各組以12%烏拉坦腹腔內注射麻醉動物后，在額鏡直視下將硬脊膜外麻.醉導管插入氣管l-2cm，觀察到導管內液柱隨動物呼吸而波動后，對實驗組和模型組按5mg/kg劑量緩慢注入博來霉素A5制作肺纖維化模型。假手術組只進行手術，不注入博來霉素。各組采用靜脈注射給藥，連續(xù)給藥14d后(假手術組和對照組采用生理鹽水)，分別對動物進行肺功能檢測、臟器系數(shù)檢測、CTGF檢測并檢測實驗動物血清中的MAO(單胺氧化酶)含量。檢測結締組織生長因子CTFG在實驗大鼠肺纖維化中的表達，實驗儀器與試劑為CTGF-mRNA原位雜交試劑盒(武漢博±德生物工程有限公司)；0LYMPUSCX41圖象采集顯微鏡(OLYMPUS公司)；復日FR-988生物顯微圖像分析軟件(上海復日科技有限公司)。對實驗動物的肺組織石蠟切片進行原位雜交；CTGFmRNA采用下列mRNA序列(5，-CTGCTGCCGCGTCTGCGCCAAGCAGCTGGG-3，；5'-CAACTGCCTGGTCCAGACCACAGAGTGGAG-3，；5'-TGTACTACAGGAAGATGTACGGAGACATGG-3')作為寡核苷酸探針。嚴格按照說明書進行操作。用PBS代替雜交液作為陰性對照。實驗基底保持相對無菌，實驗所用試劑均由含DEPC水配制以消除RNA酶的作用，所有實驗用品均經高壓消毒，整個操作過程戴口罩、手套，避免交叉污染，出現(xiàn)假陽性。胞漿內出現(xiàn)棕黃色顆粒即為陽性。7結果判定每個標本隨機取5個不同的高倍視野(X400)，每個視野計算出兩個平均灰度值(平均灰度值和陽性表達強度呈反比關系)。CTGF因子檢測結果(i±s，n=10，平均灰度值范圍0_1，值越小，陽性越強)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>與模型組相比，實驗各組GTGF因子的平均灰度值均有顯著提高(P<0.01)，并且采用復方制劑的實驗組1-8的平均灰度值也顯著高于采用地塞米松磷酸鈉的實驗組10(P<0.05)，說明本發(fā)明提供的復方制劑可以抑制CTGF因子的產生從而治療肺部纖維化，在相同依地酸鈣鈉劑量下，采用本發(fā)明提供的復方制劑的實驗組的平均灰度值顯著高于單純采用依地酸*丐鈉的實驗組。血清中單胺氧化酶(MAO)活力的檢測結果(又士s，n=10，U/h/mgprot)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>與模型組相比，實驗各組血清中單胺氧化酶(MAO)活力均有顯著降低(P<0.05)，并且采用本發(fā)明提供的復方制劑的的實驗組1-8的酶活力也低于采用采用地塞米松磷酸鈉的實驗組IO，說明依地酸鈣鈉可以抑制單胺氧化酶從而治療肺部纖維化。特別是與單純采用依地酸鈣鈉的實驗組8相比，本發(fā)明提供的復方制劑以更小劑量的依地酸鈣鈉實現(xiàn)了相當或更好的抑制單胺氧化酶效果。動物肺功能檢查方法以10%戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射麻醉動物后，將其固定在木板上，在無菌操作下做頸部正中切口，充分暴露氣管，并下穿手術線待固定氣管插管。在氣管下段做一小"T"形切口，將自制的氣管插管固定于氣管內，然后將麻醉大鼠放入體描箱中，打開肺功能儀各開關，調整各項參數(shù)到備用狀態(tài)后，將氣管插管與體描箱中的導管聯(lián)通，關閉體描箱，行肺功能檢查，檢查完畢后保存各項數(shù)據(jù)，計算每分鐘通氣量、肺順應性。肺功能檢測于處死實驗動物前進行。動物肺功能分析系統(tǒng)型號AniRes2003，購于北京貝蘭博科技公司。檢驗結果如下(5±s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>與模型組相比，實驗各組肺功能均有顯著提高(P<0.01)，并且采用本發(fā)明提供復方制劑的實驗組1-8的各組肺功能也好于采用地塞米松磷酸鈉的實驗組10，同時，復方制劑在較低的依地酸鈣鈉劑量和皮質激素劑量下實現(xiàn)了比較高的依地酸鈣鈉更好或相當?shù)闹委熜Чf明本發(fā)明提供復方制劑可以很好的治療肺部纖維化。于肺功能檢查后檢測臟器系數(shù)，處死前稱取大鼠體重，處死后，取肺臟，清除淤血和污物后計算臟器系數(shù)，臟器系數(shù)=(大鼠肺重量/大鼠體重)X1000，臟器系數(shù)檢測結果(又土s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>與模型組相比，實驗各組臟器系數(shù)均有顯著降低(P<0.01)，并且采用依地酸鈣鈉的實驗組1-8的臟器系數(shù)也低于采用地塞米松磷酸鈉的實驗組IO，說明本發(fā)明提供的復方制劑可以很好的治療肺部纖維化，說明本發(fā)明提供的復方制劑在治療肺部纖維化的同時，能夠很好的克服皮質激素容易引起體重降低的副作用。2、嚴重哮喘致肺部纖維化模型雄性SD大鼠，SPF級，體重(305±20)g，采用雞卵蛋白(0VA，美國Sigma公司產品)即每組各在腹腔注射OVA10mg，Al(OH)310mg，生理鹽水lml的混懸液，第10天重復一次；12天(即第18天)開始激發(fā)，給予1%OVA生理鹽水5ml霧化吸入，每天1次，每次30min，持續(xù)2周，對照組采用生理鹽水代替。取造模成功的大鼠分成實驗組l-10、模型組，每組10只，對照組取10只，采用靜脈給藥，對照組和模型組采用生理鹽水代替，連續(xù)給藥14d后，檢測血清中單胺氧化酶(MAO)活力和肺功能。各實驗組給藥情況如下表，表2(地塞米松磷酸鈉，DEX;倍他米松磷酸鈉，BEX;依地酸鈣鈉，EDTA)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>經過檢測，模型組以及各實驗組的血清中單胺氧化酶(MAO)活力與博萊霉素造模的模型組及相應實驗組相比無顯著差異，說明對于嚴重哮喘致肺部纖維化模型，各實驗組藥物的降低血清中單胺氧化酶(MAO)活力作用與對博萊霉素致肺纖維化模型基本相同。肺功能檢查結果如下(X±s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>本發(fā)明提供的復方制劑對于嚴重哮喘致肺部纖維化的模型的治療效果比對于博來霉素致肺纖維化模型的治療效果更好。經過同樣的復方制劑的治療，嚴重哮喘致肺部纖維化的模型動物的肺功能改善情況好于博來霉素致肺纖維化模型，與此同時，經過同樣的地塞米松磷酸鈉的治療，博來霉素致肺纖維化模型動物的肺功能改善情況卻好于嚴重哮喘致肺部纖維化的模型，說明與地塞米松磷酸鈉相比，本發(fā)明提供的復方制劑更適合于對嚴重哮喘或慢性阻塞性肺炎引起的肺部纖維化的治療。權利要求一種依地酸鈣鈉與皮質激素制成的復方制劑，由作為活性成分的依地酸鈣鈉與皮質激素和一種或幾種可藥用的輔料組成。2.如權利要求1所述的復方制劑在制備抑制人或哺乳動物結締組織生長因子、單胺氧化酶藥物中的應用。3.如權利要求1所述的復方制劑在制備治療人或哺乳動物肺部纖維化疾病藥物中的應用。4.如權利要求1所述的復方制劑，其特征是所述的制劑為注射劑，由作為活性成分的依地酸鈣鈉與皮質激素和一種或幾種適用于注射劑的輔料組成。5.如權利要求1所述，其特征所述的復方制劑在治療時依地酸鈣鈉的劑量為0.l-lg/日，糖皮質激素劑量為0.lmg-5mg/日。6.如權利要求4所述的注射劑，含有重量百分比2-20%的依地酸鈣鈉，重量百分比0.01-0.1%的糖皮質激素以及可用于注射劑的輔料。7.如權利要求6所述的注射劑，特征是所述的糖皮質激素優(yōu)選地塞米松磷酸鈉、倍他米松磷酸鈉一種或幾種。8.如權利要求6或7所述的注射劑，其特征是所述的輔料優(yōu)選為余量的注射用水。9.如權利要求6-8任一所述的注射劑，其特征是所述輔料還可以含有丙二醇，所述丙二醇的用量為0-30%。10.如權利要求6-9任一所述的注射劑，其特征是所述輔料還可以含有作為pH緩沖劑的磷酸鹽。全文摘要依地酸鈣鈉與皮質激素復方制劑在制備抑制結締組織生長因子、單胺氧化酶藥物中的應用，提供了一種依地酸鈣鈉與皮質激素制成的復方制劑，由作為活性成分的依地酸鈣鈉與皮質激素和一種或幾種可藥用的輔料組成，所述復方制劑含有重量百分比2-20％的依地酸鈣鈉，重量百分比0.01-0.1％的糖皮質激素以及可用于注射劑的輔料。文檔編號A61P11/00GK101791313SQ20101012610公開日2010年8月4日申請日期2010年3月17日優(yōu)先權日2010年3月17日發(fā)明者于潤芳,劉凱,吳媛媛,張冬蘭,張嵐,李靜,楊國存,林劼,王虹,程振國,肖敏霞申請人:天津金耀集團有限公司