抑制hiv病毒與宿主細胞融合的非對映體多肽及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種抑制HIV病毒與宿主細胞融合的非對映體多肽及其用途。所述非對映體多肽為序列表中序列1所示多肽CT105；或者序列表中序列2所示多肽CT106；或者序列表中序列3所示多肽CT107。還包括應用所述多肽得到的化合物或者聚合物或者組合物。該類多肽的作用位點與現有的藥物不同，并且水溶性較好、活性高、不易被蛋白酶水解。
【專利說明】抑制HIV病毒與宿主細胞融合的非對映體多肽及其用途
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種抑制HIV病毒與宿主細胞融合，不易被蛋白酶水解、低免疫原性的非對映體多肽。本發(fā)明還涉及所述多肽的用途。
【背景技術】
[0002]獲得性免疫缺陷綜合征(AcquiredImmune Deficiency Syndrome, AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)感染引起的。艾滋病目前在世界范圍內流行，對人類的健康造成了嚴重的威脅。HIVl型(HIV-1)是造成AIDS感染的主要病原體。接種疫苗是預防HIV-1 感染的最佳途徑，然而艾滋病疫苗的研發(fā)屢受挫折，迄今沒有取得突破性的進展。
[0003]HIV-1感染宿主細胞是一個復雜的過程，包括吸附、進入、脫殼、逆轉錄、整合、復制、轉錄、翻譯、裝配、成熟等各個階段。上述過程的每個階段均涉及特異性的酶或蛋白參與作用，他們都可能成為藥物的有效靶點。目前臨床上治療HIV感染的藥物分為4大類:逆轉錄酶抑制劑(包括核苷類逆轉錄酶抑制劑和非核苷類逆轉錄酶抑制劑)、蛋白酶抑制劑、整合酶抑制劑、進入抑制劑(輔助受體CCR5拮抗劑)和融合抑制劑。
[0004]美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration, FDA)批準上市的融合抑制劑僅有2003年上市的T20。臨床使用時發(fā)現，HIV病毒融合抑制劑單獨應用即可降低病毒的荷載量，并且副作用較低。與逆轉錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑聯合使用，不僅可以降低這兩種藥的使用量，降低副作用，是當前抗HIV藥物研究的熱點方向。
[0005]盡管T20的發(fā)現開辟了利用肽類藥物控制HIV的新領域，但是由于T20本身的不足限制了其發(fā)展。首先是耐藥性，因為T20完全衍生于HIV-1跨膜蛋白gp41的天然序列，對靶標突變的敏感性較高，靶標序列單個氨基酸殘基的突變就會導致T20的活性降低。其次，T20易被胃酸破壞，只能進行皮下注射。第三T20在體內的生物利用度極低，成人給藥量為180mg/人,每日兩次。
[0006]C34 是一種衍生于 gp41C 端重復序列(C-terminal heptad repeat, CHR)的多肽，與T20不同之處的是C34的N端含有Trp628、Trp631和Ile635，這三個殘基能夠與gp41N端的疏水口袋結合，從而抑制gp41形成三聚體。而且這三個殘基具有高度的序列保守性，病毒不易對C34產生耐藥性。然而C34水溶性極差，很難發(fā)展成藥物，但由于擁有CHR的核心序列，所以可以作為新型抗病毒多肽的設計模板。T1249是T20的第二代產品，它的氨基端類似于C34的N端，羧基端類似于T20的C端，是一個嵌合序列39肽，由HIV-1、HIV_2以及猿免疫缺陷病毒(SIV) CHR區(qū)域相關序列構成，與T20相比，在N端增加了與HIV的N端疏水口袋結合的序列。盡管T1249的活性比T20高出一個數量級，但gp41N端重復序列(N-terminal heptad repeat,NHR)突變仍然對其產生耐藥性，出于對制劑和市場等方面的考慮，Trimeris/Roche公司終止了 T1249的臨床研究?；贑34的序列，國內設計了抗HIV多肽西夫韋肽(Sifuvirtide)，安全性和耐受性良好，于2010年順利完成了 II b期臨床研究。[0007]由于第一、第二代多肽融合抑制都存在較大的問題，因此研發(fā)第三代或下一代高效的融合抑制劑多肽具有重要的理論意義和應用價值。
[0008]參考文獻:
[0009][I] Peisajovich SG，Gallo SA，Blumenthal Rj Shai Y.C-terminaloctyIation rescues an inactive T20mutant_Implications for the mechanismof HIV/simia nimmunodeficiency virus-1nduced membrane fusion.J BiolChemj 2003，278(23):21012-21017.[0010][2] Tan JJj Ma XT, Liu C，Zhang XYj Wang CX.The Current Status andChallenges in the Development of Fusion Inhibitors as Therapeutics forHIV-lInfection.Curr Pharm Des，2013，19(10):1810-1817.[0011][3] Tan JJ，Cong XJj Hu LMj Wang CXj Jia Lj Liang XJ.Therapeutic strategiesunderpinning the dev elopment of novel techniques for the treatment of HIVinfection.Drug Discov Today，2010，15 (5-6):186-197.[0012][4]Nomura Wj Hashimoto Cj Suzuki T，Ohashi N，Fujino M，Murakami Tj YamamotoN，Tamamura H.Multimerized CHR-derived peptides as HIV-1fusion inhibitors.Bioorg Med Chem，2013，21(15):4452-4458.[0013][5] Hollmann A，Matos PM，Augusto MT，Castanho M，Santos NC.Conjugationof Cholesterol to HIV-1Fusion Inhibitor C34Increases Peptide-MembraneInteractions Potentiating Its Action.PLoS One，2013，8 (4).[0014][6] Chong HH，Yao X，Qiu ZLj Sun JP，Zhang Mj Waltersperger Sj Wang MT, LiuSL，Cui S，He YX.Short-peptide fusion inhibitors with high potency againstwild-type and enfuvirtide-resistant HIV-1.FASEB J，2013，27 (3):1203-1213.[0015][7]Qi Z，Shi WGj Xue N，Pan CG，Jing WGj Liu KLj Jiang SB.Rationally DesignedAnt1-HIV Peptides Containing Multifunctional Domains as Molecule Probes forStudying the Mechanisms of Action of the First and Second Generation HIV FusionInhibitors.J Biol Chem，2008，283(44):30376-30384.[0016][8]Li LZj Ben YY，Yuan SH，Jiang SB，Xu JQ，Zhang XY.Efficacy, Stability, andBiosafety of Sifuvirtide Gel as a Microbicide Candidate against HIV-1.PLoSOne, 2012，7(5).
【發(fā)明內容】

[0017]本發(fā)明的目的是提供新型的抑制HIV病毒與宿主細胞融合的非對映體多肽，該類多肽的作用位點與現有的藥物不同，并且水溶性較好、活性高、不易被蛋白酶水解。
[0018]抑制HIV病毒與宿主細胞融合的非對映體多肽，其特征在于:所述非對映體多肽為下述a)或b)或c):
a)序列表中序列I所示多肽CT105；
b)序列表中序列2所示多肽CT106；
c)序列表中序列3所示多肽CT107。
或者上述a)或b)或c)所述多肽的氨基端連接氨基保護基和/或羧基端連接羧基保護基得到的化合物；
或者上述a)或b)或c)所述多肽的羧基端連接膽固醇或親脂性基團得到的化合物；或者上述a)或b)或c)所述多肽被聚乙二醇、馬來酰亞胺修飾得到的化合物。
使用上述的多肽和/或化合物形成的聚合物。
一種組合物，它由兩部分構成，第一種為上述任意的多肽、化合物、和/或聚合物；另一種為載體或輔料。
上述的多肽或化合物，或上述的聚合物，或上述的組合物至少應用于如下一種產品:
Cl)治療艾滋病病人的產品，如藥物或治療性疫苗；
c2)預防艾滋病病毒感染的產品；
c3)輔助治療艾滋病病人的產品；
c4)抑制艾滋病病毒進入宿主細胞的產品。
[0019]本發(fā)明所述的第一條多肽的名稱為CT105，其殘基酸序列如序列表中序列I所示。
[0020]為了提高多肽的穩(wěn)定性，所述序列I的第I位氨基酸殘基連接有氨基酸保護基，所述序列I的第38位氨基酸殘基連接有羧基保護基。
[0021]本發(fā)明所述的 第二條多肽的名稱為CT106，其殘基酸序列如序列表中序列2所示，在序列中加入了 D-型氨基酸。
[0022]為了提高多肽的穩(wěn)定性，所述序列2的第I位氨基酸殘基連接有氨基酸保護基，所述序列2的第38位氨基酸殘基連接有羧基保護基。
[0023]本發(fā)明所述的第三條多肽的名稱為CT107，其殘基酸序列如序列表中序列3所示。
[0024]為了提高多肽的穩(wěn)定性，所述序列3的第I位氨基酸殘基連接有氨基酸保護基，所述序列3的第38位氨基酸殘基連接有羧基保護基。
[0025]上述氨基端保護基可為:叔丁氧羰基、芐氧羰基、2-聯苯基-2-丙氧羰基、鄰苯二甲酰亞胺基、對甲苯磺?；?、三苯甲基、甲酰基、三氟乙?；?；所述羧基保護基可為:叔丁基，甲基，乙基，芐基，稀丙基，五氣帶苯基，對甲氧芐基，等。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為用非變性凝膠電泳分析HIV-lgp415-helix、6_helix與C34標(A)或CT105(B)的相互作用。
[0027]圖 2SDS 對 HIV-lgp415-helix 與 C34 標(A)以及 HIV-lgp415_helix 與 CT105 (B)相互作用的影響。
[0028]圖3是CT105感染細胞的抑制率(假病毒法)。
[0029]圖4是CT106感染細胞的抑制率(假病毒法)。
[0030]圖5是CT107感染細胞的抑制率(假病毒法)。
【具體實施方式】
[0031]下述實施例中所使用的實驗方法如果沒有特別說明，均為常規(guī)方法。
[0032]下述實施例中所使用的試劑、材料等，如果沒有特別說明，均為從商業(yè)途徑獲得。
[0033]以下的優(yōu)先實施例對本發(fā)明作詳細說明，但不意味著限制本發(fā)明的內容。
[0034]實施例1.多肽合成及修飾[0035]1.1材料及儀器
[0036]所需的化學試劑均來源于化學試劑供應商，使用前未純化。儀器設備有固相合成管，TS-2搖床，Multifuge XlR離心機，DZF6050型真空干燥器等。
[0037]1.2多肽合成
[0038]采用經典的固相合成法合成多肽。以羧基樹脂為固相載體，以二甲基甲酰胺(dimethylformamide,DMF)和二氯甲燒(dimethylformamide,DCM)為洗脫溶劑，以六氫批P定(piperidine)為脫保護試劑。首先取適量樹脂粉末，用DMG溶脹30min，然后用DMF清洗數次后抽干，此時樹脂準備完畢，可開始偶聯氨基酸。合成步驟如下:(I)脫保護:用DMF配制新鮮的20%的六氫吡啶溶液，取2-3mL上述溶液潤洗樹脂，抽干后再加入5mL上述溶液，放入搖床高速搖轉20min ; (2)清洗:抽去廢液，依次用DMF，DCM和DMF分別徹底沖洗樹脂3_5遍；(3)偶聯:用DMF配置新鮮的脲正離子型縮合劑(HATU)，取1.6mL加入稱量好的氨基酸中(0.lmol)，再加入0.4mL N, N-二異丙基乙胺(DIEA)，混勻后與樹脂混合，置于搖床高速搖轉25min ； (4)清洗:抽去廢液，依次用DMF，DCM和DMF分別徹底沖洗樹脂3_5遍。如此反復上述步驟，每個循環(huán)結束后，樹脂上都會耦合上一個氨基酸殘基。直到所有氨基酸殘基都耦合完成后，即可將樣品真空干燥以備后用。
[0039]1.3多肽的分離及純化
[0040]上述干燥后的樣品為連在樹脂上的多肽，需將合成的多肽從樹脂上分離才可得到完整可用的多肽。分離步驟如下:(1)用三氟乙酸(TFA)潤洗干燥的合成管并放入連有多肽產物的樹脂；(2)用乙二硫醇(EDT)、苯甲硫醚、苯甲醚和TFA分別以0.3:0.5:0.2:9的比例配置新鮮的切離混合液(ImL混合液可切離50-60mg產物)，與多肽產物混合，在搖床上搖轉1-2個小時；(3)將反應后液體轉移至潔凈容器中，加入無水乙醚并靜置，直到多肽全部析出并沉淀；棄掉上清，用無水乙醚重懸多肽沉淀，并以7000r的速度離心IOmin,重復三次；(4)將離心所得沉淀真空干燥即可獲得純化后的多肽。
[0041]實施例2.多肽的分子量及純度
[0042]2.1材料及儀器
[0043]所需的化學試劑均來源于化學試劑供應商，使用前未純化。儀器設備有質譜儀(型號=Autoflex MALD1-T0F，廠家:德國Bruker公司)，分析型高壓液相色譜(型號:Waters2695,廠家:ffaters 公司)。所用試劑乙臆(acetonitrile)、甲酸(Formic acid)均為HPLC級別，實驗用水為Mi 11 iQ處理后的三蒸水。
[0044] 2.2多肽的分子量測定。(I)樣品制備:取切離后的干燥樣品，用含0.1%甲酸的乙腈和含0.1%甲酸的純水以1:1的比例溶解；(2)點靶:取溶解后樣品I μ L點于樣靶上，待液體揮發(fā)干后，取I μ L CCA基質點于相同靶點與樣品混勻，待自然干燥后置儀器中測定，測定的結果見表1。
[0045]2.3多肽的純度的測定。(I)樣品準備:秤取適量樣品，用含0.1%甲酸的乙腈和含0.1%甲酸的純水以1:1的比例溶解，并過濾；(2)系統(tǒng)準備:在并不接柱子的情況下，分別用100%的純水和ACN清洗系統(tǒng)；只將柱子的入口端與儀器連接，出口端豎直向上放置，用100%ACN沖洗系統(tǒng)并將流速從0.1緩慢上調至lmL/min ;待柱子出口端有液滴均勻流出后，將出口端接入系統(tǒng)；緩慢調整流動相比例至洗脫梯度的起始比例(95%水和5%ACN)，維持30min左右，至檢測器中的基線平穩(wěn)為止；(3)進樣測定:分別取100 μ L樣品溶液和50%ACN溶液(含0.1%甲酸)加入樣品瓶中，將樣品瓶置于樣品盤中并記錄下位置，即可進樣。一般在測量樣品前會先進行一次空樣(純溶劑)測定作為對照。
測定結果見表1。
[0046]表1合成多肽的分子量及純度
【權利要求】
1.抑制HIV病毒與宿主細胞融合的非對映體多肽，其特征在于:所述非對映體多肽為下述a)或b)或c): a)序列表中序列I所示多肽CT105； b)序列表中序列2所示多肽CT106； c)序列表中序列3所示多肽CT107。
2.應用權利要求1所述抑制HIV病毒與宿主細胞融合的非對映體多肽得到的化合物，其特征在于:或者上述a)或b)或c)所述多肽的氨基端連接氨基保護基和/或羧基端連接羧基保護基得到的化合物； 或者上述a)或b)或c)所述多肽的羧基端連接膽固醇或親脂性基團得到的化合物； 或者上述a)或b)或c)所述多肽被聚乙二醇、馬來酰亞胺修飾得到的化合物。
3.使用權利要求1-2中任意所述的多肽和/或化合物形成的聚合物。
4.一種組合物，它由兩部分構成，第一種為權利1-3中所述任意的多肽、化合物、和/或聚合物；另一種為載體或輔料。
5.權利要求1-2中任意所述的多肽或化合物，或權利要求3所述的聚合物，或權利4所述的組合物至少應用于如下一種產品: Cl)治療艾滋病病人的產品，如藥物或治療性疫苗； c2)預防艾滋病病毒感染的產品； c3)輔助治療艾滋病病人的產品； c4)抑制艾滋病病毒進入宿主細胞的產品。
【文檔編號】A61K39/12GK103724404SQ201310671634
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月8日 優(yōu)先權日:2013年12月8日
【發(fā)明者】譚建軍, 苑紅領, 曾毅, 李春華, 劉斌, 張小軼, 王存新 申請人:北京工業(yè)大學