專利名稱：適合于癌癥治療的包含體外擴(kuò)增的t淋巴細(xì)胞和血管形成抑制劑的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改進(jìn)的療法，其包含血管形成抑制劑的抑制劑、尤其是VEGF的抑制 劑，其與通過腫瘤反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的體外擴(kuò)增和活化方法獲得的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞、 特別是⑶4+輔助細(xì)胞和/或⑶8+T淋巴細(xì)胞組合。腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞不是⑶4+⑶25+Hi 淋巴細(xì)胞，即本發(fā)明不涵蓋調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞。此外，在本發(fā)明中使用的腫瘤反應(yīng)性T淋巴 細(xì)胞與所謂的腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(TIL)不同。在本發(fā)明中使用的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì) 胞不是所謂的SNAL(前哨淋巴結(jié)獲得性淋巴細(xì)胞)或MNAUMetinel淋巴結(jié)獲得性淋巴細(xì) 胞)。本發(fā)明還涉及包含血管形成抑制劑的抑制劑、尤其是VEGF的抑制劑和腫瘤反應(yīng)性T 淋巴細(xì)胞的組合物。一般來說，為了實(shí)現(xiàn)在劑量、給藥途徑和給藥時(shí)間方面具有靈活性的適 合的治療方案，組合物包含兩種分開的制劑，一種含有一種或多種血管形成抑制劑的抑制 劑，另一種含有腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞。腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞可以通過腫瘤反應(yīng)性淋巴 細(xì)胞、特別是CD4+輔助細(xì)胞和/或CD8+T淋巴細(xì)胞的體外擴(kuò)增和活化方法獲得。
背景技術(shù)：
根據(jù)免疫監(jiān)視假說，免疫系統(tǒng)持續(xù)敏化以對(duì)抗形成中的腫瘤，實(shí)驗(yàn)證據(jù)強(qiáng)烈支持 這一看法。特異性腫瘤抗原的鑒定已產(chǎn)生用于腫瘤免疫療法的新的可能性，并且許多免疫 治療方法現(xiàn)在正轉(zhuǎn)化成臨床試驗(yàn)。其中，腫瘤抗原特異性淋巴細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移似乎特別有 前途。到目前為止，這些嘗試通常是基于來自外周血的單核細(xì)胞或從新鮮腫瘤樣本分離的 腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(TIL)。在最近的試驗(yàn)中，使用擴(kuò)增的TIL的自體轉(zhuǎn)移治療患有惡性黑 素瘤的患者，已報(bào)道客觀應(yīng)答率高達(dá)51%。TIL細(xì)胞很少，由于來自腫瘤的免疫抑制機(jī)制， 它們通常是無應(yīng)答性的(無反應(yīng)性的)，導(dǎo)致需要進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的擴(kuò)增(幾個(gè)月)。此外，方 案旨在擴(kuò)增⑶8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞，并且已經(jīng)將細(xì)胞重新導(dǎo)入用化療預(yù)先處理的患者中，此 外患者已經(jīng)用高劑量的白介素-2治療，以提供CD8+T細(xì)胞的存活。血管形成、也稱為新生血管化，是用于形成新血管的基礎(chǔ)過程。在正常生理?xiàng)l件 下，血管形成受到高度調(diào)控，并且對(duì)于生殖、胚胎發(fā)育、組織修復(fù)和傷口愈合來說是必不可 少的。但是，在各種病理情況下也發(fā)生血管形成，這些病理情況包括腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、炎性 疾病例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、骨關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、Crohn' s病、潰瘍性結(jié)腸炎以及與 眼部新生血管化相關(guān)的各種眼部疾病。事實(shí)上，血管形成是對(duì)各種不同促血管形成刺激物 例如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和其他生理分子以及其他因素例如缺氧和低pH做出響應(yīng)而發(fā)生 的。新血管發(fā)生的血管形成級(jí)聯(lián)反應(yīng)需要調(diào)控所需細(xì)胞過程例如細(xì)胞外基質(zhì)(ECM) 重塑、侵入、遷移、增殖、分化和管形成的各種分子的協(xié)作。在起始階段后，促血管形成分 子例如VEGF、bFGF、PDGF等通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞表面受體(例如VEGFR1/Flt_l和VEGFR2/ Flk-1/KDR)活化內(nèi)皮細(xì)胞。這些被活化的細(xì)胞經(jīng)歷了一系列細(xì)胞增殖、細(xì)胞粘附分子表達(dá) 增加、蛋白水解酶分泌增加和細(xì)胞遷移和侵入增加的過程。許多不同分子參與促進(jìn)增殖和 侵入，包括用于粘附的整合蛋白、選擇蛋白和免疫球蛋白基因超家族的成員，以及用于降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白水解酶例如基質(zhì)金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶。最后，生物化學(xué)信號(hào)的復(fù) 雜級(jí)聯(lián)反應(yīng)由與細(xì)胞外基質(zhì)組分和可溶性因子的相互作用的細(xì)胞表面受體產(chǎn)生，導(dǎo)致管腔 形成并分化成成熟血管。由于VEGF與前面提到的各種疾病的內(nèi)在關(guān)聯(lián)，VEGF被認(rèn)為是用于抗癌治療的有 吸引力的靶，特別是與常規(guī)的化療、放療和其他抗血管形成藥劑組合。在本技術(shù)領(lǐng)域中已知 許多血管形成抑制劑(VEGF和VEGF相關(guān)抑制劑)?？梢蕴岬降氖抢鏥EGF抑制性適體； 例如Macugen (哌加他尼，輝瑞)抗體或其片段；例如抗VEGF抗體，例如Avastin (貝 伐單抗(bevacizumab)，Genentec)，或其片段例如 Lucentis (蘭尼單抗(ranibizumab)， Genentec)，已經(jīng)出現(xiàn)在市場(chǎng)上。但是，正如前面指出的，例如Avastin 的使用要求療法與抑制細(xì)胞的化合物組合 才具有治療效果。此外，例如Avastin 的使用在用作組合療法時(shí)已顯示出多種不想要的 副作用。主要的副作用是高血壓和出血的風(fēng)險(xiǎn)升高。腸穿孔已有報(bào)道。腦部毛細(xì)血管滲漏 綜合征、鼻中隔穿孔和腎臟血栓性微血管病也已有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
在癌癥治療中使用例如通過本文公開的根據(jù)WO 2004/032951和WO 2007/071388(屬于同一申請(qǐng)人)的方法獲得的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，并與一種或多種 VEGF抑制劑組合，設(shè)想將可以有效的方式治療癌癥。尤其是設(shè)想到將可以獲得改進(jìn)的治療。 因此，設(shè)想到與使用本文描述的免疫療法或VEGF抑制劑的治療相比，將獲得改進(jìn)的治療。 通過使用VEGF抑制劑產(chǎn)生血管形成的阻斷，將會(huì)增加氧氣的缺乏即缺氧癥，導(dǎo)致癌細(xì)胞壞 死，所述癌細(xì)胞將被吸收，并引起免疫系統(tǒng)的呈遞和活化加強(qiáng)。因此，免疫療法與VEGF抑制 劑的組合似乎彼此補(bǔ)充。將可能獲得下列一種或多種有益效果a)總體存活率的提高(優(yōu)選情況下，與不使用一種或多種VEGF抑制劑的腫瘤反 應(yīng)性T淋巴細(xì)胞治療相比，或可選地，與使用相同的VEGF抑制劑和在特定癌癥類型的治療 中經(jīng)常使用的細(xì)胞抑制化合物的治療相比)，即提高至少10%，例如至少約20%、至少約 30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%或至少約80% ；b)腫瘤尺寸的減小(在實(shí)體腫瘤的情況下)；腫瘤尺寸可以使用RECIST判據(jù)通過 CT掃描、MRI或超聲波進(jìn)行測(cè)量，并且減小至少10%，例如至少約20%、至少約30%、至少 約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%或至少約80% ；C)轉(zhuǎn)移的消退，例如使用RECIST判據(jù)通過CT掃描測(cè)量到的；消退應(yīng)該為至少 10%,例如至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70% 或至少約80% ；d)有害副作用的頻率降低；e)副作用的幅度降低；f)腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的劑量和/或一種或多種VEGF抑制劑的劑量降低(與 在不使用一種或多種VEGF抑制劑的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞治療中腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞 的劑量相比，或可選地，與使用相同的VEGF抑制劑和在特定癌癥類型的治療中經(jīng)常使用的 細(xì)胞抑制化合物的治療相比)，即腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞和/或一種或多種VEGF抑制劑劑 量降低至少10%，例如至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%或至少約80%。應(yīng)該理解，本發(fā)明的相關(guān)T淋巴細(xì)胞源自于淋巴結(jié)、典型為前哨淋巴結(jié)(SEAL)和 / 或 metinel 淋巴結(jié)(MEAL)。因此，本發(fā)明涉及組合物，其包含a) 一種或多種VEGF抑制劑，以及b)腫瘤反應(yīng)性⑶4+T輔助細(xì)胞和/或⑶8+T淋巴細(xì)胞。正如上面提到的，這樣的組合物一般包含兩種分開的制劑，各含一種有效成分。此 外，使用的腫瘤反應(yīng)性CD4+T輔助細(xì)胞和/或CD8+T淋巴細(xì)胞與腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(TIL) 不同。此外，預(yù)計(jì)與同樣劑量/數(shù)量的組分單獨(dú)給藥相比，組合將具有累加或協(xié)同效果。組合療法特別適合于可以從前哨或metinel淋巴結(jié)產(chǎn)生腫瘤反應(yīng)性細(xì)胞的情況。 在這樣的情況下，腫瘤反應(yīng)性細(xì)胞可以來自同一患者，即細(xì)胞是自體的。但是，不能排除在 某些情況下同種異體移植可以提供有效的治療。定義術(shù)語“腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞”是指帶有特異性針對(duì)并識(shí)別腫瘤抗原的T細(xì)胞受 體的T淋巴細(xì)胞。術(shù)語“T輔助細(xì)胞”是指活化時(shí)促進(jìn)獲得性免疫應(yīng)答的T淋巴細(xì)胞。術(shù)語“Thl細(xì)胞”是指當(dāng)使用細(xì)胞因子例如IFN- Y活化時(shí)促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng) 答的T輔助細(xì)胞。術(shù)語“Th2細(xì)胞”是指當(dāng)使用細(xì)胞因子例如IL-4活化時(shí)促進(jìn)體液免疫應(yīng)答的T輔 助細(xì)胞。術(shù)語“⑶4+輔助性T淋巴細(xì)胞”是指表達(dá)⑶4的T淋巴細(xì)胞；即它們是⑶4+T淋 巴細(xì)胞，不被當(dāng)作具有標(biāo)記物例如高的CD25表達(dá)和F0XP3表達(dá)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。術(shù)語“⑶8+T淋巴細(xì)胞”是指表達(dá)⑶8的T淋巴細(xì)胞。術(shù)語“調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞”是指抑制獲得性免疫應(yīng)答、表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子R)xP3的T淋 巴細(xì)胞。術(shù)語T淋巴細(xì)胞的“特異性活化”是指抗原特異性的、MHC限制的、T細(xì)胞受體介導(dǎo) 的活化。相比之下，術(shù)語T淋巴細(xì)胞的“非特異性活化”泛指所有T細(xì)胞的活化，不論T細(xì) 胞受體特異性如何。術(shù)語“腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞”或“TIL”是指離開血流并遷移到腫瘤中的白血細(xì)胞 (白細(xì)胞)。治療性TIL通常是由自體TIL構(gòu)成的細(xì)胞制備物，其在體外被操作，并且在體 內(nèi)給藥后重新浸潤(rùn)腫瘤以引發(fā)腫瘤細(xì)胞裂解。治療性TIL從腫瘤組織分離。因此，定義TIL 的是淋巴細(xì)胞的位置。根據(jù)定義，TIL是在腫瘤組織中收獲的淋巴細(xì)胞。但是，它們?cè)诠δ?上通常是不同的，因?yàn)樗鼈円呀?jīng)受腫瘤誘導(dǎo)的抑制，并帶有例如指示功能性抗腫瘤應(yīng)答的 關(guān)閉的表觀遺傳標(biāo)志物，正如我們最近發(fā)現(xiàn)的(P Jansson, J immunol，2008)。術(shù)語“腫瘤來源的抗原”打算涵蓋腫瘤細(xì)胞、腫瘤的勻漿液(所述勻漿液可以被變 性)、或腫瘤蛋白、多肽或肽，例如以純化、天然、合成和/或重組蛋白、多肽或肽的形式。腫 瘤來源的抗原可以是完整分子、其片段或完整分子和/或片段的多聚體或聚合體。適合的 多肽和肽的實(shí)例是包含約5到約30個(gè)或約1-1000個(gè)氨基酸例如約10到25個(gè)氨基酸、約10到20個(gè)氨基酸或約12到18個(gè)氨基酸，或例如約30-50個(gè)氨基酸、約70-100個(gè)氨基酸、 約200-500個(gè)氨基酸或約500-1000個(gè)氨基酸的多肽和肽。如果使用肽(例如在本文參考實(shí) 施例1中描述的自體方法中)，在培養(yǎng)物中的終摩爾濃度一般為約0. 1到約5. 0 μ Μ，例如可 以使用約0. 1到約4. 0 μ Μ、約0. 2到約3. 0 μ Μ、約0. 3到約2. 0 μ M或約0. 3到約1. 0 μ Μ。 腫瘤來源的抗原可以是自體的或異體的，即從待治療的患者產(chǎn)生或從另一個(gè)患有癌癥的對(duì) 象獲得。在本發(fā)明的實(shí)施例中，發(fā)明人使用了自體的變性腫瘤提取物，但是，正如前面提到 的，其他來源的腫瘤來源的抗原也可能適用于本發(fā)明。術(shù)語“前哨淋巴結(jié)”是指接受來自腫瘤的淋巴引流液的第一個(gè)淋巴結(jié)。術(shù)語 “metinel淋巴結(jié)”是指接受來自轉(zhuǎn)移腫瘤的淋巴引流液的第一個(gè)淋巴結(jié)。術(shù)語“副作用頻率的降低”是指在使用組合進(jìn)行治療的臨床試驗(yàn)中觀察到的有害 副作用，與如果使用單獨(dú)組分進(jìn)行治療的情況相比頻率較低。術(shù)語“有害副作用”是指對(duì)藥物的反應(yīng)是有害的和不是有意的，并且其發(fā)生在通常 在人類中用于疾病的預(yù)防、診斷或治療或用于改變生理功能的劑量下。術(shù)語“副作用的幅度降低”是指任何可測(cè)量的副作用的測(cè)量到的幅度和/或頻率 降低。正如上面提到的，組合給藥可以引起累加或協(xié)同效果。典型情況下，如果獲得的效 果相當(dāng)于組合單獨(dú)給藥時(shí)所獲得的效果的“加和”，存在累加效果，而如果獲得的效果高于 組合單獨(dú)給藥時(shí)所獲得的效果的“加和”，存在協(xié)同效果。兩種情況都是有利的，因?yàn)槟軌蚴?用較低量的組分獲得足夠的效果。術(shù)語“單克隆抗體”是指都是由同一親本細(xì)胞的克隆的一種類型的免疫細(xì)胞產(chǎn)生 的相同的單特異性抗體。該定義還包括保留了與VEGF或其受體的相關(guān)免疫反應(yīng)性的抗體 的片段、部分或形式。術(shù)語“表位”、也稱為抗原決定簇，是指大分子被免疫系統(tǒng)識(shí)別的部分。術(shù)語“多克隆抗體”是指源自于不同B細(xì)胞系的抗體。它們是針對(duì)特異性抗原分 泌的各識(shí)別不同表位的免疫球蛋白分子的混合物。術(shù)語“VEGF”是指被分類為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子蛋白的蛋白類別。該定義還包括 VEGF的任何亞型、同種型或表位。術(shù)語“ VEGF抑制劑”、“抗血管形成化合物”、“血管形成抑制劑”可以互換使用，是 指抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的活性或產(chǎn)生的化合物或多種化合物。它是指例如在核 酸水平上抑制VEGF表達(dá)的蛋白例如單克隆抗體、抗體、抗體片段或肽(環(huán)狀或非環(huán)狀)、核 酸、siRNA、核酶，以及抑制VEGF的小分子。該術(shù)語還指VEGF的所有同種型、亞型和表位的 抑制劑。術(shù)語“藥物賦形劑”或“可藥用賦形劑”可以互換使用，是指任何用作藥物活性成 分的載體的無治療活性的物質(zhì)。術(shù)語“相關(guān)T淋巴細(xì)胞”是指特異性針對(duì)所靶向的癌癥類型的腫瘤反應(yīng)性CD4+輔 助細(xì)胞和/或CD8+T淋巴細(xì)胞。術(shù)語“組合物”是指單獨(dú)地或以任何組合形式構(gòu)成組合物的一種或多種獨(dú)立實(shí)體 或制備物。因此，該術(shù)語被用于指稱各自在獨(dú)立的制備物中的相關(guān)T淋巴細(xì)胞、一種或多 種VEGF抑制劑和任選的化療化合物；或相關(guān)T淋巴細(xì)胞在一種獨(dú)立制備物中，一種或多種
9VEGF抑制劑和任選的化療化合物在另一種或其他獨(dú)立制備物中。該術(shù)語也可用于指稱相 關(guān)T淋巴細(xì)胞、VEGF抑制劑和任選的化療化合物的一種單一組合物，只要所有活性成分在 相同時(shí)間點(diǎn)適時(shí)地并通過相同給藥途徑給藥。在下文中，術(shù)語“免疫治療組分”用于指稱T淋巴細(xì)胞組分，“抗血管形成組分”用 于指稱含有一種或多種VEGF抑制劑的組分，即本發(fā)明的組合物中的兩種必備組分。免疫治療組分——腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞本發(fā)明人以前已經(jīng)顯示，未接觸過抗原的T細(xì)胞的活化可以在次級(jí)淋巴器官例如 前哨淋巴結(jié)的高度特化的微環(huán)境中發(fā)生。換句話說，前哨淋巴結(jié)可以被當(dāng)作免疫系統(tǒng)遇到 腫瘤抗原的原始位點(diǎn)。本發(fā)明人以前公開了用于從前哨淋巴結(jié)擴(kuò)增腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的通用方法， 顯示了能夠?qū)那吧诹馨徒Y(jié)獲得的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)以獲得腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的培 養(yǎng)物(W0 2004/03^51和W02007/071388，二者在此引為參考)。通過向移除前哨淋巴結(jié)的 患者給藥有效量的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞可用于治療癌癥。相關(guān)T淋巴細(xì)胞通過擴(kuò)增腫瘤反應(yīng)性⑶4+輔助細(xì)胞和/或⑶8+T淋巴細(xì)胞的方 法獲得，其中特異性培養(yǎng)條件已被確定和優(yōu)化，并且其中在整個(gè)擴(kuò)增階段中監(jiān)測(cè)T淋巴細(xì) 胞上和培養(yǎng)基中的特異性標(biāo)志物，以便在可能的最短時(shí)間跨度內(nèi)獲得大量腫瘤反應(yīng)性T淋 巴細(xì)胞。此外，本發(fā)明同時(shí)還提供了引導(dǎo)腫瘤反應(yīng)性CD4+輔助細(xì)胞和/或CD8+T淋巴細(xì)胞 朝向特異性亞群發(fā)育的方法。T淋巴細(xì)胞不是CD4+CD25+Hi淋巴細(xì)胞，即本發(fā)明不包含調(diào)節(jié) 性T淋巴細(xì)胞。表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子R)xP3的CD4+CD25mT淋巴細(xì)胞被認(rèn)為是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CTreg)。1Treg 具有通過抑制活化和增殖來調(diào)控T輔助細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的性質(zhì)，此外Treg抑制有用 的Thl細(xì)胞因子例如IFN-γ的產(chǎn)生和釋放。因此，本發(fā)明的方法促進(jìn)T輔助細(xì)胞和T細(xì)胞 毒性T細(xì)胞的擴(kuò)增，并避免Treg細(xì)胞的擴(kuò)增?；罨摹⒃鲋车蘑?+輔助性T淋巴細(xì)胞可以分化成兩個(gè)主要細(xì)胞亞類，Thl和 Th2細(xì)胞，它們根據(jù)產(chǎn)生的特異性細(xì)胞因子來定義。Thl細(xì)胞產(chǎn)生Y-干擾素和白介素 12(IL-12)，而Th2細(xì)胞產(chǎn)生白介素-4、白介素-5和白介素-13。Thl T淋巴細(xì)胞據(jù)信促進(jìn) 細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Tc)、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的活化，所有這些細(xì)胞都能攻擊癌 細(xì)胞并普遍防御腫瘤。Thl和Th2類型的T-輔助(⑶4+)淋巴細(xì)胞能夠分化成記憶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞。記 憶性T-輔助(CD4+)淋巴細(xì)胞特異性針對(duì)它們首次遇到的抗原，并能夠在第二次免疫應(yīng)答 期間被喚醒，喚起針對(duì)腫瘤抗原的更快速和強(qiáng)烈的應(yīng)答。在人類中有證據(jù)表明淋巴細(xì)胞存 活至少20年，并可能終生。效應(yīng)性⑶4+T淋巴細(xì)胞是產(chǎn)生細(xì)胞因子和INF- γ的活性細(xì)胞。因此，本發(fā)明涵蓋了⑶4+輔助T淋巴細(xì)胞，包括Thl和Th2亞型和從其衍生的記 憶和效應(yīng)細(xì)胞以及⑶8+T淋巴細(xì)胞的應(yīng)用。最經(jīng)常通過參考實(shí)施例中描述的方法產(chǎn)生的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞是CD4+輔助 T淋巴細(xì)胞。在某些情況下，擴(kuò)增方法的一個(gè)目的是模擬患者自身免疫系統(tǒng)的天然途徑，并 在某種程度上讓患者的免疫系統(tǒng)的成分根據(jù)呈遞抗原的是MHC I還是MHC II來確定首先 產(chǎn)生的是⑶4+輔助細(xì)胞還是⑶8+T淋巴細(xì)胞。在大多數(shù)情況下，抗原將被II類MHC分子 呈遞，導(dǎo)致⑶4+輔助T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生。但是，在某些情況下產(chǎn)生⑶8+T淋巴細(xì)胞。如果產(chǎn)生CD4+輔助T淋巴細(xì)胞，它們將按照本文的描述進(jìn)一步擴(kuò)增；但是，該方法也可用于擴(kuò)增 ⑶8+細(xì)胞。本發(fā)明人以前已提出了用于擴(kuò)增相關(guān)T淋巴細(xì)胞的詳細(xì)方法(W02007/071388 和W02004/03^51)，它們?cè)诖艘秊閰⒖肌５牵部梢允褂闷渌椒?，只要能夠產(chǎn)生⑶4+輔 助T淋巴細(xì)胞和/或⑶8+T淋巴細(xì)胞而沒有顯著含量的Treg細(xì)胞、即高達(dá)的細(xì)胞可以 是Treg細(xì)胞、優(yōu)選沒有細(xì)胞是Treg細(xì)胞即可。Th2細(xì)胞產(chǎn)生刺激B細(xì)胞的細(xì)胞因子。這將不導(dǎo)致腫瘤的縮小，因此應(yīng)該避免Th2 細(xì)胞的大量出現(xiàn)。相反，Thl細(xì)胞促進(jìn)CD8細(xì)胞毒性細(xì)胞，因此將破壞腫瘤細(xì)胞。為了顯 著避免Th2類型的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生，可以添加一種或多種能夠拮抗Th2型T 淋巴細(xì)胞的發(fā)育的物質(zhì)。這樣的物質(zhì)的實(shí)例是能夠中和白介素IL-4、IL-5、IL-10和/或 TGF-β (后者不是白介素)的物質(zhì)，所有這四種物質(zhì)都為建立Th2細(xì)胞因子分布和下調(diào)Thl 細(xì)胞因子生產(chǎn)所需。這樣的物質(zhì)的實(shí)例包括蛋白、多肽、肽、可溶性受體、抗體、親合體(affibody)及 其片段、融合蛋白、合成和/或有機(jī)分子例如小分子，以及天然配體。在具體實(shí)施方案中，物 質(zhì)選自與白介素結(jié)合從而中和它們的抗體例如抗IL-4抗體、IL-5抗體和/或抗IL-10抗 體，以及TGF-β的可溶性受體(例如TGF-β受體I和II)和結(jié)合蛋白(例如LAP和/或 LTBP)。一種或多種能夠拮抗Th2型T淋巴細(xì)胞的發(fā)育的物質(zhì)，例如一種或多種能夠中和 11^-4、11^-5、11^-10和/或16 -0的物質(zhì)，可以在第二階段ii)的第1天添加(參見本文參 考實(shí)施例1)。但是，因?yàn)榭贵w昂貴，因此抗體的添加也可以在隨后的步驟中，在添加能夠上 調(diào)T淋巴細(xì)胞上的IL-12R的物質(zhì)后，例如在添加能夠上調(diào)T淋巴細(xì)胞上的IL-12R的物質(zhì)
后一天、兩天或三天進(jìn)行。中和物質(zhì)應(yīng)該以足以中和白介素的量添力Π，例如與待中和的白介素的量相比過量 10-100倍(摩爾)。當(dāng)使用抗體時(shí)，一般需要終濃度為約2到約^g/ml培養(yǎng)基。對(duì)于其他 類型的中和物質(zhì)來說，應(yīng)該使用提供與上述濃度的抗體同樣的效果的終濃度。為了維持對(duì)Th2型T淋巴細(xì)胞發(fā)育的抑制，可以定期、例如在階段ii)中每?jī)商臁?三天或四天向擴(kuò)增物添加附加量的一種或多種能夠拮抗Th2型T淋巴細(xì)胞發(fā)育的物質(zhì)，例 如一種或多種能夠中和IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-β的物質(zhì)。應(yīng)該理解，術(shù)語每?jī)商臁?三天或四天是指在整個(gè)擴(kuò)增過程中，從第一次添加至少一種能夠拮抗Th2型T淋巴細(xì)胞發(fā) 育的物質(zhì)后的第二天、第三天或第四天開始，在每個(gè)第二天、第三天或第四天添加至少一種 能夠拮抗Th2型T淋巴細(xì)胞發(fā)育的物質(zhì)。為了有利于Thl型腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生，第二階段ii)(參見本文參考實(shí) 施例1)可以包含添加一種或多種促進(jìn)Thl型T淋巴細(xì)胞發(fā)育的物質(zhì)。這樣的物質(zhì)的實(shí)例 是對(duì)IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)。更具體來說，物質(zhì)可以 是IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受體的激動(dòng)劑。這樣的激動(dòng)劑的實(shí)例包括蛋白、多肽、 肽、抗體、親合體及其片段、融合蛋白、合成和/或有機(jī)分子例如小分子，以及天然配體。在 具體實(shí)施方案中，物質(zhì)分別是IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受體的天然配體，例如IL-7、 IL-12、IL-15 和 / 或 IL-21。IL-12的效應(yīng)是通過刺激IL-12R來活化IFN- γ誘導(dǎo)的STAT途徑，從而促進(jìn)Thl 淋巴細(xì)胞的活化。IL-21的功能是增加朝向Thl型T淋巴細(xì)胞的增殖、活化和發(fā)育。
IL-7和IL-15都通過促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)擴(kuò)增、增加活化的Thl程序化T淋巴 細(xì)胞的數(shù)目起作用。用于提供相關(guān)T淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增方法優(yōu)選是提供Thl型⑶4+腫瘤反應(yīng)性T淋巴 細(xì)胞的擴(kuò)增方法。本發(fā)明的另一方面是通過使用本文描述的擴(kuò)增腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的 方法，獲得相對(duì)大量的記憶類型的T淋巴細(xì)胞。在癌癥治療中，被治療患者接受大量效應(yīng)性 腫瘤反應(yīng)性CD4+T淋巴細(xì)胞當(dāng)然是重要的，因?yàn)檎缜懊嫣岬降?，這促進(jìn)了細(xì)胞毒性T淋巴 細(xì)胞(Tc)、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的活化，所有這些細(xì)胞都能攻擊癌細(xì)胞并普遍抵 御腫瘤。因此，本發(fā)明的相關(guān)T淋巴細(xì)胞(⑶4+T輔助細(xì)胞和/或⑶8+反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞) 可以通過下述方法獲得用腫瘤來源的抗原連同至少一種對(duì)IL-2受體具有激動(dòng)活性的物 質(zhì)一起刺激腫瘤反應(yīng)性CD4+T輔助細(xì)胞和/或CD8+T淋巴細(xì)胞，以促進(jìn)腫瘤反應(yīng)性CD4+T輔 助細(xì)胞和/或CD8+T淋巴細(xì)胞的存活；以及活化并促進(jìn)腫瘤反應(yīng)性CD4+T輔助細(xì)胞和/或 ⑶8+T淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)，其中當(dāng)⑶4+T輔助細(xì)胞和/或⑶8+T淋巴細(xì)胞上的⑶25細(xì)胞表面 標(biāo)志物(或IL-2R標(biāo)志物)下調(diào)時(shí)啟動(dòng)第二階段ii)。通過同時(shí)給藥顯著量的記憶腫瘤反應(yīng)性⑶4+T淋巴細(xì)胞，患者獲得了長(zhǎng)達(dá)終生的 針對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)或原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移的保護(hù)。正如從本文參考實(shí)施例1顯示的，T淋巴細(xì)胞上細(xì)胞表面活化標(biāo)記物⑶25和⑶69 的表達(dá)可用于確定何時(shí)啟動(dòng)本發(fā)明的重要步驟，例如何時(shí)啟動(dòng)第二階段ii)。因此，在整個(gè) 階段i)和階段ii)中連續(xù)地、例如每?jī)商?、每三天或每四天監(jiān)測(cè)CD25和CD69的表達(dá)，可能 是有益的。但是，除了本文公開的擴(kuò)增方法之外，其他方法也可能是適合的。使用參考實(shí)施 例1中描述的方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是高的細(xì)胞產(chǎn)量，以及對(duì)方法進(jìn)行指導(dǎo)以提供所選T淋巴細(xì) 胞的可能性；但是，也存在例如較低產(chǎn)量也可接受的情況，因此也可以使用其他方法。因?yàn)楸景l(fā)明的一個(gè)目的是獲得可用于向患者給藥的包含特異性CD4+腫瘤反應(yīng)性 T淋巴細(xì)胞的組合物，因此可以在某些時(shí)間點(diǎn)收獲腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致擴(kuò)增步驟的 終止。收獲腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的最適時(shí)間點(diǎn)是T淋巴細(xì)胞上⑶25的表達(dá)下調(diào)時(shí)，其中 下調(diào)被定義為5%或以下的⑶4+T淋巴細(xì)胞和/或⑶8+T淋巴細(xì)胞群表達(dá)⑶25。最適收獲 時(shí)間點(diǎn)也可以根據(jù)產(chǎn)生的IFN-Y量的測(cè)量值來確定。IFN-Y的產(chǎn)量與初始IFN-γ產(chǎn)量相 比應(yīng)該增加至少2倍，例如增加至少3倍、至少4倍或至少5倍，所述初始IFN- γ產(chǎn)量一般 對(duì)應(yīng)于至少100pg/ml培養(yǎng)基的IFN-Y水平。包含腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞給藥的癌癥治療的成功由多種因素決定，所述因素例 如為在從前哨淋巴結(jié)擴(kuò)增細(xì)胞后獲得的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的量、即可用于灌輸?shù)交颊?中的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的量，獲得有效量腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞所需的時(shí)間，以及通過 所使用的擴(kuò)增方法獲得的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的特定亞群的濃度和比率。當(dāng)療法與一種 或多種VEGF抑制劑組合時(shí)，所有這些成功因素也被設(shè)想是重要的。在標(biāo)題“腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞”下的本段落中描述的所有詳細(xì)情況，對(duì)于包含在 含有免疫治療組分和血管形成組分的組合物中的T淋巴細(xì)胞也同樣有效?？寡苄纬山M分——血管形成抑制劑、尤其是VEGF抑制劑血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是生長(zhǎng)因子的亞家族，更具體來說是半胱氨酸結(jié)生長(zhǎng) 因子的血小板衍生的生長(zhǎng)因子家族。它們是重要的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白，參與血管發(fā)生(胚胎循環(huán)系統(tǒng)的從頭形成)和血管形成(從已存在的血管系統(tǒng)生長(zhǎng)血管)兩者。最重要的成員是 VEGF-A。其他成員是胎盤生長(zhǎng)因子(PIGF)、VEGF-B, VEGF-C和VEGF-D。已發(fā)現(xiàn)許多VEGF 相關(guān)蛋白由病毒編碼(VEGF-E)和編碼在某些蛇的毒液中(VEGF-F)。由于VEGF的固有特性，這類蛋白在癌癥治療中極為重要，并已成為使用蛋白、單 克隆抗體或抗體衍生物和作為VEGF抑制劑的小分子或VEGF所刺激的酪氨酸激酶的療法中 重要的靶。單克隆抗體或抗體衍生物的實(shí)例是貝伐單抗(Avastin 用于轉(zhuǎn)移的結(jié)腸直腸 癌、非小細(xì)胞肺癌和轉(zhuǎn)移的乳腺癌的醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥)和蘭尼單抗(Lucentis )。小分子抑 制劑的實(shí)例是舒尼替尼(Sutent⑥)、索拉非尼(Nexavar )、N-甲基_2_[ [3_[ (E) _2_吡 啶-2-基乙烯基]-IH-吲唑-6-基]硫烷基]苯甲酰胺(Axitinib )和5-[ W-[(2，3-二 甲基-2H-吲唑-6-基)(甲基)氨基]嘧啶-2-基]氨基]-2-甲基苯磺酰胺(Pazopanib )。但是，在貝伐單抗(Avastin )的情況下，已發(fā)現(xiàn)這種療法必須與標(biāo)準(zhǔn)的化療例 如基于5-氟尿嘧啶的化療或紫杉醇組合才具有療效。除了需要組合療法之外，在Avastin 治療過程中已發(fā)現(xiàn)許多副作用，例如胃腸道(GI)穿孔、傷口愈合并發(fā)癥和出血。如上所述，VEGF抑制劑的作用主要是抑制腫瘤組織中的血管形成，從而終止腫瘤 生長(zhǎng)。據(jù)認(rèn)為，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)介導(dǎo)的血管形成在腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作 用。因此，正在對(duì)抗VEGF療法作為潛在的抗癌癥療法、作為常規(guī)化療或放療的替代或輔助 療法進(jìn)行活躍的研究。用于阻斷VEGF途徑的技術(shù)包括1)針對(duì)VEGF或其受體的中和單克 隆抗體，2) VEGF受體的小分子酪氨酸激酶抑制劑，3)用作VEGF的假受體的可溶性VEGF受 體，以及4)特異性靶向VEGFmRNA的核酶。最近來自III期臨床試驗(yàn)的證據(jù)使得FDA批準(zhǔn) 了貝伐單抗、抗VEGF單克隆抗體與本技術(shù)領(lǐng)域已知的其他常規(guī)化療藥劑組合，作為轉(zhuǎn)移的 結(jié)腸直腸癌的一線療法。因此，本發(fā)明的組合物可以包含VEGF抑制劑，例如VEGF或其受體的中和單克隆抗 體、VEGF受體的小分子酪氨酸激酶抑制劑、用作VEGF的假受體的可溶性VEGF受體和特異 性靶向VEGF mRNA的核酶，或其任何組合。其他可能有用的VEGF或相關(guān)抑制劑是被分類為屬于下列一種或多種的單克隆或 多克隆或重組抗體抗VEGF A、B、C、D、E或F抗體，包括所有亞型抗VEGF受體1或2抗體抗FLT 1或4抗體抗KDR抗體抗NRPl或2抗體抗VEGFR 1-4 抗體抗ARHGEF4 抗體抗前動(dòng)力蛋白1抗體抗-神經(jīng)纖毛蛋白1抗體抗促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子受體2抗體抗FIGF 抗體。設(shè)想任何血管形成的抑制劑可以與免疫療法組合使用。因此，抑制劑可以是VEGF抑制劑，包括抗VEGF抗體(例如單克隆或多克隆抗體或重組抗體)或其片段。與免疫療 法、尤其是本文中示例的免疫療法組合使用的血管形成抑制劑，包括在本文中具體公開的 那些。在標(biāo)題“血管形成抑制劑、尤其是VEGF抑制劑”下的本段落中描述的所有詳細(xì)情 況，對(duì)于包含在含有免疫治療組分和血管形成組分的組合物中的VEGF抑制劑也同樣有效。組合療法現(xiàn)在，本發(fā)明人令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，將作為一種或幾種VEGF抑制劑與CD4+輔助T淋 巴細(xì)胞和/或CD8+T淋巴細(xì)胞的單一組合物(例如可以通過本文描述的方法獲得的)，或作 為兩種獨(dú)立的組合物、一種組合物包含一種或多種VEGF抑制劑、一種組合物包含T淋巴細(xì) 胞的組合，給藥于需要的對(duì)象，能夠產(chǎn)生一種或多種上面提到的效應(yīng)。T淋巴細(xì)胞可以是⑶4+輔助T淋巴細(xì)胞、⑶8+T淋巴細(xì)胞、Thl細(xì)胞、源自于Thl 細(xì)胞的記憶細(xì)胞和/或源自于Thl細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞，及其任何組合。在實(shí)踐中，幾乎不可能獲得只含有一種特定類型T淋巴細(xì)胞的100%純的細(xì)胞群。 但是，正如可以從本文的實(shí)施例看到的，一般來說，⑶4+和⑶8+T淋巴細(xì)胞占使用的組合物 中細(xì)胞群的至少35% ；通常它們占細(xì)胞群的至少60%，并且在大多數(shù)情況下占85%以上 (使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè))。在本發(fā)明的情況下，如果組合物的免疫治療組分含有51%或以 上、例如60%或以上、75%或以上、90%或以上或95%或以上的⑶4+輔助T淋巴細(xì)胞，該組 分被說成是⑶4+輔助T淋巴細(xì)胞組分。類似地，如果組合物的免疫治療組分含有51 %或以 上、例如60%或以上、75%或以上、90%或以上或95%或以上的⑶8+T淋巴細(xì)胞，該組分被 說成是⑶8+T淋巴細(xì)胞組分。對(duì)于癌癥的有效治療來說，給藥Thl類型的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞特別有利，因?yàn)?據(jù)信該類型促進(jìn)細(xì)胞毒性τ淋巴細(xì)胞(Tc)、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的活化，所有這些 細(xì)胞都能攻擊癌細(xì)胞并普遍抵御腫瘤。即在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及組合物，其中免疫 治療組分包含至少85%的腫瘤反應(yīng)性CD4+輔助T淋巴細(xì)胞。一般來說，通過參考實(shí)施例中 描述的方法產(chǎn)生的Th2類型T淋巴細(xì)胞的百分率為30%或以下，例如25%或以下、20%或 以下、15%或以下、10%或以下、5%或以下、或0%，而至少70%的腫瘤反應(yīng)性CD4+T淋巴細(xì) 胞是Thl類型的，例如至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%。正如前面提到的，如果免疫治療組分含有顯著量的記憶性腫瘤反應(yīng)性⑶4+T淋巴 細(xì)胞，將是有利的。記憶性腫瘤反應(yīng)性CD4+T淋巴細(xì)胞能夠長(zhǎng)達(dá)終生地針對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)或原 發(fā)腫瘤的轉(zhuǎn)移保護(hù)患者。因此，本發(fā)明還提供了組合物，其中免疫治療組分包含記憶T淋巴細(xì)胞。一般來 說，當(dāng)按照本文參考實(shí)施例1擴(kuò)增腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)物時(shí)，將獲得約35%到約 90%、例如約40%到約90%、約50%到約80%或約60%到約70%的記憶類型的腫瘤反應(yīng) 性T淋巴細(xì)胞。本發(fā)明人推測(cè)，階段i)中的淋巴細(xì)胞在腫瘤抗原添加之前被允許再生這一 事實(shí)，與相對(duì)慢的擴(kuò)增階段結(jié)合在一起，導(dǎo)致形成了記憶淋巴細(xì)胞與效應(yīng)淋巴細(xì)胞的高比 率。尤其是，本發(fā)明涉及組合物，其包含通過本文參考實(shí)施例1中公開的兩步法獲得 的相關(guān)T淋巴細(xì)胞以及下列一種或多種VEGF或其受體的中和單克隆抗體、VEGF受體的小 分子酪氨酸激酶抑制劑、用作VEGF的假受體的可溶性VEGF受體和特異性靶向VEGF mRNA的核酶。正如本文前面提到的，可能存在組合物可以是單一組合物的情況，即組合物包含 兩種活性成分，即腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞和VEGF抑制劑。在這種情況下，兩種活性成分存 在于適合于腸胃外或口服給藥的組合物中，尤其是在對(duì)T淋巴細(xì)胞無害(即細(xì)胞的特性得 以維持并且細(xì)胞存活)并且VEGF抑制劑可以溶解或分散在其中的介質(zhì)中。取決于癌癥的 具體類型和對(duì)治療的反應(yīng)，這樣的單一組合物可以一次或以較高或較低頻率的時(shí)間間隔幾 次給藥。一般來說，設(shè)想組合物用于一次給藥，因此它必須含有有效量的兩種活性成分(對(duì) 于劑量參見下文)。但是，這樣的單一組合物要求待治療的疾病從每種活性成分(分別為T 淋巴細(xì)胞和VEGF抑制劑)的同時(shí)給藥獲益。但是，正如本文所述，活性成分的給藥一般在時(shí)間上分開，因此本發(fā)明的組合物一 般采用打算同時(shí)(或基本上同時(shí))或相繼給藥、即一種組分在例如0時(shí)、另一種組分在較晚 的t時(shí)給藥的兩種獨(dú)立制備物的形式。這樣的組合物能夠在劑量和給藥形式方面有較大變 化。因此，免疫治療組分可以采用用于注射或灌注的腸胃外制備物的形式，而血管形成組分 可以采用例如皮下或體腔內(nèi)(例如陰道、膀胱等)植入的植入物的形式。此外一種組分可 以包含在能夠每天超過一次給藥的形式中。因此，設(shè)想了可以進(jìn)行各種不同組合而不背離 本發(fā)明的目的。當(dāng)前，細(xì)胞免疫治療和抗血管形成治療都涉及腸胃外給藥。但是，由于細(xì)胞死亡的 風(fēng)險(xiǎn)，目前相信組合物應(yīng)該儲(chǔ)存在獨(dú)立的制備物中，并且照此給藥，或者應(yīng)該在給藥前相對(duì) 短的時(shí)間(高達(dá)1小時(shí))將兩種制備物混合并給藥。但是，不排除其他給藥途徑，參見下文。本發(fā)明的組合物的給藥可以通過本技術(shù)領(lǐng)域已知的各種途徑來實(shí)現(xiàn)，例如腸內(nèi)、 腸胃外、其他腸胃外或局部給藥。腸胃外給藥的實(shí)例包括但不限于靜脈內(nèi)(進(jìn)入靜脈)、動(dòng)脈內(nèi)(進(jìn)入動(dòng)脈)、肌肉 內(nèi)、皮下、骨內(nèi)灌注、真皮內(nèi)、鞘內(nèi)或腹膜內(nèi)。腸胃外給藥可以通過靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、鞘內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下等方式 注射或灌注藥物組合物來實(shí)現(xiàn)。其他腸胃外給藥的實(shí)例包括但不限于透皮、透過粘膜、頰(通過牙床線附近的面 頰吸收)、植入物。其他的給藥手段可以是但不限于硬膜外(硬膜外)或玻璃體內(nèi)。透皮給藥可以通過向皮膚或粘膜等施加、裱糊、滾動(dòng)、貼附、傾倒、擠壓、摩搓透皮 制備物等來實(shí)現(xiàn)。局部給藥的實(shí)例包括但不限于表皮(施加在皮膚上)、吸入、灌腸、滴眼(在結(jié)膜 上)、滴耳或陰道。腸內(nèi)給藥的實(shí)例包括但不限于口服、通過胃飼管、十二指腸飼管、胃造口術(shù)或直 腸?？诜o藥可以通過吞咽、咀嚼、吸吮包含藥物及其制劑的口服劑型來實(shí)現(xiàn)?？诜?劑可以是常規(guī)的片劑、膠囊、囊片(caplet)、溶液、懸液、乳液等。常規(guī)的片劑可以是立即或持續(xù)釋放口服片劑。片劑也可以通過例如應(yīng)用不同的涂 層技術(shù)設(shè)計(jì)成在特定組織釋放藥物組合物。因此，片劑可以用薄膜或糖涂層，以控制藥物釋 放的速率和位點(diǎn)。目前，沒有設(shè)想細(xì)胞免疫療法可以通過例如口服途徑提供，但是不能排除例如口或食管中的癌癥可以通過口服給藥來治療。局部給藥對(duì)于例如直腸癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、皮 膚癌等的治療也是一種選擇。正如上面提到的，目前使用的給藥途徑是腸胃外。因此，這一方面是重要的。應(yīng)該理解，包含本發(fā)明的組合物的給藥可以通過任何上述給藥途徑分別給藥。當(dāng) 組合物包含具有兩種獨(dú)立組合物的試劑盒，其中一種組合物包含相關(guān)T淋巴細(xì)胞、一種包 含一種或多種VEGF抑制劑時(shí)，可以進(jìn)行給藥以便包含相關(guān)T細(xì)胞的組合物可以腸胃外給 藥，包含一種或多種VEGF抑制劑的組合物可以腸胃外或通過任何其他相關(guān)途徑給藥，這取 決于與目標(biāo)最適合的給藥方法。本發(fā)明涉及包含相關(guān)T淋巴細(xì)胞和一種或多種針對(duì)VEGF的單克隆抗體的組合 物，其中單克隆抗體可以是但不限于貝伐單抗(Avastin )、Ab_153、Ab_309、Ab-342 (參 見 Chen J. H.等，Biochemisry and molecular biology international 47(2) :161-9, 1999Feb)或蘭尼單抗(Lucentis )。本發(fā)明還涉及含相關(guān)T淋巴細(xì)胞和一種或多種小分子酪氨酸激酶抑制劑的組合 物，其中酪氨酸激酶抑制劑可以是但不限于舒尼替尼(Sutent)、索拉非尼(Nexavar)、阿西 替尼和帕唑帕尼、ABT-869、BIBF1120、4-[(4-氟-2-甲基-IH-吲哚-5-基)氧基]_6_甲 氧基-7-[3-(批咯烷-1-基)丙氧基]喹唑啉(西地尼布)、氨基-5-氟甲 基-1-哌嗪基)-IH-苯并咪唑-2-基]-2 (IH)-喹啉酮(多韋替尼)、3_吡啶甲酰胺、N- (2， 3- 二氫-3，3- 二甲基-IH-吲哚-6-基)-2-[ (4-吡啶甲基)氨基]-N- (3，3- 二甲基-2， 3-二氫-IH-吲哚-6-基)-2-[(吡啶-4-基甲基)氨基]吡啶-3-甲酰胺(莫替沙尼)或 [N-(4-溴-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[(1-甲基哌啶-4-基)甲氧基]喹唑啉-4-胺(凡 德他尼)或西妥昔單抗，或其任何可藥用鹽。本發(fā)明的組合物可以包含相關(guān)T淋巴細(xì)胞和一種或多種特異性靶向VEGF mRNA 的核酶，其中核酶可以是但不限于抗Flt-I核酶。一個(gè)這樣的實(shí)例是Angiozyme (US 6，346，398)。這種情況也包含其他錘頭型核酶。本發(fā)明的組合物可以包含在常規(guī)化療中使用的其他藥物活性化合物。因此，組合 物可以包含但不限于在Avastin療法中使用的化合物。因此，組合物業(yè)可以包含但不限于 5-氟尿嘧啶、甲酰四氫葉酸、奧沙利鉬、紫杉醇、多西他賽、福馬加林(fumagallin)、蒽環(huán)類 抗生素例如柔紅霉素、多柔比星和表柔比星、喜樹堿類藥物例如伊立替康和拓?fù)涮婵?、長(zhǎng)春 新堿、卡鉬、順鉬、環(huán)磷酰胺、絲裂霉素C、米托蒽醌、氟尿苷、吉西他濱、甲氨蝶呤、博來霉素、 依托泊苷、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春地辛、長(zhǎng)春瑞濱和染料木素(genistein)。本發(fā)明還涉及在治療癌癥的藥物的制造中使用包含相關(guān)T淋巴細(xì)胞和一種或多 種下列物質(zhì)的組合物針對(duì)VEGF或其受體的中和單克隆/多克隆/重組抗體，VEGF受體 的小分子酪氨酸激酶抑制劑，用作VEGF的假受體的可溶性VEGF受體和特異性靶向VEGF mRNA的核酶，以及任選的一種或多種化療藥劑，所述化療藥劑選自但不限于5-氟尿嘧啶、 甲酰四氫葉酸、奧沙利鉬、紫杉醇、多西他賽、福馬加林(fumagallin)、蒽環(huán)類抗生素例如柔 紅霉素、多柔比星和表柔比星、喜樹堿類藥物例如伊立替康和拓?fù)涮婵?、長(zhǎng)春新堿、卡鉬、順 鉬、環(huán)磷酰胺、絲裂霉素C、米托蒽醌、氟尿苷、吉西他濱、甲氨蝶呤、博來霉素、依托泊苷、長(zhǎng) 春堿、長(zhǎng)春地辛、長(zhǎng)春瑞濱和染料木素。本發(fā)明還涉及在治療癌癥的藥物的制造中使用包含相關(guān)T淋巴細(xì)胞和一種或多種針對(duì)VEGF的單克隆抗體的組合物，其中單克隆抗體可以是但不限于貝伐單抗 (Avastin )、Ab_153、Ab_309、Ab-342(Lucentis )。本發(fā)明的組合物可以包含一種或多種附加的藥物賦形劑。特別是，免疫治療組分 可以包含適合于維持細(xì)胞特性和存活性的介質(zhì)，它同時(shí)適合于注射到哺乳動(dòng)物(人類)體 內(nèi)(即它必須是安全的)。適合的介質(zhì)可以是等滲鹽水(0.9% /^氯化鈉溶液)，任選添補(bǔ) 有血清白蛋白尤其是人類血清白蛋白和/或PH調(diào)節(jié)劑，例如磷酸鹽緩沖劑。取決于具體的制備物或組合物，賦形劑可以選自例如但不限于-對(duì)于腸胃外給藥來說溶劑包括水和丙二醇、植物油、滲透壓調(diào)節(jié)劑、PH調(diào)節(jié)劑、 無血清介質(zhì)、細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液或營(yíng)養(yǎng)劑、人類或人造血清白蛋白、自體血清、可以任選地具有與 血液相同滲張度的等滲介質(zhì)、生理鹽水溶液等。-對(duì)于腸內(nèi)給藥來說抗粘附劑、粘合劑、涂層劑、崩解劑、填料/稀釋劑、調(diào)味劑和 著色劑、PH調(diào)節(jié)劑、助流劑、潤(rùn)滑劑、防腐劑、吸附劑、甜味劑和改變活性物質(zhì)的溶解速率的 藥劑、無血清介質(zhì)、緩沖劑或溶液、細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液或藥劑、PH調(diào)節(jié)劑、人類或人造血清白蛋白、 自體血清、可以任選地具有與血液相同滲張度的等滲介質(zhì)、生理鹽水溶液、防腐劑等。本發(fā)明的組合物可用于治療任何解剖位置中上皮、間充質(zhì)或胚胎學(xué)來源的任何實(shí) 體贅生物的治療，例如對(duì)于上皮贅生物來說例如乳腺、結(jié)腸、胰腺、膀胱、小腸、前列腺、子宮 頸、外陰、卵巢中的癌，對(duì)于間充質(zhì)贅生物來說例如關(guān)節(jié)、骨骼、肌肉和肌腱中的肉瘤以及一 些血液腫瘤例如淋巴瘤，對(duì)于胚胎學(xué)贅生物來說例如畸胎瘤。更具體的實(shí)例包括但不限于 結(jié)腸直腸癌、轉(zhuǎn)移的結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、轉(zhuǎn)移的乳腺癌、轉(zhuǎn)移的腎細(xì)胞癌、轉(zhuǎn)移的多形性膠 質(zhì)母細(xì)胞瘤、轉(zhuǎn)移的卵巢癌、轉(zhuǎn)移的激素抵抗型前列腺癌、不能切除的原位晚期胰腺癌、腎 細(xì)胞癌、卵巢癌、耐受性小細(xì)胞肺癌和肺癌。本文描述的治療尤其適合于治療選自下列的癌癥乳腺、結(jié)腸、直腸、胰腺、肝臟、 膽囊、膽管、膀胱、小腸、肺、前列腺、腎臟、子宮頸、外陰、卵巢中的癌、惡性黑素瘤、頭頸部 癌；關(guān)節(jié)、骨骼、肌肉和肌腱中的肉瘤、淋巴瘤；畸胎瘤；以及轉(zhuǎn)移和原位晚期(不可動(dòng)手術(shù) 的)的上述腫瘤。本發(fā)明的組合物可以包含癌癥類型特異性⑶4+T淋巴細(xì)胞，其中至少70%的癌癥 特異性⑶4+T淋巴細(xì)胞是Thl類型，30%或以下的癌癥特異性⑶4+T淋巴細(xì)胞是Th2類型， 以及一種或多種VEGF抑制劑，和任選的在Avastin⑧療法或任何療法中使用的附加藥物活 性化合物，所述一種或多種VEGF抑制劑包括VEGF抑制劑例如抗VEGF或其受體的中和單克 隆抗體、VEGF受體的小分子酪氨酸激酶抑制劑、用作VEGF的假受體的可溶性VEGF受體和 特異性靶向VEGF mRNA的核酶。本發(fā)明的組合物也可以包含其中約35%到約90%是記憶類型的癌癥特異性T淋 巴細(xì)胞，以及一種或多種VEGF-抑制劑，和任選的在Avastin療法或任何療法中使用的附 加藥物活性化合物，所述一種或多種VEGF抑制劑包括VEGF抑制劑例如抗VEGF或其受體的 中和單克隆抗體、VEGF受體的小分子酪氨酸激酶抑制劑、用作VEGF的假受體的可溶性VEGF 受體和特異性靶向VEGF mRNA的核酶。本發(fā)明的組合物也可以包含其中約10%到約65%是效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的癌癥特異 性T淋巴細(xì)胞，以及一種或多種VEGF-抑制劑，和任選的在Avastin 療法中使用的附加藥 物活性化合物。
本發(fā)明的組合物也可以包含癌癥特異性T淋巴細(xì)胞，其中組合物包含至少1百萬、 至少5百萬、至少1千萬或至少2千萬或至少3千萬或至少4千萬或至少5千萬或至少1億 個(gè)癌癥特異性T淋巴細(xì)胞，以及一種或多種VEGF-抑制劑，和任選的在Avastin⑧療法中使 用的附加藥物活性化合物。細(xì)胞的劑量取決于疾病的嚴(yán)重性。此外，由于腫瘤反應(yīng)性T淋 巴細(xì)胞短缺，也可以使用較低劑量。本發(fā)明的組合物可以包含的VEGF抑制劑的量為約Img到約2000mg、或約70mg到 約1400mg、或約140mg到約1050mg、或約2IOmg到約1050mg、或約280mg到約1050mg、或約 350mg 到約 1050mg。本發(fā)明的組合物可以包含的VEGF抑制劑的劑量為約0. 1到約50mg/kg體重、或約 0. 5到約30mg/kg體重、或約lmg/kg到約20mg/kg體重、或約ang/kg到約15mg/kg體重、或 約3mg/kg到約15mg/kg體重、或約4mg/kg到約15mg/kg體重、或約5mg/kg到約15mg/kg 體重。上述數(shù)據(jù)是常用于Avastin 的劑量，并設(shè)想與用于其他VEGF抑制劑的劑量在同 一數(shù)量級(jí)上。但是，本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員將知曉如何確定正確劑量。此外，設(shè)想VEGF抑 制劑的劑量可以略微降低，例如約10%或以上、例如約20%或以上、例如約30%或以上、例 如約40%或以上、例如約50%或以上、例如約60%或以上、例如約70%或以上、例如約80% 或以上。例如，預(yù)計(jì)降低約10%、從50mg到1250mg的劑量是足夠的。應(yīng)該理解，本發(fā)明的組合物可以是包含治療有效量的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞和治 療有效量的一種或多種VEGF抑制劑的組合物。應(yīng)該理解，本發(fā)明的組合物可以是包含兩種獨(dú)立制備物的組合物，其中一種制備 物包含治療有效量的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，第二種制備物包含治療有效量的一種或多種 VEGF抑制劑。治療有效量的一種或多種化療藥劑，如果存在的話，可以包含在另一種獨(dú)立的 制備物中，或者它可以包括在包含一種或多種VEGF抑制劑的制備物中。應(yīng)該理解，本發(fā)明的組合物可以是包含兩種獨(dú)立組合物的試劑盒，其中一種組合 物包含治療有效量的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，第二種組合物包含治療有效量的一種或多種 VEGF抑制劑。試劑盒可以任選包含化療藥劑作為試劑盒中的獨(dú)立組合物，或以任何順序與 相關(guān)T淋巴細(xì)胞或一種或多種VEGF抑制劑組合。治療方法本文前面描述的一種或多種VEGF抑制劑與腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的組合，可用于 治療腫瘤來源的疾病。本文描述的關(guān)于VEGF抑制劑、T淋巴細(xì)胞、組合物、給藥途徑、劑量 等方面的所有詳細(xì)和具體情況，做適當(dāng)修正后可適用于本發(fā)明的方法的各種情況。通過本文描述的擴(kuò)增方法獲得的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞和一種或多種VEGF抑制 劑，可用在治療患有腫瘤來源疾病的對(duì)象或在患有腫瘤的對(duì)象中進(jìn)行腫瘤消減的方法中， 所述方法包含向需要的對(duì)象給藥有效量的本發(fā)明的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞和有效量的一 種或多種VEGF抑制劑。方法可以包含將有效量的本發(fā)明的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞和有效 量的一種或多種VEGF抑制劑作為單一組合物給藥，或者可以作為獨(dú)立的組合物給藥，所述 獨(dú)立的組合物向需要的對(duì)象的給藥可以同時(shí)或以任何次序相繼進(jìn)行。方法還包含作為第一 種治療方法給藥腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，然后進(jìn)行第二種治療方法，包括腫瘤反應(yīng)性T淋巴 細(xì)胞與一種或多種VEGF抑制劑的組合給藥。
本文描述的方法可用于治療任何解剖位置中上皮、間充質(zhì)或胚胎學(xué)來源的任何實(shí) 體贅生物，例如對(duì)于上皮贅生物來說例如乳腺、結(jié)腸、胰腺、膀胱、腦、小腸、前列腺、子宮頸、 外陰、卵巢中的癌，對(duì)于間充質(zhì)贅生物來說例如關(guān)節(jié)、骨骼、肌肉和肌腱中的肉瘤以及一些 血液腫瘤例如淋巴瘤，對(duì)于胚胎學(xué)來源贅生物來說例如畸胎瘤。更具體的實(shí)例包括但不限 于結(jié)腸直腸癌、轉(zhuǎn)移的結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、轉(zhuǎn)移的乳腺癌、轉(zhuǎn)移的腎細(xì)胞癌、轉(zhuǎn)移的多形性 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、轉(zhuǎn)移的卵巢癌、轉(zhuǎn)移的激素抵抗型前列腺癌、不能切除的原位晚期胰腺癌、 腎細(xì)胞癌、卵巢癌、耐受性小細(xì)胞肺癌和肺癌。腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的有效量的定義取決于淋巴細(xì)胞的具體類型、記憶與效 應(yīng)T淋巴細(xì)胞的比例和疾病的嚴(yán)重性。但是，可以給藥的平均最小值為至少1百萬、至少5 百萬、至少1千萬例如至少2千萬、至少3千萬、至少4千萬、至少5千萬、至少6千萬、至少 7千萬、至少8千萬或至少1億個(gè)腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞。本發(fā)明沒有在以單劑給藥的腫瘤 反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的量方面鑒定到任何上限。用于給藥的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞可以包含效應(yīng)T淋巴細(xì)胞和記憶T淋巴細(xì)胞的 組合。更具體來說，記憶類型的腫瘤反應(yīng)性τ淋巴細(xì)胞的量可以為約35%到約90%，例如約 40%到約90%、約50%到約80%或約60%到約70%，效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的百分率為約10% 到約65%，例如約20%到約50%或約30%到約40%。VEGF抑制劑的有效量的定義取決于疾病的嚴(yán)重性和類型。但是，正常的給藥劑量 在lmg/kg到約20mg/kg的范圍內(nèi)，例如2mg/kg到約15mg/kg、例如3mg/kg到約15mg/kg、 例如 4mg/kg 到約 15mg/kg、例如 5mg/kg 到約 15mg/kg。用于給藥的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞可以包含效應(yīng)T淋巴細(xì)胞和記憶T淋巴細(xì)胞的 組合。更具體來說，記憶類型的腫瘤反應(yīng)性τ淋巴細(xì)胞的量可以為約35%到約90%，例如約 40%到約90%、約50%到約80%或約60%到約70%，效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的百分率為約10% 到約65%，例如約20%到約50%或約30%到約40%，并且一種或多種VEGF抑制劑的劑量 為 lmg/kg 到約 20mg/kg，例如 ang/kg 到約 15mg/kg、例如:3mg/kg 到約 15mg/kg、例如 ^ig/ kg到約15mg/kg、例如5mg/kg到約15mg/kg體重(尤其是降低至少10%，參見上文)。腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞和VEGF抑制劑可以配制成適合于腸胃外給藥于患者的藥 物組合物，例如靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥，或通過采用常規(guī)的片劑、膠囊、囊片、溶 液、懸液或乳液形式的劑型口服給藥。當(dāng)腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞腸胃外給藥時(shí)，它們可以配制在等滲介質(zhì)、即具有與血 液相同的滲張度并包含一種或多種防止細(xì)胞聚集的物質(zhì)的介質(zhì)中，并可以包含附加的藥物 賦形劑。適合的介質(zhì)的具體實(shí)例是含有高達(dá)3%人血清白蛋白、例如高達(dá)2%人血清白蛋白 或高達(dá)人血清白蛋白的0.9% NaCl溶液。對(duì)于靜脈內(nèi)給藥來說，待給藥組合物中腫瘤 反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的濃度一般在約50萬淋巴細(xì)胞/ml介質(zhì)到約4百萬淋巴細(xì)胞/ml介質(zhì) 的范圍內(nèi)，例如從約50萬淋巴細(xì)胞/ml介質(zhì)到約3百萬淋巴細(xì)胞/ml介質(zhì)、從約50萬淋巴 細(xì)胞/ml介質(zhì)到約2百萬淋巴細(xì)胞/ml介質(zhì)或從約1百萬淋巴細(xì)胞/ml介質(zhì)到約2百萬淋 巴細(xì)胞/ml介質(zhì)。當(dāng)VEGF抑制劑腸胃外給藥時(shí)，它們可以配制在等滲介質(zhì)、即具有與血液相同滲張 度的介質(zhì)中，并可以包含附加的藥物賦形劑。適合的介質(zhì)的具體實(shí)例是含有高達(dá)3%人血清 白蛋白、例如高達(dá)2%人血清白蛋白或高達(dá)人血清白蛋白的0.9% NaCl溶液。對(duì)于靜脈內(nèi)給藥來說，待給藥組合物中VEGF抑制劑的劑量一般在約lmg/kg到約20mg/kg的范圍 內(nèi)，例如ang/kg到約15mg/kg、例如:3mg/kg到約15mg/kg、例如％ig/kg到約15mg/kg、例如 5mg/kg到約15mg/kg(尤其是降低至少10%，參見上文)。對(duì)于口服或其他給藥途徑來說， 考慮到劑量應(yīng)該為相同數(shù)量級(jí)或高達(dá)高50%。包含VEGF抑制劑的組合物可以作為單劑或多劑給藥。它可以在1到2小時(shí)或以 上的時(shí)間內(nèi)灌注。包含腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的組合物可以作為單劑或多劑給藥。它可以在1到2 小時(shí)或以上的時(shí)間內(nèi)灌注。本發(fā)明的組合物可以配制成單一組合物，其包含腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞和一種 或多種VEGF抑制劑作為單一組合物，或作為兩種獨(dú)立組合物組合使用(同時(shí)或以任何次 序順序地)，其中一種組合物包含腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，另一種組合物包含一種或多種 VEGF-抑制劑。取決于疾病的嚴(yán)重性，治療可以執(zhí)行一次或重復(fù)執(zhí)行。此外，可以在疾病復(fù)發(fā)后、 或以根據(jù)待治療的疾病的嚴(yán)重性或特點(diǎn)所認(rèn)為需要的任何時(shí)間間隔重復(fù)進(jìn)行治療。本發(fā)明的治療可以用任何其他相關(guān)的癌癥療法進(jìn)行補(bǔ)充。這樣的補(bǔ)充療法可以在 淋巴細(xì)胞和一種或多種VEGF-抑制劑給藥之前、同時(shí)或之后提供，并且可以正常用于該治 療的頻率提供。補(bǔ)充療法的適合的實(shí)例是化療等?；熕巹┛梢园ǖ幌抻?-氟尿嘧 啶、甲酰四氫葉酸、奧沙利鉬、紫杉醇、多西他賽、福馬加林(fumagallin)、蒽環(huán)類抗生素例 如柔紅霉素、多柔比星和表柔比星、喜樹堿類藥物例如伊立替康和拓?fù)涮婵?、長(zhǎng)春新堿、卡 鉬、順鉬、環(huán)磷酰胺、絲裂霉素C、米托蒽醌、氟尿苷、吉西他濱、甲氨蝶呤、博來霉素、依托泊 苷、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春地辛、長(zhǎng)春瑞濱和染料木素。上述組合物的給藥可以采用試劑盒的形式，其中試劑盒可以是單一組合物或兩種 或三種單一組合物的試劑盒。不同單一組合物可以同時(shí)或以任何次序以任何時(shí)間間隔給 藥。試劑盒成分的給藥可以任何次序獨(dú)立地口服或者腸胃外給藥。正如在本文實(shí)施例中所證實(shí)的，組合療法可以及時(shí)替換并仍能獲得出色結(jié)果。因 此，組合療法可以一開始進(jìn)行i)腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的給藥，然后進(jìn)行ii) VEGF抑制劑任選地與化療雞尾酒混合物(一種或多種化療藥劑，例如在結(jié)腸 癌的治療中5-氟尿嘧啶、甲酰四氫葉酸和奧沙利鉬或伊立替康的組合)組合給藥；這種方 式一般按照傳統(tǒng)上適用于這種組合的流程進(jìn)行，即在給藥頻率和劑量方面。兩種給藥方式可以在至少15天、尤其是1-90天例如15-60天、包括30天或1個(gè) 月的時(shí)間內(nèi)變換。下面描述兩種不同的優(yōu)選步驟，其中可以實(shí)現(xiàn)兩種不同作用方式。優(yōu)選程序1 在前哨淋巴結(jié)收獲之前約4周通過灌注進(jìn)行化療?；煱凑障嚓P(guān)藥 物的足夠劑量和程序來進(jìn)行。程序的該化療步驟是任選的。在收獲后約另外四周后，對(duì)前哨或Metinel淋巴結(jié)獲得的淋巴細(xì)胞(SNAL或MNAL) 進(jìn)行給藥。SNAL或MNAL的最適劑量是未知的，但是從灌注五千萬淋巴細(xì)胞已經(jīng)觀察到效 果。最適劑量可能更高，因?yàn)閾?jù)信效果與灌注的SNAL或MNAL的數(shù)量相關(guān)?；颊咭呀?jīng)耐受 超過十億個(gè)淋巴細(xì)胞的灌注。淋巴細(xì)胞灌注程序的近似時(shí)間是1小時(shí)。
在約另外三周后，按照相關(guān)藥物的足夠劑量通過灌注給藥VEGF抑制劑。在該治療方式中，據(jù)信VEGF抑制劑可以因子血管炎性的增加，從而引起腫瘤反應(yīng) 性SNAL或MNAL的召集/歸巢的增加。優(yōu)選程序2 在前哨或Metinel淋巴結(jié)收獲前約三周，給藥VEGF抑制劑。如上所 述，在收獲后約4周，給藥SNAL或MNAL。兩種藥物的劑量等如上所述。在該治療方式中，不進(jìn)行化療。由于增加腫瘤細(xì)胞死亡，這種治療方式的作用方式預(yù)期增加收獲的SNAL或MNAL 的數(shù)量，從而增加了前哨或Metinel淋巴結(jié)中的抗原呈遞。正如前面提到的，也可以包含化療雞尾酒混合物(其性質(zhì)取決于待治療的具體癌 癥)。作為后續(xù)療法，可以提供i)和ii)兩者，或可以僅僅給藥i)和ii)之一。當(dāng)在起 始ii)后30天提供i)時(shí)，獲得了出色結(jié)果?；蛘撸M合療法可以一開始進(jìn)行i) VEGF抑制劑任選地與化療雞尾酒混合物(一種或多種化療藥劑，例如在結(jié)腸癌 的治療中5-氟尿嘧啶、甲酰四氫葉酸和奧沙利鉬或伊立替康的組合)組合給藥；這種方式 一般按照傳統(tǒng)上適用于這種組合的流程進(jìn)行，即在給藥頻率和劑量方面，然后進(jìn)行ii)腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的給藥。兩種給藥方式可以在至少15天、尤其是1-90天例如15-60天、包括30天或1個(gè) 月的時(shí)間內(nèi)變換。作為后續(xù)療法，可以提供i)和ii)兩者，或可以僅僅給藥i)和ii)之一。


圖1顯示了前哨淋巴結(jié)是針對(duì)腫瘤抗原的T細(xì)胞反應(yīng)性的呈遞和活化的天然原初 位點(diǎn)。圖2顯示了前哨淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞最初被腫瘤抗原和低劑量IL-2活化，導(dǎo)致活化標(biāo) 志物⑶25的活化和表達(dá)(上圖)。階段I活化階段的結(jié)束由表達(dá)⑶25的⑶4+T細(xì)胞數(shù)量 的減少所定義(下圖)。當(dāng)?shù)陀?%的⑶4+T細(xì)胞表達(dá)⑶25時(shí)，使用抗原重新刺激來起始 階段II。圖3顯示階段I和階段II的活化導(dǎo)致⑶4+T輔助細(xì)胞的擴(kuò)增和富集。圖4顯示了在階段I中，大部分細(xì)胞是未接觸過抗原的CD62L+細(xì)胞或活化的 ⑶69+⑶62L+細(xì)胞。在階段II后，大部分細(xì)胞是⑶62L-，并由記憶和效應(yīng)⑶4+T輔助細(xì)胞 構(gòu)成。CD62L-T細(xì)胞不表達(dá)優(yōu)選的淋巴結(jié)歸巢分子，因此它們尋找非淋巴器官中的炎性區(qū) 域。圖5顯示了階段I中來自腫瘤(腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞)、前哨淋巴結(jié)(SN)和無關(guān) 淋巴結(jié)(LN)的受到刺激的初級(jí)細(xì)胞產(chǎn)生不少IFN-γ。圖6顯示在階段ii)擴(kuò)增后，出現(xiàn)抗原依賴性IFN- γ生產(chǎn)的劑量依賴性增加。圖7顯示擴(kuò)增和活化流程促進(jìn)了抗原特異性T細(xì)胞克隆的擴(kuò)增，正如通過TCR νβ 表達(dá)的選擇性富集所研究的。實(shí)施例參考實(shí)施例1腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增手術(shù)前，使用前哨淋巴結(jié)技術(shù)進(jìn)行前哨淋巴結(jié)的鑒定。簡(jiǎn)單來說，將Iml專利藍(lán)染 料(Patent blue dye)注射(Guerbet，Paris)并表面分布在腫瘤周圍的漿膜中。在5到10 分鐘內(nèi)，1到3個(gè)腸系膜淋巴結(jié)被染成藍(lán)色，將這些前哨淋巴結(jié)用縫合線標(biāo)記并取出(參見 圖1)。一個(gè)遠(yuǎn)離腫瘤的非前哨淋巴結(jié)也被鑒定并取下作為對(duì)照。將前哨和非前哨淋巴結(jié)對(duì)剖，從中心和周圍獲取Imm厚切片。將剩余淋巴結(jié)送去 按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。出于研究目的，也取下一部分腫瘤、包括侵入性邊緣的 樣品。細(xì)胞培養(yǎng)階段I，初始活化將前哨淋巴結(jié)材料保持在冰上，并在所有時(shí)間內(nèi)立即使用AIM V 培養(yǎng)基 (Invitrogen)照管。通過在松散裝配的玻璃勻漿器中輕柔勻漿，獲得前哨淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞 的單細(xì)胞懸液，然后將勻漿的細(xì)胞在培養(yǎng)基中清洗兩次。將前哨淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞以4百萬 個(gè)細(xì)胞/ml的濃度置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并加入白介素2 (IL-2) (Proleukin ，Chiron)至濃 度為240IU/ml培養(yǎng)基。通過使用Ultra Turrax在5倍體積(w/v)的h PBS中勻漿制備自體腫瘤提取 物，然后在97°C下變性5分鐘。在開始細(xì)胞培養(yǎng)后3到4天，以1/100的濃度加入自體腫瘤 提取物。對(duì)于長(zhǎng)期培養(yǎng)來說，將細(xì)胞保持在37°C和5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每3-4天加入 240IU IL-2/mL 培養(yǎng)基。階段II，活化和擴(kuò)增18-22天后，監(jiān)測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物的⑶25表達(dá)。當(dāng)表達(dá)⑶25的細(xì)胞數(shù)量減少到低于 5%時(shí)，通過加入濃度為1/100的自體抗原提取物在階段II中重新刺激細(xì)胞(圖2)。為了 有效的抗原呈遞，使用 Ficoll-Paque PLUS(Amersham Biosciences, GE Healthcare)收集 自體PBMC，用2500rad進(jìn)行輻照，并添加到細(xì)胞培養(yǎng)物中。重新刺激后三天，加入濃度為 100-500IU/ml的干擾素-α (Introna)和抗IL-4抗體至濃度為2 μ g/ml。5到8天后，向擴(kuò) 增物添加IL-12 (4ng/ml)，以便促進(jìn)產(chǎn)IFN- γ的Thl細(xì)胞的誘導(dǎo)。在向患者輸液的前一天，使用Ficoll-Paque PLUS (Amersham Biosciences, GE Healthcare)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行純化，以便回收培養(yǎng)物中的活細(xì)胞。在輸液當(dāng)天，將細(xì) 胞在鹽水溶液(氯化鈉Baxter，Viaflo 9mg/ml, Baxter)中洗滌兩次，然后轉(zhuǎn)移到含有 100-200ml鹽水溶液和人血清白蛋白(Baxter)的輸液袋中。在輸液之前進(jìn)行微生物存 在的調(diào)查。細(xì)胞的輸液在專業(yè)醫(yī)學(xué)監(jiān)督下在1-2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行。免疫評(píng)估進(jìn)一步的免疫評(píng)估使用氚標(biāo)記的胸苷摻入增殖分析法進(jìn)行。為此目的，留出前 哨淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞的等份試樣，通過在松散裝配的玻璃勻漿器中輕柔擠壓來獲得無前哨 淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，并通過Ficoll-Paque PLUS (Amersham Biosciences, GE Healthcare)純化外周血單核細(xì)胞。將細(xì)胞在含有2. 5 % 胎牛血清(FCS) (Life technologies)的 RPMI1640 (Lifetechnologies)中重懸浮并洗滌兩次。最后，將細(xì)胞重懸浮在含有10 %人類AB血清 (Sigma)、1 %青霉素-鏈霉素(Sigma)和1 %谷氨酰胺(Sigma)的RPMI 1640增殖培養(yǎng)基 中。淋巴結(jié)細(xì)胞和純化的PBL以3xl05個(gè)細(xì)胞/孔的量使用在96孔板中，并用1/100、1/10 稀釋的腫瘤勻漿液或10μ g/ml Con A(Sigma)刺激，一式三份。在第5、6和7天通過在收 獲前18小時(shí)加入1 μ Ci3H-胸腺嘧啶/孔(Amersham)來測(cè)量增殖。對(duì)樣品進(jìn)行閃爍計(jì)數(shù)。在細(xì)胞培養(yǎng)開始時(shí)，為了測(cè)量IFN-γ的分泌，使用1/10和1/100稀釋的腫瘤勻漿 液或lOyg/ml Con A(Sigma)在96孔板中進(jìn)行淋巴結(jié)細(xì)胞和PBL的刺激，一式三份。分泌 的IFN-Y量在三份平行樣的合并樣品中的培養(yǎng)上清液中使用ELISA(人類IFN-YDuoset， R&D Systems)進(jìn)行測(cè)量(圖幻。在細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，取出上清液樣品，在三份平行樣中使 用 ELISA (人類 IFN- y Duoset 和人類 IL-4 Duoset, R&D Systems)測(cè)量 IFN-γ 和 IL-4 的 分泌(圖6Α和6Β)。流式細(xì)胞術(shù)分析首先使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)來自前哨淋巴結(jié)、非前哨淋巴結(jié)、PBMC和來自腫瘤的細(xì)胞 進(jìn)行細(xì)胞性質(zhì)研究。每2到3周從培養(yǎng)物樣品中獲取前哨淋巴結(jié)獲得性淋巴細(xì)胞用于流式 細(xì)胞術(shù)分析。將細(xì)胞在添加有2% FCS和0. 05% NaN3的PBS(FACS)緩沖液中，與針對(duì)免疫 細(xì)胞亞群和用于淋巴細(xì)胞活化的標(biāo)記物的抗體溫育(圖3、4和5)。使用了針對(duì)下列標(biāo)志 物的與熒光素異硫氰酸酯(FITC)偶聯(lián)的抗體⑶69、HLA-DR、⑶45RA、⑶25，針對(duì)下列標(biāo)志 物的與藻紅蛋白(PE)偶聯(lián)的抗體⑶62L、⑶19、⑶45R0、⑶56，針對(duì)下列標(biāo)志物的與多甲藻 素-葉綠素-蛋白(PerCP)偶聯(lián)的抗體⑶8、⑶3，針對(duì)下列標(biāo)志物的與別藻藍(lán)素(APC)偶 聯(lián)的抗體CD4、CD14、CD8。使用β標(biāo)記試劑盒(Beckman Coulter)檢測(cè)V β -全部組成成分，將切105個(gè)細(xì) 胞/管在10 μ 1的8種不同玻璃管中染色，每個(gè)玻璃管包含F(xiàn)ITC、PE和雙色FITC-PE偶聯(lián) 的TCR V β抗體，并向每個(gè)管添加CD8 PerCP和CD4 APC (圖7)。參考實(shí)施例2通過給藥腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞治療結(jié)腸癌從結(jié)腸癌患者鑒定并取出前哨和metinel淋巴結(jié)研究了 16位被診斷有結(jié)腸癌的患者，6位女性和10位男性，平均年齡62歲?；颊?在組織病理學(xué)上分類為Duke' s C或D。也有5位患者患有Duke' s B，具有侵襲性腫瘤 特征例如潰瘍、血管或圍神經(jīng)侵入。但是，7號(hào)和14號(hào)患者在較早時(shí)間由于結(jié)腸癌進(jìn)行了手 術(shù)治療，現(xiàn)在患有轉(zhuǎn)移到肝臟的復(fù)發(fā)疾病。當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)批準(zhǔn)了本研究，每位患者提供了 書面知情同意書。前哨或Metinel淋巴結(jié)的鑒定在手術(shù)過程中進(jìn)行。通過分開腹膜粘連使結(jié)腸腫瘤 位點(diǎn)松動(dòng)，以便于檢查腫瘤和腸系膜。專利藍(lán)染料(Patent blue dye) (Guerbet,Paris)的 注入表面分布于腫瘤周圍的漿膜中。在5分鐘內(nèi)，1到3個(gè)腸系膜淋巴結(jié)被染成藍(lán)色，將這 些前哨淋巴結(jié)用縫合線標(biāo)記，并在切除術(shù)完成時(shí)取出。一個(gè)遠(yuǎn)離腫瘤的非前哨腸系膜淋巴 結(jié)也以同樣方式操作。將前哨和非前哨淋巴結(jié)對(duì)剖，從中心和周圍獲取Imm厚切片。將剩余淋巴結(jié)送去 按照常規(guī)程序進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。也取下一片腫瘤、包括侵入性邊緣部分，用于抗原制 備。
然后將從淋巴結(jié)獲得的淋巴細(xì)胞按照參考實(shí)施例1中的描述進(jìn)行擴(kuò)增。腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的給藥通過灌注按照實(shí)施例1中所述擴(kuò)增的自體淋巴細(xì)胞，對(duì)16位患者進(jìn)行治療。作為 輸液給藥了平均7470萬個(gè)活化和克隆擴(kuò)增的T細(xì)胞。沒有觀察到毒性副作用例如發(fā)燒、寒 戰(zhàn)、不適、嚴(yán)重體液潴留、肺水腫或呼吸窘迫。追蹤評(píng)估追蹤包括每第3到第6個(gè)月進(jìn)行臨床檢查并控制CEA水平。所有III級(jí)和IV級(jí) 患者還使用胸腹部計(jì)算機(jī)斷層掃描術(shù)進(jìn)行附加檢查?；颊咂骄桓?6個(gè)月(在6-51 個(gè)月范圍內(nèi))，并按照瑞典結(jié)腸直腸癌追蹤方案(Swedish colorectal cancer follow-up protocol)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。在使用自體淋巴細(xì)胞灌注進(jìn)行治療的16位患者中，8位在診斷時(shí)具 有已知的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。四位患者由于已知的復(fù)發(fā)而接受輸液，其中三位仍沒有復(fù)發(fā)跡象。一 位患者由于單生肝臟轉(zhuǎn)移而進(jìn)行手術(shù)，并從那時(shí)起尚未復(fù)發(fā)。一位具有位于兩葉中的肝臟 轉(zhuǎn)移腫瘤的患者(已被宣布不能通過肝臟手術(shù)治愈)，在輸入腫瘤反應(yīng)性淋巴細(xì)胞后肝臟 轉(zhuǎn)移腫瘤完全減退，并且CEA水平變?yōu)檎?、腹水消失、身體健康并定期鍛煉。另一位具有 肝臟轉(zhuǎn)移腫瘤的患者在輸液后肝臟轉(zhuǎn)移腫瘤和腹水減退。一位患者在輸液后3個(gè)月肝臟和 肺臟的轉(zhuǎn)移腫瘤消退、具有5. 9的幾乎正常的CEA水平(正常值< 4. 0)、腹水消失，并且他 在臨床上表現(xiàn)為健康。結(jié)果16位患有結(jié)腸癌或單生的結(jié)腸直腸肝臟轉(zhuǎn)移腫瘤的患者在南斯德哥爾摩綜合醫(yī) 院(South Stockholm General Hospital)進(jìn)行手術(shù)，并包含在研究中。腫瘤的原發(fā)位點(diǎn)有 3位在盲腸、4位在升結(jié)腸、1位在降結(jié)腸、7位在乙狀結(jié)腸、1位在直腸中。進(jìn)行了 7例右側(cè) 結(jié)腸部分切除術(shù)、1例左側(cè)結(jié)腸部分切除術(shù)、7例乙狀結(jié)腸切除和1例直腸切斷術(shù)。兩位患者 早些時(shí)候已進(jìn)行直腸切斷術(shù)和乙狀結(jié)腸切除；他們現(xiàn)在由于肝臟轉(zhuǎn)移腫瘤而經(jīng)歷部分肝臟 切除。一位患者在兩個(gè)腹部位置復(fù)發(fā)，并在早些時(shí)候由于直腸中的腫瘤而進(jìn)行過手術(shù)。在 我們的手術(shù)中，鑒定了兩個(gè)從轉(zhuǎn)移腫瘤引出的前哨淋巴結(jié)，一個(gè)在結(jié)腸腸系膜中，一個(gè)在小 腸腸系膜中。進(jìn)行了回腸結(jié)腸與腸系膜聯(lián)合區(qū)的擴(kuò)展切除。在所有患者中，通過在腫瘤周圍注射專利藍(lán)，在手術(shù)中鑒定到1到3個(gè)(平均2. 1 個(gè))前哨淋巴結(jié)。在進(jìn)行初次結(jié)腸切除的患者中，從每個(gè)樣本回收到平均15. 8個(gè)淋巴結(jié)。在 這些淋巴結(jié)的組織病理學(xué)研究后，5位患者被分類為Duke' s C，5位患者為Duke' s B，由 于在病理解剖調(diào)查中腫瘤細(xì)胞沿著神經(jīng)并在血管中生長(zhǎng)，它們?nèi)急环诸悶楦唢L(fēng)險(xiǎn)腫瘤。5 位患者具有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移腫瘤，并且在轉(zhuǎn)移腫瘤切除時(shí)被分類為Duke' s D。它們中的兩位患 者具有單生肝臟轉(zhuǎn)移腫瘤。此外，也通過FACS (熒光活化的細(xì)胞分揀)和針對(duì)由結(jié)腸癌腫 瘤表達(dá)的細(xì)胞角蛋白20的抗體對(duì)前哨淋巴結(jié)進(jìn)行分析，以檢測(cè)微型轉(zhuǎn)移腫瘤。通過流式細(xì) 胞術(shù)進(jìn)行的淋巴結(jié)的細(xì)胞角蛋白20的評(píng)估與病理解剖診斷相一致(未顯示)，除了在一個(gè) 病例中假陰性前哨淋巴結(jié)(根據(jù)組織病理學(xué)分析)在細(xì)胞角蛋白20FACS分析中是陽性的。前哨淋巴結(jié)是引流腫瘤的第一個(gè)淋巴結(jié)，因此是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤的第一個(gè)位點(diǎn) (Dahl 等，Eur. J. Surgical Oncology, 2005，31，381-385)，但是前哨淋巴結(jié)也是免疫系統(tǒng)活 化的最初位點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞、碎片、壞死的細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞積累在前哨淋巴結(jié)中，在那里 發(fā)生針對(duì)腫瘤的T細(xì)胞的呈遞、活化和克隆擴(kuò)增。本發(fā)明人利用了該前哨淋巴結(jié)獲得性淋
24巴細(xì)胞的體內(nèi)擴(kuò)增T細(xì)胞群進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)、擴(kuò)增和灌輸。前哨淋巴結(jié)獲得性淋巴細(xì)胞是針對(duì)腫瘤抗原而活化和克隆擴(kuò)增的T細(xì)胞群，其能 夠在外科手術(shù)過程中有效地收獲。與近來聚焦于細(xì)胞毒性T細(xì)胞的免疫治療試驗(yàn)相反，本 發(fā)明人的目的是產(chǎn)生用于體內(nèi)引發(fā)的T輔助細(xì)胞克隆擴(kuò)增的體外增強(qiáng)的方法流程。T輔助 細(xì)胞對(duì)于細(xì)胞毒性T細(xì)胞的有效功能和記憶細(xì)胞的產(chǎn)生似乎是必需的。此外，在靶向胰島 細(xì)胞抗原的T細(xì)胞受體轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)中，發(fā)現(xiàn)Thl細(xì)胞的灌輸對(duì)于β -細(xì)胞破壞和糖尿病的 發(fā)生是足夠的。前哨淋巴結(jié)獲得性淋巴細(xì)胞的體外培養(yǎng)物導(dǎo)致Thl活化和T輔助細(xì)胞的克 隆擴(kuò)增，正如由標(biāo)志性的Thl細(xì)胞因子IFN-γ的優(yōu)勢(shì)生產(chǎn)和限制性TCR νβ全部組成成分 的富集所表明的。用于擴(kuò)增T細(xì)胞的腫瘤勻漿物可能被II類呈遞的抗原呈遞細(xì)胞內(nèi)吞并 加工，導(dǎo)致CD4+T輔助細(xì)胞的活化，引起有利T輔助細(xì)胞的擴(kuò)增。通過交換，由胞吞作用攝 取的呈遞抗原可以被加工并呈遞在I類袋囊中，引起CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活化。有趣的 是，在某些情況下，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)CD4+和CD8+T細(xì)胞兩者的克隆擴(kuò)增。在擴(kuò)增開始時(shí)，前哨淋巴結(jié)獲得性淋巴細(xì)胞的平均數(shù)量是1.074億個(gè)細(xì)胞(在360 萬-5. 09億之間，中值為7千萬)。細(xì)胞通過流式細(xì)胞術(shù)表征。在開始時(shí)，⑶4+和⑶8+細(xì)胞 的比率平均為4. 9(在0. 36-10之間，中值為5. 4)，與外周血中⑶4/⑶8的比率(正常范圍 為1.0-2.5)相比，表明在前哨淋巴結(jié)中⑶4+Τ輔助細(xì)胞的擴(kuò)增(圖2Α)。此外，B淋巴細(xì)胞 (CD 19)和自然殺傷(NK)細(xì)胞(CD 56)存在于前哨淋巴結(jié)中(未顯示)。細(xì)胞在培養(yǎng)中保 持平均36. 1天(范圍為23-58天)，中值為33天。至少每周通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行密 切監(jiān)測(cè)。開始時(shí)，細(xì)胞總數(shù)降低。B細(xì)胞和NK細(xì)胞幾乎完全消失，并且⑶8+T殺傷細(xì)胞的數(shù) 量減少。使用的培養(yǎng)步驟主要促進(jìn)T輔助細(xì)胞的擴(kuò)增，因?yàn)镃D4/CD8的平均比率是92. 5。 用自體腫瘤抗原重新刺激導(dǎo)致腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的克隆擴(kuò)增，正如在體外培養(yǎng)之前和之后 通過調(diào)查前哨淋巴結(jié)獲得性淋巴細(xì)胞的T細(xì)胞受體νβ全部組成成分所評(píng)估的。在灌輸之前，通過測(cè)量活化和Thl細(xì)胞因子IFN- γ與Th2細(xì)胞因子IL_4的細(xì)胞 因子產(chǎn)生，針對(duì)自體腫瘤抗原對(duì)擴(kuò)增的T細(xì)胞進(jìn)行功能測(cè)試。體外擴(kuò)增的前哨淋巴結(jié)獲得 性淋巴細(xì)胞在用腫瘤抗原重新刺激后做出響應(yīng)，產(chǎn)生IFN-Y以及沒有或非常少的IL-4，表 明擴(kuò)增的T細(xì)胞是有功能的和Thl反應(yīng)性的。在本研究中對(duì)6位Duke' s D患者進(jìn)行治療。兩位在手術(shù)時(shí)被定為Duke‘ s D 階段、分別具有轉(zhuǎn)移到肝臟和肺臟與肝臟的腫瘤的患者，顯示出疾病的明顯減退(患者5和 12)。在灌輸淋巴細(xì)胞后，第一位患者具有位于兩葉中的肝臟轉(zhuǎn)移腫瘤(其已被宣布不能 通過肝臟手術(shù)治愈)的完全消退(圖3)、正常的CEA水平、腹水的消失，并表現(xiàn)出健康。患 者12顯示出肝臟和肺臟中的轉(zhuǎn)移腫瘤的減退，并伴有5. 9的幾乎正常的CEA水平(正常值 < 4. 0)、腹水的消失，并且他表現(xiàn)出臨床健康。患者1顯示出肝臟轉(zhuǎn)移腫瘤的尺寸減小，并 在開始時(shí)CEA水平降低、腹水消失，并且當(dāng)她似乎由于肺栓塞突然死亡時(shí)(第191天)體型 極好。兩位Duke' s D患者表現(xiàn)出疾病穩(wěn)定，轉(zhuǎn)移腫瘤沒有發(fā)展、CEA水平也沒有增加。研 究中最老的7號(hào)患者顯示出5個(gè)月的疾病穩(wěn)定，但是隨后CEA水平開始增加，她在83歲時(shí) 死亡。沒有進(jìn)行尸體剖檢。一位患者在手術(shù)是被分為Duke' s C階段，但是不久后發(fā)生向 肝臟和肺臟的腫瘤轉(zhuǎn)移(Duke' s D)，但是在灌輸和化療后，觀察到肺部和肝臟轉(zhuǎn)移腫瘤的 減退，并僅具有略微升高的CEA水平。被分類為Duke' s C的患者都具有正常的CEA水平， 并且沒有表現(xiàn)出疾病的放射學(xué)或臨床復(fù)發(fā)的任何跡象。被分類為Duke' s C的4位患者都健康，具有正常的CEA水平，并且沒有疾病復(fù)發(fā)的跡象。9號(hào)患者被分類為Duke' s B，但是 具有侵襲性生長(zhǎng)的腫瘤，顯示出疾病復(fù)發(fā)的跡象并具有升高的CEA水平(67)和肝臟轉(zhuǎn)移腫 瘤的跡象。為了研究被灌輸?shù)腡細(xì)胞的命運(yùn)，本發(fā)明人分析了外周血中針對(duì)腫瘤提取物的T 細(xì)胞增殖。正如前面提到的，他們能夠在灌輸前的任何患者中證明外周血中T細(xì)胞針對(duì)自 體腫瘤抗原的任何反應(yīng)性。但是，我們能夠在所有調(diào)查的患者中在長(zhǎng)達(dá)灌輸后42個(gè)月內(nèi)檢 測(cè)到外周血中針對(duì)自體腫瘤抗原的T細(xì)胞增殖，表明存在克隆增殖的循環(huán)的腫瘤反應(yīng)性T 細(xì)胞。患者特征的概述下面是本研究的所有參加者的表，在手術(shù)中Duke' s分類后分組SD =穩(wěn)定的疾 病，CR=完全響應(yīng)參加者特征
權(quán)利要求
1.一種組合物，其包含a)一種或多種VEGF抑制劑，以及b)腫瘤反應(yīng)性⑶4+T輔助細(xì)胞和/或⑶8+T淋巴細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中⑶4+T輔助細(xì)胞和/或⑶8+反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞通過下述方法獲得用腫瘤來源的抗原連同至少一種對(duì)IL-2受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)刺激腫瘤反應(yīng)性 CD4+T輔助細(xì)胞和/或CD8+T淋巴細(xì)胞，以促進(jìn)腫瘤反應(yīng)性CD4+T輔助細(xì)胞和/或CD8+T淋 巴細(xì)胞的存活；以及活化并促進(jìn)腫瘤反應(yīng)性CD4+T輔助細(xì)胞和/或CD8+T淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)，其中當(dāng)CD25細(xì) 胞表面標(biāo)志物(或IL-2R標(biāo)志物)在⑶4+T輔助細(xì)胞和/或⑶8+T淋巴細(xì)胞上被下調(diào)時(shí)啟 動(dòng)第二階段ii)。
3.權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的組合物，其中VEGF抑制劑選自抗VEGF或其受體的中和單克 隆抗體、VEGF受體的小分子酪氨酸激酶抑制劑、用作VEGF的假受體的可溶性VEGF受體和 特異性靶向VEGF mRNA的核酶或其組合。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中抗VEGF的中和單克隆抗體是貝伐單抗(Avastin )。
5.權(quán)利要求3的組合物，其中抗VEGF的中和單克隆抗體是蘭尼單抗(Lucentis )。
6.權(quán)利要求3的組合物，其中抗VEGF的中和單克隆抗體選自Ab-153、Ab-309、Ab-342。
7.權(quán)利要求3的組合物，其中VEGF受體的酪氨酸激酶抑制劑選自舒尼替尼(Sutent )、索拉非尼(Nexavar )、N-甲基_2_[ [3_[ (E) _2_吡啶-2-基乙烯基]-IH-吲唑-6-基] 硫烷基]苯甲酰胺(Axitinib )和5-[[4-[(2，3-二甲基-2H-吲唑-6-基)(甲基)氨基] 嘧啶-2-基]氨基]-2-甲基苯磺酰胺(Pazopanib )。
8.權(quán)利要求3的組合物，其中特異性靶向VEGFmRNA的核酶是錘頭型核酶。
9.權(quán)利要求8的組合物，其中錘頭型核酶選自抗Flt-I核酶。
10.權(quán)利要求9的組合物，其中抗Flt-I核酶是Angiozyme 。
11.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的組合物，其包含癌癥類型特異性CD4+T淋巴細(xì)胞，其中至少 70%的癌癥特異性⑶4+T淋巴細(xì)胞是Thl型，30%或低于30%的癌癥特異性⑶4+T淋巴細(xì) 胞是Th2型。
12.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的組合物，其包含癌癥特異性T淋巴細(xì)胞，其中約35%至約 90%是記憶型的。
13.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的組合物，其包含癌癥特異性T淋巴細(xì)胞，其中約10%至約 65%是效應(yīng)T淋巴細(xì)胞。
14.權(quán)利要求11-13任一項(xiàng)的組合物，其包含癌癥特異性T淋巴細(xì)胞，其中組合物包含 至少1千萬或至少2千萬或至少3千萬或至少4千萬或至少5千萬或至少1億個(gè)腫瘤反應(yīng) 性T淋巴細(xì)胞。
15.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的組合物，其中VEGF抑制劑的量為約Img至約2000mg、或 約70mg至約1400mg、或約140mg至約1050mg、或約210mg至約1050mg、或約280mg至約 1050mg、或約 350mg 至約 1050mg。
16.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的組合物，其中組合物是包含治療有效量的腫瘤反應(yīng)性T淋 巴細(xì)胞和治療有效量的一種或多種VEGF抑制劑的單一組合物。
17.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的組合物，其包含兩種獨(dú)立的制備物，其中一個(gè)制備物包含治 療有效量的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，第二個(gè)制備物包含治療有效量的一種或多種VEGF抑制 劑。
18.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的組合物，其還包含化療藥劑，所述化療藥劑選自5-氟尿嘧 啶、甲酰四氫葉酸、奧沙利鉬、紫杉醇、多西他賽、福馬加林、柔紅霉素、多柔比星、表柔比星、 伊立替康、拓?fù)涮婵怠㈤L(zhǎng)春新堿、卡鉬、順鉬、環(huán)磷酰胺、絲裂霉素C、米托蒽醌、氟尿苷、吉西 他濱、甲氨蝶呤、博來霉素、依托泊苷、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春地辛、長(zhǎng)春瑞濱、染料木素或其組合。
19.權(quán)利要求18的組合物，其中組合物包含含有治療有效量的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞 的制備物和包含治療有效量的一種或多種VEGF抑制劑的制備物，以及任選的，包含治療有 效量的一種或多種化療藥劑的制備物。
20.權(quán)利要求18的組合物，其中組合物是兩種獨(dú)立組合物的試劑盒，其以任意組合包 含治療有效量的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞和治療有效量的一種或多種VEGF抑制劑以及任選 的治療有效量的化療藥劑，或組合物是包含3種獨(dú)立組合物的試劑盒，其中一種組合物包 含治療有效量的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，第二種組合物包含治療有效量的一種或多種VEGF 抑制劑，第三種組合物包含治療有效量的一種或多種化療藥劑。
21.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的組合物，其中組合物還包含可藥用賦形劑，所述賦形劑選自 抗粘附劑、粘合劑、涂層劑、崩解劑、填料/稀釋劑、調(diào)味劑和著色劑、PH調(diào)節(jié)劑、助流劑、潤(rùn) 滑劑、防腐劑、吸附劑、甜味劑和改變活性物質(zhì)的溶解速率的材料、無血清介質(zhì)、緩沖劑或溶 液、細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液或營(yíng)養(yǎng)劑、人類或人造血清白蛋白、自體血清、能任選地具有與血液相同滲 張度的等滲介質(zhì)、生理鹽水溶液、防腐劑或其組合。
22.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)中限定的一種或多種VEGF抑制劑和腫瘤反應(yīng)性CD4+T輔助細(xì) 胞和/或CD8+T淋巴細(xì)胞在制造用于治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。
23.權(quán)利要求22的應(yīng)用，其中癌癥選自乳腺、結(jié)腸、直腸、胰腺、肝臟、膽囊、膽管、膀胱、 腦、小腸、肺、前列腺、腎臟、子宮頸、外陰、卵巢中的癌，惡性黑素瘤，頭頸部癌；關(guān)節(jié)、骨骼、 肌肉和肌腱中的肉瘤，淋巴瘤；畸胎瘤；以及轉(zhuǎn)移和原位晚期(不可動(dòng)手術(shù)的)的上述腫 瘤。
24.權(quán)利要求22的應(yīng)用，其中藥物是單一組合物或包含兩種或三種獨(dú)立制備物的試劑 盒，其中一種制備物包含腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，另一種制備物包含一種或多種VEGF抑制 劑，以及其它制備物包含一種或多種化療藥劑，所述化療藥劑任選與任意的兩種前面提到 的組合物組合在單一組合物中。
25.權(quán)利要求對(duì)的應(yīng)用，其中試劑盒的制備物可以同時(shí)或以任意次序順序給藥。
26.權(quán)利要求25的應(yīng)用，其中至少一種制備物打算用于腸胃外或口服給藥。
27.權(quán)利要求沈的應(yīng)用，其中腸胃外給藥可以是靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥。
28.權(quán)利要求沈的應(yīng)用，其中口服制備物可以是常規(guī)的片劑、膠囊、囊片、溶液、懸液、 乳液。
29.權(quán)利要求25- 任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中試劑盒中的組合物可以任意次序獨(dú)立地腸胃 外或口服給藥。
30.一種用于治療患有癌癥的患者的方法，所述方法包括向患者給藥腫瘤反應(yīng)性 CD4+T輔助細(xì)胞和/或CD8+T淋巴細(xì)胞和一種或多種VEGF抑制劑以及任選的一種或多種化療藥劑，并且其中腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞。
31.權(quán)利要求30的方法，其中⑶4+T輔助細(xì)胞和/或⑶8+反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞通過下述 方法獲得用腫瘤來源的抗原連同至少一種對(duì)IL-2受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)刺激腫瘤反應(yīng)性 CD4+T輔助細(xì)胞和/或CD8+T淋巴細(xì)胞，以促進(jìn)腫瘤反應(yīng)性CD4+T輔助細(xì)胞和/或CD8+T淋 巴細(xì)胞的存活；以及活化并促進(jìn)腫瘤反應(yīng)性CD4+T輔助細(xì)胞和/或CD8+T淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)，其中當(dāng)CD25細(xì) 胞表面標(biāo)志物(或IL-2R標(biāo)志物)在⑶4+T輔助細(xì)胞和/或⑶8+T淋巴細(xì)胞上被下調(diào)時(shí)啟 動(dòng)第二階段ii)。
32.權(quán)利要求30的方法，其中VEGF抑制劑選自抗VEGF或其受體的中和單克隆抗體、 VEGF受體的小分子酪氨酸激酶抑制劑、用作VEGF的假受體的可溶性VEGF受體和特異性靶 向VEGF mRNA的核酶或其組合。
33.權(quán)利要求32的方法，其中抗VEGF的中和單克隆抗體是貝伐單抗(Avastin )。
34.權(quán)利要求32的方法，其中抗VEGF的中和單克隆抗體是蘭尼單抗(Lucentis )。
35.權(quán)利要求32的方法，其中抗VEGF的中和單克隆抗體選自Ab-153、Ab_309、Ab_342。
36.權(quán)利要求32的方法，其中VEGF受體的酪氨酸激酶抑制劑選自舒尼替尼(Sutent )、索拉非尼(Nexavar _ )、N-甲基_2_[ [3_[ (E) _2_吡啶-2-基乙烯基]-IH-吲唑-6-基] 硫烷基]苯甲酰胺(Axitinib )和5-[[4-[(2，3-二甲基-2H-吲唑-6-基)(甲基)氨基] 嘧啶-2-基]氨基]-2-甲基苯磺酰胺(Pazopanib )。
37.權(quán)利要求32的方法，其中特異性靶向VEGFmRNA的核酶是錘頭型核酶。
38.權(quán)利要求37的方法，其中錘頭型核酶選自抗Flt-I核酶。
39.權(quán)利要求38的方法，其中抗Flt-I核酶是Angiozyme 。
40.權(quán)利要求30-39任一項(xiàng)的方法，其包含給藥癌癥類型特異性CD4+T淋巴細(xì)胞，其中 至少70%的癌癥特異性⑶4+T淋巴細(xì)胞是Thl型，30%或以下的癌癥特異性⑶4+T淋巴細(xì) 胞是Th2型。
41.權(quán)利要求30-39任一項(xiàng)的方法，其包含給藥癌癥特異性T淋巴細(xì)胞，其中約35%至 約90%是記憶型。
42.權(quán)利要求30-39任一項(xiàng)的方法，其包含給藥癌癥特異性T淋巴細(xì)胞，其中約10%到 約65%是效應(yīng)T淋巴細(xì)胞。
43.權(quán)利要求30-42任一項(xiàng)的方法，其包含給藥含有治療有效量腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞 和治療有效量的一種或多種VEGF抑制劑的組合物。
44.權(quán)利要求30-42任一項(xiàng)的方法，其包含給藥兩種獨(dú)立的制備物，其中一種制備物包 含治療有效量的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，第二種制備物包含治療有效量的一種或多種VEGF 抑制劑。
45.權(quán)利要求30-44任一項(xiàng)的方法，其任選還包含化療藥劑，所述化療藥劑選自5-氟尿 嘧啶、甲酰四氫葉酸、奧沙利鉬、紫杉醇、多西他賽、福馬加林、柔紅霉素、多柔比星、表柔比 星、伊立替康、拓?fù)涮婵怠㈤L(zhǎng)春新堿、卡鉬、順鉬、環(huán)磷酰胺、絲裂霉素C、米托蒽醌、氟尿苷、吉 西他濱、甲氨蝶呤、博來霉素、依托泊苷、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春地辛、長(zhǎng)春瑞濱、染料木素或其組合。
46.權(quán)利要求30-42任一項(xiàng)的方法，其中給藥的是包含治療有效量的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞和治療有效量的一種或多種VEGF抑制劑以及治療有效量的一種或多種化療藥劑的組 合物。
47.權(quán)利要求30-42任一項(xiàng)的方法，其中給藥的組合物是兩種獨(dú)立組合物的試劑盒，其 以任意組合包含治療有效量的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞和治療有效量的一種或多種VEGF抑 制劑以及任選的治療有效量的化療藥劑，或組合物是包含三種獨(dú)立組合物的試劑盒，其中 一種組合物包含治療有效量的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，第二種組合物包含治療有效量的一 種或多種VEGF抑制劑，第三種組合物包含治療有效量的一種或多種化療藥劑。
48.權(quán)利要求30-47任一項(xiàng)的方法，其包含給藥至少1千萬或至少2千萬或至少3千萬 或至少4千萬或至少5千萬或至少1億個(gè)腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的癌癥特異性T淋巴細(xì)胞。
49.權(quán)利要求30-48任一項(xiàng)的方法，其中給藥的VEGF抑制劑的量選自約Img到約 2000mg、或約 70mg 至Ij約 1400mg、或約 140mg 至Ij約 1050mg、或約 2IOmg 至Ij 約 1050mg、或約 280mg 到約 1050mg、或約 350mg 到約 1050mg。
50.權(quán)利要求30-49任一項(xiàng)的方法，其中癌癥選自乳腺、結(jié)腸、直腸、胰腺、肝臟、膽囊、 膽管、膀胱、腦、小腸、肺、前列腺、腎臟、子宮頸、外陰、卵巢中的癌，惡性黑素瘤，頭頸部癌； 關(guān)節(jié)、骨骼、肌肉和肌腱中的肉瘤，淋巴瘤；畸胎瘤；以及轉(zhuǎn)移和原位晚期(不可動(dòng)手術(shù)的) 的上述腫瘤。
51.權(quán)利要求30-50任一項(xiàng)的方法，其中至少一種活性成分通過腸胃外或口服途徑給藥。
52.權(quán)利要求51的方法，其中腸胃外給藥是靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥。
53.權(quán)利要求51的方法，其中口服給藥采用常規(guī)的片劑、膠囊、囊片、溶液、懸液或乳液 制備物的形式。
54.權(quán)利要求30的方法，其中腫瘤反應(yīng)性⑶4+T輔助細(xì)胞和/或⑶8+T淋巴細(xì)胞通過 靜脈內(nèi)給藥。
55.權(quán)利要求30-51任一項(xiàng)的方法，其中腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞和一種或多種VEGF抑 制劑以及任選的一種或多種化療藥劑同時(shí)或以任意次序以任意時(shí)間間隔順序給藥。
56.權(quán)利要求M或55的方法，其中試劑盒組分可以任意次序獨(dú)立地口服或腸胃外給藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用組合治療的改進(jìn)的癌癥療法，所述組合治療使用了通過腫瘤反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的體外擴(kuò)增和活化方法獲得的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞、特別是CD4+輔助細(xì)胞和/或CD8+T淋巴細(xì)胞，以及血管形成抑制劑的抑制劑、尤其是VEGF的抑制劑。
文檔編號(hào)A61K38/18GK102119214SQ200980128006
公開日2011年7月6日 申請(qǐng)日期2009年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月18日
發(fā)明者奧拉·溫克維斯特, 馬格納斯·索恩 申請(qǐng)人:森托科隆國(guó)際公司