專利名稱：用于位點特異性偶聯(lián)的半胱氨酸工程化抗體的制作方法
用于位點特異性偶聯(lián)的半胱氨酸工程化抗體1.相關申請的交互引用本申請要求2008年1月18日提交的美國專利臨時申請第61/022，073號的優(yōu)先 權，并將其內(nèi)容納入本文作為參考。
2.發(fā)明領域本發(fā)明涉及含有半胱氨酸工程化改造的CHl結(jié)構域的抗體，所述半胱氨酸工程化 改造產(chǎn)生了用于偶聯(lián)反應的游離巰基。還提供了設計、修飾、生產(chǎn)和應用這些抗體的方法。3.
背景技術：
3. 1癌癥和癌癥治療每年有超過120萬美國人發(fā)生癌癥。癌癥是美國的第二大死亡原因，而且如果這 種趨勢繼續(xù)下去，癌癥將在2010年成為第一位的死亡原因。肺癌和前列腺癌是美國男性的 頭號癌癥殺手。肺癌和乳腺癌是美國女性的頭號癌癥殺手。在美國每2個男性中就有一個 會在其人生的某一時間被診斷出癌癥。在美國每3個女性中就會有一個在其人生的某一時 間被診斷出癌癥。目前的治療選擇，例如手術、化療和放射治療，通常是沒有效果或者表現(xiàn) 出嚴重的副作用?？罐D(zhuǎn)移藥劑開發(fā)的一個障礙在于用于設計和評估這些藥物的測試系統(tǒng)。多數(shù)常 規(guī)癌癥治療以快速生長的細胞作為靶標。然而，癌癥細胞不一定生長得更快，而是能在正 常細胞不能存活的條件下可以存活和生長(Lawrence和Steeg, 1996，World J. Urol. 14 124-130)。這些正常細胞和惡性細胞行為的根本差異提供了治療靶向的機會。微轉(zhuǎn)移腫瘤 已經(jīng)分散到整個身體的范例強調(diào)了需要在外在和三維微環(huán)境下評估潛在化學治療藥物。許 多標準癌癥藥物測試在標準細胞培養(yǎng)(即單層生長)條件下檢測了腫瘤細胞的生長或存 活。然而，在二維測試中細胞行為通常并不能可靠預測體內(nèi)腫瘤細胞的行為。目前，癌癥治療可包括外科手術、化療、激素治療和/或放射治療來清除患者體內(nèi) 的癌細胞(例如參見1998年Rubenstein和!^ederman編的《科學美國人醫(yī)藥篇》第3卷第 12章第4部分中Stockdale的《癌癥患者管理原則》一文(Stockdale, 1998，“ Principles of Cancer Patient Management" , in ScientificAmerican :Medicine,vol. 3. Rubenstein and Federman, eds. , Chapter 12, SectionIV)) 對患者而言，所有這些途徑都具有明顯的 缺陷。例如，外科手術可能由于患者的健康原因而不能進行或是可能不被患者所接受。此 外，外科手術可能不能完全去除癌組織。放射治療只有當癌組織表現(xiàn)出比正常組織更高的 放射敏感性才有效，而且放射治療也通常引起嚴重的副作用。激素治療很少作為單一藥劑 給予，而且盡管有效，常用于在用其他治療去除了大部分的癌細胞之后來預防或延遲癌癥 的復發(fā)。至于化學治療，有多種化療劑可以用于治療癌癥。大量的癌癥化學療法通過抑 制DNA合成來發(fā)揮作用(例如參見1990年紐約培格曼出版社出版的Gilman等《古德 曼吉爾曼治療學的藥理學基礎》第8版(Gilman et al.，Goodman and Gilman' s =The Pharmacological Basis of Therapeutics, Eighth Ed. (Pergamon Press, New York,1990)))。同樣地，化療劑在本質(zhì)上是非特異性的。另外，幾乎所有的化療劑都是有毒性的， 并且化療引起明顯的且通常是危險的副作用，包括嚴重反胃、骨髓抑制、免疫抑制等(例如 參見1998年Rubenstein和!^derman編的《科學美國人醫(yī)藥篇》第3卷第12章第10部 分的 Mockdale 的《癌癥患者管理原則》一文(Stockdale，1998，“ Principles OfCancer Patient Management “ in Scientific American Medicine, vol.3, Rubensteinand Federman, eds.，ch. 12，sect. 10))。而且，即使給予化療劑的組合，很多腫瘤細胞對化療劑 具有抗性或會產(chǎn)生抗性。現(xiàn)在，癌癥治療可以包括生物治療或免疫治療。生物治療/免疫治療受到數(shù)量限 制，并且盡管比化療劑的特異性更強，很多生物治療/免疫治療也同時攻擊健康細胞和癌 細胞。此外，這些治療可能產(chǎn)生副作用例如皮疹或腫脹、包括發(fā)燒、發(fā)冷和疲勞等流感樣癥 狀、消化道問題或過敏反應。3. 2用于癌癥治療的抗體抗體是結(jié)合特異抗原的免疫蛋白。在包括人和小鼠等在內(nèi)的大多數(shù)哺乳動物中， 抗體由配對的重多肽鏈和輕多肽鏈構成。每條鏈由2個截然不同的區(qū)域構成，被稱為可變 區(qū)(Fv)和恒定區(qū)(Fe)。輕鏈和重鏈Fv區(qū)包含分子的抗原結(jié)合決定簇并且負責結(jié)合靶抗 原。Fc區(qū)決定了抗體的類型(或同種型)(例如IgG)，并且負責結(jié)合多種天然蛋白來引發(fā) 重要的生物化學事件?？贵w的Fc區(qū)與包括Fc受體和其它配體等在內(nèi)的多種配體相互作用，引起一批 重要的功能效應，即效應器功能。IgG類的Fc受體的重要家族是Fc γ受體(FcyR)。這 些受體介導了抗體和免疫系統(tǒng)的細胞性手臂之間的通訊(Raghavan等，1996年，Armu Rev Cell. Dev Biol 12 181-220 ;Ravetch 等，2001 年，Annu RevImmunol 19:275-290)。在 人類中，這個蛋白家族包括Fc γ RI (CID64)，包括同種型Fc γ RIA、Fc y RIB和Fc y RIC ； Fc y RII (CD32)，包括同種型 Fc γ RIIA、Fc γ RIIB 禾口 Fc γ RIIC ；以及 Fc γ RIII (CD16)，包括 同種型 Fc γ RIIIA 和 Fc γ RIIIB (Jefferis 等，2002 年，Immunol Lett 82:57-65)。這些受 體典型地帶有介導與Fc結(jié)合的胞外結(jié)構域、跨膜區(qū)域和可能介導細胞內(nèi)某些信號傳導事 件的胞內(nèi)結(jié)構域。這些不同的Fc γ R亞型在不同細胞上表達(綜述參見Ravetch等，1991 年，Annu Rev Immunol 9:457-492)。例如，在人類中，F(xiàn)c γ RIIIB只在嗜中性粒細胞中發(fā) 現(xiàn)，而Fc γ RIIIA在巨噬細胞、單核細胞、自然殺傷(NK)細胞和T細胞亞群中都有發(fā)現(xiàn)。Fc/Fc γ R復合物的形成將效應細胞招募到結(jié)合抗原的位點，通常導致細胞內(nèi)的 信號傳導事件和重要的后續(xù)免疫應答例如炎癥介質(zhì)的釋放、B細胞活化、細胞內(nèi)吞、吞噬 作用和細胞毒性攻擊。介導細胞毒性和吞噬細胞效應器功能的能力是抗體破壞靶細胞的 一種潛在機制。表達Fc γ R的非特異性細胞毒性細胞識別靶細胞上結(jié)合的抗體，并且隨 之引發(fā)靶細胞的裂解，這種細胞介導的反應稱為抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC) (Raghavan φ, 1996, Annu Rev CellDev Biol 12 :181-220 ；Ghetie ，2000， Arrnu Rev Immunol 18 :739-766 ;Ravetch 等，2001，Annu Rev Immunol 19:275-290)。值得注意的 是，介導ADCC的主要細胞NK細胞只表達Fc γ RIIIA，而單核細胞表達Fc γ RI、Fc γ RII和 Fc y RIII (Ravetch 等，1"1，見上)。另一個重要的Fc配體是補體蛋白Clq。Fc結(jié)合到Clq上介導了一個稱為補體依 賴性細胞毒性(CDC)的過程(綜述參見Ward等，1995，Ther Immuno 12 77-94) 0 Clq能結(jié)
7合6個抗體，雖然結(jié)合2個IgG就足以活化補體信號級聯(lián)。Clq和Clr以及Cls絲氨酸蛋白 酶形成復合物，從而形成補體通路的Cl復合物?？贵w的某些關鍵特性包括但不限于對靶標的特異性、介導免疫效應器機制的能 力、血清中的半衰期長，這些特性使抗體和相關的免疫球蛋白分子能成為有力的治療方法。 許多單克隆抗體目前正在開發(fā)中或是正在用于包括癌癥在內(nèi)的多種病癥的治療中。這些 抗體的例子包括Vitaxin (美迪免疫公司(Medimmune))、人源化的整合蛋白ανβ3抗體 (例如PCT出版物W02003/075957)、Herceptin (基因泰克公司(Genetech))、已經(jīng)批準用 于治療乳腺癌的人源化的抗Her2/neU抗體(例如美國專利第5，677，171號)、CNT0 95 (塞 托克公司(Centocor))、人整合蛋白 α v 抗體(PCT 出版物 WO 02/12501) ,Rituxan (IDEC/ 基因泰克公司/羅氏制藥)、已經(jīng)批準用于治療非霍奇金淋巴瘤的嵌合式抗CD20抗體(例 如美國專利第5，736，137號)和Erbitux (英客隆公司(ImClone))、嵌合式的抗EGFR抗 體(例如美國專利第4，943，533號)?？贵w破壞腫瘤細胞存在多種可能機制，包括通過阻斷所需的生長通路、引起凋亡 的胞內(nèi)信號傳導、提高受體的下調(diào)和/或更新、ADCC、CDC和促進獲得性免疫應答來抑制增 M (Cragg 1999, Curr Opin Immunol 11 :541-547 ；Glennie ^,2000, Immunol Today 21 :403-410)。然而，盡管廣泛使用，抗體還沒有針對臨床使用進行優(yōu)化，而且許多抗體的抗 癌效力低于最佳水平。所以，非常需要提高抗體破壞靶向癌細胞的能力。3. 3抗體偶聯(lián)物在癌癥的治療中，使用抗體偶聯(lián)物(即免疫偶聯(lián)物)來進行細胞毒性劑或細 胞生長抑制劑(即殺死或抑制腫瘤細胞的藥物)的局部遞送(Lambert，J. (2005)Curr. Opinion in Pharmacology 5 :543-549 ；Wu 等(2005)Nature Biotechnology23 (9) 1137-1146 ；Payne, G. (2003)Cancer Cell 3 :207-212 ；Syrigos 禾口 Epenetos (1999) Anticancer Research 19 :605-614 ;Nieuleseu_Duvaz 禾口 Springer (1997)Adv. Drag Del. Rev. 26 :151-172 ；美國專利第4，975，278號)，理論上可以將藥物部分靶向性地遞送到 腫瘤，并且在細胞內(nèi)富集，而進行這些非偶聯(lián)藥物藥劑全身給藥可能導致對正常細胞以 及所要消除的腫瘤細胞的毒性都達到不可接受的毒性(Baldwin等(1986) Lancet (1986 年3月15日)第603-05頁；1985年A. Pinchera等編《單克隆抗體‘84 生物和臨床應 用》第475-506頁Thorpe的《綜述癌癥治療中細胞毒性劑的抗體運載體》一文(Thorpe，
(1985)“Antibody Carriers OfCytotoxic Agents In Cancer Therapy :A Review, " in Monoclonal Antibodies' 84 :Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al(ed. s)，pp. 475-506))。因此，所尋求的目標就是功效最大化且毒性最小化。設計和精 制抗體偶聯(lián)物的努力集中在單克隆抗體(mAb)的選擇性以及藥物結(jié)合和藥物釋放性質(zhì)上 (Lambert, J. (2005)Curr. Opinion in Pharmacology 5:543—549)。多克隆抗體禾口單克 隆抗體都已報道可用于這些策略(Rowland等(1986)Cancer Immunol. Immunother. ,21 183-87)。用于這些方法的藥物包括柔紅霉素、阿霉素、甲氨喋呤和長春地辛(Rowland等
(1986))。用于抗體-毒素偶聯(lián)物的毒素包括細菌毒素例如白喉毒素，植物毒素例如蓖麻毒 素和白樹素(Gelonin)，小分子毒素例如格爾德霉素(Geldanamycin) (Mandler等Q000) J. of the Nat-Cancer Inst. 92(19) :1573-1581 ⑶已打氾一！“等 O000)Bioorganic&Med. Chem. Letters 10 :1025-1028 ；Mandler 等(2002)Bioconjugate Chem. 13 :786-791)、類美坦素
8(maytansinoids)(EP 1391213 ；Liu 等(1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA93 :8618-8623)和 卡里奇霉素(caliceamicin) (Lode等(1998)Cancer Res. 58 :2928 ；Hinman等(1993)Cancer Res. 53 :3336-3342)。毒素可能通過下列機制來實現(xiàn)它們的細胞毒性和抑制細胞的作用，包 括結(jié)合微管蛋白、結(jié)合DNA或抑制拓撲異構酶。當偶聯(lián)到大抗體或蛋白受體配體上時，一些 細胞毒性藥物會變得失去活性或活性降低。一些抗體偶聯(lián)物已經(jīng)獲得FDA批準或者在進行臨床試驗。例如ZEVALIN (替伊莫單抗，Biogen/Idec公司)由針對正常和惡性B淋巴細胞表面的⑶20抗原的鼠 IgGl κ單克隆抗體以及111M或9°￥放射性同位素通過硫脲結(jié)合劑-螯合劑連接起來而構 成(Wiseman 等(2000) Eur. J. Nucl. Med. 27 (7) :766-77 ；Wiseman 等(2002) Blood 99(12) 4336-42 ；Witzig 等(2002)J. Clin. Oncol. 20(10) :2453-63 ；Witzig 等(2002)J.Clin. Oncol. 20(15) =3262-69) 0盡管ZEVALIN 具有抗B細胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的 活力，給藥在多數(shù)患者中導致了嚴重且長期的血細胞減少。MYLOTARG (吉妥珠單 抗奧唑米星、惠氏制藥)，一種由人CD33抗體連接到卡里奇霉素上組成的抗體-藥物偶聯(lián) 物，也在2000年被批準用于注射治療急性骨髓性白血病(《未來的藥物》(Drugs ofthe Future) (2000)25(7) :686 ；美國專利第 4，970，198 號；第 5，079，233 號；第 5，585，089 號； 第 5，606，040 號；第 5，693，762 號；第 5，739，116 號；第 5，767，285 號，第 5，773，001 號)。 莫坎妥珠單抗(Cantuzumab mertansine) (Immunogen公司)，一種由人C242抗體通過二硫 結(jié)合劑SPP連接到類美坦素藥物部分DMl上構成的抗體-藥物偶聯(lián)物(Xie等Q004) J，of Pharm, and Exp. Ther. 308(3) 1073-1082)，正在進行用于治療表達癌癥抗原的癌癥的臨床 試驗，例如結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌和其他癌癥。MLN-2704(千禧制藥(Millennium Pharm)、BZL 生物制劑公司(BZL Biologies)、免疫原公司(Immimogen))，一種由抗前列腺特異性膜抗原 (PSMA)單克隆抗體連接到類美坦素藥物部分DMl構成的抗體-藥物偶聯(lián)物，在進行潛在前 列腺腫瘤治療的開發(fā)中。奧利斯他汀肽(Auristatin)、奧利斯他汀E(AE)和單甲基奧利斯他汀(MMAE)、多 拉司他汀(dolastatin)的合成類似物(W0 02/088172)，已經(jīng)被偶聯(lián)到(i)嵌合式單克 隆抗體cBR96(特異性針對癌上的Lewis Y) ； (ii)特異性針對惡性血液腫瘤上的⑶30的 cACIO (Klussman 等 Q004)，BioconjugateChemistry 15(4) :765-773 ;Doronina 等 Q003) Nature Biotechnology 21(7) :778-784 ；Francisco ^ (2003)Blood 102(4) :1458-1465; US 2004/0018194) ； (iii)抗 CD20 的抗體，例如RITUXAN (W0 04/032828)用于治療表 達⑶20的癌癥和免疫病癥；(iv)用于治療結(jié)腸癌的抗EphB2R抗體2H9和抗IL-8(Mao等 (2004) Cancer Research 64(3) :781-788) ； (ν) E-選擇素抗體(Bhaskar 等 QOO3) Cancer Res. 63 :6387-6394)；和(vi)其他抗 CD30 抗體(W0 03/043583)。美國專利第 5，767，237 號和第6，124，431號公開了奧利斯他汀E的變體。2004年3月觀日，knter等在《美國 癌癥石if究協(xié)會學 艮》(Proceedings of the AmericanAssociation for Cancer Research) 第45卷第623號摘要中，介紹了偶聯(lián)到單克隆抗體上的單甲基奧利斯他汀E。奧利斯他汀 類似物MMAE和MMAF已經(jīng)被偶聯(lián)到各種抗體上(W0 2005/081711)。用常規(guī)方式連接(即通過共價鍵連接)藥物部分和抗體，通常會形成藥物部分連 接到抗體的多個位點的分子的非均質(zhì)混合物。例如，細胞毒性藥物通常經(jīng)由抗體中通常數(shù) 量很多的賴氨酸或半胱氨酸殘基偶聯(lián)到抗體上，產(chǎn)生非均質(zhì)的抗體-藥物偶聯(lián)物混合物。依據(jù)反應條件，非均質(zhì)混合物中抗體的分布通常為具有到0到約8個或更多的連接的藥物 部分的抗體。另外，在每個藥物部分與抗體的比例為特定整數(shù)比例的偶聯(lián)物亞族中，也存在 潛在的非均質(zhì)混合物，該非均質(zhì)混合物中藥物部分連接到抗體的各種不同位點上。分析和 制備方法不足以分離和鑒定由偶聯(lián)反應獲得的非均質(zhì)混合物中的抗體-藥物偶聯(lián)物分子 種類?？贵w是大的、復雜的且結(jié)構變化多的生物分子，通常帶有許多反應功能基團。它們和 接頭試劑以及藥物-接頭中間體的反應活力依賴于許多因子例如PH、濃度、鹽濃度和共溶 劑。而且，由于難以控制反應條件以及鑒別反應物和中間體，多步驟的偶聯(lián)過程可能是不可 以重復的。半胱氨酸巰基在中性pH下是有反應活力的，不像大多數(shù)胺在接近pH7時是質(zhì)子化 的且親核性差。由于游離的巰基(R-SH，巰基)基團是相對有反應活力的，帶有半胱氨酸殘 基的蛋白通常以它們二硫鍵連接寡聚體的氧化形式存在，或帶有內(nèi)部橋聯(lián)的二硫基團。胞 外蛋白通常不帶有游離巰基(1997年倫敦學術出版社出版的Garman的《非放射性標記實 踐方法》的第 55 頁(Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling :A Practical Approach, 倫敦的學術出版社(Academic I^ress，London)，第55頁))。蛋白中游離巰基的量可以用標 準埃爾曼測試(Ellman' s assay)來評估。IgM是一個二硫鍵連接五聚體的例子，而IgG 是一個帶有內(nèi)部二硫橋聯(lián)將亞基結(jié)合起來的蛋白的例子。在這些蛋白中，需要用如二硫蘇 糖醇(DTT)或硒醇等試劑來還原二硫鍵(Singh等Q002) Anal. Biochem. 304 :147-156)，從 而產(chǎn)生反應活性的游離巰基。該方法可能導致抗體失去三級結(jié)構和抗原結(jié)合特異性。與抗體胺基或羥基相比，抗體半胱氨酸巰基通常對親電子偶聯(lián)劑的反應活性更 強，即具有更強的親核性。已經(jīng)通過基因工程技術將半胱氨酸殘基導入到蛋白中，形成與 配體的共價結(jié)合或形成新的分子內(nèi)二硫鍵(Better等(1994) J. Biol. Chem. 13 :9644-9650 ； Bernhard 等(1994)Bioconjugate Chem. 5 :126-132 ；Greenwood 等(1994)Therapeutic Immunology 1 :247-255 ;Tu 等(1999)Proc. Natl. Acad, ki USA 96 :4862-4867 ；Kanno 等 U000)J.of Biotechnology，76 :207-214 ;Chmura 等 UOOl) Proc. Nat. Acad. ki. USA 98(15) :8480-8484 ；美國專利第6，M8，564號)。然而，通過將蛋白中的各種氨基酸殘基突 變成半胱氨酸氨基酸來設計半胱氨酸巰基會產(chǎn)生潛在的問題，尤其是當殘基不配對(游離 Cys)或他們相對可以進行反應或氧化的情況下。在濃縮的蛋白溶液中，不論是在大腸桿菌 周質(zhì)、培養(yǎng)上清液、還是在部分或完全純化的蛋白中，蛋白表面未配對的半胱氨酸殘基能夠 配對或氧化形成分子間二硫鍵，并由此形成蛋白二聚體或多聚體。二硫化二聚體的形成提 供了新的Cys，其對與藥物、配體或其他標記的偶聯(lián)不具有反應活性。而且，如果蛋白在新工 程化半胱氨酸和現(xiàn)存的半胱氨酸殘基之間氧化形成分子內(nèi)二硫鍵，兩種Cys基團都不能進 行活性位點參與作用和相互作用。而且，蛋白會由于錯誤折疊或失去三級結(jié)構而變得沒有 活性或沒有特異性(Zhang 等(2002) Anal. Biochem. 311 :1_9)。過去已經(jīng)有過通過工程化將偶聯(lián)位點引入抗體的嘗試。美國專利第5，219，916號 描述了修飾“表面口袋”殘基例如krl56或Thrl73(根據(jù)美國衛(wèi)生與公眾服務部的1987年 Kabat 等《免疫學感興趣的序列》第 4 版(Sequencesof Immunological Interest, 4th ed.， US Dept. of Health and Human Services，1987))。在相關研究中，研究人員確定，在工程化 改造偶聯(lián)位點中，只有“表面口袋”中的殘基能夠支持進行半胱氨酸取代(Lyons等.(1990) Protein Eng. 3 :8 第 703—708 頁)。
所以，需要能夠開發(fā)出穩(wěn)定的半胱氨酸工程化抗體，該抗體能提供可用于偶聯(lián)各 種藥劑的游離巰基。本文所引用或討論的參考文獻并不代表承認在本發(fā)明前已經(jīng)存在于本領域中。
4.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了帶有修飾的CHl結(jié)構域的抗體，使得它們包含能夠與各種試劑偶聯(lián) 的游離半胱氨酸殘基。本發(fā)明的半胱氨酸工程化抗體在抗體重鏈的131-139區(qū)域由一個或 多個氨基酸被非天然存在的半胱氨酸所取代，所取代的半胱氨酸提供了能用于偶聯(lián)的游離 巰基。在一個實施方式中，本發(fā)明的半胱氨酸工程化抗體包含1，2，3，4，5，6，7，8或更多個 取代的半胱氨酸。在另一個實施方式中，在抗體CHl結(jié)構域的131-139區(qū)域包含用半胱氨 酸取代絲氨酸或蘇氨酸殘基的取代。本發(fā)明的半胱氨酸工程化抗體包含連接修飾的CHl結(jié)構域和另一抗體鏈的非天 然存在的二硫鍵。在一個實施方式中，本發(fā)明的半胱氨酸工程化抗體包含一個或多個游離 巰基，這些巰基是由連接修飾的CHl結(jié)構域和另一抗體鏈之間的非天然存在的二硫鍵形成 的結(jié)果。本發(fā)明的另一個方面提供了用于產(chǎn)生半胱氨酸工程化抗體的核酸、載體和宿主細 胞。本發(fā)明的另一個方面提供了抗體偶聯(lián)物和制造這種含有偶聯(lián)到藥物上的本發(fā)明 的半胱氨酸工程化抗體的偶聯(lián)物的方法，其中藥物可以為細胞毒性劑、化療劑、肽、擬肽、蛋 白骨架、酶、毒素、放射性核、DNA、RNA、siRNA、小分子RNA、肽核酸、熒光標記或生物素等。本發(fā)明的另一個方面提供了當結(jié)合到細胞表面受體上時能夠內(nèi)化的抗體。在這些 方面，本發(fā)明的抗體能用于胞質(zhì)遞送運載分子和/或藥劑。本發(fā)明的另一個方面提供了用本發(fā)明的抗體偶聯(lián)物治療、檢測和診斷癌癥、自身 免疫疾病、炎癥或傳染病的方法。
5.


圖IA是IgG結(jié)構的示意圖。發(fā)生突變的CHl結(jié)構域的殘基131到殘基139的區(qū) 域用深黑色表示。插入圖顯示了 CHl結(jié)構域的殘基131到殘基139的IgG區(qū)域的放大圖。圖IB顯示了對131位點進行半胱氨酸工程化改造以在抗體內(nèi)形成能用于偶聯(lián)的 游離巰基所采用的策略。特別是，EphB4特異性抗體1C6的κ輕鏈和重鏈帶有用粗體字樣 顯示的半胱氨酸殘基。另外，IgGl抗體類型中天然存在的相關二硫鍵用實線表示。位點131 由絲氨酸轉(zhuǎn)化為半胱氨酸的特定工程化改造(在圖中用粗體并加下劃線表示)代表了潛 在的鏈間二硫鍵，會形成該二硫鍵來代替連接輕鏈羧基端半胱氨酸和重鏈半胱氨酸220之 間的正規(guī)鏈間二硫鍵。這種可通過插入131Cys而形成的潛在的二硫鍵也顯示了出來(虛 線)。這里所顯示的二硫鍵被實驗結(jié)果所證實。圖IC是各種抗體類型的CHl結(jié)構域的比對，列出了含有用于半胱氨酸工程化改造 的候選絲氨酸或蘇氨酸殘基的等價區(qū)域。加框的區(qū)域代表在其他抗體類型中IgGl的CHl 結(jié)構域的等價區(qū)域。圖2A是考馬斯亮藍染色的PAGE膠，顯示了表達和純化的抗體在非還原(插圖i)和還原(插圖ii)條件下走膠的情況。該圖中所顯示的抗體包括ICl(第1道)和由ICl 衍生的各種半胱氨酸工程化抗體(第2-15道)，抗體上樣濃度為2微克/孔。圖2B比較了野生型IgGl和krl31突變?yōu)镃ys的突變體的非還原性肽圖譜。ICl 為IgGl亞型的EphA2特異性抗體。插圖A是在重鏈鉸鏈區(qū)和輕鏈C-末端(Hll-LM)和含 有krl31的肽(H5)之間有常規(guī)二硫鍵連接的ICl野生型(IClWT)抗體；插圖B是ICl的 Serl51Cys突變體，表現(xiàn)為輕鏈和重鏈(Hll-LM)和ICl野生型肽H5之間的常規(guī)二硫鍵減 少，并且突變的半胱氨酸與輕鏈C末端(H5m-L15)以及與鉸鏈區(qū)(H5m_Hll)之間出現(xiàn)新形 成的二硫鍵。在突變的Cysl31中只發(fā)現(xiàn)有痕量的游離半胱氨酸。圖3顯示了對純化的1C6野生型(A)和lC6Serl31Cys (B)抗體進行尺寸排阻層析 (SEC)分析的結(jié)果。對抗體進行表達和純化后，進行SEC層析。點狀繪圖代表了一套分子 量確定的標記物，用于建立抗體的表觀分子量。如圖(A)所示，1C6野生型抗體在對應于單 體抗體的分子量的SEC柱上被洗脫下來。而半胱氨酸工程化的1C6抗體的SEC分析(B)顯 示，與野生型抗體相似，該抗體也以單體形式存在。圖 4 顯示了對純化的 ICl 野生型(A)、lClSerl34Cys (B)、lClSerl32Cys (C)和 lClSerl31-132-134-136Cys(D)抗體進行尺寸排阻層析(SEC)分析的結(jié)果。點狀繪圖 代表了一套分子量確定的標記物，用于建立抗體的表觀分子量。如圖(A)所示，ICl野 生型抗體在對應于單體抗體的分子量的SEC柱上被洗脫下來。而半胱氨酸工程化抗體 lClSerl34Cys(B)，lClSerl32Cys (C)和 lClSerl31-132-134-136Cys (D)的 SEC分析顯示，與 野生型抗體相似，這些抗體也以單體形式存在。圖5顯示了對純化的1C6野生型和lC6Serl31Cys抗體進行基于ELISA的抗原結(jié) 合測試的結(jié)果。這些抗體特異性識別EphB4受體。如圖所示，測得的ELISA形式的野生型 抗體和半胱氨酸工程化krl31Cys抗體的結(jié)合親和力圖譜是非常相似的。圖6顯示了對純化的ICl野生型和lClSerl31Cys抗體進行基于ELISA的抗原結(jié) 合測試的結(jié)果。這些抗體特異性識別EphA2受體。如圖所示，測得的ELISA形式的野生型 抗體和半胱氨酸工程化krl31Cys抗體的結(jié)合親和力圖譜是非常相似的。另外，加入1毫 摩DTT對結(jié)合圖譜沒有產(chǎn)生可檢測到的效果。圖7顯示了 1C6野生型抗體㈧和lC6Serl31Cys抗體⑶的差示掃描量熱法 (DSC)的溫度記錄圖。兩種抗體都顯示出非常相似的解鏈溫度(Tm)，分別為70°C和69°C。圖 8 顯示 了 ICl 野生型(A)、lClSerl31Cys(B)、lClkrl34CysK)、 IClSer (131-132) Cys (D)和 IClSer (131-132_1；34-136) Cys 抗體的差示掃描量熱法(DSC)的 溫度記錄圖。所有抗體都顯示出非常相似的解鏈溫度(Tm)。圖9顯示了在各種條件下1C6 (野生型)抗體和lC6Serl31Cys (突變型)抗體的 生物素偶聯(lián)研究結(jié)果。在圖A中，1C6和lC6Serl31Cys抗體在各種溫度下、37°C、45°C 和55°C )與EZ-Link生物素_HPDP(皮爾斯公司，Pierce)進行偶聯(lián)反應。檢測獲得的生 物素偶聯(lián)效率并且作圖。lC6Serl31CyS抗體表現(xiàn)出比1C6抗體更高的位點特異性生物素 偶聯(lián)效率。在圖B中，1C6和lC6Serl31Cys抗體在各種溫度下、37°C、45°C和55°C ) 與EZ-Link碘乙酰-PE02-生物素進行偶聯(lián)反應。檢測獲得的生物素偶聯(lián)效率并且作圖。 lC6Serl31Cys抗體表現(xiàn)出比1C6抗體更高的位點特異性生物素偶聯(lián)效率。圖10顯示了用BIACORE 測試檢測ICl野生型和lClSerl31Cys抗體對各種FCy受體的相對親和力的結(jié)果。研究的各種FCy受體有FCyI (A)、FCyRIIIA(B)、 FcYRIIA(C) ,Fc,RIIB(D) ο ICl野生型和lClSerl31Cys抗體對各種Fcy受體表現(xiàn)出非常相 似的結(jié)合親和力。圖11顯示了用BIACORE 測試檢測ICl野生型和lClSerl31Cys抗體在pH6和 pH7. 4下對Fcfoi受體的相對親和力的結(jié)果。lClSerl31Cys抗體在pH6和pH7. 4下都表現(xiàn) 出和ICl野生型抗體相似的結(jié)合Fcfoi受體的結(jié)合圖譜。圖12顯示了在PC3細胞進行的抗體內(nèi)化研究的結(jié)果。在第一欄中顯示了一組對 照。在(A)中沒有染色的細胞用DAPI復染。在(B)中，只用二抗染色的細胞用DAPI復染。 在(C)中，對照一抗R347與細胞孵育，也用DAPI復染。在(D)中，細胞孵育一個小時，然 后用R347染色。這些對照(A-D)中，沒有一個顯示出任何抗體特異性的細胞染色。在(E) 中，在時間點0細胞與ICl野生型抗體一起孵育，并孵育1小時。在1小時的2張代表性的 圖顯示了 ICl野生型抗體的內(nèi)化。在(F)中，細胞與lClSerl31CyS抗體從時間點0開始 孵育1小時。在1小時的2張代表性的圖顯示了 lClSerl31Cys抗體的內(nèi)化。在(G)中，細 胞與lClSerl34CyS抗體從時間點0開始孵育1小時。在1小時的2張代表性的圖顯示了 lClSerl34Cys抗體的內(nèi)化。在(H)中，細胞與IClSer (131-132)Cys抗體從時間點0開始孵 育1小時。在1小時的2張代表性的圖顯示了 lClSer(131-132)CyS抗體的內(nèi)化。在⑴ 中，細胞與IClSer (131-132-134-136) Cys抗體從時間點0開始孵育1小時。在1小時的2 張代表性的圖顯示了 IC lSer(131-132-134-136)CyS抗體的內(nèi)化。與野生型的抗體相比， 所有的半胱氨酸工程化抗體都以相似的程度內(nèi)化。圖13顯示了結(jié)合特異性實驗的結(jié)果，其中半胱氨酸工程化抗體顯示了與半胱氨 酸工程化改造前的野生型ICl抗體等價的對EphA2的結(jié)合特異性。使用2個不相關抗體 (對照抗體1和2)來確認這個ELISA實驗對EphA2的特異性。而且，半胱氨酸殘基的多重 取代并沒有改變抗體對它的同源(cognate)抗原的結(jié)合特異性。這些結(jié)果表明，與半胱氨 酸工程化改造之前的抗體相比，抗體的半胱氨酸工程化改造并沒有改變它的結(jié)合特異性。圖14顯示了在用游離半胱氨酸處理前(1-8道)和處理后(9-16道)的各種半胱 氨酸工程化抗體與PEG的偶聯(lián)反應的結(jié)果。與用IOmM游離半胱氨酸處理半胱氨酸工程化 抗體相比，非半胱氨酸處理的泳道顯示出PEG化(分子量較高的條帶)的水平降低。含有 半胱氨酸工程化前的抗體的對照孔在任何條件下都沒有表現(xiàn)出可檢測的聚乙二醇化水平 (第1、5、9和13道)。聚乙二醇化反應在37°C進行120分鐘。樣品在10% NuPage MOP膠 上走膠。圖15顯示了半胱氨酸工程化抗體進行脫帽反應的實驗結(jié)果。脫帽反應釋放了用 于偶聯(lián)反應的工程化的半胱氨酸，而沒有破壞抗體整體結(jié)構。對抗體1C1(野生型)(第2、8 道)、lClSerl34Cys(第 3、9 道)、lClThri;35Cys(第 4、10 道)、lClkrl36Cys(第 5、11 道)、 1(111!!~13亂78(第6、12道)進行脫帽反應，并且用非還原性PAGE進行分析。所呈現(xiàn)的蛋 白譜表明，與脫帽反應前的抗體(第2-6道)相比，脫帽反應并沒有使抗體整體結(jié)構不穩(wěn)定 (第 8-12 道)。圖16顯示了將各種半胱氨酸工程化抗體與生物素偶聯(lián)的實驗的結(jié)果。簡言 之，半胱氨酸工程化抗體和對照進行脫帽反應，然后放入馬來酰亞胺-PEG2-生物素的偶 聯(lián)反應中。然后去除掉未反應的偶聯(lián)物。蛋白質(zhì)印跡分析中正對照顯示出強烈的生物素染色(第1道)。對照ICl抗體沒有檢測到偶聯(lián)的生物素(第3道)。半胱氨酸工程 化抗體 lClkrl34Cys (第 4 道)、lClThrl35Cys (第 5 道)、lClSerl36Cys (第 6 道)和 lClThrl39Cys(第7道)顯示出對偶聯(lián)的生物素的強染色。同樣，圖中也很明顯，半胱氨酸 工程化抗體的輕鏈并沒有顯示出任何生物素偶聯(lián)。對照抗體(第1道)的較低條帶顯示出 高水平的染色，而半胱氨酸工程化的抗體和野生型對應物的較低條帶沒有顯示出對較低條 帶(輕鏈)的任何顯著的染色(第3-7道)。圖17顯示了表明在與異源試劑偶聯(lián)后半胱氨酸工程化抗體保留了對它們的同 源抗原的結(jié)合特異性的實驗結(jié)果。在這個實驗中，與半胱氨酸工程化改造前的親本抗體 相比，分析生物素偶聯(lián)的半胱氨酸工程化抗體所保持的抗原結(jié)合特異性。基于ELISA的 測試表明，與半胱氨酸工程化改造和偶聯(lián)前的親本抗體相比，偶聯(lián)的半胱氨酸工程化抗體 lClSerl34Cys、lClThrl35Cys、lClkrl36Cys 和 lClThrl39Cys 對同源(congate)的 EphA2 抗原表現(xiàn)出非常相似的結(jié)合譜。6.發(fā)明詳述本發(fā)明基于一個發(fā)現(xiàn)，即為了工程化改造能與各種試劑偶聯(lián)的位點，抗體的CHl 結(jié)構域表面上的殘基(參見圖1A)適用于用半胱氨酸取代。本發(fā)明的化合物包括親本或野生型抗體的CHl結(jié)構域的131-139區(qū)域中1，2，3，4， 5，6，7，8或更多個氨基酸被半胱氨酸所取代的半胱氨酸工程化抗體，其中恒定區(qū)的編號系 統(tǒng)是由Kabet等建立的EU索引(1991年，美國國立衛(wèi)生研究院公報91-3M2，國家技術信 息服務，斯普林菲爾德，弗吉尼亞州(1991,NIHPublication 91-3242，National Technical Information Service，Springfield，VA.))。需要注意，因為IgG分子的同源二聚體特性， 半胱氨酸殘基的單取代會導致獲得的抗體內(nèi)出現(xiàn)2個半胱氨酸殘基。為了和藥物或化合 物進行偶聯(lián)，本發(fā)明獲得的半胱氨酸工程化抗體可以帶有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18或更多個的游離巰基。在一些實施方式中，本發(fā)明的半胱氨酸工程化抗體包含絲氨酸變?yōu)榘腚装彼岬娜?代。在其他實施方式中，本發(fā)明的半胱氨酸工程化抗體包含蘇氨酸變?yōu)榘腚装彼岬娜〈Ｔ?一些實施方式中，本發(fā)明的半胱氨酸工程化抗體包含絲氨酸和蘇氨酸都變?yōu)榘腚装彼岬娜?代。在一些實施方式中，本發(fā)明的半胱氨酸工程化抗體包含選自下列位點的至少一個 取代抗體的CHl結(jié)構域的131、132、133、1；34、135、136、137、138和139位點，其中恒定區(qū)的 編號系統(tǒng)是由Kabet等建立的EU索引(見上)。在其他實施方式中，本發(fā)明的半胱氨酸工 程化抗體包含選自下列位點的至少2個取代抗體的CHl結(jié)構域的131、132、133、134、135、 136、137、138和139位點。在其他實施方式中，本發(fā)明的半胱氨酸工程化抗體包含選自下 列位點的至少3個取代抗體的CHl結(jié)構域的131、132、133、134、135、136、137、138和139 位點。在其他實施方式中，本發(fā)明的半胱氨酸工程化抗體包含選自下列位點的至少4個取 代抗體的CHl結(jié)構域的131、132、133、134、135、136、137、138和139位點。在其他實施方 式中，本發(fā)明的半胱氨酸工程化抗體包含選自下列位點的至少5個取代抗體的CHl結(jié)構域 的131、132、133、134、135、136、137、138和139位點。在其他實施方式中，本發(fā)明的半胱氨 酸工程化抗體包含選自下列位點的至少6個取代抗體的CHl結(jié)構域的131、132、133、134、 135、136、137、138和139位點。在其他實施方式中，本發(fā)明的半胱氨酸工程化抗體包含選自
14下列位點的至少7個取代抗體的CHl結(jié)構域的131、132、133、134、135、136、137、138和139 位點。在其他實施方式中，本發(fā)明的半胱氨酸工程化抗體包含選自下列位點的至少8個取 代抗體的CHl結(jié)構域的131、132、133、134、135、136、137、138和139位點。在其他實施方 式中，本發(fā)明的半胱氨酸工程化抗體包含抗體的CHl結(jié)構域的131、132、133、134、135、136、 137、138和139位點的取代。在一些實施方式中，本發(fā)明的半胱氨酸工程化抗體不包含132和/或138位點的 取代。在其他實施方式中，本發(fā)明的半胱氨酸工程化抗體包含的取代僅在IgGl分子或其等 價物的CHl結(jié)構域的131-139區(qū)域中的蘇氨酸和/或絲氨酸位置。在一個實施方式中，本發(fā)明的半胱氨酸工程化抗體包括在選自下組的位點中絲氨 酸和/或蘇氨酸被半胱氨酸取代的IgGl 131、132、133、134、135、136、137、138和139。在其 他實施方式中，本發(fā)明的半胱氨酸工程化抗體來源于IgGl、IgG2、IgG3或IgG4類型。在又一 些其他實施方式中，本發(fā)明的半胱氨酸工程化抗體來源于非IgG類型例如IgAl、IgA2、IgM、 IgD或IgE。在其他實施方式中，本發(fā)明的抗體包含對應于IgGl的CHl結(jié)構域的131-139 區(qū)域的殘基的半胱氨酸工程化改造。在另一個實施方式中，本發(fā)明的抗體包含對于圖IC中 顯示的各種抗體類型中所示殘基的半胱氨酸工程化改造。在其他實施方式中，本發(fā)明的抗 體包含抗體片段，包括但不限于Fab和Fab2分子形式。如圖IA所示，IgGl分子的CHl結(jié)構域的131-139區(qū)域暴露于溶劑中。同樣地，設 想可擴展131-139環(huán)(換而言之，即插入附加的氨基酸)來促進表面對各種試劑的位點特 異性偶聯(lián)。在一些實施方式中，本發(fā)明的抗體的CHl結(jié)構域的131-139環(huán)可以擴展至少1 個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至 少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個或至少15個氨基酸。在一些實施方 式中，本發(fā)明的抗體的CHl結(jié)構域的131-139環(huán)的擴展發(fā)生在131、132、133、134、135、136、 137、138或139位殘基之后。在其他實施方式中，本發(fā)明的抗體的CHl結(jié)構域的131-139環(huán) 的擴展發(fā)生在131、132、133、134、135、136、137、138和139位殘基之后。在其他實施方式中，IgGl分子的CHl結(jié)構域的131-139環(huán)的擴展可以包含任何氨 基酸。在其他實施方式中，所述擴展包含至少一個非天然存在的半胱氨酸。在其他實施方 式中，所述擴展包含蘇氨酸和/或絲氨酸殘基。在其他實施方式中，所述擴展還包括用非半 胱氨酸殘基來取代天然存在的半胱氨酸殘基。在另一個實施方式中，半胱氨酸工程化抗體包含形成至少一個非天然存在的二硫 鍵。非天然存在的二硫鍵可以是鏈內(nèi)鍵或是鏈間鍵。非天然存在的二硫鍵可以將兩個分開 的抗體分子連接到一起。非天然存在的二硫鍵的形成可以解放至少一個游離巰基，該巰基 原來與另一個半胱氨酸殘基連接。顯示出游離巰基的半胱氨酸殘基工程化改造可能導致形成抗體類型的混合物，二 硫鍵的位點具有高度的可變性。例如，天然存在的“正規(guī)的” 二硫鍵(圖IB所示)可能只 在樣品中的一些抗體中存在。已經(jīng)了解，其他非天然存在的半胱氨酸的工程化改造可能導 致形成“正規(guī)的”二硫鍵以外的二硫鍵。在一些實施方式中，在輕鏈和重鏈的131-139區(qū)域 出現(xiàn)的任何非天然存在的半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵。在其他實施方式中，在輕鏈和重 鏈的131、132、133、134、135、136、137、138和/或139位點出現(xiàn)的任何非天然存在的半胱氨 酸殘基之間形成二硫鍵。
為了限制在一個樣品中抗體出現(xiàn)二硫鍵位點的可變性，半胱氨酸工程化抗體可包 含將天然存在的半胱氨酸殘基補償性地取代為另一個殘基，來消除一個二硫鍵。在一個特 定實施方式中，本發(fā)明的半胱氨酸工程化抗體包含將天然存在的半胱氨酸殘基(例如在重 鏈220位點的半胱氨酸)取代為另一個氨基酸殘基來去除一個二硫鍵。與進行修飾前的抗體相比，形成至少一個非天然存在的二硫鍵可能影響本發(fā)明的 半胱氨酸工程化抗體的穩(wěn)定性。在一些實施方式中，與進行半胱氨酸工程化改造之前的相 同抗體相比，非天然存在的二硫鍵可能提高半胱氨酸工程化抗體的穩(wěn)定性。在其他實施方 式中，與進行半胱氨酸工程化改造之前的相同抗體相比，非天然存在的二硫鍵可能降低半 胱氨酸工程化抗體的穩(wěn)定性。本發(fā)明的半胱氨酸工程化抗體保留了它們野生型對應物的抗原結(jié)合能力。在一個 實施方式中，與半胱氨酸工程化改造之前的抗體相比，本發(fā)明的半胱氨酸工程化抗體表現(xiàn) 出基本相同的親和力。在另一個實施方式中，與半胱氨酸工程化改造之前的抗體相比，本發(fā) 明的半胱氨酸工程化抗體表現(xiàn)出親和力降低。在另一個實施方式中，與半胱氨酸工程化改 造之前的抗體相比，本發(fā)明的半胱氨酸工程化抗體表現(xiàn)出親和力提高。本發(fā)明的抗體可對它的一個或多個同源的抗原具有高結(jié)合親和力。例如，本文 所述的抗體可具有恒定的結(jié)合速率或k。n速率(抗體(Ab) +抗原-> Ab-Ag)，該速率為 至少 2 X IO5IT1S人至少 5 X IO5IT1 s \ 至少 IO6M 1S 人至少5X IO6IT1 s \至少IO7M 1S \至少 5 X IO7IT1S-1 或至少 IO8M-1S^10在另一個實施方式中，抗體的k。ff速率(Ab-Ag- > Ab+Ag)為小于5X ΙΟ、—1、小 于KT1S人小于5XKT2S人小于ΙΟ、-1、小于5X ΙΟ、4、小于10、弋小于5Χ l(T4s入或小 于ιοΛτ1。在另一個實施方式中，本發(fā)明的抗體的1^速率小于sxio、—1、小于 ο、—1、小 于5X10、人小于1 (T6S人小于5X 10、人小于10^^、小于5\10^^、小于lO^V1、小于 δΧΙΟ、—1、小于 IO-iV1 或小于 IO-10S-1。在另一個實施方式中，抗體的親和常數(shù)或Ka(k。n/k。ff)為至少ΙΟΙ1、至 少 5 X IO2IT1、至少 IO3IT1、至少 5 X IO3IT1、至少 IO4IT1、至少 5 X IO4IT1、至少 IO5IT1、至 少 5 X IO5IT1、至少 IO6IT1、至少 5 X IO6IT1、至少 IO7IT1、至少 5 X IO7IT1、至少 IO8IT1、至少 5 X IO8IT1、至少 IO9IT1、至少 5 X ΚΑΤ1 UOicT1、至少 5 X IOiciIT1、至少 IO1^T1、至少 5 X IO11ITi、 至少 IO12IT1、至少 δΧΙΟ12]^1、至少 10 -1、至少 δΧΙΟ1^1、至少 ΙΟΙ1、至少 5 X IO14IT1、至 少ΙΟ、—1或至少5X KAf1。在又一個實施方式中，抗體的解離常數(shù)或Kd(k。ff/k。n)為小于 5X 1(Γ2Μ、小于 1(Γ2Μ、小于 5Χ 1(Γ3Μ、小于 1(Γ3Μ、小于 5Χ 1(Γ4Μ、小于 1(Γ4Μ、小于 5Χ 1(Γ5Μ、小 于1(Γ5Μ、小于5Χ1(Γ6Μ、小于ΙΟ—Μ、小于5Χ1(Γ7Μ、小于10"Μ、小于5Χ 1(Γ8Μ、小于10—Μ、小于 5Χ 1(Γ9Μ、小于 10^1、小于 5Χ 1(T1QM、小于 1(T1QM、小于 5X 1(Γ"Μ、小于 1(Γ"Μ、小于 5Χ 1(Γ12Μ、 小于1(Γ12Μ、小于5Χ10 Μ、小于IOU、于5X10 M、小于1(Γ14Μ、小于5Χ10 Μ或小于 10_15Μ。依照本文所述的方法使用抗體，用本文所述的方法或本領域技術人員已知的方 法(例如BIAcore測試、ELISA)(碧雅國際公司、烏普薩拉、瑞典(BiacoreInternational AB, Uppsala, Sweden))測得的解離常數(shù)(Kd)小于 3000pM、小于 2500pM、小于 2000pM、小 于1500pM、小于1000pM、小于750pM、小于500pM、小于250pM、小于200pM、小于150pM、小于 100pM、小于 75pM。
Fc區(qū)域的調(diào)控本發(fā)明還提供了帶有改變的Fc區(qū)域的半胱氨酸工程化抗體(本發(fā)明中也稱為“變 異的Fc區(qū)域”)。因此，在一個實施方式中，本發(fā)明的抗體包含一個變異的Fc區(qū)域(即Fc 區(qū)域已經(jīng)如下所述發(fā)生了變化))。包含變異的Fc區(qū)域的本發(fā)明的抗體在本文中也稱作“Fe 變異的蛋白”。在變異的Fc區(qū)域的描述中，需要了解本發(fā)明的抗體的Fc區(qū)域包含根據(jù)Kabat等 的EU索引的編碼方案(1991，NIH公報91-3M2，國家技術信息服務，斯普林菲爾德、弗吉尼 亞州)。已經(jīng)知道，F(xiàn)c區(qū)域的變體(例如，氨基酸取代和/或插入和/或缺失)增強或減 少了效應子功能(參見Presta等，2002，Biochem Soc Trans 30 :487-490 ；美國專利第 5，624，821 號、第 5，885，573 號和 PCT 出版物 W 00/42072,W099/58572 和 W 04/029207)。 相應地，在一個實施方式中，本發(fā)明的抗體包含變異的Fc區(qū)域。在一個實施方式中，抗體的 變異的Fc區(qū)域表現(xiàn)出與天然的Fc相似水平的誘導效應子功能。在另一個實施方式中，變 異的Fc區(qū)域表現(xiàn)出比天然的Fc更高的誘導效應子功能。在另一個實施方式中，變異的Fc 區(qū)域表現(xiàn)出比天然的Fc較低的誘導效應子功能。在另一個實施方式中，抗體的變異的Fc 區(qū)域表現(xiàn)出比天然的Fc更強的誘導ADCC的功能。在另一個實施方式中，變異的Fc區(qū)域表 現(xiàn)出比天然的Fc較低的誘導ADCC的功能。在另一個實施方式中，變異的Fc區(qū)域表現(xiàn)出比 天然的Fc更強的誘導CDC的功能。在另一個實施方式中，變異的Fc區(qū)域表現(xiàn)出比天然的 Fc較低的誘導CDC的功能。變異的Fc區(qū)域的特定的實施方式在下文中有詳細描述。本領域也已經(jīng)知道Fc區(qū)域進行糖基化修飾可以增強或降低效應子功能(參見 例如 Umana 等，1999，Nat. Biotechnol 17 :176-180 ；Davies 等，2001，BiotechnolBioeng 74:288-294 ；Shields 等，2002，J Biol Chem 277 :26733-26740 ；Shinkawa 等，2003，J Biol Chem 278:3466-3473)美國專利第6，602，684號；美國專利序列號第10/277，370 號；美國專利序列號第 10/113，9 號；PCT WO 00/61739A1 ；PCT WO 01/292246A1 ；PCT WO 02/311140A1 ；PCT WO 02/30954A1 ;Potillegent 技術(碧華公司，新澤西普林斯頓 (Biowa，Inc. Princeton, N. J.))、GiycoMAb 糖基化工程改造技術(GLYCART 生物技術公司， 瑞士蘇黎世(GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland)) .相應地，在一個實施方式中，本發(fā)明的抗體的Fc區(qū)域包含氨基酸殘基糖基化的改 變。在另一個實施方式中，氨基酸殘基的糖基化改變導致了效應子功能降低。在另一個實 施方式中，氨基酸殘基的糖基化改變導致了效應子功能增強。在一個特定實施方式中，F(xiàn)c區(qū) 域巖藻糖基化(fucosylation)降低。在另一個實施方式中，F(xiàn)c區(qū)域是巖藻糖基化的(參 見例如美國專利申請公報第2005/0226867號)。最新研究提示，在IgG分子上的低聚寡糖上加上唾液酸增強了它們的抗炎癥活 力，并且改變了它們的細胞毒性(Keneko 等，Science 313,670-673(2006) ；Scallon 等， Mol, Immuno. 2007Mar ；44(7) :1524-34)。所以，抗體治療的功效可以通過選擇最適合于目 標應用的糖基化形式來進行優(yōu)化?？贵w的2個CH2結(jié)構域間插入的兩個寡聚糖鏈參與了 Fc 區(qū)域與其受體的結(jié)合。前面引用的研究表明，唾液酸糖苷化(sialylation)水平升高的IgG 分子具有抗炎癥的性質(zhì)，而唾液酸糖苷化水平降低的IgG分子的免疫刺激性質(zhì)提高。所以， 抗體治療劑可以為特定的應用“定制”合適的唾液酸糖苷化譜。調(diào)控抗體的唾液酸糖苷化狀態(tài)的方法報道在題為《治療活力提高的方法和組合物》(Methods AndCompositions With Enhanced Therapeutic Activity)的W02007/005786，以及題為《抗炎癥活力提高且細胞 毒性下降的多肽以及相關方法》(Polyp印tides WithEnhanced Anti-Inflammatory And Decreased Cytotoxic Properties And RelatedMethods) ^ W02007/117505, 利都整體引入本文作為參考。在一個實施方式中，與未改變的Fc區(qū)域?qū)φ障啾?，本發(fā)明抗體的Fc區(qū)域包含改變 的唾液酸糖苷化狀態(tài)。在一個實施方式中，與未改變的Fc區(qū)域?qū)φ障啾?，本發(fā)明抗體的Fc 區(qū)域包含包含提高的唾液酸糖苷化狀態(tài)。在一些實施方式中，與未改變的Fc區(qū)域?qū)φ障?比，本發(fā)明的抗體的Fc區(qū)域的唾液酸糖苷化提高約5 %、約10 %、約15 %、約20 %、約25 %、 約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 60%、約 65%、約 70%、約 80%、約 85%、約 90%、約95%、約100%、約125%、約150%或更高。在一些實施方式中，與未改變的對照Fc 區(qū)域相比，本發(fā)明的抗體的Fc區(qū)域的唾液酸糖苷化提高約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約 10倍、約20倍、約50倍或更高。在另一個實施方式中，與未改變的Fc區(qū)域?qū)φ障啾?，本發(fā)明抗體的Fc區(qū)域的唾 液酸糖苷化狀態(tài)降低。在一些實施方式中，與未改變的Fc區(qū)域?qū)φ障啾?，本發(fā)明的抗體的 Fc區(qū)域的唾液酸糖苷化降低約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、 約 40%、約 45%、約 50%、約 60%、約 65%、約 70%、約 80%、約 85%、約 90%、約 95%、約 100%、約125%、約150%或更多。在一些實施方式中，與未改變的對照Fc區(qū)域相比，本發(fā)明 的抗體的Fc區(qū)域的唾液酸糖苷化降低約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約10倍、約20倍、 約50倍或更多。本領域也已經(jīng)知道可以修飾Fc區(qū)域來延長蛋白的半衰期。半衰期的延長使得可 以降低供給患者的藥物的量，而且可以降低給藥的頻率。相應地，可以通過修飾(例如取 代、缺失或插入)參與Fc與Fcfoi受體之間相互作用的氨基酸殘基來產(chǎn)生半衰期延長的本 發(fā)明的抗體(參見例如PCT出版物第97/34631號和第02/060919號，都整體以引用的方 式納入本文)。此外，可以通過本領域廣泛使用的技術偶聯(lián)到PEG或白蛋白上，來延長本發(fā) 明的抗體的半衰期。在一些實施方式中，與對照未改變的Fc區(qū)域相比，本發(fā)明的抗體的Fc 區(qū)域的半衰期延長約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約 45 %、約 50 %、約 60 %、約 65 %、約 70 %、約 80 %、約 85 %、約 90 %、約 95 %、約 100 %、約 125 %、約150 %或更多。在一些實施方式中，與未改變的對照Fc區(qū)域相比，本發(fā)明的抗體的 Fc區(qū)域半衰期延長約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約10倍、約20倍、約50倍或更多。在另一個實施方式中，本發(fā)明的抗體的Fc區(qū)域的半衰期縮短。在一些實施方式 中，與對照未改變的Fc區(qū)域相比，本發(fā)明的抗體的Fc區(qū)域的半衰期縮短約5%、約10%、 約 15%、約 20%、約 25%、約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 60%、約 65%、約 70%、約80%、約85%、約90%、約95%、約100%、約125%、約150%或更多。在一些實施 方式中，與未改變的對照Fc區(qū)域相比，本發(fā)明的抗體的Fc區(qū)域半衰期縮短約2倍、約3倍、 約4倍、約5倍、約10倍、約20倍、約50倍或更多。本發(fā)明包含與比照分子(例如除了帶有野生型的Fc區(qū)域外具有相同的氨基酸序 列的蛋白)相比，對Fc配體(例如，F(xiàn)c受體Clq)的結(jié)合性質(zhì)改變的Fc變體蛋白。結(jié)合性 質(zhì)的例子包括但不限于，結(jié)合特異性、解離平衡常數(shù)(Kd)、解離和結(jié)合速率(分別為k。ff*k。n)、結(jié)合親和力和/或親合力。通常認為，對于Kd高的結(jié)合分子，Kd低的結(jié)合分子(例如， Fc變體蛋白例如抗體)可能是優(yōu)選的。然而，在一些實例中，1^或1^。 的值要比Kd值相關 性更高。本領域的熟練技術人員能確定哪一個動力學參數(shù)對于給定抗體的應用更為重要。Fc區(qū)域?qū)ζ渑潴w的親和力和結(jié)合特性可以通過本領域已知的各種體外測試方法 (基于生物化學或免疫學的測試)來確定，所述方法用于確定Fc-Fc γ R相互作用，即Fc區(qū) 域?qū)c γ R的特異性結(jié)合，包括但不限于，平衡方法(例如，酶聯(lián)免疫吸附測試(ELISA)或 放射免疫測試(RIA))、或動力學方法(例如BIACORE 分析)、和其他方法例如間接結(jié) 合測試、競爭抑制測試、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、凝膠電泳和層析(例如，膠過濾)。這 些方法和其他方法可以使用一種或多種所檢測的組分上的或在多種檢測方法中所采用的 標記，包括但不限于，顯色標記、熒光標記、發(fā)光標記或同位素標記。結(jié)合親和力和動力學 的詳細描述可以在費城的利平科特-雷文出版公司1999年出版的Paul，W. E編的《基礎 免疫學〉〉第 4 版(Paul, W. Ε. , ed. , Fundamental Immunology,4thEd. , Lippincott-Raven, !Philadelphia (1999))中找到，主要集中在抗體-免疫原的相互作用上。在一個實施方式中，相對于比照分子，F(xiàn)c變體蛋白對一個或多個Fc配體的結(jié)合增 強。在另一個實施方式中，F(xiàn)c變體蛋白對Fc配體的親和力比比照分子高至少2倍、或至少 3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至 少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200 倍。在一個特定實施方式中，F(xiàn)c變體蛋白對受體的結(jié)合增強。在另一個特定實施方式 中，F(xiàn)c變體蛋白對Fc受體Fc γ RIIIA的結(jié)合增強。在又一個特定實施方式中，F(xiàn)c變體蛋白 對Fc受體Fc y RIIB的結(jié)合增強。在還一個特定實施方式中，F(xiàn)c變體蛋白對Fc受體Fcfoi 的結(jié)合增強。在又一個特定實施方式中，相對于比照分子，F(xiàn)c變體蛋白對Clq的結(jié)合增強?？梢詸z測任何特定的Fc變體蛋白通過ADCC介導靶細胞裂解的能力。為了評估 ADCC活力，向靶細胞中加入感興趣的Fc變體蛋白以及免疫效應細胞，所述細胞可以被抗原 抗體復合物所激活并導致靶細胞的細胞裂解。通常通過被裂解的細胞釋放出的標記(例 如，放射性底物、熒光染料或天然細胞內(nèi)蛋白)來檢測細胞裂解。能用于這些測試的效應 細胞包括外周血單核細胞(PMBC)和天然殺傷(NK)細胞。特定的體外ADCC測試的例子 在 Wisecarver 等，198579 :277-282 ;Bruggeraann 等，1987，J Exp Med 166:1351-1361; Wilkinson ^,2001, J Immunol Methods 258 183-191 ;Patel 1995J Immunol Methodsl84 :29-38等文中描述。感興趣的Fc變體蛋白的ADCC活力還可以在體內(nèi)進行評 估，例如在 Clynes 等，1998，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 :652-656 —文中所公開動物模型 中進行。在一個實施方式中，相對于比照分子，F(xiàn)c變體蛋白的ADCC活力增強。在一個特定 實施方式中，F(xiàn)c變體蛋白的ADCC活力要比比照分子高至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、 或至少10倍、或至少50倍、或至少100倍。在另一個特定實施方式中，相對于比照分子，F(xiàn)c 變體蛋白對Fc受體Fc YRIIIA的結(jié)合增強，并且ADCC活力增強。在其他實施方式中，相對 于比照分子，F(xiàn)c變體蛋白的ADCC活力增強且血清中的半衰期也延長。在一個實施方式中，相對于比照分子，F(xiàn)c變體蛋白的ADCC活力降低。在一個特定 實施方式中，F(xiàn)c變體蛋白的ADCC活力要比比照分子低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、 或至少10倍、或至少50倍、或至少100倍。在另一個特定實施方式中，相對于比照分子，F(xiàn)c變體蛋白對Fc受體Fc YRIIIA的結(jié)合降低，并且ADCC活力降低。在其他實施方式中，相對 于比照分子，F(xiàn)c變體蛋白的ADCC活力降低且血清中的半衰期延長。在一個實施方式中，相對于比照分子，F(xiàn)c變體蛋白的CDC活力增強。在一個特定實 施方式中，F(xiàn)c變體蛋白的⑶C活力要比比照分子高至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至 少10倍、或至少50倍、或至少100倍。在其他實施方式中，相對于比照分子，F(xiàn)c變體蛋白 的CDC活力增強且血清中的半衰期也延長。在一個實施方式中，相對于比照分子，F(xiàn)c變體 蛋白對一個或多個Fc配體的結(jié)合降低。在另一個實施方式中，F(xiàn)c變體蛋白對Fc配體的親 和力要比比照分子低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少 20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、 或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍。在一個特定實施方式中，F(xiàn)c變體蛋白對Fc受 體的結(jié)合降低。在另一個實施方式中，F(xiàn)c變體蛋白對Fc γ RIIIA的結(jié)合降低。在又一個特 定實施方式中，相對于比照分子，本文所述的Fc變體對Fc受體Fc YRIIIA的親和力要低至 少約5倍，其中所述Fc變體對Fc受體Fc y RIIB的親和力是其比照分子的約2倍之內(nèi)。在 還一個特定實施方式中，F(xiàn)c變體蛋白對Fc受體Fcfoi的結(jié)合減弱。在又一個特定實施方式 中，相對比照分子，F(xiàn)c變體蛋白對Clq的結(jié)合減弱。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了 Fc變體，其中Fc區(qū)域在選自下組的一個或多 個位點包含非天然存在的氨基酸殘基根據(jù)Kabat建立的EU索引編號的234，235，236， 237，238，239，240，241，243，244，245，247，251，252，254，255，256，262，263，264，265，266， 267，268，269，279，280，284，292，296，297，298，299，305，313，316，325，326，327，328，329， 330,331,332,333,334,339,341,343,370,373,378,392,416,419,421,440 和 443 位點。 可選地，F(xiàn)c區(qū)域在本領域技術人員已知的附加和/或可選位點上可以包含有非天然存在 的氨基酸殘基(參見例如美國專利5,624,821 ；6，277，375 ；6, 737,056 ；PCT專利公報WO 01/58957 ；WO 02/06919 ；WO 04/016750 ；WO 04/029207 ；WO 04/035752 ；WO 04/074455:W0 04/099249 ；WO 04/063351 ；WO 05/070963 ；WO 05/040217, WO 05/0擬925 和 W006/020114)。在一個特定實施方式中，本發(fā)明提供了一個Fc變體，其中Fc區(qū)域包含至少一個 選自下組的非天然存在的氨基酸殘基根據(jù)Kabat建立的EU索引編號的234D，234E，234N， 234Q,234T,234H,234Y,2341，234V,234F,235A,235D,235R,235W,235P,235S,235N,235Q, 235T,235H,235Y,2351,235V,235F,236E,239D,239E,239N,239Q,239F,239T,239H,239Y, 2401，240A，240T,240M,241W,241L,241Y,241E,241R,243W,243L,243Y,243R,243Q, 244H, 245A,247L,247V,247G,251F,252Y,254T,255L,256E,256M,2621，262A,262T,262E,2631， 263A,263T,263M，264L,2641，264W,264T,264R,264F,264M,264Y,264E,265G,265N,265Q, 265Y,265F,265V,2651，265L，265H,265T,2661，266A，266T,266M,267Q,267L,268E,269H, 269Y,269F,269R,270E,280A,284M,292P,292L,296E,296Q,296D,296N,296S,296T,296L, 2961，296H，269G,297S,297D,297E,298H,2981，298T，298F,2991，299L，299A,299S,299V, 299H,299F,299E,3051，313F，316D,325Q,325L,3251，325D,325E,325A,325T,325V, 325H, 327G,327W. 327N,327L,328S,328M,328D,328E, 328N, 328Q, 328F,3281，328V,328T,328H, 328A,329F,329H,329Q,330K,330G,330T,330C,330L,330Y,330V,3301，330F,330R,330H, 331G，331A，331L，331M，331F，331W，331K，331Q，331E，331S，331V，331I，331C，331Y，331H， 331R, 331N,331D,331T,332D,332S,332W,332F,332E,332N,332Q,332T,332H,332Y,332A,339T，370E，370N，378D，392T，396L，416G，419H，421K，440Y 和 434W?？蛇x地，F(xiàn)c 區(qū)域可以 包含附加的和/或可選的本領域技術人員已知的非天然存在的氨基酸殘基(參見例如，美 國專禾Ij 5, 624, 821 ；6，277，375 ；6，737，056 ；PCT 專利公報 WO 01/58957 ；WO 02/06919 ；WO 04/016750 ；W004/029207 ；WO 04/035752 和 WO 05/040217)。生產(chǎn)抗體的方法本發(fā)明的半胱氨酸工程化抗體可以用本領域已知的任何合成抗體的方法來生產(chǎn)， 尤其是通過化學合成或優(yōu)選通過重組表達技術。單克隆抗體可以采用本領域已知的各種技術來制備，包括使用雜交瘤、重組細 胞和噬菌體展示技術，或上述技術的組合。例如，單克隆抗體可以用雜交瘤技術生產(chǎn)，包 括本領域已知的技術，例如Harlow等的《抗體實驗室手冊》(冷泉港實驗室出版社，第 二版，1998) (Harlow et al. , Antibodies :ALaboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)) ； 1981 年紐約愛思唯爾出版社出版的 Hammerling 等 的《單克隆抗體和T細胞雜交瘤》第563-681頁(Hammerling, et al.，in =Monoclonal Antibodies and T-CeiIHybridomas 563-681 (Elsevier，N. Y.，1981))中所教授的技術(所 述參考文獻整體以引用的方式納入本文)。如本文所用，術語“單克隆抗體”不限于經(jīng)由雜 交瘤技術生產(chǎn)的抗體。術語“單克隆抗體”指由單克隆產(chǎn)生的抗體，包括任何真核、原核或 噬菌體克隆，而不是指其生產(chǎn)的方法。生產(chǎn)和篩選用雜交瘤技術制造的特異性抗體的方法是常規(guī)的并且是本領域所熟 知的。簡要地說，用靶抗原(可以是全長蛋白或其結(jié)構域，例如胞外結(jié)構域或配體結(jié)合結(jié)構 域)來免疫小鼠，且一旦檢測到免疫應答，例如在小鼠的血清中檢測到針對該靶抗原的特 異性抗體，收獲小鼠的脾臟并且分離脾細胞。然后用熟知的技術將脾細胞與任何合適的骨 髓瘤細胞進行融合，例如來源于ATCC的細胞系SP20。用有限稀釋法來選擇和克隆雜交瘤。 然后用本領域已知的方法對雜交瘤進行測試，選擇分泌能結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體的細胞。 用陽性雜交瘤細胞免疫小鼠，可以產(chǎn)生通常含有高水平抗體的腹水。因此，可以通過培養(yǎng)能分泌本發(fā)明抗體的雜交瘤細胞來產(chǎn)生單克隆抗體，其中優(yōu) 選雜交瘤細胞是通過融合取自用靶抗原免疫的小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞而產(chǎn)生的，然后 對融合產(chǎn)生的雜交瘤進行篩選，選出能分泌可結(jié)合特定靶抗原的的抗體的雜交瘤克隆。能識別特定靶抗原表位的抗體片段可以通過本領域技術人員已知的任何技術產(chǎn) 生。例如，本發(fā)明的Fab和F(ab’)2片段可以通過蛋白水解切割免疫球蛋白分子產(chǎn)生，使用 酶例如木瓜蛋白酶(產(chǎn)生Fab片段)或胃蛋白酶(產(chǎn)生F(ab’)2片段)。F(ab’)2片段包 含可變區(qū)域、輕鏈恒定區(qū)和重鏈的CHl結(jié)構域。此外，本發(fā)明的抗體還可用本領域已知的噬 菌體展示技術來產(chǎn)生。在噬菌體展示方法中，功能性抗體結(jié)構域展示在帶有編碼它們的多聚核苷酸序列 的噬菌體顆粒表面上。尤其是，編碼VH和VL結(jié)構域的DNA序列是從動物cDNA文庫(例如， 人或小鼠淋巴組織的cDNA文庫)擴增得來的。用PCR把編碼VH和VL結(jié)構域的DNA通過 scFv接頭重組在一起，并且克隆到噬菌粒載體中(例如ρ CANTAB 6或pComb 3HSS)中。將 載體電轉(zhuǎn)到大腸桿菌中，且用輔助噬菌體感染大腸桿菌。這些方法中所用的噬菌體典型地 為絲狀噬菌體，包括fd和M13，且VH和VL結(jié)構域通常和噬菌體基因III或基因VIII重組融 合在一起。可以用抗原來篩選或鑒定表達能與感興趣的表位結(jié)合的抗原結(jié)合結(jié)構域的噬菌體，例如，采用標記的抗原或是結(jié)合或捕獲在固體表面或珠子上的抗原?？捎糜谥圃毂景l(fā)明 的抗體的噬菌體展示方法的例子包括下列文獻中所公開的Brinkman等，1995，J. Immunol. Methods 182 :41-50 ；Ames 等，1995，J. Immunol. Methods 184 177 ；Keitleborough φ, 1994，Eur. J. Immunol 24 :952-958 ；Persic 等，1997，Gene 187 :9 ；Burton 等，1994， Advances inlmmunology 57 :191-280 ；國際專利申請第 PCT/GB91/01i;34 號；國際專利公 報 WO 90/02809, W091/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982， W095/20401 和 W097/13844 ；以及美國專利第 5，698，426 號、第 5，223，409 號、第 5，403，484 號、第 5，580，717 號、第 5，427，908 號、第 5，750，753 號、第 5，821，047 號、第 5，571，698 號、 第 5，427，908 號、第 5，516，637 號、第 5，780，225 號、第 5，658，727 號、第 5，733，743 號和第 5，969，108號，上述文獻整體以引用的方式納入本文。如上述參考文獻所述，在噬菌體篩選后，可以從噬菌體上分離出編碼抗體的區(qū)域， 并且用于產(chǎn)生包括人抗體等在內(nèi)的全抗體或者任何其他所需抗原結(jié)合片段，并在任何所需 宿主中表達，所述宿主包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母和細菌，例如如下文所 述。用于重組產(chǎn)生i^ab、Fab’和F(ab’)2片段的技術，也可用本領域已知的方法，例如如下 列文獻中所公開的國際公報第WO 92/22324號；Mullinax等，1992，BioTechniques 12: 864 ；Sawai 等，1995，AMI 34 :26 ；和 Better 等，1988，Science 240 :1041 (所述參考文獻整 體以引用的方式納入本文)。為了產(chǎn)生全抗體，可以使用包括VH或VL核苷酸序列、限制性位點和保護限制性位 點的側(cè)翼序列的PCR引物來擴增scFv克隆中的VH或VL序列。使用本領域技術人員所熟 知的克隆技術，將PCR擴增的VH結(jié)構域克隆到表達例如人Y 4恒定區(qū)等VH恒定區(qū)的載體 中，且PCR擴增的VL結(jié)構域克隆到表達例如人κ或λ恒定區(qū)等VL恒定區(qū)的載體中。優(yōu) 選地，用于表達VH或VL結(jié)構域的載體包含EF-I α啟動子、分泌信號、可變結(jié)構域的克隆位 點、恒定結(jié)構域、和如新霉素等選擇性標記。VH和VL結(jié)構域也可以克隆到一個表達必需恒 定區(qū)域的載體上。然后，使用本領域技術人員已知的技術，將重鏈轉(zhuǎn)換載體和輕鏈轉(zhuǎn)換載體 共轉(zhuǎn)到細胞系中，產(chǎn)生表達如IgG等全長抗體的穩(wěn)轉(zhuǎn)或瞬轉(zhuǎn)細胞系。對于包括在人體內(nèi)使用抗體和體外檢測測試等某些應用，優(yōu)選可以使用人源或 嵌合抗體。對人對象的治療處理尤其需要使用完全人源的抗體?？梢酝ㄟ^各種本領域已 知的方法來制備人源抗體，包括使用來源于人免疫球蛋白序列的抗體文庫來采用如上所述 的噬菌體展示方法。也參見美國專利第4，444，887號和第4，716，111號；和國際出版物 WO 98/46645，WO 98/50433，WO 98/24893，W098/16654, WO 96/34096，WO 96/33735 和 WO 91/10741，上述文獻整體以引用的方式納入本文。人源抗體也可以使用轉(zhuǎn)基因小鼠來產(chǎn)生，該小鼠不能表達功能性的內(nèi)源免疫球蛋 白，但是能表達人免疫球蛋白基因。例如，人重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因復合物可以隨機導 入或通過同源重組轉(zhuǎn)入小鼠胚胎干細胞。任選地，人的可變區(qū)、恒定區(qū)和多樣性區(qū)可以和 人重鏈和輕鏈基因一起導入小鼠胚胎干細胞中。通過同源重組，小鼠重鏈和輕鏈免疫球蛋 白基因可以獨立地或是隨人免疫球蛋白位點的導入而同時失去功能。尤其是，Jh區(qū)域的純 合性缺失阻止了內(nèi)源性抗體的產(chǎn)生。擴增修飾的胚胎干細胞，并且顯微注射到胚泡中產(chǎn)生 嵌合小鼠。然后養(yǎng)殖嵌合小鼠，以產(chǎn)生能表達人源抗體的純合后代。用選擇的抗原(例如 全長的本發(fā)明多肽或或其一部分)以正常的方式免疫轉(zhuǎn)基因小鼠?？梢杂贸Ｒ?guī)的雜交瘤技術，從免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠獲得直接針對抗原的單克隆抗體。在B細胞分化的過程中，轉(zhuǎn)基 因小鼠所攜帶的人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因重新排列，并且隨后發(fā)生類型轉(zhuǎn)換和體細胞突變。因 此，使用這樣的技術，可產(chǎn)生治療上有效的IgG、IgA、IgM和IgE抗體。生產(chǎn)人源抗體的該 技術的概述，可以參見 Lonberg 和 Huszar (1995，Int. Rev. Immunol. 13 :65-93)的文章。對 生產(chǎn)人源抗體和人源單克隆抗體的該項技術的詳細討論和生產(chǎn)這些抗體的方法，可以參見 例如國際出版物WO 98/24893,WO 96/34096和WO 96/33735 ；和美國專利第5，413，923號、 第 5，625，126 號、第 5，633，425 號、第 5，569，825 號、第 5，661，016 號、第 5，545，806 號、第 5，814，318號和第5，939，598號，這些文獻整體以引用的方式納入本文。另外，例如梅達瑞 (Medarex)公司(新澤西普林斯頓)等公司可提供用類似上述技術生產(chǎn)的直接針對所選抗 原的人源抗體。嵌合抗體是抗體的不同部分來源于不同免疫球蛋白分子的一種分子，例如抗體 帶有來源于非人源抗體的可變區(qū)和人免疫球蛋白的恒定區(qū)。生產(chǎn)嵌合抗體的方法是本領 域已知的。參見如 Morrison，1985，Science 229 1202 ;0i 等，1986，BioTechniques 4 214 :Gillies 等 1989，J Immunol Methods 125 :191-202 ；和美國專利第 6，311，415 號、第 5，807，715號、第4，816，567號和第4，816，397號，整體以引用的方式納入本文。包含一個或 多個來源于非人源物種的CDR和來源于人免疫球蛋白分子的框架區(qū)的嵌合抗體可以用本 領域已知的各種技術生產(chǎn)，包括，例如，⑶R嫁接(EP 239, 400 ；國際公報WO 91/09967 ；和美 國專利第5，225，539號，第5，530，101號和第5，585，089號)、凝合(veneering)或表面重 修(EP 592, 1. 06；EP 519, 596 ；Padlan,1991, Molecular Immunology 28(4/5) :489-498; Studnicka 等，1994，Protein Engineering 7 :805 ；和 Roguska 等，1994，PNAS91 :969)、和 鏈替換(美國專利第5，565，332號)。通常，框架區(qū)的框架殘基可以被來源于CDR供體抗體的對應殘基所取代，從而改 變抗原結(jié)合，優(yōu)選為提高抗原結(jié)合。這些框架取代可以通過本領域所熟知的方法來鑒定， 例如通過模擬CDR和框架殘基的相互作用來鑒定對于抗原結(jié)合重要的框架殘基，并且通 過序列比較來鑒別特定位點不尋常的框架殘基(參見例如美國專利第5，585，089號；和 Riechmann等，1988，Nature 332 :323，整體以引用的方式納入本文)。人源化的抗體是一種抗體或其變體或片段，它能夠與預先確定的抗原結(jié)合，并且 包含帶有基本為人免疫球蛋白的氨基酸序列的框架區(qū)和帶有基本為非人源免疫球蛋白氨 基酸序列的CDR。人源化的抗體包含基本上至少一種且典型地為2個可變結(jié)構域，該可變結(jié) 構域所有的或基本上所有的CDR區(qū)對應于非人源免疫球蛋白(即供體抗體)的CDR區(qū)域； 并且所有的或基本上所有的框架區(qū)為人免疫球蛋白的共有序列。優(yōu)選地，人源化的抗體還 包含至少一部分的免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，典型地為人免疫球蛋白的恒定區(qū)。通常，抗體含 有輕鏈以及至少重鏈的可變結(jié)構域?？贵w還可包括重鏈的CH1、鉸鏈、CH2、CH3、CH4區(qū)域。 人源化的抗體可選自免疫球蛋白的任何類型，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE、以及任何同種 型，包括IgGpIgGylgQ和IgQ。通常，當需要人源化抗體表現(xiàn)出細胞毒性活力時，恒定結(jié)構 域是固定補體的恒定結(jié)構域，且類型典型地為IgG115當不需要這樣的細胞毒性時，恒定結(jié)構 域可以是IgG2類的恒定結(jié)構域。人源化抗體可以包含來自一種以上類型或同種型的序列， 并且選擇特定的恒定結(jié)構域來優(yōu)化所需的效應子功能也在本領域的普通技術范圍內(nèi)。人源 化抗體的框架區(qū)和CDR區(qū)不需要精確對應于親本序列，例如供體CDR或共有框架可以取代、插入或缺失至少一個殘基而被突變，使得CDR或框架殘基在該位點上不對應于共有序列或 輸入抗體。然而，這樣的突變不會是廣泛的。通常至少75%、通常超過90%，或者甚至大于 95%的人源化抗體殘基對應于親本框架區(qū)(FR)和CDR序列的殘基。人源化抗體可以用本領域已知的各種技術來生產(chǎn)，包括但不限于，⑶R-嫁接(歐 洲專利EP 239，400 ；國際公報WO 91/09967 ；和美國專利第5，225，539號、第5，530，101號 和第5，585，089號)、凝合或表面重修(歐洲專利EP 592，106和EP 519，596 ；Padlan, 1991， Molecular Immunology 28 (4/5) :489-498 ；Studnicka 等，1994，Protein Engineering 7(6) :805-814 ；禾口 Roguska 等 1994，PNAS 91 :969-973)、鏈替換(chain shuffling)(美 國專利第5，565，332號)、以及下列文獻中公開的技術例如美國專利第6，407，213號、 第 5，766，886 號、第 5，585，089 號、國際公報 WO 9317105、Tan 等，2002，J. Immunol. 169 1119-25 ；Caldas 等，2000，Protein Eng. 13:353-60 ；Morea 等，2000，Methods 20 :267-79 ； Baca 等，1997，J. Biol. Chem. 272 :10678-84 ；Roguska 等，1996，Protein Eng. 9 :895-904 ； Couto 等，1995, Cancer Res. 55 (23Supp) :5973s_5977s ；Couto 等，1995, Cancer Res. 55 1717-22 ；Sandhu,1994，Gene 150 :409-10 ；Pedersen 等，1994，J.Mol. Biol. 235 :959-73, Jones 等，1986，Nature 321 :522-525, Riechmann 等，1988，Nature332 :323,和 Presta, 1992，Curr. Op. Struct. Biol 2 :593_596。通常，框架區(qū)中的框架殘基可以被CDR供體抗體 的對應殘基所取代來改變抗原結(jié)合，優(yōu)選為提高抗原結(jié)合。這些框架取代可以通過本領域 所熟知的方法來鑒定，例如通過模擬CDR和框架殘基的相互作用來鑒定對于抗原結(jié)合重要 的框架殘基，并且通過比較序列來鑒別特定位點不尋常的框架殘基(參見例如Queen等的 美國專利第5，585，089號；和Riechmann等，1988，Nature 332 :323，在本發(fā)明中整體應用 作為參考)。此外，采用本領域技術人員所熟知的技術，本發(fā)明的抗體可以反過來用于產(chǎn)生抗 個體基因型的抗體(參見例如 Greenspan&Bona，1989，F(xiàn)ASEBJ. 7 :437-444 ；和 Nissinoff， 1991，J. Immunol 147 :2429-2438)。本發(fā)明提供了使用包含編碼本發(fā)明的抗體或其片段的 核苷酸序列的多聚核苷酸的方法。在其他實施方式中，本發(fā)明包括表達含有半胱氨酸工程化殘基的分離的CHl結(jié)構 域。這樣的分離的CHl結(jié)構域可以用作骨架，用于表面展示。在其他實施方式中，分離的 CHl結(jié)構域可以用于和抗體輕鏈的Ck和CX亞基聯(lián)用。在又一些其他實施方式中，本發(fā)明的抗體可包含缺少至少一個半胱氨酸殘基的鉸 鏈區(qū)。在其他實施方式中，本發(fā)明的抗體可以包含完全沒有半胱氨酸殘基的鉸鏈區(qū)。在一 些實施方式中，本發(fā)明的抗體包含所有半胱氨酸殘基都被絲氨酸或蘇氨酸所替代了的鉸鏈 區(qū)。這些抗體會表現(xiàn)出偶聯(lián)效率提高且二硫鍵不規(guī)則性(scrambling)減少。另外，各種出版物描述了獲得半衰期被改變了的生理活性分子的方法，所述半衰 期的改變可以通過向分子內(nèi)導入FcfoI結(jié)合多肽(W0 97/43316 ；美國專利第5，869，046號； 美國專利第5，747，035號；WO 96/32478 ；WO 91/14438)，或通過將分子與保留了 Fcfoi結(jié)合 親和力但是對其他Fc受體的親和力大大下降的抗體進行融合(W0 99/43713)，或是與抗體 的Fcfoi結(jié)合結(jié)構域相融合(W000/09560 ；美國專利第4，703，039號)而實現(xiàn)。提高生理活 性分子半衰期的特殊技術和方法也可以在2006年8月1日批準的題為《半衰期提高的抗 體》(〃 Antibodies with Increased Half-lives")的美國專利第 7，083，784 號中找到，
24在此整體以引用的方式納入本文。特別是，可以預期本發(fā)明的抗體包含含有M252Y/S2MT/ T256E或H433K/N434F/W36H氨基酸殘基突變(根據(jù)Kabat的EU索引進行編號)的Fc區(qū) 域。編碼抗體的多聚核苷酸可以用本領域已知的任何方法得到多聚核苷酸以及決定多聚核苷酸的核苷酸序 列。因為已經(jīng)知道抗體的氨基酸序列，編碼這些抗體的核苷酸序列可以用本領域熟知的方 法來確定，即將已知編碼特定氨基酸的核苷酸密碼子以這樣的方式組裝起來，產(chǎn)生一個編 碼本發(fā)明抗體或其片段的核酸。這樣的編碼抗體的多聚核苷酸可以用化學合成的寡核苷酸 來組裝(例如如Kutmeier等，1994，BioTechniques 17 :242中所述)，簡要地說，涉及合成 含有編碼抗體的序列一部分的重疊寡核苷酸、將這些寡核苷酸退火并連接，然后用PCR擴 增連接的寡核苷酸。任選地，編碼抗體的多聚核苷酸可以產(chǎn)生自合適來源的核酸。如果沒有含有編碼 特定抗體的核酸的克隆，但是抗體的序列是已知的，編碼免疫球蛋白的核酸可以是化學合 成的或是從合適的來源獲得的(例如，抗體cDNA文庫、或產(chǎn)生自任何表達抗體的組織或細 胞的cDNA文庫或提取自所述組織或細胞的核酸，優(yōu)選為Poly A+RNA,采用可與序列的3’和 5’末端雜交的合成的引物用PCR擴增，或者采用特異針對特定基因序列的寡核苷酸探針進 行克隆，來鑒定來源于cDNA文庫的編碼抗體的cDNA克隆)。然后，可以采用本領域熟知的 任何方法，將PCR產(chǎn)生的擴增的核酸克隆到可復制克隆載體中。一旦確定抗體的核苷酸序列，可以用本領域熟知的操縱核苷酸序列的方法來操縱 抗體的核苷酸序列，例如重組DNA技術、定點突變、PCR等(參見例如1990年冷泉港實驗室 的Sambrook等《分子克隆，實驗室手冊》第2版(冷泉港、紐約)(Sambrook et al.，1990， Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d Ed. ,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)和1998年紐約約翰威立出版社出版的Ausubel等編的《分子生物學現(xiàn) 有方法》(Ausubel et al.，eds.，1998, Current Protocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons, NY,)，都整體以引用的方式納入本文)所述的技術，來產(chǎn)生帶有不同氨基酸序 列的抗體，例如制造氨基酸取代、缺失和/或插入。在一個特定實施方式中，采用常規(guī)重組DNA技術將一個或多個CDR插入到框架區(qū) 內(nèi)?？蚣軈^(qū)可以是天然存在的或是共有框架區(qū)，并且優(yōu)選為人框架區(qū)(人框架區(qū)的列表可 參見例如Chothia等，1998，J. Mol. Biol. 278 :457-479)。優(yōu)選地，通過組合框架區(qū)和CDR產(chǎn) 生的多聚核苷酸編碼特異性結(jié)合EphA2或EphA4的抗體。優(yōu)選地，如上文所討論的，可以在 框架區(qū)內(nèi)制造一個或多個氨基酸取代，并且優(yōu)選地所述氨基酸取代提高了抗體對其抗原的 結(jié)合。此外，這樣的方法還可用于制造一個或多個可變區(qū)參與鏈內(nèi)二硫鍵形成的半胱氨酸 殘基的氨基酸取代或缺失，從而產(chǎn)生缺少一個或多個鏈內(nèi)二硫鍵的抗體。多聚核苷酸的其 他變化也包含在本發(fā)明中并屬于本領域的技術范圍內(nèi)。抗體的重組表達本發(fā)明的抗體、衍生物、類似物或其片段的重組表達需要構建含有編碼抗體的多 聚核苷酸的表達載體。一旦獲得編碼本發(fā)明的抗體、或抗體的重鏈或輕鏈、或其一部分的多 聚核苷酸，可以采用本領域熟知的技術用重組DNA技術來生產(chǎn)用于產(chǎn)生抗體的載體。因此， 本文描述了通過表達含有編碼抗體的核苷酸序列的多聚核苷酸來制備蛋白的方法?？梢允褂帽绢I域技術人員所熟知的方法來構建含有抗體編碼序列以及合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信 號的表達載體。這些方法包括例如體外重組DNA技術、合成技術和體內(nèi)遺傳重組。因此，本發(fā)明提供了可復制的載體，該載體包含可操作性地連到啟動子上的編碼 本發(fā)明的抗體、抗體的重鏈或輕鏈、抗體重鏈或輕鏈的可變區(qū)或其一部分、或是重鏈或輕鏈 的CDR的核苷酸序列。這樣的載體可包含編碼抗體恒定區(qū)的核苷酸序列(參見例如國際公 報TO 86/05807和WO 89/01036 ；和美國專利第5，122，464號)，并且抗體的可變結(jié)構域也 可克隆到這樣的表達載體中，用于表達完整的重鏈、完整的輕鏈或完整的重鏈和輕鏈兩者。用常規(guī)技術把表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞，然后用常規(guī)技術培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的細胞，以產(chǎn) 生本發(fā)明的抗體。因此，本發(fā)明包括宿主細胞，所述宿主細胞含有操作性地連接于異源啟動 子的編碼本發(fā)明的抗體或其片段、或其重鏈或輕鏈、或其一部分、或本發(fā)明的抗體的單條鏈 的多聚核苷酸。在表達雙鏈抗體的某些實施方式中，為了表達完整的免疫球蛋白，編碼重鏈 和輕鏈的載體可以在宿主細胞中共表達，如下文中詳細描述?？梢允褂枚喾N宿主表達載體系統(tǒng)來表達本發(fā)明的抗體(參見如美國專利第 5，807，715號)。這種宿主表達系統(tǒng)代表了可以產(chǎn)生感興趣的編碼序列并且進行后續(xù)純化 的運載體，也代表了當用合適的核苷酸編碼序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染時可以原位表達本發(fā)明的抗體 的細胞。這些系統(tǒng)包括但不限于，微生物例如用包含抗體編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒 DNA或粘粒DNA表達載體轉(zhuǎn)化的細菌(例如大腸桿菌和枯草桿菌)；用含有抗體編碼序列的 重組酵母表達載體轉(zhuǎn)化的酵母(例如畢赤酵母(Saccharomyces Pichia))；用含有抗體編 碼序列的重組病毒表達載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統(tǒng)；用含抗體編碼序列的 重組病毒表達載體(例如花椰菜花葉病毒，CaMV ；煙草花葉病毒，TMV)感染的、或是用含抗 體編碼序列的重組質(zhì)粒表達載體(例如Ti質(zhì)粒)感染的植物細胞系統(tǒng)；或帶有含來源于 哺乳動物細胞基因組的啟動子(例如金屬硫蛋白啟動子)或來源于哺乳動物病毒的啟動子 (例如腺病毒晚期啟動子、痘苗病毒7. 5K啟動子)的重組表達構建體的哺乳動物細胞系統(tǒng) (例如C0S、CH0、BHK、293、NS0和3T3細胞)。重組抗體的表達優(yōu)選采用細菌例如大腸桿菌， 且更優(yōu)選采用真核細胞，尤其是用于表達完整的重組抗體的真核細胞。例如，哺乳動物細胞如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)結(jié)合載體例如來源于人巨細胞病 毒的主要即刻早期基因啟動子元件是有效的抗體表達系統(tǒng)(!decking等，1986，Gene 45 101 ；和 Cockett 等，1990，BioTechnology 8 2)。在細菌系統(tǒng)中，可以根據(jù)所表達的抗體的應用來方便地選擇多種表達載體。例 如，當為了生產(chǎn)抗體的藥物組合物要大量生產(chǎn)這樣的蛋白時，可能需要能夠高水平表達 容易進行純化的融合蛋白產(chǎn)物的載體。這樣的載體包括但不限于，大腸桿菌表達載體 pUR278 (Ruther等，1983，EMBO 12 :1791)，其中抗體編碼序列可以與Lac Z編碼區(qū)相匹配 地(in frame with))單獨連入載體中，從而產(chǎn)生融合蛋白；pIN載體Qnouye和Inouye， 1985,Nucleic Acids Res. 13 :3101-3109 ；Van Heeke 和 Schuster，1989，J. Biol，Chem. 24 5503-5509)；等等。也可用PGEX載體以具有谷胱苷肽5-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白的形式 來表達外源多肽。.一般而言，這樣的融合蛋白是可溶的，并且可以方便的從裂解的細胞進 行純化，所述純化是通過吸附和結(jié)合到谷胱甘肽-瓊脂糖珠子基質(zhì)上、然后在游離谷胱甘 肽存在下進行洗脫。PGEX載體設計上包含凝血酶或因子蛋白酶切割位點，這樣克隆的靶 基因產(chǎn)物可以從GST部分上釋放出來。
在昆蟲系統(tǒng)中，采用苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)作為表達外源基因的 載體。該病毒在草地貪夜蛾細胞(Spodoptera frugiperda)中生長?？贵w編碼序列可以單 獨克隆到病毒的非必需區(qū)，并且置于AcNPV啟動子的控制之下。在哺乳動物宿主細胞中，可以使用多種基于病毒的表達系統(tǒng)。當使用腺病毒作為 表達載體的情況下，感興趣的抗體編碼序列可以連接到腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯控制復合物上， 例如晚期啟動子和三聯(lián)前導序列。然后可以將這一嵌合基因通過體外或體內(nèi)重組插入到 腺病毒基因組中。插入病毒基因組的非必需區(qū)(例如El或E3區(qū))將會造成重組病毒是 有生存能力的并且能在感染的宿主中表達抗體(例如參見Logan和Sienk，1984，PNAS 81 6355-6359)。為了有效地翻譯插入的抗體編碼序列，可能還需要特定的起始信號。這些信 號包括ATG起始密碼子和相鄰序列。而且，起始密碼子必須與所需編碼序列的閱讀框相匹 配，以確保翻譯完整的插入體。這些外源翻譯控制信號和起始密碼子可以是各種來源的、天 然的和合成的?？梢酝ㄟ^插入合適的轉(zhuǎn)錄增強元件、轉(zhuǎn)錄終止子等來提高表達的效率(參 見例如 Bittner 等，1987，Methods inEnzymol. 153 :516-544)。此外，可以選用能以所需特定方式調(diào)控插入序列的表達、或修飾和加工基因產(chǎn)物 的宿主細胞株。這樣的蛋白產(chǎn)物修飾(如糖基化)和加工(如切割)對于蛋白的功能可起 重要作用。不同的宿主細胞對蛋白和基因產(chǎn)物的翻譯后加工和修飾具有特有的且特異性 的機制。可以選擇合適的細胞系或宿主系統(tǒng)，以確保對于表達的外源蛋白的正確修飾和加 工。為了這個目的，可以使用具有能正確加工初級轉(zhuǎn)錄物、糖基化和磷酸化基因產(chǎn)物的細胞 機制的真核宿主細胞。這樣的哺乳動物宿主細胞包括但不限于，CH0、VER0、BHK、HeLa、C0S、 MDCKJ93、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20、NSl 和 T47D、NSO (—種不能內(nèi)源性產(chǎn)生任 何免疫球蛋白鏈的小鼠骨髓瘤細胞系)、CRL7030和HsS78Bst細胞。為了長期高產(chǎn)量的生產(chǎn)重組蛋白，優(yōu)選穩(wěn)定表達。例如，可以工程化制造穩(wěn)定表達 抗體的細胞系。可以用受到合適表達控制元件(例如啟動子、增強子、序列、轉(zhuǎn)錄終止子、聚 腺苷酸化位點等)控制和可選擇標記的DNA來轉(zhuǎn)化宿主細胞，而不是使用帶有病毒復制起 點的表達載體。在導入外源DNA后，可以讓工程化細胞在富營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長1-2天，然后 轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基中。在重組質(zhì)粒中的可選擇標記提供了對于選擇的抗性，使質(zhì)粒穩(wěn)定的整 合到細胞的染色體上，并且生長形成能克隆并擴增成細胞系的灶(foci)。該方法可方便地 用于工程化改造能表達抗體的細胞系。這樣的工程化細胞系尤其適用于篩選和評估能直接 或間接與抗體相互作用的組合物。可以使用多種選擇系統(tǒng)，包括但不限于，單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等， 1977，Cell 11 :223)、谷氨酰胺合成酶、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Szyhlska 和 Szybalski, 1992，Proc. Natl. Acad. Sci USA 48 :202)、和腺苷磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶 (Lowy 等，1980，Cell 22 :8-17)基因可分別用于 tk_、gs_、hgprt-或 aprt-細胞中。也 可用抗代謝藥物的抗性作為選擇的基礎來篩選下列基因dhfr，賦予對甲胺喋呤的抗 性(Wigler 等，1980，PNAS 77 :357 ；0 ‘ Hare 等，1981，PNAS78 :1527) ；gpt,賦予對霉酚 酸的抗性(Mulligan和Berg，1981，PNAS 78 :2072) ；neo，賦予對氨基糖苷G418的抗性 (Wu 禾口 Wu,1991, Biotherapy 3 87 ；Tolstoshev,1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32 573 ；Mulligan,1993, Science 260 :926 ；以及 Morgan 禾口 Anderson，1993，. Ann. Rev. Biochern. 62 :191 ； (1993 年 5 月)，TIBTECH 11 :155-)；以及 hygro，賦予對潮霉素的抗性(Santerre等，1984，Gene30 :147)。可以常規(guī)使用重組DNA技術領域公知的方法來選擇所 需的重組克隆，且這些方法在下文中有描述，例如1993年紐約約翰威立國際出版公司出版 的Ausubel等編的《現(xiàn)代分子生物學實驗技術》(Ausubel et al (eds.). CurrentProtocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons,NY(1993)) ；1990年的紐約斯托克頓出版社出版 的Kriegler的《基因轉(zhuǎn)移和表達實驗指南》(Kriegler，Gene Transfer and Expression^ Laboratory Manual, Stockton Press,NY(1990))；以及1994年紐約約翰威立國際出版公司 出版的Dracopoli等編的《人類遺傳學方法》第12和13章(Chapters 12and 13, Dracopoli et al. (eds)，Current Protocols in. Human Genetics, John Wiley&Sons，NY(1994))； Colberre-Garapin等，1981，J Mol. Biol. 150 :1，其全文以引用的方式納入本文。通過載體擴增可以提高抗體的表達水平(綜述參見1987年紐約學術出版社的 ((DNA克隆》第三卷中BetDbington和Hentschel的《DNA克隆中使用基于基因擴增的載體 在哺乳動物細胞中表達克隆的基因》(Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genesin mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3. (Academic Press, New York, 1987))。當表達抗體的載體 系統(tǒng)中的標記是可以擴增的，提高宿主細胞培養(yǎng)中的抑制劑水平能夠提高標記基因的拷貝 數(shù)。因為擴增的區(qū)域與抗體基因相關，抗體的產(chǎn)生也提高(Grouse等，1983，Mol. Cell Biol 3 257)。宿主細胞可以共轉(zhuǎn)本發(fā)明的2個表達載體，第一載體編碼重鏈來源的多肽，且第 二載體編碼輕鏈來源的多肽。兩個載體可包含能均衡重鏈和輕鏈多肽表達的相同的可選擇 標記。任選地，可使用單個載體，所述載體編碼且能表達重鏈和輕鏈多肽。在這種情況下，輕 鏈應該位于重鏈前，以避免過量產(chǎn)生毒性的游離重鏈(ftxnidfoot，1986，Nature 322 :52 ； 和Kohler，1980，PNAS 77 :2197)。重鏈和輕鏈的編碼序列可包含cDNA或基因組DNA。一旦用重組表達生產(chǎn)了本發(fā)明的半胱氨酸工程化抗體，可以用本發(fā)明已知的任何 純化免疫球蛋白分子的方法來進行純化，例如通過層析(例如離子交換層析、親和層析，特 別是通過對蛋白A后的特異性抗原的親和層析，以及尺寸排阻柱層析)、離心、溶解度差異、 或任何純化蛋白的標準技術。而且，本發(fā)明的抗體或其片段可以融合到本文所述的或本領 域已知的異源多肽序列上來促進純化。半胱氨酸工程化抗體的規(guī)模化生產(chǎn)為了獲得大量的本發(fā)明的半胱氨酸工程化抗體，可以用規(guī)?；椒ㄟM行抗體生產(chǎn) (下文中稱為“本發(fā)明的規(guī)?；椒ā?。在一些實施方式中，可在研究實驗室中用本發(fā)明的 規(guī)模化方法來生產(chǎn)半胱氨酸工程化抗體，可以擴大到在分析級的生物反應器(例如但不限 于51^，1(^，151^，3(^或5(^生物反應器)中生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白，而保留蛋白的功能活性。例 如，在一個實施方式中，用HPSEC或rCGE測得，以本發(fā)明的規(guī)?；椒ㄉa(chǎn)的蛋白表現(xiàn)出低 到無法檢測的水平的凝集，即低于蛋白重量的5%、低于4%、低于3%、低于2%、低于或 低于0.5%的凝聚，和/或低到無法檢測水平的斷裂，即在各峰中80%或更高、85%或更高、 90%或更高、95 %或更高、98%或更高、或99%或更高、或99. 5 %或更高的總峰區(qū)代表完好 的半胱氨酸工程化抗體。在其他實施方式中，在研究實驗室中可用本發(fā)明的規(guī)模化方法來生產(chǎn)半胱氨酸工 程化抗體，可以擴大到在生產(chǎn)級的生物反應器(例如但不限于75L、100L、I50L、300L或500L生物反應器)中生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白。在一些實施方式中，與研究實驗室的生產(chǎn)方法相比， 本發(fā)明的規(guī)?；椒ǖ纳a(chǎn)效率并沒有降低或只降低了很少。在其他實施方式中，本發(fā)明 的規(guī)?；椒ㄉa(chǎn)半胱氨酸工程化抗體的生產(chǎn)效率為約10mg/L、約20mg/L、約30mg/L、約 50mg/L、約 75mg/L、約 100mg/L、約 125mg/L、約 150mg/L、約 175mg/L、約 200mg/L、約 250mg/ L、約300mg/L或更高。在其他實施方式中，本發(fā)明的規(guī)?；椒ㄉa(chǎn)半胱氨酸工程化抗體的生產(chǎn)效率 為至少約10mg/L、至少約20mg/L、至少約30mg/L、至少約50mg/L、至少約75mg/L、至少約 100mg/L、至少約 125mg/L、至少約 150mg/L、至少約 175mg/L、至少約 200mg/L、至少約 250mg/ L、至少約300mg/L或更高。在其他實施方式中，本發(fā)明的規(guī)?；椒ㄉa(chǎn)半胱氨酸工程化抗體的生產(chǎn)效率 為從約10mg/L到約300mg/L、從約10mg/L到約250mg/L、從約10mg/L到約200mg/L、從約 10mg/L 到約 175mg/L、從約 10mg/L 到約 150mg/L、從約 10mg/L 到約 100mg/L、從約 20mg/L 到 約 300mg/L、從約 20mg/L 到約 250mg/L、從約 20mg/L 到約 200mg/L、從約 20mg/L 到約 175mg/ L、從約 20mg/L 到約 150mg/L、從約 20mg/L 到約 125mg/L、從約 20mg/L 到約 100mg/L、從約 30mg/L 到約 300mg/L、從約 30mg/L 到約 250mg/L、從約 30mg/L 到約 200mg/L、從約 30mg/ L 到約 175mg/L、從約 30mg/L 到約 150mg/L、從約 30mg/L 到約 125mg/L、從約 30mg/L 到約 100mg/L、從約 50mg/L 到約 300mg/L、從約 50mg/L 到約 250mg/L、從約 50mg/L 到約 200mg/L、 從 50mg/L 到約 175mg/L、從約 50mg/L 到約 150mg/L、從約 50mg/L 到約 125mg/L、從約 50mg/ L 到約 100mg/L。為了確保本發(fā)明的抗體的穩(wěn)定性，已經(jīng)開發(fā)了合適的測試。在一個實施方式中，采 用本領域已知的技術來鑒定本發(fā)明的蛋白的穩(wěn)定性。在其他實施方式中，可用凝集和/或 斷裂比例或圖譜來評估本發(fā)明的蛋白的穩(wěn)定性。為了測定凝集或斷裂水平，可以采用多種 技術。在一個實施方式中，可采用分析超速離心(AUG)，尺寸排阻層析(SEC)、高效尺寸排阻 層析(HPSEC)、解鏈溫度(Tm)、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、毛細管凝膠電泳(CGE)、光散射 (SLS)、傅里葉變換紅外光譜(FTIR)、圓二色譜(CD)、尿素誘導的蛋白伸展技術、內(nèi)在色氨 酸熒光、差示掃描量熱法、或1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS)蛋白結(jié)合技術評估凝集和/或斷 裂圖譜。在另一個實施方式中，用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分析來鑒定本發(fā)明的蛋白的 穩(wěn)定性。在另一個實施方式中，用尺寸排阻層析(SEC)圖譜分析來鑒定本發(fā)明的蛋白的穩(wěn) 定性?？贵w偶聯(lián)物本發(fā)明包含使用重組融合或化學偶聯(lián)(包括共價和非共價偶聯(lián))了異源試劑的半 胱氨酸工程化抗體產(chǎn)生作為靶標部分的融合蛋白(在下文中稱為“抗體偶聯(lián)物)。異源試劑 可以是多肽(或其一部分，優(yōu)選為至少10個、至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、 至少60個、至少70個、至少80個、至少90個或至少100個氨基酸的多肽)、核酸、小分子(小 于1000道爾頓)、或無機或有機化合物。融合不需要是直接的，而可以通過接頭序列發(fā)生融 合。與異源試劑融合或偶聯(lián)的抗體可以本領域已知的方法來用于體內(nèi)檢測、治療、控制或監(jiān) 測病癥的進程。參見例如國際公報WO 93/21232 ；EP439, 095 ；Naramura等，.1994, Immunol Lett. 39 :91-99 ；美國專利第 5，474，981 號；Gillies 等，1992, PNAS 89 :1428-1432 ；和 Fell 等，1991，J. Immunoll46 J446-2452，其全文以引用的方式納入本文。在一些實施方式中，所要檢測、治療、控制或監(jiān)測的病癥為自身免疫病、炎癥、傳染病或癌癥相關病癥。用于將多 肽融合或偶聯(lián)到抗體部分的方法是本領域已知的。參見例如，美國專利第5，336，603號、 第 5，622，929 號、第 5，359,046 號、第 5，349,053 號、第 5,447,851 號和第 5，112,946 號； EP 307, 434 ；EP 367，166 ；國際公報 W096/04388 和 WO 91/06570 ；Ashkenazi 等，1991，PNAS 88 :10535-10539 ；Zheng 等，1995，J. Immunol 154 :5590-5600 ；和 Vil 等，1992，PNAS 89 11337-11341 (所述參考文獻全文以引用的方式納入本文)?？梢杂没蚧炫?、基序混排、外顯子混排、和/或密碼子混排的技術(統(tǒng)稱為“DNA 混排(DNA shuffling)”)來產(chǎn)生附加的融合蛋白。可以采用DNA混排來改變本發(fā)明的半 胱氨酸工程化抗體的活力(例如具有親和力較高和解離速率較低的抗體)。通常參見美國 專利第 5，605，793 號；第 5，811，238 號；第 5，830，721 號；第 5，834，252 號和第 5，837，458 號，以及 Patten 等，1997，Curr. Opinion Biotechnol. 8 :724-33 ；Harayama, 1998，Trends Biotechnol 16 :76 ；Hansson,等，1999，J. Mol Biol. 287 :265 ；以及 Lorenzo 禾口 Blasco， 1998, BioTechniques 24 :308 (各文獻以其全文以引用的方式納入本文)。在重組前，可采 用易錯聚合酶鏈式反應、隨機核苷酸插入或其他方法來進行隨機突變，從而改變抗體或其 片段、或編碼的抗體或其片段。編碼抗體或抗體片段的多聚核苷酸的一個或多個部分可以 和一種或多種異源試劑的一個或多個組分、基序、部件、部分、結(jié)構域、片段等進行重組。在一個實施方式中，本發(fā)明的半胱氨酸工程化抗體或其片段或變體偶聯(lián)到標記物 序列(例如肽)以幫助純化。在某些實施方式中，標記物氨基酸序列是六組氨酸肽，例如PQE 載體所提供的標記(凱杰公司，伊頓大街9259號，查茲沃斯，加利福尼亞，91311 01IAGEN， Inc. ,9259Eton Avenue, Chatsworth, CA，91311))，在這些標記物中，很多是商品化的。如 Gentz等，1989，PNAS 86 :821中所述，例如，六組氨酸便于融合蛋白的純化。其他可用于 純化的肽標記包括但不限于對應于來源于流感紅細胞凝集素蛋白的表位的紅細胞凝集素 “HA”標記(Wilson 等，1984，Cell 37:767)、和〃 flag"標記。在其他實施方式中，本發(fā)明的抗體偶聯(lián)到一個診斷或檢測試劑上。這些抗體可用 于監(jiān)測或預測病癥(例如但不限于癌癥)的發(fā)展或進程，作為臨床測試程序的一部分，例如 確定特定治療的功效?？梢詫⒖贵w與可檢測物質(zhì)結(jié)合起來完成這種診斷和檢測?？蓹z測物質(zhì)包括但不 限于各種酶，例如但不限于辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶； 輔基，例如但不限于鏈霉親合素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；熒光物質(zhì)，例如但不限 于，7-羥基香豆素、熒光素、異硫氰酸酯熒光素、若丹明、二氯三嗪胺熒光素、丹磺酰氯或藻 紅蛋白；發(fā)光物質(zhì)，例如但不限于生物發(fā)光物質(zhì)，例如但不限于，熒光素酶、熒光素和發(fā)光蛋 白；放射性物質(zhì)，例如但不限于，祕(213Bi)、碳(wC)、鉻(51Cr)、鈷(57Co)、氟(18F)、釓(153Gd, 1H3Gd)、鎵(68 ,67 )、鍺 f8Ge)、鈥(166Ho)、銦(115In, 113h，112InZ11^OjII (131I，125I，123I， 121I)、鑭(140La)、镥(177Lu)、錳(54Mn)、鉬(99Mo)、鈀(103Pd)、磷(32P)、鐠(142Pr)、钷(149Pm)、 錸(186Rej188Re)^f (1° )、釕(97Ru)、釤(153Sm)、鈧(47Sc), (75Se), II (85Sr) M (35S), # ("Tc)、鉈(2tllTi)、錫(113Sn, 117Sn)、氚(3H)、氙(13 )、鐿(16i3Yb，mYb)、釔(9°Y)和鋅(65Zn) 等；采用各種正電子發(fā)射斷層掃描的正電子發(fā)射金屬，以及非放射性順磁性金屬離子。在其他實施方式中，本發(fā)明的半胱氨酸工程化抗體與下列治療劑偶聯(lián)在一起 治療劑例如細胞毒素，如細胞生長抑制劑或細胞殺傷劑；治療劑或放射性金屬離子，例如α發(fā)射體。細胞毒素或細胞毒性劑包括任何對細胞有害的試劑。例子包括紫杉醇、 細胞松弛素B、短桿菌肽D、溴乙啶、依米丁、絲裂霉素、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷 (tenoposide)、長春新堿、長春堿、秋水仙堿、阿霉素、道諾霉素、二羥基蒽二酮、米托蒽醌、 光輝霉素、放射菌素D、l-去氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、心得安、 嘌呤霉素、表阿霉素和環(huán)磷酰胺，以及他們的類似物或同源物。治療劑包括但不限于，抗 代謝物(例如甲氨喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氮烯唑胺 (decartazine))，烷基化試劑(例如二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、硫代苯丁酸氮芥 (thioepa thlorambucil)、美法侖(melphalan)、卡氯芥(BCNU)和洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰 胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、]鏈脲霉素、絲裂霉素C和順二氯二元胺鉬 (II) (DDP)順鉬)，蒽環(huán)霉素(如道諾霉素(原柔紅霉素)和阿霉素)，抗生素(如放線菌素 D (原放線菌素)，爭光霉素、光神霉素和安曲霉素(anthramycir^AMC))，以及抗有絲分裂試 劑(如長春新堿和長春堿)。在一個實施方式中，細胞毒性劑選自下組烯二炔(enediyne)、偏端霉素、倍癌霉 素(duocarmycin)、紫杉烷、嘌呤霉素、多拉司他汀、類美坦素和長春花生物堿。在其他實施 方式中，細胞毒性劑為紫杉醇、多烯紫衫醇、CC-1065、SN-38、托泊替康、嗎啉代阿霉素、根霉 素、氰基嗎啉代阿霉素、多拉司他汀-10、棘霉素、考布他丁、加里剎霉素、美登素、DM-1、奧 利斯他汀或其他多拉司他汀衍生物，例如奧利斯他汀E或奧利斯他汀F、AEB、AEVB, AEFP, MMAE (單甲基奧利斯他汀E)、MMAF (單甲基奧利斯他汀F)，軟珊瑚醇或紡錘菌素。奧利斯 他汀E(在本領域中也叫多拉司他汀-10)以及他的衍生物的合成和結(jié)構在美國專利申請 公報第2003/0083263A1號和第2005/0009751A1號；國際專利申請PCT/US02/13435 ；美國 專利第 6，323，315 號、第 6，239，104 號、第 6，034，065 號、第 5，780，588 號、第 5，665，860 號、第 5，663，149 號、第 5，635，483 號、第 5. 599，902 號、第 5，554，725 號、第 5，530，097 號、 第 5，521，284 號、第 5，504，191 號、第 5，410，024 號、第 5，138，036 號、第 5，076，973 號、第 4，986，988 號、第 4，978，744 號、第 4，879，278 號、第 4，816，444 號和第 4，486，414 號，所有 這些文獻的全文以引用的方式納入本文。在其他實施方式中，本發(fā)明抗體偶聯(lián)物中的細胞毒性劑為抗微管蛋白劑?？刮⒐?蛋白劑是一類早已明確的癌癥治療化合物?？刮⒐艿鞍讋┑睦影ǖ幌抻?，紫杉烷 (如Taxol (紫杉醇)、多烯紫杉醇)、T67(杜拉瑞克公司(Tularik))、長春花和奧利斯 他汀(如奧利斯他汀E、AEB、AEVB, MMAE, MMAF, AEFP)。包括在這一類中的抗微管蛋白劑 還有長春花生物堿、包括長春新堿和長春堿，長春地辛和長春瑞濱；紫杉烷例如紫杉醇和多 烯紫杉醇和漿果赤霉素衍生物、埃博霉素A和B、噻氨酯噠唑、5-氟尿嘧啶和脫羰秋水仙堿 (colcimid)、雌莫司汀、隱藻素、西馬多丁、類美坦素、考布他汀、多拉司他汀、迪斯科特摩利 得(discodermolide)和軟珊瑚醇。在更多的特定實施方式中，細胞毒性劑選自下組長春 花生物堿、鬼白毒素、紫杉烷、漿果赤霉素衍生物、隱藻素、類美坦素、考布他汀、和多拉司他 汀。在更多特定實施方式中，細胞毒性劑為長春新堿、長春堿、長春地辛、長春瑞濱、VP-16、 喜樹堿、紫杉醇、多烯紫杉醇、埃博霉素A、埃博霉素B、噻氨酯噠唑、秋水仙堿、脫羰秋水仙 堿、雌莫司汀、西馬多丁、迪斯科特摩利得、美登素、DM-1、奧利斯他汀或其他多拉司他汀 衍生物，如奧利斯他汀E或奧利斯他汀F、AEB、AEVB, AEFP, MMAE (單甲基奧利斯他汀E)、 MMAF(單甲基奧利斯他汀F)，軟珊瑚醇或紡錘菌素。
在一個特定實施方式中，藥物為類美坦素，一類抗微管蛋白劑。在一個更特定的實 施方式中，藥物為美坦素。而且，在一個特定實施方式中，細胞毒性劑或細胞生長抑制劑為 DM-I (ImmunoGen 公司，也參見 Chari 等.1992，CancerRes 52:127-131)。天然產(chǎn)物美坦素 抑制微管蛋白的多聚化，引起有絲分裂被阻止和細胞死亡。因此，美坦素的作用機制和長 春新堿和長春堿的機制相類似。然而，美坦素的體外細胞毒性要比這些長春花生物堿強約 200-1000倍。在另一個特定實施方式中，藥物為AEFP。在一些實施方式中，抗體可以偶聯(lián)到其他小分子或蛋白毒素上，例如但不限于， 相思豆毒素、番木鱉堿、毒芹素、白喉毒素、蟾毒素、波特淋菌毒素、志賀毒素、內(nèi)毒素、破傷 風毒素、百日咳毒素、炭疽熱毒素、霍亂毒素、鐮葉芹醇、伏馬毒素Bi、伏馬毒素B2、α毒 素、莫魯蝎毒素、蝎毒素(agitoxin)、卡律(布德)蝎毒素、瑪格(斑蝎)毒素、斯洛毒素 (slotoxin)、錫拉蝎毒素(scyllatoxin)、胡符毒素(hefutoxin)、鈣抑蛋白、太卡毒素、鈣 阻蛋白、格爾德霉素(Geldanamycin)、白樹素(Gelonin)、百脈根甙(Iotaustralin)、赭曲 霉毒素A、棒曲霉素、蓖麻毒素、士的寧(Mrychnine)、單端孢霉烯、玉米烯酮和河豚毒素。毒素、間隔分子、接頭分子、延伸分子等及其結(jié)構的進一步例子可以在下列 文獻中找到美國專利申請公報 2006/0074008AU2005/0238649AU2005/0123536AU 2005/0180972Α1、2005/0113308Α1、2004/0157782Α1、美國專利第 6，884，869B2 號、美國專 利第5，635，483號，其全文都以引用的方式納入本文。如本發(fā)明所述，用于偶聯(lián)到本發(fā)明抗體偶聯(lián)物上的化合物可包括傳統(tǒng)的化療劑， 例如阿霉素、紫杉醇、卡鉬、美法侖、長春花生物堿、甲氨喋呤、絲裂霉素C、依托泊苷以及其 他。另外，可以用條件性穩(wěn)定的接頭將例如CC1065類似物、加里剎霉素、美坦素、多拉司他 汀10的類似物、根瘤菌素和水螅毒素等有效的試劑連接到抗體上，形成有效的免疫偶聯(lián) 物。在某些實施方式中，細胞毒性劑或細胞生長抑制劑為多拉司他汀。在更特定的實 施方式中，多拉司他汀屬于奧利斯他汀類。在本發(fā)明的一個特定實施方式中，細胞毒性劑或 細胞生長抑制劑為MMAE。在本發(fā)明的另一個特定實施方式中，細胞毒性劑或細胞生長抑制 劑為AEFP。在本發(fā)明的另一個特定實施方式中，細胞毒性劑或細胞生長抑制劑為MMAF。在其他實施方式中，本發(fā)明的抗體偶聯(lián)到改變了給定生物應答的治療劑或藥物部 分上。治療劑或藥物部分并不限于經(jīng)典化學治療劑。例如，藥物部分可為帶有所需生物活 力的蛋白或多肽。這些蛋白可包括，例如，毒素例如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假單胞菌外 毒素、霍亂毒素、或白喉毒素；蛋白例如腫瘤壞死因子、α干擾素、β干擾素、神經(jīng)生長因 子、血小板衍生生長因子、組織纖溶酶原激活劑；凋亡劑，例如TNF-α、TNF-β、AIM I (參 見國際公報 W097/33899)、AIM II(參見國際公報 WO 97/34911)、Fas 配體(Takahashi 等， 1994，J. Immunol.，6 :1567)、和VEGF(參見國際公報WO 99/23105)；血栓形成劑或抗血管 生成劑，例如血管增生抑制素或內(nèi)皮生長抑制素；或是生物應答修飾因子，例如淋巴因子 (如白細胞介素-1( “IL-1”)、白細胞介素-2( “IL-2”)、白細胞介素-4( “IL-4”)、白 細胞介素-6( “IL-6”)、白細胞介素-7( “IL-7”)、白細胞介素-9( “IL-9”)、白細胞介 素-15( “IL-15”)、白細胞介素-12( “仏-12”)、粒/巨噬細胞集落刺激因子(“GM-CSF”) 和粒細胞集落刺激因子(“G-CSF”)、或生長因子(如生長激素(“GH”)。在其他實施方式中，本發(fā)明的抗體偶聯(lián)到帶有多聚精氨酸或多聚賴氨酸殘基的多肽上。在一些實施方式中，所述多肽包含5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或更多的氨基酸 殘基。在一些實施方式中，多聚精氨酸多肽可以包含至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15 或更多的精氨酸殘基。在其他實施方式中，多聚賴氨酸多肽可包含至少5，6，7，8，9，10，11， 12，13，14，15或更多個賴氨酸殘基。在其他實施方式中，多肽可包含精氨酸和賴氨酸殘基的 任意組合。在其他實施方式中，本發(fā)明的抗體可以偶聯(lián)到治療劑上，例如放射性物質(zhì)或用于 偶聯(lián)放射金屬離子的巨環(huán)螯合劑(放射活性物質(zhì)的例子參見上文)。在某些實施方式中， 巨環(huán)螯合劑為可通過接頭分子連接到抗體上的1，4，7，10_四氮雜環(huán)十二烷-N，N'，N"， N"-四乙酸(DOTA)。這樣的接頭分子是本領域所共知的，將在本發(fā)明下文中進一步討論， 可以參見 Denardo 等，1998，Clin Cancer Res, 4 :2483-90 ；Peterson 等，1999，Bioconjug. Chem. 10 :553 ；以及 Zimmerman 等，1999，Mud. Med. Biol. 26 :943_50，上述每一篇文獻的全文 以引用的方式納入本文。在其他實施方式中，本發(fā)明的抗體偶聯(lián)到核酸上。核酸可以選自下組DNA、RNA、 短鏈干擾RNA(SiRNA)、小分子RNA、發(fā)夾或核酸模擬物例如肽核酸。在一些實施方式中，偶 聯(lián)的核酸為至少10個、至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少100 個、至少200個、至少500個、至少1000個、至少5000個或更多個堿基對。在一些實施方式 中，偶聯(lián)的核酸為單鏈的。在可選實施方式中，偶聯(lián)的核酸為雙鏈的。在一些實施方式中，偶聯(lián)的核酸編碼開放閱讀框。在一些實施方式中，偶聯(lián)的核酸 所編碼的開放閱讀框?qū)诘蛲稣T導蛋白、病毒蛋白、酶或腫瘤抑制蛋白。將這些核酸遞 送到細胞的技術可以在下面的文獻中找到，Song等.NatureBiotechnology，2005，Vol23 6p709-717以及美國專利第6，333，396號，其全文以引用的方式納入本文。將治療部分偶聯(lián)到抗體上的技術是已經(jīng)熟知的?？梢杂帽绢I域已知的任何方法 把部分偶聯(lián)到抗體上，包括但不限于，醛/席夫連接、巰基連接、酸不穩(wěn)定連接、順烏頭連 接、腙連接、酶可降解連接(通常參見Gamett，2002，Adv. DrugDeliv. Rev. 53 :171-216)。將 治療部分偶聯(lián)到抗體上的其他技術也是熟知的，參見例如1985年Alan R. Liss出版社出 版的Reisfeld等編的《單克隆抗體和癌癥治療》一書第M3-56頁中Anion等的“癌癥治 療藥物中用于免疫攻擊的單克隆抗體”一文(Anion et al.，“ Monoclonal Antibodies For ImmunotargetingOf Drugs In Cancer Therapy, " in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld. et al. (eds. ), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)) ； 1987 年馬塞爾·德克爾公司出版的Robinson等編的《受控藥物遞送》(第2版)的第623-53 頁的Hellstrom等的“用于藥物遞送的抗體”一文(Hellstrom et al.，“ Antibodies ForDrug Delivery,“ in Controlled Drug Delivery(2nd Ed. ),Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)) ； 1985 年 Pinchera 等編的《單克隆抗體的生 物和臨床應用》一書第475-506頁中Thorpe的“腫瘤治療中細胞毒性劑的抗體運載體 綜述，，(Thorpe, “ Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In CancerTherapy A Review, " in Monoclonal Antibodies Biological And ClinicalAppIications, Pinchera et al. (eds.)，pp. 475-506 (1985)) ； 1985 年學術出版社出版的 Baldwin 等編 的《用于癌癥檢測和治療的單克隆抗體》一書第303-16頁的“放射性標記的抗體在癌癥 治療中的應用分析、結(jié)果和未來預期” ("Analysis, Results, And Future ProspectiveOf The Therapeutic Use OfRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy, " in Monoclonal Antibodies For CancerDetection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Pressl985))；以及 Thorpe 等，1982，Immunol. Rev. 62 :119_58。將抗 體融合或偶聯(lián)到多肽部分上的方法是本領域已知的。參見例如美國專利第5，336，603號、 第 5，622，929 號、第 5，359，046 號、第 5，349，053 號、第 5，447，851 號和第 5，112，946 號；EP 307, 434 ；EP 367，166 ；國際公報 WO 96/04388 和 WO 91/06570 ;Ashkenazi 等，1991，PNAS 88 :10535-10539 ；Zheng 等，1995，J. Immunol. 1. 54 :5590-5600 ；以及 Vil 等，1992，PNAS 89:11337-11341。抗體和部分的融合并不必須是直接的，而可以通過接頭序列來實現(xiàn)。這 樣的接頭分子是本領域所共知的，在下列文獻中有描述=Denardo等，1998，Clin Cancer Res. 4 :2483-90 ；Peterson 等，1999，Bioconjug. Chem. 10 :553 ；Zimmerman 等，1999，Nucl. Med. Biol. 26 :943-50 ；Gamett，2002，Adv. DrugDeliv. Rev. 53 :171-216，上述每一篇文獻的 全文以引用的方式納入本文?？梢圆捎?種方式來使得本發(fā)明的抗體偶聯(lián)物在靶向的細胞外的藥物活力最小 化第一，可以采用結(jié)合到細胞膜表面受體而不是可溶受體上的抗體，使得包括通過前藥轉(zhuǎn) 換酶的作用產(chǎn)生的藥物在內(nèi)的藥物在活化的淋巴細胞的細胞表面集中。使得結(jié)合到本發(fā) 明的抗體上的藥物活力最小化的另一個方式是，以一種除非藥物從抗體上水解或切割下來 否則其活力降低的方式進行藥物偶聯(lián)?？梢圆捎眠@些方法用對活化的淋巴細胞表面的環(huán) 境(如在活化的淋巴細胞表面表達的蛋白酶活力)或當偶聯(lián)物被活化的淋巴細胞所吸收 后遇到的活化的淋巴細胞內(nèi)部環(huán)境(例如在內(nèi)涵體內(nèi)，例如由于PH敏感性或蛋白酶敏感 性等，或在溶酶體環(huán)境中)敏感的接頭把藥物連接到抗體上。能用于本發(fā)明的接頭的例子 在下列專利中公開了 美國專利申請公報第2005/0123536A1號、第2005/0180972A1號、第 2005/0113308A1號、第2004/0157782A1號、和美國專利第6，884，869B2號、所有這些文獻全 文都以引用的方式納入本文。在一個實施方式中，接頭是能在溶酶體中水解的酸不穩(wěn)定的腙或酰胼類(參見例 如美國專利第5，622，9 號)。在可選實施方式中，藥物可以通過其他酸不穩(wěn)定的接頭添加 到抗體上，例如順式烏頭酰胺、原酸酯、乙縮醛和縮酮(Dubowchik和Walker，1999，Pharm. Therapeutics 83 :67-123 ；Neville 等，1989，Biol. Chem. 264 :14653-14661)。這些接頭在 中性PH條件下是相對穩(wěn)定的，例如在血液中，但是在溶酶體近似pH等pH低于5的條件下 是不穩(wěn)定的。在其他實施方式中，用可以被胞內(nèi)蛋白酶切割的肽間隔分子將藥物連接到本發(fā) 明的抗體上。目標酶包括組織蛋白酶B和D、以及血纖維蛋白溶酶，這些酶已知都能水解 二肽藥物衍生物使得活性藥物在靶細胞內(nèi)釋放出來(Dubowchik和Walker，1999，Pharm. Therapeutics 83 :67-123)。采用胞內(nèi)蛋白水解藥物釋放的優(yōu)點在于，一旦偶聯(lián)了藥物的活 力大大削弱，并且偶聯(lián)物在血清中的穩(wěn)定性會格外的高。在又一些其他實施方式中，接頭為丙二酸接頭(Johnson等，1995. AnticancerRes. 15 :1387-93)、馬來酰亞胺苯甲酰接頭(Lau 等，1995， Bioorg-Med-Chem. 3(10) :1299-1304),或 3，-N-酰胺類似物(Lau 等，1995， Bioorg-Med-Chem. 3(103 :1305-12)。如上所述，抗體偶聯(lián)物通常是將化合物或藥物通過接頭偶聯(lián)到抗體上制成的。在本發(fā)明的偶聯(lián)物中可以使用本領域已知的任何接頭，例如雙功能劑(例如二醛或亞氨酸 酯)或支鏈腙接頭(參見如美國專利第5，擬4，805號，所述文獻的全文以引用的方式納入 本文)。在本發(fā)明的某些非限制性的實施方式中，偶聯(lián)物部分和抗體部分間的接頭區(qū)域在 某些條件下是可以切割的，其中接頭的切割或水解將藥物部分從抗體部分上釋放出來。在 一些實施方式中，接頭在胞內(nèi)條件下對切割或水解敏感。在一個實施方式中，如果pH改變一定的值或是超過一定的值，偶聯(lián)物部分和抗體 部分間的接頭區(qū)域可以被切割。在本發(fā)明的另一個實施方式中，接頭在溶酶體的環(huán)境中是 可以被切割的，例如酸性條件(即PH在5-5. 5左右或更低)。在其他實施方式中，接頭為被 肽酶或蛋白酶切割的肽基接頭，所述蛋白酶包括但不限于溶酶體蛋白酶、膜聯(lián)蛋白酶、胞內(nèi) 蛋白酶、或內(nèi)涵體蛋白酶。典型地，接頭至少長2個氨基酸，更典型地，至少長3個氨基酸。 例如，可以使用被組織蛋白酶B切割的肽基接頭(如Gly-Phe-Leu-Gly接頭)，組織蛋白酶B 是一種在癌組織中高表達的巰基依賴的蛋白酶。其他這種接頭在如美國專利第6，214，345 中有描述，所述文獻的全文以引用的方式納入本文。在本發(fā)明的其他非相互排斥的實施方式中，本發(fā)明的抗體偶聯(lián)物中用于偶聯(lián)抗體 和化合物的接頭能促進細胞內(nèi)化。在某些實施方式中，接頭-藥物部分促進細胞內(nèi)化。在 某些實施方式中，選擇接頭使得整個抗體偶聯(lián)物的結(jié)構能促進細胞內(nèi)化。在一個實施方式 中，接頭是硫醚接頭(參見例如Wi 1 Iner等的美國專利第5，622，9 號，所述文獻的全文以 引用的方式納入本文)。在另一個實施方式中，接頭為腙接頭(參見如Greenfield等的美 國專利第5，122，368號，和King等的第5，824，805號，所述文獻的全文以引用的方式納入 本文)。在又一些其他實施方式中，接頭為二硫化物接頭。本領域已知多種二硫化物接 頭，包括但不限于用SATA (N-琥珀酰亞胺基-S-乙酰基硫代醋酸酯)、SPDP (N-琥珀酰亞胺 基-3- (2-吡啶二硫代)-丙酸酯)，SPDB (N-琥珀酰亞胺基-3- (2-吡啶二硫代)-丁酸酯) 和SMPT (N-琥珀酰亞胺基-氧基羰基-α -甲基-α - (2-吡啶基二硫代)甲苯)形成的二硫 化物接頭。SPDB和 SMPT(參見如 Thorpe等，1987,Cancer Res. ,47 :5924-5931 ； 1987年牛津 大學出版社出版的C. W. Vogel編的《免疫偶聯(lián)物癌癥放射顯影和治療中的抗體偶聯(lián)物》一 書第 28-55 頁中 Wawrzynczak等的文章(Wawrzynczak et al, 1987, In Immunoconjugates Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer, ed. C. W. Vogel, Oxford U. Press, pp. 28-55)；也參見Thorpe等的美國專利第4，880，935號；所述文獻的全文以引 用的方式納入本文)?？捎糜诒景l(fā)明的組合物和方法的各種接頭在美國專利申請公報 US2004/0018194A1中有描述，所述文獻的全文以引用的方式納入本文。在本發(fā)明的又一些其他實施方式中，抗體偶聯(lián)物的接頭單元連接細胞毒性劑或細 胞生長抑制劑(藥物單元；-D)和抗體單元(-A)。在某些實施方式中，接頭單元具有通式i.-iTa-Ww-Yy-,其中ii. -T-為延伸單元；iii. a 為 O 或 1;iv. 每個-W-為獨立的氨基酸單元；
v.w為獨立的從2到12的整數(shù)vi. -Y-為間隔單元；和vii. y 為 0、1 或 2存在延伸單元(-T-)時，延伸單元將抗體單元連接到氨基酸單元(-W-)上。天然 的或經(jīng)過化學操作出現(xiàn)在抗體上的有用的功能基團包括但不限于巰基、氨基、羥基、碳水化 合物的異頭羥基、和羧基。本發(fā)明的半胱氨酸工程化抗體帶有至少一個游離的巰基用于偶 聯(lián)。導入游離巰基的其他方法包括還原抗體的胞內(nèi)二硫鍵。任選地，可以通過抗體的賴氨 酸部分與2-亞氨基硫烷(thiolane)(特羅氏試劑，Traut ‘ s reagent)或其他巰基生成試 劑反應來產(chǎn)生巰基。如果存在間隔單元，氨基酸單元(-W-)將延伸單元(-T-)連接到間隔單元(-Y-) 上；如果沒有間隔單元，該氨基酸單元(-W-)將將延伸單元連接到細胞毒性劑或細胞生長 抑制劑(藥物單元；D)上。在一些實施方式中，-Ww-為二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、 十一肽或十二肽單元。接頭單元的氨基酸單元可以被酶切割，從而釋放出藥物單元(-D)，該 藥物單元在體內(nèi)釋放后發(fā)生質(zhì)子化來提供細胞毒性藥物(D)，所述酶包括但不限于腫瘤相 關蛋白酶。在一個實施方式中，氨基酸單元為苯丙氨酸-賴氨酸二肽(phe-lys或Π(接頭)。 在另一個實施方式中，氨基酸單元為纈氨酸-瓜氨酸二肽(val-cit或VC接頭)。存在間隔單元(-Y-)時，間隔單元將氨基酸單元連接到藥物單元上。有兩種普通 間隔單元自我犧牲型或非自我犧牲型。非自我犧牲型間隔單元是在從抗體-接頭-藥物 偶聯(lián)物或藥物-接頭復合物上酶切去除氨基酸單元后，一部分或全部間隔單元還結(jié)合在藥 物單元上的間隔單元。非自我犧牲型間隔單元的例子包括但不限于(甘氨酸-甘氨酸)間 隔單元和甘氨酸間隔單元。當帶有甘氨酸-甘氨酸間隔單元或甘氨酸間隔單元的本發(fā)明的 抗體-接頭-藥物偶聯(lián)物經(jīng)腫瘤細胞相關蛋白酶、癌癥細胞相關蛋白酶或淋巴細胞相關蛋 白酶進行酶切后，甘氨酸-甘氨酸-藥物部分或甘氨酸-藥物部分從A-T-Ww-上切割下來。 為了釋放藥物，可以在靶細胞內(nèi)發(fā)生獨立的水解反應來切割甘氨酸-藥物單元鍵。自我犧牲型間隔分子的其他例子包括但不限于與PAB基團電子相等的芳香族化 合物，例如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(例子參見Hay等，Bioorg. Med. Chem. Lett.，1999， 9,2237)和鄰-或?qū)?氨基芐甲基乙縮醛。可以使用在酰胺鍵水解后很容易發(fā)生環(huán)化的間隔 分子，例如取代的或非取代的4-氨基丁酸酰胺(Rodrigues等，Chemistry, Biology, 1995， 2，223)、合適取代的環(huán)系統(tǒng)(Storm等，J. Amer. Chem. Soc, 1972，94，5815)和2-氨基苯基丙 酸酰胺(Amsberry等，J. Org. Chern.，1990，55，5867)。去除在甘氨酸的α位點取代的含胺 藥物(Kingsbury等，J. Med. Chem.，1984，27，1447)也是能用于本發(fā)明的抗體_接頭-藥物 偶聯(lián)物的自我犧牲型間隔分子策略的例子。將異源分子偶聯(lián)到抗體的方法異源分子(如本文所述的分子)能通過工程化半胱氨酸殘基提供的游離巰基有效 地偶聯(lián)到本發(fā)明的抗體上。在一個方面，本發(fā)明提供了將異源分子有效偶聯(lián)到半胱氨酸工 程化抗體上的方法。在一個實施方式中，異源分子的偶聯(lián)可以發(fā)生在選自下組位點的至少 一個工程化半胱氨酸殘基提供的游離巰基上抗體的CHl結(jié)構域的131，132，133，134，135，136，137，138和139位點。在其他實施方式中，本發(fā)明的方法包含異源分子有效地偶聯(lián)到 選自下組位點的至少一個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個或 至少8個工程化半胱氨酸殘基提供的游離巰基上抗體的CHl結(jié)構域的131，132，133，134， 135，136，137，138，和 139 位點。工程化改造將非天然存在的半胱氨酸殘基導入抗體上可改變重鏈和輕鏈的二硫 鍵配對，使得作為二硫鍵一部分的天然存在的半胱氨酸殘基釋放出來，并且呈現(xiàn)出能偶聯(lián) 的游離巰基。在另一個實施方式中，所述方法包括使異源分子在不是由選自下組的位點的 至少一個工程化半胱氨酸殘基提供的游離巰基上有效地偶聯(lián)到半胱氨酸工程化抗體抗體 的 CHl 結(jié)構域的 131，132，133，134，135，136，137，138 和 139 位點?？梢杂酶鞣N本領域接受的技術來測定抗體中游離巰基的存在，例如在實施例1中 所述的技術。通過評估偶聯(lián)反應后留存的游離巰基，可以確定異源分子偶聯(lián)到抗體上的效 率。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了將異源分子有效偶聯(lián)到半胱氨酸工程化抗體上的方 法。在一個實施方式中，通過檢測偶聯(lián)反應后留存的游離巰基的水平，測得的偶聯(lián)效率為 至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至 少45 %、至少50 %、至少55 %、至少60 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少 90%、至少95%、至少98%或更高。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了將異源分子偶聯(lián)到抗體上的方法，其中抗體 包含至少一個氨基酸取代，從而形成2個或更多的游離巰基。在另一個實施方式中，該方法 包含含有至少1個氨基酸取代的抗體，從而形成至少2個、至少4個、至少6個、至少8個、 至少10個、至少12個、至少14個、至少16個或更多的游離巰基。能偶聯(lián)的本發(fā)明的抗體可包含巰基被封閉或加帽的游離半胱氨酸殘基。這樣的帽 包括蛋白、肽、離子或其他與巰基相互作用并且防止或抑制偶聯(lián)物形成的物質(zhì)。在一些實施 方式中，在偶聯(lián)反應前，需要對本發(fā)明的抗體進行脫帽。在特定實施方式中，本發(fā)明的抗體 脫帽并且展示出能進行偶聯(lián)的游離巰基。在其他特定實施方式中，本發(fā)明的抗體進行了脫 帽反應，該反應不會打亂或重新安排天然存在的二硫鍵。在其他實施方式中，本發(fā)明的抗體 進行了如實施例9或10中所示的脫帽反應。在一些實施方式中，本發(fā)明的抗體可以進行偶聯(lián)反應，其中待偶聯(lián)的抗體濃度為 至少lmg/ml、至少ang/ml、至少3mg/rnl、至少4mg/ml、至少5mg/ml或更高。使用抗體偶聯(lián)物的方法可以預期，本發(fā)明的抗體偶聯(lián)物可用于治療各種疾病或病癥，如具有過表達腫瘤 抗原的特性的病癥。疾病或過度增殖病癥的例子包括良性或惡性腫瘤、白血病、淋巴惡性 腫瘤。其他疾病包括神經(jīng)、神經(jīng)膠質(zhì)、星形膠質(zhì)細胞、下丘腦、腺體、巨噬細胞、上皮細胞、內(nèi) 皮細胞或基質(zhì)惡性腫瘤。其他癌癥或過度增殖病癥包括頭、頸、眼、嘴、喉、食道、胸、皮膚、 骨、肺、結(jié)腸、直腸、結(jié)腸直腸、胃、脾、腎、骨骼肌、皮下組織、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、子宮內(nèi)膜、前 列腺、乳房、卵巢、睪丸、甲狀腺、血液、淋巴結(jié)、腎、肝、胰腺、腦或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的癌癥?？?以用本發(fā)明的方法預防、控制、治療或改善的癌癥的例子包括但不限于頭、頸、眼、嘴、喉、食 道、胸、骨、肺、結(jié)腸、直腸、胃、前列腺、乳房、卵巢、腎、肝、胰腺和腦的癌癥。其他癌癥包括 但不限于下列癌癥白血病例如但不限于急性白血病，急性淋巴細胞白血病，急性髓細胞 白血病例如成髓細胞、前髓細胞、髓單核細胞、單核細胞、紅細胞白血病和骨髓發(fā)育異常綜合征，慢性白血病例如但不限于慢性髓細胞(粒細胞)白血病、慢性淋巴細胞白血病、毛 細胞白血病；真性紅細胞增多癥；淋巴瘤例如但不限于何杰金氏病、非何杰金氏?。欢喟l(fā)性 骨髓瘤例如但不限于冒煙型(smoldering)多發(fā)性骨髓瘤、非分泌型骨髓瘤、骨硬化性骨 髓瘤、漿細胞性白血病、孤立性漿細胞瘤和髓外漿細胞瘤；Waldenstrom巨球蛋白血癥；未 確定顯著性的單克隆免疫球蛋白病；良性單克隆免疫球蛋白??；重鏈??；骨癌和結(jié)締組織 肉瘤例如但不限于骨肉瘤、骨髓瘤骨病、多發(fā)性骨髓瘤、膽脂瘤誘導的骨肉瘤、骨佩吉特氏 (Paget' s)病、骨肉瘤、軟骨肉瘤、尤文氏(Ewing’ s)肉瘤、惡性巨細胞腫瘤、骨纖維肉瘤、 脊索瘤、骨膜肉瘤、軟組織肉瘤、血管肉瘤(血管肉瘤)、纖維肉瘤、卡波西氏肉瘤、平滑肌 肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、神經(jīng)鞘瘤、橫紋肌瘤和滑膜肉瘤；腦腫瘤例如但不限于，神經(jīng) 膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、室鼓膜瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、非膠質(zhì)腫瘤、聽神經(jīng)瘤、 顱咽管瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、腦脊膜瘤、松果體細胞瘤、成松果體細胞瘤和原發(fā)性腦淋巴瘤； 乳腺癌包括但不限于，腺癌、小葉(小細胞)癌、導管內(nèi)癌、髓樣乳腺癌、乳腺粘液腺癌、管 狀乳腺癌、乳頭狀乳腺癌、佩吉特氏病(包括青少年佩吉特氏病)和炎性乳腺癌；腎上腺癌 例如但不限于嗜鉻細胞瘤和腎上腺皮質(zhì)癌；甲狀腺癌例如但不限于乳突狀或濾泡狀甲狀腺 癌、髓樣甲狀腺癌和退化發(fā)育型甲狀腺癌；胰腺癌例如但不限于，胰島瘤、促胃液素瘤、胰升 血糖素瘤、舒血管腸肽瘤(vipoma)、生長抑制素分泌型腫瘤、以及良性腫瘤或胰島細胞瘤； 垂體癌例如但不限于庫欣氏(Cushing’ s)病、泌乳刺激素分泌型腫瘤、肢端肥大癥和尿崩 癥(diabetes insipius)；眼癌例如但不限于，眼黑色素瘤例如虹膜黑色素瘤、脈絡膜黑色 素瘤和睫狀體黑色素瘤，以及視網(wǎng)膜母細胞瘤；陰道癌例如鱗狀細胞癌、腺癌、黑色素瘤； 外陰癌例如鱗狀細胞癌、黑色素瘤、腺癌、基底細胞癌、肉瘤和佩吉特氏病；宮頸癌例如但不 限于鱗狀細胞癌和腺癌；子宮癌例如但不限于子宮內(nèi)膜癌和子宮肉瘤；卵巢癌例如但不限 于，卵巢上皮細胞癌、交界瘤、生殖細胞腫瘤和間質(zhì)瘤；食道癌例如但不限于，鱗狀細胞癌、 腺癌、腺樣囊性癌、粘液表皮樣癌、腺樣鱗狀細胞癌、肉瘤、黑色素瘤、漿細胞瘤、疣狀癌和燕 麥細胞(小細胞)癌；胃癌例如但不限于，腺癌，蕈傘型(息肉型)、潰瘍型、淺表擴散型、廣 泛擴散型、惡性淋巴瘤，脂肪肉瘤、纖維肉瘤和癌肉瘤；結(jié)腸癌；直腸癌；肝癌例如但不限于 肝細胞癌和肝母細胞瘤，膽囊癌例如腺癌，膽管癌例如但不限于乳突狀、結(jié)節(jié)型或彌散性膽 管癌；肺癌例如非小細胞肺癌、鱗狀細胞癌(表皮樣癌)、腺癌、大細胞癌和小細胞肺癌；睪 丸癌例如但不限于生殖細胞腫瘤、精原細胞瘤、未分化睪丸癌(anaplastic)、經(jīng)典(典型) 睪丸癌、精母細胞睪丸癌、非精原細胞癌、胚胎性癌、畸胎瘤癌、絨毛膜癌(卵黃囊瘤)；前列 腺癌例如但不限于，腺癌、平滑肌肉瘤和橫紋肌肉瘤；陰莖癌；口腔癌例如但不限于鱗狀細 胞癌、基底細胞癌；唾液腺癌例如但不限于腺癌、粘膜表皮樣癌、腺樣囊性癌；咽癌例如但 不限于鱗狀細胞癌和疣狀癌；皮膚癌例如但不限于基底細胞癌、鱗狀細胞癌和黑色素瘤，淺 表擴散型黑色素瘤、結(jié)節(jié)型黑色素瘤、惡性雀斑樣痣黑色素瘤、肢端著色斑性黑素瘤 ’腎癌 例如但不限于，腎細胞癌、腺癌、腎上腺樣瘤、纖維肉瘤、移行細胞癌(腎盂和/或輸尿管)； 威姆氏瘤；膀胱癌例如但不限于移行細胞癌、鱗狀細胞癌、腺癌、癌肉瘤。另外，癌癥包括粘 液肉瘤、骨源性肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管內(nèi)皮細胞肉瘤、間皮瘤、滑膜瘤、成血管細胞瘤、上皮 癌、囊腺癌、支氣管肺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌和乳頭狀腺癌(這些病癥的綜述參見 1985年費城利平科特出版社出版的Fishman等的《藥學》第2版(Fishman et al, 1985， Medicine. 2d Ed.，J. B. Lippincott Co.，Philadelphia)和 1997 年美國企鵝出版社出版的Murphy等的《知情決定癌癥診斷、治療和恢復全書》(Murphy et al.，1997，Informed Decisions TheCompIete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U. S. A. , Inc. , United States of America))。也可以予頁其月，凋亡 失常導致的癌癥也可用本發(fā)明的方法和組合物來進行治療。這些癌癥可包括但不限于濾泡 性淋巴瘤、P53突變的癌癥、激素依賴的乳腺、前列腺和卵巢腫瘤、以及癌癥前期損傷例如家 族性腺瘤性息肉病和骨髓增生異常綜合征。本發(fā)明的蛋白和含有所述蛋白的組合物可用于多種應用，例如對各種慢性和急性 疾病和病癥的治療，所述病癥包括但不限于自身免疫疾病和/或炎癥疾病，包括修格連氏 綜合征(Sjogren’ s syndrome)、風濕性關節(jié)炎、牛皮癬樣狼瘡、動脈硬化癥、糖尿病和其他 視網(wǎng)膜病、晶狀體后纖維增生癥、增齡性黃斑變性、新生血管型青光眼、血管瘤、甲狀腺肥大 (包括葛瑞夫茲氏癥)、角膜或其他組織移植、和慢性炎癥、膿血癥、風濕性關節(jié)炎、腹膜炎、 克羅恩氏病、再灌注損傷、敗血病、內(nèi)毒素休克、囊性纖維化、心內(nèi)膜炎、牛皮癬、關節(jié)炎(如 銀屑病關節(jié)炎)、過敏性休克、器官缺血、再灌注損傷、脊髓損傷和同種異體移植物排斥。自 身免疫病和炎癥的其他例子包括但不限于，斑禿、強直性脊柱炎、抗磷脂綜合征、自身免疫 性愛迪生病、腎上腺的自身免疫病、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性肝炎、自身免疫性 卵巢炎和睪丸炎、修格連氏綜合征、牛皮癬、動脈硬化癥、糖尿病和其他視網(wǎng)膜病、晶狀體后 纖維增生癥、增齡性黃斑變性、新生血管型青光眼、血管瘤、甲狀腺肥大(包括葛瑞夫茲氏 癥)、角膜或其他組織移植、和慢性炎癥、膿血癥、風濕性關節(jié)炎、腹膜炎、克羅恩氏病、再灌 注損傷、敗血病、內(nèi)毒素休克、囊性纖維化、心內(nèi)膜炎、牛皮癬、關節(jié)炎(如銀屑病關節(jié)炎)、 過敏性休克、器官缺血、再灌注損傷、脊髓損傷和同種異體移植物排斥，自身免疫性血小板 減少癥、白塞病(Behcet’ s disease)、大皰性類天皰瘡、心肌癥、脂肪痢皮炎、慢性疲勞免 疫功能失調(diào)綜合征(CFIDS)、慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病、Churg-Strauss綜合征、 疤痕性類天皰瘡、CREST綜合征、冷凝集素病、克羅恩病、盤狀狼瘡、原發(fā)性混合型冷球蛋白 血癥、纖維肌痛(fibromyalgia)-纖維肌炎、血管球性腎炎、葛瑞夫茲氏癥、格林巴利綜合 征(Guillain-Barre)、橋本甲狀腺炎、特發(fā)性肺纖維化、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、 IgA神經(jīng)病、幼年型關節(jié)炎、扁平苔癬、紅斑狼瘡、美尼爾氏病(Meniere，s disease)、混合 結(jié)締組織病、多發(fā)性硬化、I型或免疫介導的糖尿病、重癥肌無力、尋常性天皰瘡、惡性貧 血、結(jié)節(jié)性多動脈炎、多軟骨炎(polychrondritis)、多腺體綜合征、風濕性多肌痛、多肌炎 和皮肌炎、原發(fā)性血液丙球蛋白缺乏、原發(fā)性膽管硬化、牛皮癬、銀屑性關節(jié)炎、雷諾氏現(xiàn) 象(Raynauld’ s phenomenon)、賴特綜合征(Reiter’ s syndrome)、風濕性關節(jié)炎、肉狀 瘤病、硬皮病、修格連氏綜合征、僵硬綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、紅斑狼瘡、高安氏動脈炎、 顳動脈炎/巨細胞動脈炎、潰瘍性結(jié)腸炎、葡萄膜炎、脈管炎例如皮炎皰疹樣脈管炎、白癜 風和韋格納肉芽腫(Wegener's granulomatosis)。炎癥的例子包括但不限于哮喘、腦炎 (enc印hilitis)、炎性腸病、慢性阻塞性肺病(COPD)、過敏性病癥、敗血癥性休克、肺纖維 化、未分化脊柱關節(jié)病、未分化關節(jié)病、關節(jié)炎、炎性骨質(zhì)溶解和由慢性病毒或細菌感染引 起的慢性炎癥。本發(fā)明的組合物和方法可與一種或多種用于預防、控制或治療上述疾病的 傳統(tǒng)治療一起使用。本發(fā)明還提供了使用抗體和/或抗體偶聯(lián)物來使各種傳染性病原失去活性的方 法，所述傳染性病原例如病毒、真菌、真核微生物和細菌。在一些實施方式中，可用本發(fā)明
39的抗體或抗體偶聯(lián)物使RSV、hMPV、PEV或流感病毒失活。在其他實施方式中，可用本發(fā) 明的抗體和/或抗體偶聯(lián)物使真菌病原體失活，例如但不限于阿米巴原蟲(Naegleria)、 曲霉菌(Aspergillus)、子囊酵母菌(Blastomyces)、組織胞漿菌(Histoplasma)、假絲酵 母(Candida)或癬屬(Tinea)的成員。在其他實施方式中，可用本發(fā)明的抗體或抗體偶 聯(lián)物使真核微生物失活，例如但不限于梨形鞭毛蟲(Giardia)、弓形蟲(Toxoplasma)、瘧 原蟲(Plasmodium)、克氏錐蟲(Trypanosoma)和內(nèi)阿米巴蟲(Entamoeba)屬的成員。在 其他實施方式中，可用本發(fā)明的抗體或抗體偶聯(lián)物使細菌病原體失活，例如但不限于葡 萄球菌(Staphylococcus)、鏈球菌(Streptococcus)、假單胞菌(Pseudomonas)、梭菌 (Clostridium)、包柔氏螺旋體菌(Borrelia)、弧菌(Vibro)、奈瑟氏菌(Neiserria)屬的成 員O 本發(fā)明的抗體和/或抗體偶聯(lián)物以及帶有同樣物質(zhì)含有所述抗體和/或抗體偶聯(lián) 物的的組合物可用于各種目的，例如多余作為治療劑用于各種慢性和急性疾病和病癥的治 療，包括但不限于包括病毒性、細菌性和真菌性疾病等傳染病。病毒病原體的例子包括但不 限于腺病毒科(如哺乳動物腺病毒和禽腺病毒)、皰疹病毒科(如單純皰疹病毒1、單純皰疹 病毒2、單純皰疹病毒5和單純皰疹病毒6)、光滑病毒科(如光滑病毒、腸桿菌噬菌體MS2、 同分異構光滑病毒(allolevirus))、痘病毒科(如脊椎動物痘病毒亞科、副痘病毒、禽痘病 毒、山羊痘病毒、兔痘病毒、豬痘病毒、軟疣痘病毒和昆蟲痘病毒亞科)、乳多空病毒科(如 多瘤病毒和乳頭瘤病毒)、副粘病毒科(如副粘病毒、副流感病毒1)、麻疹病毒屬(如麻疹 病毒)、腮腺炎病毒屬(如腮腺炎病毒)、肺病毒科(如肺病毒、人呼吸道合胞病毒)、偏肺病 毒(如鳥偏肺病毒和人偏肺病毒)、小核糖核酸病毒科(如腸道病毒、鼻病毒、感肝病毒(如 人甲肝病毒)、心病毒和口蹄疫病毒)、呼腸孤病毒科(如正呼腸孤病毒、環(huán)狀病毒、輪狀病 毒、質(zhì)型多角體病毒、斐濟病毒、植物呼腸孤病毒和水稻病毒)、逆轉(zhuǎn)錄病毒科(如哺乳動物 B型逆轉(zhuǎn)錄病毒、哺乳動物C型逆轉(zhuǎn)錄病毒、鳥C型逆轉(zhuǎn)錄病毒、D型逆轉(zhuǎn)錄病毒、BLV-HTLV 逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒(如人免疫缺陷病毒1和人免疫缺陷病毒幻、泡沫病毒)、黃病毒科(如 丙肝病毒)、嗜肝DNA病毒科(如乙肝病毒)、披膜病毒科(如α病毒(如辛德畢斯病毒) 和風疹病毒屬(如風疹病毒))、彈狀病毒科(如水泡病毒、狂犬病毒、短時熱病毒、質(zhì)型彈 狀病毒和粒外彈狀病毒)、沙粒病毒科(如沙粒病毒、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒、愛皮 病毒和拉沙熱病毒)，以及冠狀病毒科(如冠狀病毒和曲狀環(huán)曲病毒)。細菌病原體的例子 包括但不限于，水生螺旋菌家族(AquaspiriIlum family)、固氮螺旋菌家族(Azospirillum family)、固氮菌家方矣(Azotobacteraceae family)、擬桿菌家方矣(Bacteroidaceae family)、巴爾通體類(Bartonella species)、蛭弧菌家族(Bdellovibrio family)、 彎曲桿菌類(Campylobacterspecies)、衣原體類(Chlamydia species)(如肺炎衣原 體(Chlamydia pneumoniae))、梭菌、腸桿菌家方矣(Enterobacteriaceae family)(如 枸櫞酸桿菌類(CitrcAacter species)、愛德華氏菌(Edwardsiella)、產(chǎn)氣腸桿菌 (Enterobacter aerogenes)、歐文氏桿菌類(Erwinia species)、大腸桿菌(Escherichia coli)、哈夫尼菌類(Hafnia species)、克雷伯氏菌類(Klebsiella species)、摩爾 根氏菌類(Morganella species)、普通變形桿菌(Proteus vulgaris)、普羅威登斯 菌(Providencia)、沙門氏菌類(Salmonella species)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcesecns)和福氏志賀菌(Shigellaflexneri))、力口德納氏菌家族(Gardinellafamily)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、嗜鹽菌家族(Halobacteriaceae family)、螺桿菌家方矣(Helicobacter family)、軍團菌家方矣(Legionallaceae family)、 李其i 特菌類(Listeria species)、甲基球菌家方矣(Methylococcaceae family)、結(jié)核菌 (如結(jié)核性分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis))、奈瑟氏菌家族(Neisseriaceae family)、海洋螺菌家族(Oceanospirillumfamily)、巴其Jf 德菌家族(Pasteurellaceae family)、月市炎球菌類(Pneumococcus species，、假單胞菌類(Pseudomonas species)、 根瘤菌家族(Rhizobiaceae family)、螺旋菌家族(Spirillum family)、無毛螺旋菌家 族(Spirosomaceae family)、葡萄球菌Gtaphylococcuss (如耐甲氧西林的金黃色葡萄 球菌(Staphylococcus aureus)禾口化月農(nóng)性葡萄球菌(Staphylococcus pyrogenes))、鏈 球菌屬(Streptococcus)(如腸炎鏈球菌(Streptococcusenteritidis)、Streptococcus fasciae禾口月市炎鏈球菌(Sti^ptococcus pneumoniae))、蝙蝠弧菌屬螺旋桿菌家族 (Vampirovibr Helicobacter family)以及蝙蝠弧菌家方矣(Vampirovibriofamily)。 真菌病原體的例子包括但不限于，犁頭霉菌家族(Absidia species)(如傘枝犁頭霉 (Absidia corymb if era)禾口分枝犁頭霉(Absidia ramosa))、曲霉菌類(Aspergillus species)(如黃曲霉(Aspergillus flavus)、煙曲菌(Aspergillus fumigatus)、構巢曲霉 (Aspergillus nidulans)、漂曲霉(Aspergillus niger)、土曲霉(Aspergillusterreus))、 魅獎霉(Basidiobolus ranarum)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、念珠菌類 (Candida species)(如白色念珠菌(Candida albicans)、光滑念珠菌(Candidaglabrata)、 克爾念珠菌(Candida kerr)、克柔念珠菌(Candida krusei)、近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)、偽熱帶念珠菌(Candida pscudotropicalis)、季也蒙假絲酵母(Candida quillermondii)、鮍褶假絲酵母(Candida rugosa)、類星形念珠菌(Candidastellatoidea) 和熱帶假絲酵母(Candida tropicalis))、粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis)、耳霉 菌類(Conidiobolus species)、新型隱球菌(Cryptococcus neoforms)、克銀漢霉類 (Cunninghamella species)、皮膚真菌、莢膜組織胞楽菌(Histoplasmacapsulatum)、 膏樣小孢子菌(Microsporum gypseum)、微小毛霉菌(Mucor pusillus)、巴西芽生菌 (Paracoccidioides brasiliensis)、波氏假阿利什菌(Pseudallescheria boydii)、西伯 鼻抱子菌(Rhinosporidium seeberi)、卡氏月市抱子菌(Pneumocystis carinii)、根毒菌類 (Rhizopus species)(如少根根霉(Rhizopus arrhizus)、米根霉菌(Rhizopus oryzae) 禾口小孢根霉(Rhizopus microsporus))、酵母類(Saccharomyces species)、申克孢子絲菌 (Sporthrix schenckii)、接合菌、以及例如接合菌(Zygomycetes)、子囊菌(Ascomycetes)、 擔子菌(Basidiomycetes)、半知菌(Deuteromycetes)禾口卵毒菌(Oomycetes)等類型。本發(fā)明還提供了使用抗體來消耗細胞群的方法。在一個實施方式中，本發(fā)明的方 法用于消耗下列細胞類型嗜伊紅細胞、嗜堿細胞、嗜中性粒細胞、T細胞、B細胞、肥大細 胞、單核細胞、內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞。本發(fā)明的抗體及其偶聯(lián)物也可用于這些疾病的癥狀的診斷和檢測。在另一個實施 方式中，本發(fā)明的組合物可用于監(jiān)測疾病的進程。在另一個實施方式中，本發(fā)明的組合物可 用于監(jiān)測治療方案。在另一個實施方式中，本發(fā)明的組合物可在離體應用中用于診斷，例如 診斷試劑盒。本發(fā)明的組合物可用于使靶抗原可視化。在一些實施方式中，靶抗原為內(nèi)化的細
41胞表面受體。在其他實施方式中，靶抗原為細胞內(nèi)抗原。在其他實施方式中，靶抗原為核內(nèi) 抗原。在一個實施方式中，本發(fā)明的抗體或抗體-藥物偶聯(lián)物一旦結(jié)合即內(nèi)化進入細 胞，如本文所述，其中內(nèi)化比對照抗體高至少約10 %、至少約20 %、至少約30 %、至少約 40 %、至少約40 %、至少約50 %、至少約60 %、至少約70 %、至少約80 %、至少約90 %、至少 約100%、至少約110%、至少約130%、至少約140%、至少約150%、至少約160%、或至少 約 170%。在另一個實施方式中，本發(fā)明的抗體一旦結(jié)合就內(nèi)化進入細胞。如本文所述，其中 內(nèi)化比對照抗體高 1_10%、10% -20%,20% -30%,30-40%,40-50%,50-60%,60-70%, 70-80 80-90 90-100 %,100-110 %,110-120 %,120-130 % ,130-140 %,140-150 150-160% ,160-170% ο在另一個實施方式中，本發(fā)明的抗體一旦結(jié)合就內(nèi)化進入細胞，用第二抗體的 內(nèi)化測試測得其內(nèi)化比對照抗體高1_10%、10% -20 %,20 % -30 %,30-40 %,40-50 %, 50-60 60-70 70-80 80-90 90-100 %、100-110 %、110-120 %,120-130 130-140 %、140-150 %、150-160 %、160-170 %。藥物組合物在另一個方面，本發(fā)明提供了組合物，例如但不限于藥物組合物，所述組合物含有 與藥學上可接受的運載體配制在一起的一種或多種本發(fā)明的抗體或抗體偶聯(lián)物，或其組 合。這些組合物可包含本發(fā)明的一種抗體，或者含有例如但不限于兩種或更多種本發(fā)明的 不同抗體的組合。例如，本發(fā)明的藥物組合物可包含能結(jié)合靶抗原上不同表位或是具有補 足活力的抗體的組合。本發(fā)明的藥物組合物還可在組合治療中進行給藥，例如與其他試劑混合。例如，組 合治療可包括本發(fā)明的抗體與至少一種其他療法的組合，其中所述治療可為外科手術、免 疫治療、化療、放射治療或藥物治療。本發(fā)明的藥物復合物可包括一個或多個藥學上可接受的鹽。這些鹽的例子包括酸 加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括來源于無毒無機酸的鹽，例如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫 溴酸、氫碘酸、亞磷酸等等，以及來源于無毒有機酸的鹽，例如脂肪族單羧酸和脂肪族二羧 酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳香酸、脂肪族和芳香族磺酸等等。堿加成鹽包括來 源于堿土金屬的鹽，例如鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽等等，以及來源于無毒有機胺的鹽，例如N， N’ - 二芐基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等等。本發(fā)明的藥物組合物還可包括藥學上可接受的抗氧化劑。藥學上可接受的抗氧化 劑包括(1)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、半胱氨酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞 硫酸鈉等等；( 油溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基羥基茴香醚(BHA)、丁基羥 基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等等；以及C3)金屬螯合劑，例如檸檬酸、 乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等等。可用于本發(fā)明的藥物組合物的合適的水性或非水性運載體的例子包括水、乙醇、 多羥基化合物(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等等)，以及上述物質(zhì)的合適混合物，例如橄欖 油等植物油，以及如油酸乙酯等可注射的有機酯。合適的流動性可通過使用包裝材料(如 卵磷脂)、維持所需的顆粒大小(對于分散體系而言)、以及通過使用表面活性劑來維持。
這些組合物也可包含佐劑例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。可以通過殺菌程 序和加入各種抗細菌和抗真菌劑來保證阻止微生物的出現(xiàn)，所述抗細菌和抗真菌劑例如對 羥基苯甲酸酯(paraben)、氯丁醇、苯酚山梨酸等等。也可適當?shù)叵蚪M合物中加入等滲劑，例 如糖、氯化鈉等等。此外，可通過加入例如單硬脂酸鋁和明膠等延長吸收的試劑來延長可注 射的藥物形式的吸收。藥物組合物通常必須在制造和儲存條件下是無菌的且穩(wěn)定的。組合物可配制成溶 液、微乳化液、脂質(zhì)體或其他適合達到高藥物濃度的有序結(jié)構。運載體可為溶劑或分散介 質(zhì)，含有如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等等)，以及上述物質(zhì)的合適 混合物。合適的流動性可通過使用包裝材料(如卵磷脂)、維持所需的顆粒大小(對于分散 體系而言)、以及通過使用表面活性劑來維持在很多情況下，也可適當?shù)叵蚪M合物中加入等 滲劑，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇和氯化鈉等。此外，可通過加入例如單硬脂酸鋁和明 膠等延長吸收的試劑來延長可注射的藥物形式的吸收?？梢酝ㄟ^向含有上面列舉的一種成分或成分組合的合適溶劑中加入所需量的活 性化合物，接著按需要進行除菌微過濾來制備無菌可注射溶液。通常，可以通過將活性化合 物加入到含有基礎(basic)分散介質(zhì)和上述的其他所需成分的無菌載體中來制備分散體 系。對于用于配制無菌可注射溶液的無菌粉末，優(yōu)選制備方法為真空干燥和冷凍干燥(凍 干)來從原先的無菌過濾后的溶液得到活性成分加上任何其他所需成分的粉末。在一個實施方式中，本發(fā)明的組合物為基本不含內(nèi)毒素和/或相關熱原物質(zhì)的不 含熱原的制劑。內(nèi)毒素包括被限制在微生物內(nèi)并且當微生物被分解或死亡時釋放出來的毒 素。熱原物質(zhì)還包括來源于細菌和其他微生物外膜的誘導發(fā)燒的、熱穩(wěn)定物質(zhì)(糖蛋白)。 如果給予人，這兩類物質(zhì)都能導致發(fā)燒、血壓過低和休克。由于潛在的有害作用，優(yōu)選從經(jīng) 靜脈內(nèi)給藥的藥物溶液中去除掉即使是少量的內(nèi)毒素。食品和藥物管理局(FDA)設定了單 次1小時時間內(nèi)靜脈內(nèi)藥物使用的上限為每劑每公斤體重每劑5個內(nèi)毒素單位(EU)(《美美 國藥典委員會藥典論壇〉〉(The United States Pharmacopeial Convention,Pharmacopeial Forum) 26(1) :223(2000)) 0當以數(shù)百或上千毫克每公斤體重的量來給予治療性蛋白時， 優(yōu)選去除掉即使痕量的內(nèi)毒素。在一個實施方式中，組合物中內(nèi)毒素和熱原的水平為低 于10EU/mg、或低于5EU/mg，、或低于lEU/mg、或低于0. lEU/mg、或低于0. 01EU/mg、或低于 0.001EU/mg。在另一個實施方式中，組合物中的內(nèi)毒素和熱原水平低于約10EU/mg、或低于 約5EU/mg、或低于約lEU/mg、或低于約0. lEU/mg、或低于約0. 01EU/mg、或低于約0. 001EU/ rngo在一個實施方式中，本發(fā)明包含給予組合物，其中所述給藥為口服、腸胃外、肌肉 內(nèi)、鼻內(nèi)、陰道、直腸、舌、舌下、口腔、口內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮膚、皮下或經(jīng)皮給藥。在另一個實施方式中，本發(fā)明還包含與其他治療聯(lián)合給予組合物，例如外科手術、 化療、激素治療、生物治療、免疫治療或放射治療。劑量/給藥為了制備包含本發(fā)明的抗體或抗體偶聯(lián)物的藥物或無菌組合物，將抗體/抗體 偶聯(lián)物和藥學可接受的運載體或賦形劑混合。通過與生理上可接受的運載體、賦形劑或 穩(wěn)定劑混合可將治療劑和診斷劑的制劑制成如凍干粉末、糖漿、水性溶液、洗劑或懸浮液 形式(參見如2001年紐約州紐約麥格勞-希爾公司出版的Hardman等Q001)《古德曼吉爾曼治療學的藥理學基礎》(Hardman，et al. (2001)Goodman and Oilman' s The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N. Y.) ；2000 ^f-M^} 州紐約利平科特·威廉姆斯·威爾金斯出版社出版的Germaro的《雷明頓藥學技術與實 踐〉〉(Gennaro (2000) Remington :The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, andffilkins, New York, N. Y) ； 1993年紐約馬塞爾·德克爾公司出版的Avis等 編的《藥物制劑劑型腸胃外藥物》(Avis, et al. (eds. ) (1993)PharmaceuticalDosage Forms =Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY) ；1990 $參丑^] * · 司出版的Lieberman等編的《藥物制劑劑型藥片》(Lieberman，et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms :Tablets, Marcel Dekker, NY) ; 1990 年紐約馬塞爾 德 克爾公司出版的Lieberman等編的《藥物制劑劑型分散體系》(Lieberman，et al. (eds.) (1990)Pharmaceutical Dosage Forms :Disperse Systems,Marcel Dekker,NY) ；2000年紐 約州紐約馬塞爾 德克爾公司出版的W^einer和Kotkoskie的《賦形劑毒性和安全》(Weiner and Kotkoskie (2000)Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc. , New York, N. Y.))。選擇治療劑的給藥方案依賴于幾個因素，包括實體在血清或組織中的代謝速率 (turnover rate)、癥狀水平、實體的免疫原性、以及在生物基質(zhì)內(nèi)靶細胞的可及度。在某 些實施方式中，給藥方案使遞送到患者的治療劑的量最大化，且副作用處于可接受的水 平。因此，生物遞送的量部分取決于特定實體以及所治療病癥的嚴重性?？梢缘玫竭x擇抗 體、細胞因子和小分子的合適劑量的指導(參見例如1996年英國牛津郡科學出版社出版 白勺 Wawrzynczak 白勺〈〈抗體治療〉〉(Wawrzynczak (1996)Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK) ； 1991年紐約州紐約馬塞爾·德克爾公司出版的Kresina 編的《單克隆抗體、細胞因子和關節(jié)炎》(Kresina (ed. ) (1991)MonoclonalAntibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York， N. Y.) ;1993 年紐約州紐約馬塞 爾·德克爾公司出版的Bach編的《自身免疫疾病的單克隆抗體和肽治療》(BaCh(ed.) (1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy inAutoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, N. Y.) ；Baert 等 O003)New Engl. J. Med. 348 :601-608 ；Milgrom 等 (1999) New Engl. J. Med, 341 :1966-1973 ;Slamon 等(2001) New Engl J. Med. 344 :783-792 ; Bemaminovitz 等(2000)New Engl. J. Med. 342 :613-619 ；Ghosh 等.(2003)New Engl. J. Med. 348 :24-32 ；Lipsky 等· (2000) New Engl. J. Med. 343 :1594-1602)。由臨床醫(yī)生來決定合適的劑量，例如利用本領域已知或猜測的能影響治療或預測 能影響治療的參數(shù)或因素。通常，劑量從低于最適宜劑量的量開始，并且在此后以較小的增 量提高，直到相對于任何負面副作用達到所需或最適宜效果。重要的診斷檢測包括對如炎 癥的癥狀或所產(chǎn)生的炎癥細胞因子的水平的檢測。本發(fā)明的藥物組合物中活性成分的實際劑量水平可以變化，以可以獲得針對特定 患者、組合物和給藥方式的能有效達到所需治療應答、而對患者沒有毒性的活性成分的量。 所選擇的劑量水平取決于各種藥代動力學因子，包括采用的本發(fā)明的特定組合物或其酯、 鹽或胺的活力，給藥的途徑，給藥的時間，采用的特定化合物的分泌速率，治療的持續(xù)時間， 與所采用的特定組合物聯(lián)用的其他藥物、化合物和/或物質(zhì)，所治療患者的年齡、性別、體 重、病情、健康狀況和過往病史，以及醫(yī)療領域所熟知的類似因素。
包含本發(fā)明的抗體或抗體偶聯(lián)物的組合物可以通過連續(xù)灌輸、或每劑間間隔如一 天或一周、或是每周1-7次來提供。劑量可以通過靜脈內(nèi)、皮下、局部給予、口服、鼻、直腸、 肌肉內(nèi)、腦內(nèi)或吸入給藥來提供。特定的劑量方案是包含能避免明顯不良副作用的最大劑 量或劑量頻率。每周總劑量可為至少0. 05微克/公斤體重、至少0. 2微克/公斤、至少 0. 5微克/公斤、至少1微克/公斤、至少10微克/公斤、至少100微克/公斤、至少0. 2 毫克/公斤、至少ι. O毫克/公斤、至少2. 0毫克/公斤、至少10毫克/公斤、至少25毫克 /公斤或至少50毫克/公斤(參見例如Yang等· (2003) New Engl，J. Med. 349 :427-434 ； Herold 等· (2002)New Engl, J. Med, 346 :1692-1698 ；Liu 等· (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67 :451-456 ；Portietji·· (20003)Cancer Immunol. Immunother. 52 :133_144)。齊[J 量可為至少15微克、至少20微克、至少25微克、至少30微克、至少35微克、至少40微克、 至少45微克、至少50微克、至少55微克、至少60微克、至少65微克、至少70微克、至少75 微克、至少80微克、至少85微克、至少90微克、至少95微克或至少100微克。給予對象的 劑量可共計為至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12或更多次。對本發(fā)明的抗體或抗體偶聯(lián)物，給予患者的劑量可為0. 0001毫克/公斤到100毫 克/公斤患者體重。劑量可為0.0001毫克/公斤到20毫克/公斤、0. 0001毫克/公斤到 10毫克/公斤、0. 0001毫克/公斤到5毫克/公斤、0. 0001毫克/公斤到2毫克/公斤、 0. 0001毫克/公斤到1毫克/公斤、0. 0001毫克/公斤到0. 75毫克/公斤、0. 0001毫克/ 公斤到0. 5毫克/公斤、0. 0001毫克/公斤到0. 25毫克/公斤、0. 0001-0. 15毫克/公斤、 0. 0001-0. 10 毫克 / 公斤、0. 001-0. 5 毫克 / 公斤、0. 01-0. 25 毫克 / 公斤、或 0. 01-0. 10 毫 克/公斤患者體重?？梢杂没颊唧w重的公斤數(shù)(kg)乘以毫克/公斤(mg/kg)為單位的給藥劑量計算 本發(fā)明的抗體或抗體偶聯(lián)物的用藥量。本發(fā)明的抗體的用藥量可為小于等于150微克/公 斤、小于等于125微克/公斤、小于等于100微克/公斤、小于等于95微克/公斤、小于等 于90微克/公斤、小于等于85微克/公斤、小于等于80微克/公斤、小于等于75微克/ 公斤、小于等于70微克/公斤、小于等于65微克/公斤、小于等于60微克/公斤、小于等 于陽微克/公斤、小于等于50微克/公斤、小于等于45微克/公斤、小于等于40微克/ 公斤、小于等于35微克/公斤、小于等于30微克/公斤、小于等于25微克/公斤、小于等 于20微克/公斤、小于等于15微克/公斤、小于等于10微克/公斤、小于等于5微克/公 斤、小于等于2. 5微克/公斤、小于等于2微克/公斤、小于等于1. 5微克/公斤、小于等于 1微克/公斤或小于等于0. 5微克/公斤患者體重。本發(fā)明的抗體或抗體偶聯(lián)物的單位劑量可為0. 1毫克到20毫克、0. 1毫克到15毫 克、0. 1毫克到12毫克、0. 1毫克到10毫克、0. 1毫克到8毫克、0. 1毫克到7毫克、0. 1毫 克到5毫克、0. 1毫克到2. 5毫克、0. 25毫克到20毫克、0. 25毫克到15毫克、0. 25毫克到 12毫克、0. 25毫克到10毫克、0. 25毫克到8毫克、0. 25毫克到7毫克、0. 25毫克到5毫克、 0. 5毫克到2. 5毫克、1毫克到20毫克、1毫克到15毫克、1毫克到12毫克、1毫克到10毫 克、1毫克到8毫克、1毫克到7毫克、1毫克到5毫克、或1毫克到2. 5毫克。本發(fā)明的抗體或抗體偶聯(lián)物的用藥量可以在對象中達到的血清滴度為至少0. 1 微克/毫升、至少0. 5微克/毫升、至少1微克/毫升、至少2微克/毫升、至少5微克/毫 升、至少6微克/毫升、至少10微克/毫升、至少15微克/毫升、至少20微克/毫升、至少25微克/毫升、至少50微克/毫升、至少100微克/毫升、至少125微克/毫升、至少150 微克/毫升、至少175微克/毫升、至少200微克/毫升、至少225微克/毫升、至少250微 克/毫升、至少275微克/毫升、至少300微克/毫升、至少325微克/毫升、至少350微克 /毫升、至少375微克/毫升、或至少400微克/毫升。任選地，本發(fā)明的抗體的用藥量可 以在對象中達到的血清滴度為至少0. 1微克/毫升、至少0. 5微克/毫升、至少1微克/毫 升、至少2微克/毫升、至少5微克/毫升、至少6微克/毫升、至少10微克/毫升、至少15 微克/毫升、至少20微克/毫升、至少25微克/毫升、至少50微克/毫升、至少100微克 /毫升、至少125微克/毫升、至少150微克/毫升、至少175微克/毫升、至少200微克/ 毫升、至少225微克/毫升、至少250微克/毫升、至少275微克/毫升、至少300微克/毫 升、至少325微克/毫升、至少350微克/毫升、至少375微克/毫升、或至少400微克/毫 升。本發(fā)明的抗體或抗體偶聯(lián)物的服藥可以是重復的，且給藥可以間隔至少1天、2 天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2個月、75天、3個月或至少6個月。對特定患者的有效量可以根據(jù)下列因素而有所變化，例如所治療的病情、患者 的整體健康狀況、給藥的方法途徑和劑量、以及副作用的嚴重程度(參見例如1996年佛 羅里達州博卡拉頓的國際醫(yī)藥出版公司出版的Maynard等的《藥品臨床試驗的標準操作 禾呈i￥￥ 》 (Maynard， et al. (1996)A Handbook of SOPsfor Good Clinical Practice, Interpharni Press, Boca Raton, Fla.) ；2001 年英國倫敦 Urch 出版社出版的 Dent 的 《藥品實驗室和臨床試驗管理規(guī)范》(Dent (2001)Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch PubL, London, UK))。給藥的途徑可為如局部給予或皮膚給予，經(jīng)靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦內(nèi)、肌肉內(nèi)、眼 內(nèi)、動脈內(nèi)、腦脊內(nèi)、創(chuàng)傷內(nèi)注射或灌輸，或通過緩釋系統(tǒng)或植入物(參見例如Sidman等 (1983)Biopolymers 22 :547-556 ；Langer 等(1981)J. Biomed. Mater. Res. 15 :167-277 ； Langer (1982) Chem. Tech. 12 :98-105 ；Epstein 等.(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 3688-3692 ；Hwang,等(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034;美國專利第 6，350466號和第6，316，0 號)。需要時，組合物還可包括增溶劑和局部麻醉劑，例如利多 卡因，以緩解注射位點的疼痛。另外，可以采用肺部給藥，例如使用吸入器或噴霧器并且和 氣溶膠劑配制在一起。參見例如美國專利第6，019，968號、第5，985，320號、第5，985，309 號、第 5，934，272 號、第 5，874，064 號、第 5，855，913 號、第 5，290，540 號和第 4，880，078 號； 以及 PCT 出版物 WO 92/19244,WO 97/32572,W097/44013,WO 98/31346 和 WO 99/66903，上 述每篇文獻的全文以引用的方式納入本文。在一個實施方式中，本發(fā)明的抗體、聯(lián)合治療或 組合物可以采用阿爾卡姆斯公司的AIR 肺部藥物遞送技術來進行給藥(阿爾卡姆斯有限 公司，劍橋，馬薩諸塞州(Alkermes，Inc.，Cambridge, Mass.))。本發(fā)明的組合物還可使用本領域已知的一種或多種方法來通過一種或多種給藥 途徑進行給藥。熟練的技術人員會意識到，可以根據(jù)所需的結(jié)果來變化給藥的途徑和/或 方式。所選的本發(fā)明抗體的給藥途徑包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、脊髓或其他 腸胃外給藥途徑，例如通過注射或灌注。腸胃外給藥可代表除了腸和局部給藥之外的給藥 方式，通常通過注射，且包括但不限于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眼窩內(nèi)、心臟內(nèi)、 皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬腦膜上以及胸骨內(nèi)注射和灌注。任選地，本發(fā)明的組合物可以通過非腸胃外途徑給藥，例如局部、表皮或黏膜 途徑給藥，例如鼻內(nèi)、口服、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、舌下或局部給藥。如果本發(fā)明的抗體或其偶聯(lián)物是在受控釋放或持續(xù)釋放系統(tǒng)中給藥的，可使用 泵來實現(xiàn)受控或持續(xù)釋放(參見Langer，見上文；Sefton, 1987，CRC Crii. Ref. Biomed. Eng. 14 20 ；Buchwald 等 1980，Surgery 55 :507 ；Saudek 等，1989，N. Engl. J. Med. 321 574)?？墒褂枚嗑畚锊牧蟻磉_到本發(fā)明治療劑的受控或持續(xù)釋放(參見例如1974年佛羅 里達州博卡拉頓的CRC出版社出版的Langer和Wise編的《受控釋放的醫(yī)學應用》(Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds. ),CRC Pres. ,Boca Raton, Fla. (1974)) ； 1984年紐約威立出版社出版的Smolen和Ball編的《受控的藥物生物利用 度、藥物產(chǎn)品設計和性能》(Controlled Drag Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen and Ball(eds. ), Wiley,New York(1984)) ；Ranger 禾口 Peppas, 1983, J. ， Macromo 1. Sci. Rev. Macromo 1. Chem. 23 61 ； iii # B Levy 等 1985, Science225 190 ； During 等 1989，Ann. Neurol 25 :351 ；Howard 等 1989，J Neurosurg. 71 :105)；美國專利第 5，679，377號；美國專利第5，916，597號；美國專利第5，912，015號；美國專利第5，989，463 號；美國專利第5，128，326號；PCT出版物WO 99/15154 ；和PCT出版物WO 99/20253。用 于持續(xù)釋放制劑的多聚物的例子包括但不限于聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)、聚(甲基丙烯 酸甲酯)、聚丙烯酸、聚(乙烯-共-乙烯基醋酸酯)、聚甲基丙烯酸、聚乙交酯(PLG)、聚 酸酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、聚交酯(PLA)、聚(丙交 酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。在一個實施方式中，用于持續(xù)釋放制劑的多聚物為 惰性的、不含有可濾除的雜質(zhì)、在儲存條件下是穩(wěn)定的、無菌的且為可生物降解的。受控的 或持續(xù)釋放系統(tǒng)可以用于預防或治療目的，這樣只需要全身劑量的一部分(參見1984年 Goodson的《受控釋放的醫(yī)學應用》(見上文)第2卷第115-138頁(Goodson，in Medical ApplicationsofControlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)))。受控釋放系統(tǒng)在綜述Langer (1990，Science 249 :1521A 533)中有所討論?？?以采用本領域技術人員已知的任何技術來生產(chǎn)包含本發(fā)明的一種或多種抗體或其偶 聯(lián)物的持續(xù)釋放制劑。參見例如美國專利第4，526，938號，PCT出版物W091/05548， PCT出版物WO 96/20698，Ning等1996，“用緩釋凝膠對人結(jié)腸癌異種移植物的腫瘤內(nèi) 放身寸免疫治療，，(“Intratumoral Radioimmunotheraphy of aHuman Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel, " )Radiotherapy&Oncology 39:179-189; Song等，1995，“長循環(huán)乳劑的抗體介導的肺靶向作用”("Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions, " ) ， PDA.Journal of Pharmaceutical Science&Technology 50 :372-397 ；Cleek 等，1997，“bFGF 抗體的心血管應用中生物可
(“ Biodegradable Polymeric Carriers for abFGF Antibody for CardiovascularApplication, " )Pro. Intl. Symp. Control. Rel Bioact. Mater. 24 :853-854,以及Lam等，1997，“用于局部遞送的重組人源化單克隆抗體微囊 化，，("Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody forLocal Delivery, “ )Proc. Int' 1. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24 :759_760，上述每篇文 獻的全文以引用的方式納入本文。如果局部給予本發(fā)明的抗體或抗體偶聯(lián)物，可以將它配制成藥膏、乳霜、透皮貼
47劑、洗劑、凝膠、香波、噴霧、氣霧劑、溶液、乳劑或本領域技術人員所熟知的其他劑型。參見 如1995年賓夕法尼亞州伊斯頓的馬克出版公司出版的《雷明頓藥學和藥物劑型入門》第 19 版(Remington' s Pharmaceutical Sciencesand Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed.，Mack Pub，Co.，Easton，Pa. (1995))。在一些實例中，通常采用動 態(tài)粘滯度比水高、且包含與局部給予兼容的運載體或一種或多種賦形劑的非噴霧局部給予 劑型、粘性到半固體或固體劑型。合適的制劑包括但不限于溶液、懸浮液、乳劑、乳霜、藥膏、 粉末、擦劑、油膏等等，如果需要，制劑為無菌的或與輔助試劑相混合(如防腐劑、穩(wěn)定劑、 潤濕劑、緩沖劑或鹽)來影響各種性質(zhì)，例如滲透壓。其他合適的局部給予的劑型包括噴霧 氣溶膠制劑，其中，在一些實例中，活性成分與固體或液體惰性運載體混合在一起，與加壓 揮發(fā)劑(例如氣態(tài)推進劑如氟利昂)混合起來包裝或包裝在塑料擠瓶中。如果需要，也可 向藥物組合物或劑型中加入增濕劑或保濕劑。這些添加成分的例子是本領域所熟知的。如果含有抗體或抗體偶聯(lián)物的組合物是鼻內(nèi)給藥的，它可配成氣霧劑、噴霧、薄霧 或液滴形式。特別是，可使用合適的推進劑(如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、 二氧化碳或其他合適的氣體)從加壓包裝或噴霧器中以氣霧劑噴霧的形式常規(guī)地遞送本 發(fā)明使用的預防劑或治療劑。在加壓氣霧劑的情況下，可以通過提供閥來遞送測定的量，從 而確定劑量單位。吸入器或吹入器中使用的膠囊和藥筒(由如明膠制成)可配制成含有化 合物的粉末混合物和如乳糖或淀粉之類的合適的粉末基礎成分的粉末混合物。與如細胞因子、類固醇、化療劑、抗生素或放射線等第二治療劑共同給藥或治 療的方法是本領域所熟知的(參見例如2001年紐約州紐約麥格勞-希爾公司出版 的Hardman等QOOl)《古德曼吉爾曼治療學的藥理學基礎》(Hardman，et al. (2001) Goodman and Oilman' s The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hi11, New York, N. Y.) ；2001年賓夕法尼亞州費城利平科特·威廉姆斯·威爾金斯出版社出版 的Poole和Peterson編的《高級藥物之實踐一個實用方法》(Poole and Peterson (eds.) (2001)Pharmacotherapeutics for AdvancedPractice :A Practical Approach, Lippincott, ffilliams&ffiikins, Phila.，Pa.) ；2001 年賓夕法尼亞州費城利平科特·威 廉姆斯·威爾金斯出版社出版的Chabner和Longo編的《癌癥的化學治療和生物治療》 (Chabner and Longo (eds. )(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, ffilliams&ffiikins, Phila.，Pa.)。有效量的治療劑可以使癥狀減輕至少10% ；至少20% ； 至少約30% ；至少40%或至少50%。能與本發(fā)明的抗體或其偶聯(lián)物聯(lián)合給予的附加治療(如預防劑或治療劑)給藥可 以與給予本發(fā)明的抗體間隔少于5分鐘、少于30分鐘、少于1小時，間隔約1小時，間隔約 1-2小時，間隔約2-3小時，間隔約3-4小時，間隔約4-5小時，間隔約5_6小時，間隔約6_7 小時，間隔約7-8小時，間隔約8-9小時，間隔約9-10小時，間隔約10-11小時，間隔約11_12 小時，間隔約12-18小時，間隔約18-24小時，間隔約24-36小時，間隔約36-48小時，間隔 約48-52小時，間隔約52-60小時，間隔約60-72小時，間隔約72-84小時，間隔約84-96小 時，間隔約96-120小時?？梢栽谝淮位颊咴L問中給予2個或更多的治療。本發(fā)明的抗體或抗體偶聯(lián)物以及其他治療可以循環(huán)給予。循環(huán)治療涉及一段時間 的第一治療(如第一預防劑或治療劑)給藥，隨后是一段時間的第二治療(如第二預防劑 或治療劑)給藥，可選地，隨后是一段時間的第三治療(如預防劑或治療劑)的給藥等等，并且重復這種有序給藥(即循環(huán))以減少對于治療中的一個治療產(chǎn)生抗性，從而避免或降 低治療中一個治療的副作用和/或提高治療的功效。在某些實施方式中，本發(fā)明的抗體和抗體偶聯(lián)物可以配制成能確保體內(nèi)正確分布 的形式。例如，血腦屏障(BBB)排除了很多高度親水的化合物。為了確保本發(fā)明的治療 化合物能穿過血腦屏障BBB(如果需要)，它們可以配制在如脂質(zhì)體中。制造脂質(zhì)體的方 法，參見如美國專利第4，522，811號；第5，374，548號和第5，399，331號。脂質(zhì)體可包含 能選擇性傳送到特定細胞或器官的一個或多個部分，從而增強靶向性藥物遞送(參見如 V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29 :685)。靶向性部分的例子包括葉酸或生物素(參 見如Low等的美國專利第5，416，016號)；甘露糖苷(Umezawa等，(1988) Biochem. Biopkys. Res. Commun. 153 :1038)；抗體(P. G. Bloeman 等·(1995) FEBS Lett. 357 :140 ；Μ. Owais 等· (1995) Antimicrob. AgentsChemother. 39 :180)；表面活性劑蛋白 A 受體(Briscoe 等· (1995) Am. J. Physiol.1233 134) ；pl20(Schreier 等· (1994) J. Biol. Chem. 269 9090)；也參見 K. Keinanen ；M. L. Laukkanen (1994)FEBS Lett. 346 :123 J. J. Killion ； L. J. Fidler(1994，)Immimomethods 4 :273。本發(fā)明提供了向有需求的對象單獨給予含有本發(fā)明的抗體或抗體偶聯(lián)物的藥物 組合物或與其他治療聯(lián)用的方法。本發(fā)明的聯(lián)合治療中的治療(如預防劑或治療劑)可以 同時或相繼給予對象。本發(fā)明的聯(lián)合治療中的治療(如預防劑或治療劑)也可以是循環(huán)給 藥的。循環(huán)治療涉及一段時間的第一治療(如第一預防劑或治療劑)給藥，隨后是一段時 間的第二治療(如第二預防劑或治療劑)給藥，并且重復這種有序給藥(即循環(huán))以減少 對于治療中的一個治療(如藥劑)產(chǎn)生抗性，從而避免或降低治療中一個治療(如藥劑) 的副作用和/或提高治療的功效。本發(fā)明的聯(lián)合治療中的治療(如預防劑或治療劑)可同時給予對象。術語“同時 地”不限于在完全相同的時間給予治療(如預防劑或治療劑)，而是表明含有本發(fā)明的抗體 或抗體偶聯(lián)物的藥物組合物在一定的時間間隔內(nèi)以一定順序給予患者，使得本發(fā)明的抗體 或其偶聯(lián)物能夠與其他治療一起發(fā)揮作用，提供比它們以別的方式給藥更強的效果。例如， 每個治療可以在同一時間或在不同時間點以任何順序依次給予對象，然而，如果不在同一 時間給藥，他們必須在足夠接近的時間內(nèi)給藥，從而能夠提供所需的治療或預防效果。每一 個治療可以向?qū)ο蠓珠_給予，以任何合適的形式并經(jīng)過任何合適的途徑給藥。在各種不同 的實施方式中，給予對象的治療(如預防劑或治療劑)間隔少于15分鐘、少于30分鐘、少 于1小時，間隔約1小時，間隔約1-2小時，間隔約2-3小時，間隔約3-4小時，間隔約4-5 小時，間隔約5-6小時，間隔約6-7小時，間隔約7-8小時，間隔約8-9小時，間隔約9-10小 時，間隔約10-11小時，間隔約11-12小時，間隔M小時，間隔48小時，間隔72小時或間隔 1周。在其他實施方式中，兩個或多個治療(如預防劑或治療劑)在同一次患者訪問中進行 給藥。聯(lián)合治療中的預防劑或治療劑可以在同一藥物組合物中給予對象?；蛘?，聯(lián)合治 療中的預防劑或治療劑可以在獨立的藥物組合物中同時給予對象。預防劑或治療劑可以用 相同的或不同的給藥途徑給予對象。特定實施方式1. 一種半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，半胱氨酸工程化抗體包含在抗體的重鏈上由EU索引編碼系統(tǒng)確定的131-139區(qū)域的一個或多個氨基酸被半胱氨酸殘基取代，其 中所述半胱氨酸工程化抗體包含至少一個游離的巰基。2.如實施方式1所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述抗體包含2個或2 個以上游離的巰基。3.如實施方式1所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述抗體包含4個或4 個以上游離的巰基。4.如實施方式1所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述抗體包含6個或6 個以上游離的巰基。5.如實施方式1所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述抗體包含8個或8 個以上游離的巰基。6.如實施方式1所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述抗體包含10個或 10個以上游離的巰基。7.如實施方式1所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述抗體包含12個或 12個以上游離的巰基。8.如實施方式1所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述抗體包含14個或 14個以上游離的巰基。9.如實施方式1所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述抗體包含16個或 16個以上游離的巰基。10.如實施方式1所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，被取代的氨基酸選自 下組根據(jù)EU索引編碼系統(tǒng)確定的抗體重鏈的131、132、134、135、136和139位。11.如實施方式1-10中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述抗 體是Fab或Fab2形式的抗體片段。12.如實施方式1-11中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，半胱氨 酸工程化抗體包含至少一個非天然存在的二硫鍵的形成。13.如實施方式1-12中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述工 程化抗體表現(xiàn)出與半胱氨酸工程化改造之前的抗體相比相同或更強的對特定靶標的結(jié)合 親和力。14.如實施方式1-13中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述工 程化抗體表現(xiàn)出與半胱氨酸工程化改造之前的抗體相比相同或更低的對特定靶標的結(jié)合 親和力。15.如實施方式1-14中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述工 程化抗體表現(xiàn)出與半胱氨酸工程化改造之前的抗體相比相同或更強的對一種或多種Fc受 體的結(jié)合親和力。16.如實施方式1-15中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述工 程化抗體誘導出與半胱氨酸工程化改造之前的抗體相比相同或更高水平的抗體依賴性細 胞介導的細胞毒性(ADCC)。17.如實施方式1-15中任一所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述工程 化抗體誘導出比半胱氨酸工程化改造之前的抗體更低水平的抗體依賴性細胞介導的細胞 毒性(ADCC)。
50
18.如實施方式1-17中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述工 程化抗體誘導出與半胱氨酸工程化改造之前的抗體相比相同或更高水平的抗體依賴的補 體依賴性細胞毒性(CDC)。19.如實施方式1-17中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述工 程化抗體誘導出比半胱氨酸工程化改造之前的抗體更低水平的抗體依賴的補體依賴性細 胞毒性(CDC)。20.如實施方式1-19中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，如斷裂 和/或凝集圖譜所測，所述工程化抗體表現(xiàn)出與半胱氨酸工程化改造之前的抗體相比相同 或更高水平的穩(wěn)定性。21.如實施方式1-20中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，如斷裂 和/或凝集圖譜所測，所述工程化抗體表現(xiàn)出比半胱氨酸工程化改造之前的抗體更低水平 的穩(wěn)定性。22.如實施方式1-21中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，與半胱 氨酸工程化改造之前的抗體相比，所述工程化抗體表現(xiàn)出半衰期縮短。23.如實施方式1-22中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述游 離的巰基能與細胞毒性劑、化療劑、毒素、放射性核素、DNA、RNA、siRNA、小分子RNA、肽核酸、 非天然氨基酸、肽、酶、熒光標記或生物素進行化學偶聯(lián)。24.如實施方式23所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述細胞毒性劑選 自下組抗微管蛋白劑、DNA小型凹槽結(jié)合物、類美坦素抗體和奧利斯他汀。25.如實施方式23所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述化療劑選自下 組泰素、紫杉醇、阿霉素、甲氨喋呤、多拉司他汀、長春花生物堿、甲氨喋呤和倍癌霉素。26.如實施方式23所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述毒素選自下組 相思豆毒素、番木鱉堿、毒芹素、白喉毒素、波特淋菌毒素、志賀毒素、內(nèi)毒素、破傷風毒素、 百日咳毒素、炭疽熱毒素、霍亂毒素、鐮葉芹醇、α毒素、格爾德霉素(Geldanamycin)、白樹 素(Gelonin)、百脈根甙(Iotaustralin)、蓖麻毒素、士的寧(Strychnine)和河豚毒素等。27.如實施方式23所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述放射核素選自 下組鉻(51Cr)、鈷(57Co)、氟(18F)、釓 P3Gd, 159Gd)、鍺(68Ge)Ijc (166Ho)、銦(115 , 113In, 112In, 111^i)、碘(1311，1251，1231，1211)、鑭(14tlLa)、镥(177Lu)、錳(54Mn)、鉬("Mo)、鈀(ltl3Pd)、磷 (32P)、鐠(142Pr) (149Pm)、錸(186Re, 188Re)、銠(1° )、釕(97Ru), ^ (153Sm)^fi (47Sc), (75Se)、鍶(85Sr)、硫(35S)、锝("Tc)、鉈(201Ti)、錫(113Snj117Sn)、氚(3H)、氙(133Xe)、鐿(169Yb, 175Yb)、釔(9°Y)和鋅(65Zn)。28.如實施方式23所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述抗體為內(nèi)化抗 體。29.如實施方式1- 中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述抗 體為單克隆、嵌合式、人源化、雙特異性或多特異性抗體。30. 一種分離的核酸，含有編碼如實施方式1- 中任一項所述的半胱氨酸工程化 抗體的重鏈可變結(jié)構域或輕鏈可變結(jié)構域的核苷酸序列。31. 一種含有如實施方式30所述的核酸的載體。32. 一種含有如實施方式31所述的載體的宿主細胞。
33. 一種如實施方式1- 中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體的抗體偶聯(lián)物。34. 一種含有如實施方式33所述的抗體偶聯(lián)物的藥物組合物。35. 一種對有需求的對象進行癌癥、自身免疫疾病、炎性或傳染性疾病或病癥檢測 的方法，所述方法包含對所述對象給予如實施方式34所述的組合物。36.如實施方式35所述的方法，其特征在于，所述疾病或病癥包含過表達能與所 述抗體偶聯(lián)物結(jié)合的細胞表面抗原的細胞。37. 一種抑制靶細胞增殖的方法，所述方法包含使所述細胞與有效量的如實施方 式33所述的抗體偶聯(lián)物相接觸。38. 一種抑制對象中靶細胞增殖的方法，所述方法包含給予有效量的如實施方式 34所述的組合物。39.如實施方式37或38所述的方法，其特征在于，所述靶細胞過表達能與所述抗 體偶聯(lián)物結(jié)合的細胞表面抗原。40. 一種對有需求的對象進行癌癥、自身免疫疾病、炎性或傳染性疾病或病癥治療 的方法。所述方法包含向所述對象給予治療有效量的如實施方式34所述的組合物。41.如實施方式40所述的方法，其特征在于，所述疾病或病癥含有過表達能與所 述抗體偶聯(lián)物結(jié)合的細胞表面抗原的細胞。42.如實施方式40所述的方法，其特征在于，所述方法包含殺死與所述疾病相關 的細胞或降低這些細胞的生長速率。43.如實施方式40所述的方法，其特征在于，所述方法包含消耗B細胞或T細胞。44.如實施方式40所述的方法，所述方法包含給予附加的治療，所述附加治療選 自下組化療、生物治療、免疫治療、放射治療、激素治療和外科手術。45.將異源分子有效偶聯(lián)到如實施方式119中任一項所述的半胱氨酸工程化抗 體上的方法。46.如實施方式45所述的方法，其特征在于，所述方法包含將所述異源分子偶聯(lián) 到選自下組的至少一個位點該抗體的CHl結(jié)構域的131、132、133、134、135、136、137和 139位點。47.如實施方式45或46所述的方法，其特征在于，所述異源分子選自下組細胞 毒性劑、化療劑、毒素、放射性核素、DNA、RNA、siRNA、小分子RNA、肽核酸、肽、酶、熒光標記或 生物素。48.如實施方式47所述的方法，其特征在于，所述細胞毒性劑選自下組抗微管蛋 白劑、DNA小型凹槽結(jié)合物、類美坦素抗體(anti-mitmaytansanoid)和奧利斯他汀。49.如實施方式47所述的方法，其特征在于，所述化療劑選自下組泰素、紫杉醇、 阿霉素、甲氨喋呤、多拉司他汀、長春花生物堿和甲氨喋呤。50.如實施方式47所述的方法，其特征在于，所述毒素選自下組相思豆毒素、番 木鱉堿、毒芹素、白喉毒素、波特淋菌毒素、志賀毒素、內(nèi)毒素、破傷風毒素、百日咳毒素、炭 疽熱毒素、霍亂毒素、鐮葉芹醇、α毒素、格爾德霉素、白樹素、百脈根甙、蓖麻毒素、士的寧 和河豚毒素。51.如實施方式47所述的方法，其特征在于，所述放射核素選自下組鉻(51Cr)、鈷 (57Co)、氟(18F)、釓(153Gd, 159Gd)、鍺(68Ge)JjC (16f5Ho)、銦(115In, 113In, 112In, 111^i)、碘(1311，1251，1231，1211)、鑭(14tlLa)、镥(177Lu)、錳(54Mn)、鉬("Mo)、鈀(ltl3Pd)、磷(32P)、鐠(142Pr)、钷 (149Pm)、錸(186Re, 188Re)、銠(105Rh)、釕(97Ru)、釤(153Sm)、鈧(47Sc)、硒(75Se)、鍶(85Sr)、硫 (3 )、锝("Tc)、鉈(2tllTi)、錫(113Sn, mSn)、氚(3H)、氙(13 )、鐿(16i3Yb，mYb)、釔(9°Y)和 鋅(6 !!)。52.如實施方式45-51中任一項所述的方法，其特征在于，如偶聯(lián)反應后檢測殘余 的游離巰基所示，所述效率至少為5%或以上。53.如實施方式45-52中任一項所述的方法，其特征在于，如偶聯(lián)反應后檢測殘余 的游離巰基所示，所述效率至少為25%或以上。54.如實施方式45-53中任一項所述的方法，其特征在于，如偶聯(lián)反應后檢測殘余 的游離巰基所示，所述效率至少為75%或以上。55.如實施方式1- 中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述抗 體不含有在位點132和/或138的半胱氨酸取代。56.如實施方式1- 或55中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所 述抗體含有位點132和/或138的取代，其中所述取代不是半胱氨酸。57.如實施方式1- 或55-56中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于， 所述抗體在131-139環(huán)區(qū)含有至少一個擴展。58.如實施方式1- 或55-57中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于， 所述抗體在131-139環(huán)區(qū)含有擴展，其中，所述擴展含有至少1個到至少15個氨基酸的插 入。59.如實施方式1- 或55-58中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于， 所述抗體在131-139環(huán)區(qū)含有擴展，其中，所述擴展發(fā)生在選自下組的位點之后131、132、 133、134、135、136、137、138 和 139 殘基。60.如實施方式1- 或55-59中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于， 所述抗體在131-139環(huán)區(qū)含有擴展，其中，所述擴展發(fā)生在選自下組的位點之后131、132、 133、134、135、136、137、138 和 139 殘基。61.如實施方式1- 或55-59中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于， 所述抗體在131-139環(huán)區(qū)含有至少第一和第二擴展，其中，所述第一擴展發(fā)生在選自下組 的位點之后:131、132、133、134、135、136、137、138和139殘基；且其中所述第二擴展發(fā)生在 選自下組的位點之后:131、132、133、134、135、136、137、138和139殘基。等價物可以認為前述說明書內(nèi)容足以使本領域的技術人員能實施本發(fā)明。前述描述和實 施例詳細描述了本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方式，并且描述了發(fā)明人所預期的最佳方式。然而， 應理解，無論上述描述在文章中是多么詳細，本發(fā)明可以多種方式來實施，并且本發(fā)明應當 根據(jù)所附權利要求以及其任何等價物進行解釋。本發(fā)明引用的所有參考文獻，包括專利、專利申請、文章、教科書等等以及其所引 用的參考文獻，在此以其全文以引用的方式納入本文。另外，2008年1月18日遞交的下述美國臨時專利申請第61/022，073號的全文也 以引用的方式納入本文。7.實施例現(xiàn)在，參照下列實施例來描述本發(fā)明。提供這些實施例只是為了舉例說明，本發(fā)明 并不限于這些實施例，而是包括經(jīng)過本發(fā)明的教授之后變得很明顯的本發(fā)明的任何和全部變化。7. 1實施例1半胱氨酸工程化抗體的表達和鑒定在IgGl分子的CHl結(jié)構域的131-139區(qū)域制造一系列半胱氨酸對絲氨酸或蘇氨 酸的取代。采用生物學領域從業(yè)者已知的標準DNA重組技術來產(chǎn)生半胱氨酸工程化IgGl 分子。(參見例如2000年12月冷泉港出版社出版的Sambrook等的《分子克隆試驗指南》 (Sambrook et al. Molecular Cloning-ALaboratory Manual, December 2000,Cold Spring Harbor Lab Press)))。IgGl分子上的CHl結(jié)構域的131-139區(qū)域代表暴露于溶劑的柔性區(qū) 域(見圖1A)。暴露于溶劑使得該區(qū)域伸展能夠讓偶聯(lián)試劑到達特定的殘基。代表與IgGl 的CHl結(jié)構域的131-139位點等價的其他各種抗體類型的序列比對在圖IC中顯示。這個 區(qū)域所含的絲氨酸和/或蘇氨酸殘基是用于被半胱氨酸殘基取代的特定候選氨基酸。圖IB中顯示了半胱氨酸工程化抗體策略的一個實施例。粗體顯示的是在這個序 列中天然存在的半胱氨酸殘基以及預測的二硫鍵配對模式(實線)。下劃線是半胱氨酸取 代了位點131的絲氨酸殘基的位點。用虛線表示包含導入的半胱氨酸的潛在二硫鍵。在圖2A中，ICl野生型及其半胱氨酸工程化衍生物被表達、純化且進行了 PAGE分 析。在非還原(插圖i)和還原(插圖ii)條件下，ICl野生型(第1道)抗體和它的各種 半胱氨酸工程化衍生物(第2-15道)表現(xiàn)出非常相似的分子量圖譜。在圖2B中，顯示了 ICl野生型和lClSerl31Cys突變體的非還原肽圖的比較。在 這個實施例中，采用限制型蛋白水解和反相層析/質(zhì)譜(RP-LC/MQ來鑒定野生型和半胱氨 酸工程化ICl和1C6抗體中的二硫鍵模式和游離半胱氨酸殘基。材料和方法非還原肽圖分析。單克隆抗體mAb用酸性緩沖液中的5mMN_乙基順 丁烯二酰亞胺在室溫下處理20分鐘進行加帽，隨后用IOmM磷酸鹽緩沖液、250mM氯化鈉、 6M胍、pH 7. O在37°C處理30分鐘進行變性。然后用IOOmM磷酸鹽緩沖液、0. ImM EDTA、pH 7. O將變性的單克隆抗體(mAb)溶液稀釋6倍。按照酶蛋白比例1 10加入肽鏈內(nèi)切酶 Lys-C0反應混合物在37°C孵育16- 小時。向一半的反應混合物加入5_10 μ L的500mM DTT并且在37°C孵育15分鐘進行還原。非還原的和還原的消化產(chǎn)物都用LC/MS進行分析。 用反相 HPLC(Phenomenex Jupiter 5m C18 柱 250X2mm)來實現(xiàn) HPLC 分離，然后用 UV-探 頭和在線LTQ離子阱質(zhì)譜(賽默飛世爾，ThermoFisher)來檢測。RP-HPLC移動相A為溶于 水中0. 的TFA且移動相B為溶于乙腈的0. 1% TFA。流速為0. 2mL/分鐘且梯度為150 分鐘內(nèi)0-60%的B。以m/z范圍為300-2000的陽離子模式操作帶有電噴霧界面的LTQ離 子阱質(zhì)譜。用MS全掃描和局部(zoom)掃描分析來鑒定肽圖的每個峰。也收集MS/MS光譜 來驗證肽的序列。用LC-MS實驗的肽質(zhì)量來測定二硫鍵連接，并且比較還原的和非還原的 消化產(chǎn)物的肽圖來確認。搜索帶NEM加合物的肽質(zhì)量來鑒定含游離巰基的肽。結(jié)果1C1為IgGl亞型的EphA2特異性抗體。圖2B的插圖A為ICl野生型抗體，它 在重鏈鉸鏈區(qū)和輕鏈C-末端(Hll-LK)顯示了常規(guī)二硫鍵連接并且該肽帶有％1~131015)。 圖2B的插圖B為lClSerl31Cys突變體，它顯示為輕鏈和重鏈之間的常規(guī)二硫鍵(H11-L15) 減少和ICl野生肽H5的減少，并且在突變的半胱氨酸與輕鏈C-末端(H5m-L15)之間以及與鉸鏈區(qū)(H5m-L15)之間出現(xiàn)新形成的二硫鍵連接。采用上述方法，我們測定1C1、 lClSerl31Cys以及其他突變體中的二硫鍵連接。此外，我們測定lClSerl31Cys抗體在輕鏈 和重鏈之間形成了新的鏈間二硫鍵，并且重鏈位點220的半胱氨酸為游離的，可用于位點 特異性藥物偶聯(lián)。用上述方法也可鑒定游離巰基。用其他半胱氨酸工程化抗體也獲得了相 似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。在圖3中，顯示了代表1C6 (EphB4特異性抗體)野生型(A)和lC6Serl31Cys抗體 的尺寸排阻層析(SEC)分析結(jié)果的圖表。尺寸排阻層析是本領域熟知的一種測定天然狀 態(tài)的分子(如蛋白)的表觀分子量的方法。在這個實施例中，在含有IOOmM硫酸鈉、IOOmM 磷酸鈉、PH6. 8的緩沖液中，將純化的抗體1C6野生型(A)或lC6Serl31Cys(B)上樣到SEC 柱(TSK-GELG3000SWXL)。以ImL/分鐘的流速過柱。用于測定表觀分子量的校正標準樣 品包括甲狀腺球蛋白(670kDa)、牛丙種球蛋白(158kDa)、雞卵清蛋白(44kDa)、馬肌球素 (17kDa)、和維生素B12(1.35kDa)。如圖(A和B)中非常相似的自動記錄圖所證明，1C6野 生型和lC6Serl31CyS都以單體形式存在。其他半胱氨酸工程化抗體也獲得了相似的結(jié)果 (數(shù)據(jù)未顯示)。在圖4 中，顯示了代表 ICl 野生型(A)、1C lSerl34Cys (B), lClSerl31-132Cys (C) 和lClSerl31-132-134-136CyS(D)抗體的尺寸排阻層析(SEC)分析的結(jié)果的圖表。如上所 述進行尺寸排阻層析。如圖(A-D)中非常相似的自動記錄圖所證明，ICl野生型和它的各種 半胱氨酸工程化突變體都以單體形式存在。其他的半胱氨酸工程化抗體獲得了相似的結(jié)果 (數(shù)據(jù)未顯示)。7. 2實施例2鑒定半胱氨酸工程化抗體的表位結(jié)合本實施例比較了半胱氨酸工程化抗體與親本野生型抗體的結(jié)合特性。材料和方法在IXPBS的BSA中進行結(jié)合測試，所有的孵育步驟都在室溫下 用震蕩速度為6. 5的實驗室在線儀器公司(Lab-Line Instrument)的滴定板搖床完成。生 物素化的EphB4或EphA2和釕標記(BV標記)抗人κ抗體與鏈霉親和素Μ280珠子以及系 列稀釋的lC6、lC6Serl31Cys、lCl和lClSerl31Cys分別一起孵育。受體和抗人κ抗體的 濃度為1 μ g/ml，且抗體濃度為1 μ g/ml到7. 8ng/ml。用Bioveris的M-系列分析儀來顯 示特異性結(jié)合。該儀器從板上吸取混合物，然后使其流經(jīng)一個電磁體。M280珠子粘在平臺 上，然后使洗滌溶液流經(jīng)珠子以去除任何沒有結(jié)合的抗體或受體。對平臺施加靜電荷，使其 傳播到達三明治結(jié)構內(nèi)的釕標記使它發(fā)射出光。作為最終電子接收者的讀取溶液，只要施 加電荷就允許釕持續(xù)發(fā)射光。然后解除電磁體并將樣品洗掉。洗滌和讀數(shù)是由儀器自動完 成并且在孔間是一致的。結(jié)果在這個實施例中，對純化的抗體1C6野生型和lC6Serl31Cys進行了基于 ELISA(溶液形式)的抗原結(jié)合測試。這些抗體特異性識別EphB4受體。如圖5所示，測 得ELISA形式的野生型抗體和半胱氨酸工程化krl31Cys抗體的結(jié)合親和力圖譜非常 相似。相似的，對于基于ICl的半胱氨酸工程化抗體，測得ELISA形式的ICl野生型和 lClSerl31Cys抗體的結(jié)合親和力圖譜非常相似(參見圖6)。加入還原劑如ImM DTT，對于 半胱氨酸工程化抗體lClSerl31CyS的結(jié)合圖譜沒有影響。其他的半胱氨酸工程化抗體獲 得了相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果表明，與親本抗體相比，將半胱氨酸殘基加入CHl 結(jié)構域的工程化改造不改變所得抗體的表位結(jié)合特性。
7. 3實施例3鑒定半胱氨酸工程化抗體的穩(wěn)定性在這個實施例中，將親本(野生型)抗體解鏈溫度(Tm)與半胱氨酸工程化抗體的 解鏈溫度進行比較。材料與方法采用差示掃描量熱法(DSC)來測定野生型和半胱氨酸工程化抗體的 解鏈溫度(Tm)。Tm代表了抗體的穩(wěn)定性，Tm越高表明非常穩(wěn)定并且抗體不凝聚。DSC實驗測 得了本發(fā)明研究的抗體(野生型和半胱氨酸工程化抗體)的熱容在10°C 100°C范圍內(nèi)是 溫度的函數(shù)。用Microcal VP-DSC超敏掃描微量量熱儀(Microcal VP-DSC ultrasensitive scanning microcalorimeter)進行 DSC 檢測。DSC 實驗在 25mM 組氨酸鹽酸鹽、pH6、5mM EDTA條件下進行。在裝載到量熱儀上之前，用于DSC的所有溶液和樣品用0. 22微米的濾器 進行過濾并且脫氣。對于每一組測試，首先獲得緩沖液相對應的基線運行結(jié)果。此后立刻 將緩沖溶液從樣品艙中去除。向樣品艙加入0. 5ml濃度為0. 5-lmg/ml的抗體(野生型和 半胱氨酸工程化的)溶液。在測定過程中，對照艙充滿了樣品緩沖液。從每一個樣品-緩 沖液對的實驗結(jié)果中減去相應的緩沖液-緩沖液對的基線運行結(jié)果。原始數(shù)據(jù)對濃度和掃 描速率進行標準化。用Microcal提供的Origin DSC軟件對數(shù)據(jù)進行擬合。也對偶聯(lián)的抗 體(與EZ-Link生物素-HPDP(皮爾斯公司，Pierce)和Z-Link碘乙酰-PE02生物素的抗 體)進行DSC實驗，且獲得了與野生型和半胱氨酸工程化抗體相似的溫度記錄圖。結(jié)果在這個實施例中，使用差示掃描量熱法(DSC)來測定各種野生型和半胱 氨酸工程化抗體的解鏈曲線。圖7顯示了 1C6野生型抗體㈧和lC6Serl31Cys抗體 ⑶的差示掃描量熱(DSC)溫度記錄圖。兩種抗體都表現(xiàn)出非常相似的解鏈溫度(Tm)， 分別為 70 °C 和 69 "C。圖 8 顯示了 ICl 野生型(A)、lClSerl31Cys (B)、lClSerl34Cys (C)、 IClSer (131-132) Cys (D)和 IClSer (131-132_1；34-136) Cys 抗體的差示掃描量熱(DSC)溫度 記錄圖。所有的抗體都表現(xiàn)出非常相似的解鏈溫度(Tm)。其他半胱氨酸工程化抗體也獲得 了相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果表明半胱氨酸殘基加入CHl結(jié)構域的工程化改造 沒有改變所得抗體的穩(wěn)定性。7. 4實施例4半胱氨酸工程化抗體的生物素偶聯(lián)物在這個實施例中，通過增加的生物素摻入證明了半胱氨酸工程化抗體上的游離偶 聯(lián)位點。材料和方法EZ-Link生物素-HPDP (偶聯(lián)試劑1 = CRl)和EZ-Link碘乙酰-PE02 生物素(偶聯(lián)試劑2 = CR2)來源于皮爾斯公司(Pierce)。野生型和半胱氨酸工程化抗體 在 IOOmM磷酸鹽緩沖液、IOOmM NaCl pH 8. 0、0. 02mM DTT、5mM EDTA 中在氮氣下 37°C孵育 3 小時。孵育后，用IPBS IXUmM EDTA在氮氣下對抗體樣品透析，進行緩沖體系交換。CRl 溶在100% DMSO中配成2mg/ml，CR2溶在蒸餾水中。7 μ g/ml的偶聯(lián)試劑分別與0. 5mg/ml 野生型和krl31Cys抗體分別混合、漩渦震蕩、然后在4°C、37°C、45°C和55°C孵育90分鐘。 用SEC (尺寸排阻層析)或脫鹽柱(皮爾斯公司的^BA離心式脫鹽柱)去除未結(jié)合的CRl 和CR2。用鏈霉親和素結(jié)合測試來測定生物素摻入。在溶于IXPBS的BSA中進行結(jié) 合測試，所有的孵育步驟都在室溫下用震蕩速度為6. 5的實驗室在線儀器公司(Lab-Line Instrument)的滴定板搖床完成。鏈霉親和素M280珠子和釕標記(BV標記)抗人κ抗體 與系列稀釋的生物素化的％rl31Cys和野生型分別一起孵育?？谷甩士贵w的濃度為1 μ g/ ml，且抗體濃度為1 μ g/ml到7. 8ng/ml。用Bioveris的M-系列分析儀來評估特異性結(jié)合。
結(jié)果在圖9中顯示了在各種條件下1C6(野生型)抗體和lC6krl31Cys (突變 體)抗體的生物素偶聯(lián)研究的結(jié)果。在圖A中，在各種溫度下G°C，37°C，45°C和55°C)進 行1C6和lC6Serl31Cys抗體與EZ-Link生物素-HPDP (皮爾斯公司，Pierce)的偶聯(lián)反應。 測定所得的生物素偶聯(lián)效率并且作圖。lC6Serl31CyS抗體表現(xiàn)出比1C6抗體更高的位點 特異性生物素偶聯(lián)效率。在圖B中，在各種溫度下G°C，37°C，45°C和55°C )進行1C6和 lC6Serl31Cys抗體與EZ-Link碘乙酰-PE02生物素(皮爾斯公司，Pierce)的偶聯(lián)反應。測 定所得的潛在位點特異性生物素偶聯(lián)效率并且作圖。lC6Serl31CyS抗體表現(xiàn)出比1C6抗體 更高的位點特異性生物素偶聯(lián)效率。這些結(jié)果表明半胱氨酸工程化抗體例如lC3Serl31CyS 抗體顯露出能與各種試劑(例如，與生物素偶聯(lián))進行偶聯(lián)反應的半胱氨酸。7. 5實施例5鑒定半胱氨酸工程化抗體對Fc γ受體的結(jié)合親和力在這個實施例中，比較半胱氨酸工程化抗體與野生型抗體對Fc Y受體的特異性 結(jié)合特性。材料和方法用BIAcore 3000設備(Biacore International)并采用標準實 驗方法進行BIAcore 試驗。簡要地說，用標準胺結(jié)合試劑盒把7444RU(共振單位)的 ICl野生型的和7781RU的lClSerl31Cys結(jié)合到CM5傳感器芯片(法瑪西亞生物傳感器公 司，Pharmacia Biosensor)上的右旋糖苷基質(zhì)上。通過注入70 μ 1的1. OM乙醇胺鹽酸鹽 (ρΗ8. 5)來淬滅過量的反應酯。以流速5“1/分鐘注入50011]\1的卩(^1 (1、1認、11認、118)。 ICl野生型和1(13吐13比78對？(^1 的結(jié)合水平相似。采用卵清蛋白作為負對照。在結(jié)合 實驗后，ICl野生型和lClSerl31Cys突變體的傳感器芯片表面用IM NaCl/50mM NaOH進行 再生。再生的表面芯片用于測定在含有0. 05% Tween 20的50mM磷酸鹽緩沖液pH 6. 0或 含有0. 05% Tween 20的50mM磷酸鹽緩沖液pH 7. 4中對人Fcfoi的結(jié)合。含有人Fcfoi的 溶液以5 μ 1/分鐘流經(jīng)傳感器芯片。野生型和突變體的結(jié)合水平是相似的。卵清蛋白用作 負對照。結(jié)果在圖10中，顯示了用BIAcore 測試檢測ICl野生型和lClSerl31Cys抗 體對各種Fc γ受體的相對親和力。研究的各種Fc γ受體為Fc γ RI (A)、Fc γ RIIIA(B)、 FcyRIIA(C) ,FcyRIIB(D)。ICl野生型和lClSerl31Cys抗體對各種Fcy受體表現(xiàn)出相似 的結(jié)合親和力。同樣，在圖11中顯示了BIAcore :測試檢測ICl野生型和lClSerl31Cys 抗體在ρΗ6· 0和ρΗ7· 4下對FcRn的相對親和力。在ρΗ6· 0和ρΗ7· 4下，lClSerl31Cys抗體 對Fcfoi受體的結(jié)合具有與ICl野生型相似的結(jié)合圖譜。在測試的其他半胱氨酸工程化抗 體也獲得了相似的結(jié)果。這些結(jié)果表明，抗體的CHl結(jié)構域的半胱氨酸工程化改造并沒有 影響對Fc γ受體的結(jié)合親和力，并且因此也沒有影響其控制效應子功能的能力。7. 6實施例6半胱氨酸工程化抗體的內(nèi)化在這個實施例中，測試了半胱氨酸工程化抗體在結(jié)合到細胞表面抗原上之后內(nèi)化 的能力。材料和方法用96孔U型底板進行內(nèi)化測試。濃度為106細胞/毫升的PC3 細胞(PC3細胞天然高水平表達EphA2)與均為lmg/ml的對照抗體(R347)、ICl野生型 和ICl半胱氨酸工程化抗體在冰上孵育30分鐘。孵育后，用IXPBS洗滌細胞兩次。然 后室溫下用3.7%多聚甲醛固定細胞20分鐘，然后用IXPBS洗滌2次。室溫下用溶于 IXPBS的0.5% iTriton-IOO滲透細胞5分鐘，然后用IXPBS洗滌2次。向細胞中加入溶于1XPBS、2% FBS的1毫克二抗(Alexa-Fluor 488羊抗人IgG(H+L)，分子探針公司 (Molecular Probes)#A110i;3)，并且在室溫下避光孵育30分鐘。孵育后，細胞用IXPBS 洗滌2次，然后直接包被到處理的顯微鏡載物片上。然后用含DAPI的封片劑(含DAPI的 VECTASHIELD HardSet 封片劑，載體實驗室公司 #H_1500 (VectaShield HardSet Mounting Medium with DAPI. Vector Laboratories#H-1500))將細胞固定在顯微鏡蓋玻片(蓋玻片 VWR#48382-138)下。然后將載物片在4°C孵育過夜，然后用尼康Eclipse 55i熒光顯微鏡 進行觀察。結(jié)果在圖12中顯示了在PC3細胞進行的抗體內(nèi)化研究的結(jié)果。在第一欄中顯 示了一組對照。在(A)中未染上色的細胞用DAPI復染。在(B)中，只用二抗染色的細胞用 DAPI復染。在(C)中，對照一抗R347與細胞孵育，也用DAPI復染。在⑶中，細胞孵育一個 小時，然后用R347染色。這些對照(A-D)中，沒有一個顯示出任何抗體特異性的細胞染色。 在(E)中，細胞與ICl野生型抗體在時間點0 —起開始孵育，孵育1小時。在1小時的2張 代表性的圖顯示了 ICl野生型抗體的內(nèi)化。在(F)中，細胞與lClSerl31Cys抗體從時間點 0開始孵育1小時。在1小時的2張代表性的圖顯示了 lClSerl31CyS抗體的內(nèi)化。在(G) 中，細胞與lClSerl34Cys抗體在時間點0 —起開始孵育，孵育1小時。在1小時的2張代表 性的圖顯示了 lClSerl34Cys抗體的內(nèi)化。在(H)中，細胞與IClSer (131-132) Cys抗體在時 間點0 —起開始孵育，孵育1小時。在1小時的2張代表性的圖顯示了 IC lSer(131-132) Cys抗體的內(nèi)化。在(I)中，細胞與IClSer (131-132-134-136)Cys抗體在時間點0—起開 始孵育，孵育1小時。在1小時的2張代表性的圖顯示了 IClSer (131-132-134-136)Cys抗 體的內(nèi)化。與野生型的抗體相比，所有的半胱氨酸工程化抗體都以相似的程度內(nèi)化。這些 結(jié)果表明抗體的內(nèi)化沒有受到CHl結(jié)構域半胱氨酸工程化改造的影響。7. 7實施例7半胱氨酸工程化抗體中游離巰基的定量在這個實施例中，測定半胱氨酸工程化抗體中的游離巰基。材料和方法用埃爾曼DNTB試劑(DNTB :5，5_ 二硫基-雙硝基苯甲酸))對 抗體游離巰基(-SH)進行定量測定。DNTB溶在DMF中，濃度為25mM。一旦DNTB結(jié)合到了 游離巰基，該化合物的溶液產(chǎn)生了在PH8. 0下光吸收在可見光范圍412nm的可檢測黃色產(chǎn) 物(TNB ；消光系數(shù)為1360(^(^1)。用與偶聯(lián)相同的方法來制備抗體樣品。通過與由已知 濃度的含巰基化合物(如半胱氨酸)制成的標準曲線進行簡單比較，對野生型抗體和半胱 氨酸工程化抗體中的巰基進行評估。任選地，用TNB的消光系數(shù)來對巰基進行定量，TNB在 DNTB結(jié)合到游離巰基上后就釋放出來，且TNB量與總游離巰基量直接相關。20微升濃度為 25mM的DNTB工作溶液加入到990 μ 1濃度為lmg/ml的樣品中進行稀釋。對空白測試管，相 同體積的DNTB加入到990 μ 1樣品透析緩沖液中稀釋，對半胱氨酸標準樣(如果使用)標 準濃度為10 μ Μ。DNTB和樣品充分混合并且在室溫孵育15分鐘。用安捷侖8453紫外-可 見光譜儀(Agilent 8453UV_Visible Spectroscopy)和 50 μ 1 石英比色皿來測定 412nm 和 280nm的光吸收。為了計算抗體中的游離巰基，用在412nm的兩次獨立測試的平均吸收度 除以UeOOMAnT1 (TNB的消光系數(shù))來獲得測試中的摩爾濃度，也測定溶液中抗體的摩爾濃 度。通過將TNB的摩爾濃度除以溶液中抗體的摩爾濃度，來計算游離巰基的量。結(jié)果使用上述方法，測定1C6和ICl野生型抗體以及1C6和lClSerl31Cys抗體 中游離巰基的數(shù)量。將光吸收讀數(shù)整數(shù)化成為整數(shù)，代表游離巰基的數(shù)量。埃爾曼試劑結(jié)合
58結(jié)果顯示在表1中。該數(shù)據(jù)證明，如所預測的，所產(chǎn)生的工程化抗體具有2個游離巰基(抗 體二聚體中各修飾的CHl結(jié)構域具有1個)。使用其他半胱氨酸工程化抗體也獲得了類似 的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果證明半胱氨酸工程化抗體如所預測的那樣具有游離的巰基。表1、野生型和半胱氨酸工程化抗體中游離巰基的測定。
權利要求
1.一種半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述半胱氨酸工程化抗體包含在抗體的重 鏈上由EU索引編碼系統(tǒng)確定的131-139區(qū)域的一個或多個氨基酸被半胱氨酸殘基取代，其 中所述半胱氨酸工程化抗體包含至少一個游離的巰基。
2.如權利要求1所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述抗體包含2個或2個以 上游離的巰基。
3.如權利要求1所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述抗體包含4個或4個以 上游離的巰基。
4.如權利要求1所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述抗體包含6個或6個以 上游離的巰基。
5.如權利要求1所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述抗體包含8個或8個以 上游離的巰基。
6.如權利要求1所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述抗體包含10個或10個 以上游離的巰基。
7.如權利要求1所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述抗體包含12個或12個 以上游離的巰基。
8.如權利要求1所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述抗體包含14個或14個 以上游離的巰基。
9.如權利要求1所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述抗體包含16個或16個 以上游離的巰基。
10.如權利要求1所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，被取代的氨基酸選自下 組根據(jù)EU索引編碼系統(tǒng)確定的重鏈的第131、132、134、135、136和139位。
11.如權利要求1-10中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述抗體是 Fab或Fab2形式的抗體片段。
12.如權利要求1-11中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述半胱氨 酸工程化抗體包含形成至少一個非天然存在的二硫鍵。
13.如權利要求1-12中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述工程化 抗體表現(xiàn)出與半胱氨酸工程化改造之前的抗體相比相同或更強的對特定靶標的結(jié)合親和 力。
14.如權利要求1-13中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述工程化 抗體表現(xiàn)出與半胱氨酸工程化改造之前的抗體相比相同或更低的對特定靶標的結(jié)合親和 力。
15.如權利要求1-14中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述工程化 抗體表現(xiàn)出與半胱氨酸工程化改造之前的抗體相比相同或更強的對一種或多種Fc受體的 結(jié)合親和力。
16.如權利要求1-15中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述工程化 抗體誘導出與半胱氨酸工程化改造之前的抗體相比相同或更高水平的抗體依賴性細胞介 導的細胞毒性(ADCC)。
17.如權利要求1-15中任一所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述工程化抗 體誘導出比半胱氨酸工程化改造之前的抗體更低水平的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)。
18.如權利要求1-17中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述工程化 抗體誘導出與半胱氨酸工程化改造之前的抗體相比相同或更高水平的抗體依賴的補體依 賴性細胞毒性(CDC)。
19.如權利要求1-17中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述工程化 抗體誘導出比半胱氨酸工程化改造之前的抗體更低水平的抗體依賴的補體依賴性細胞毒 性(CDC)。
20.如權利要求1-19中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，如斷裂和/或 凝集圖譜所測，所述工程化抗體表現(xiàn)出與半胱氨酸工程化改造之前的抗體相同或更高的穩(wěn) 定性。
21.如權利要求1-20中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，如斷裂和/或 凝集圖譜所測，所述工程化抗體表現(xiàn)出比半胱氨酸工程化改造之前的抗體更低的穩(wěn)定性。
22.如權利要求1-21中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，與半胱氨酸 工程化改造之前的抗體相比，所述工程化抗體表現(xiàn)出半衰期縮短。
23.如權利要求1-22中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述游離的 巰基能與細胞毒性劑、化療劑、毒素、放射性核素、DNA、RNA、siRNA、小分子RNA、肽核酸、非天 然氨基酸、肽、酶、熒光標記或生物素進行化學偶聯(lián)。
24.如權利要求23所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述細胞毒性劑選自下 組抗微管蛋白劑、DNA小型凹槽結(jié)合物、類美坦素抗體和奧利斯他汀。
25.如權利要求23所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述化療劑選自下組泰 素、紫杉醇、阿霉素、甲氨喋呤、多拉司他汀、長春花生物堿、甲氨喋呤和倍癌霉素。
26.如權利要求23所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述毒素選自下組相思 豆毒素、番木鱉堿、毒芹素、白喉毒素、波特淋菌毒素、志賀毒素、內(nèi)毒素、破傷風毒素、百日 咳毒素、炭疽熱毒素、霍亂毒素、鐮葉芹醇、α毒素、格爾德霉素、白樹素、百脈根甙、蓖麻毒 素、士的寧和河豚毒素。
27.如權利要求23所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述放射核素選自下組 鉻(51Cr)、鈷(57Co)、氟(18F)、釓(153Gd, 159Gd)、鍺(68Ge)、鈥(166Ho)、銦(115In, 113In, 112In, 111In),W (1311，1251，1231，1211)、鑭 C40La)、镥(177Lu)、猛(54Mn)、鉬(99Mo)、鈀(103Pd)、磷(32P)、 鐠(142Pr)、钷(149Pm)、錸(18fiRe, 188Re)、銠(ltl5Rh)、釕(97Ru)、釤(153Sm)、鈧(47Sc), (75Se), 鍶(85Sr)、硫(35S)、锝(99Tc)、鉈(201Ti)、錫(113Sn, 117Sn)、氚(3H)、氙(133Xe)、鐿(169Yb, 175Yb)、 釔(90Y)和鋅(65Zn)。
28.如權利要求23所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述抗體為內(nèi)化抗體。
29.如權利要求1- 中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述抗體為 單克隆、嵌合式、人源化、雙特異性或多特異性抗體。
30.一種分離的核酸，含有編碼如權利要求1- 中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體 的重鏈可變結(jié)構域或輕鏈可變結(jié)構域的核苷酸序列。
31.一種含有如權利要求30所述的核酸的載體。
32.—種含有如權利要求31所述的載體的宿主細胞。
33.一種如權利要求1- 中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體的抗體偶聯(lián)物。
34.一種含有如權利要求33所述的抗體偶聯(lián)物的藥物組合物。
35.一種對有需求的對象進行癌癥、自身免疫疾病、炎癥或傳染病或病癥的檢測的方 法，所述方法包含對所述對象給予如權利要求34所述的組合物。
36.如權利要求35所述的方法，其特征在于，所述疾病或病癥含有過表達能與所述抗 體偶聯(lián)物結(jié)合的細胞表面抗原的細胞。
37.一種抑制靶細胞增殖的方法，所述方法包含使所述細胞與有效量的如權利要求33 所述的抗體偶聯(lián)物相接觸。
38.一種抑制對象中靶細胞增殖的方法，所述方法包含給予有效量的如權利要求34所 述的組合物。
39.如權利要求37或38所述的方法，其特征在于，所述靶細胞過表達能與所述抗體偶 聯(lián)物結(jié)合的細胞表面抗原。
40.一種對有需求的對象進行癌癥、自身免疫疾病、炎癥或傳染病或病癥的治療的方 法，所述方法包括向所述對象給予治療有效量的如權利要求34所述的組合物。
41.如權利要求40所述的方法，其特征在于，所述疾病或病癥含有過表達能與所述抗 體偶聯(lián)物結(jié)合的細胞表面抗原的細胞。
42.如權利要求40所述的方法，其特征在于，所述方法包含殺死與所述疾病相關的細 胞或降低這些細胞的生長速率。
43.如權利要求40所述的方法，其特征在于，所述方法包含消耗B細胞或T細胞。
44.如權利要求40所述的方法，其特征在于，所述方法包括給予附加的治療，所述附加 治療選自下組化療、生物治療、免疫治療、放射治療、激素治療和外科手術。
45.將異源分子有效偶聯(lián)到如權利要求1- 中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體上 的方法。
46.如權利要求45所述的方法，其特征在于，所述方法包含將所述異源分子偶聯(lián)到選 自下組的至少一個位點抗體的CHl結(jié)構域的131、132、133、134、135、136、137和139位。
47.如權利要求45或46所述的方法，其特征在于，所述異源分子選自下組細胞毒性 劑、化療劑、毒素、放射性核素、DNA、RNA、siRNA、小分子RNA、肽核酸、肽、酶、熒光標記或生物
48.如權利要求47所述的方法，其特征在于，所述細胞毒性劑選自下組抗微管蛋白 劑、DNA小型凹槽結(jié)合物、類美坦素抗體和奧利斯他汀。
49.如權利要求47所述的方法，其特征在于，所述化療劑選自下組泰素、紫杉醇、阿霉 素、甲氨喋呤、多拉司他汀、長春花生物堿和甲氨喋呤。
50.如權利要求47所述的方法，其特征在于，所述毒素選自下組相思豆毒素、番木鱉 堿、毒芹素、白喉毒素、波特淋菌毒素、志賀毒素、內(nèi)毒素、破傷風毒素、百日咳毒素、炭疽熱 毒素、霍亂毒素、鐮葉芹醇、α毒素、格爾德霉素、白樹素、百脈根甙、蓖麻毒素、士的寧和河 豚毒素。
51.如權利要求47所述的方法，其特征在于，所述放射核素選自下組鉻(51Cr)、鈷 (57Co)、氟(18F)、釓(153Gd, 159Gd)、鍺(68Ge)JjC (16f5Ho)、銦(115In, 113In, 112In, 111^i)、碘(1311， 1251，1231，1211)、鑭(14tlLa)、镥(177Lu)、錳(54Mn)、鉬("Mo)、鈀(ltl3Pd)、磷(32P)、鐠(142Pr)、钷 (149Pm)、錸(186Re, 188Re)、銠(105Rh)、釕(97Ru)、釤(153Sm)、鈧(47Sc)、硒(75Se)、鍶(85Sr)、硫(3 )、锝("Tc)、鉈(2tllTi)、錫(113Sn, mSn)、氚(3H)、氙(13 )、鐿(16i3Yb，mYb)、釔(9°Y)和 鋅(6 !!)。
52.如權利要求45-51中任一項所述的方法，其特征在于，如偶聯(lián)反應后檢測殘余的游 離巰基所示，所述效率至少為5%或以上。
53.如權利要求45-52中任一項所述的方法，其特征在于，如偶聯(lián)反應后檢測殘余的游 離巰基所示，所述效率至少為25%或以上。
54.如權利要求45-53中任一項所述的方法，其特征在于，如偶聯(lián)反應后檢測殘余的游 離巰基所示，所述效率至少為75%或以上。
55.如權利要求1- 中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述抗體不 含有在位點132和/或138的半胱氨酸取代。
56.如權利要求1- 或55中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述抗 體含有位點132和/或138的取代，其中所述取代并不是半胱氨酸。
57.如權利要求1- 或55-56中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述 抗體在131-139環(huán)區(qū)含有至少一個擴展。
58.如權利要求1- 或55-57中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述 抗體在131-139環(huán)區(qū)含有擴展，其中，所述擴展含有至少1個到至少15個氨基酸的插入。
59.如權利要求1- 或55-58中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述 抗體在131-139環(huán)區(qū)含有擴展，其中，所述擴展發(fā)生在選自下組的位點之后131、132、133、 134、135、136、137、138 和 139 殘基。
60.如權利要求1- 或55-59中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述 抗體在131-139環(huán)區(qū)含有擴展，其中，所述擴展發(fā)生在選自下組的位點之后131、132、133、 134、135、136、137、138 和 139 殘基。
61.如權利要求1- 或55-59中任一項所述的半胱氨酸工程化抗體，其特征在于，所述 抗體在131-139環(huán)區(qū)至少含有第一和第二擴展，其中，所述第一擴展發(fā)生在選自下組的位 點之后131、132、133、134、135、136、137、138和139殘基；且其中所述第二擴展發(fā)生在選自 下組的位點之后:131、132、133、134、135、136、137、138 和 139 殘基。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于與多種試劑進行位點特異性偶聯(lián)的半胱氨酸工程化抗體。還提供了設計、制備、篩選、選擇和應用這些抗體的方法。
文檔編號A61K39/00GK102083460SQ200980102653
公開日2011年6月1日 申請日期2009年1月16日 優(yōu)先權日2008年1月18日
發(fā)明者C·高, H·吳, N·迪馬斯 申請人:米迪繆尼有限公司