一種高效快速適配體篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬生物制藥領(lǐng)域，具體設(shè)及一種新型的高效快速適配體篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，惡性腫瘤已成為嚴(yán)重危害人類生命健康的常見疾病，并且發(fā)展為Ξ大致死 疾病之一，研究并開發(fā)治療惡性腫瘤疾病的藥物也成為當(dāng)前首要任務(wù)。細胞毒類抗腫瘤藥 物是目前治療惡性腫瘤的主要手段之一，但此類藥物在殺滅或抑制腫瘤細胞的同時，也會 對機體的正常細胞(尤其是代謝旺盛的細胞)產(chǎn)生影響，通常在藥效劑量下就會導(dǎo)致病人出 現(xiàn)不良反應(yīng)，從而極大的限制了該類藥物的進一步應(yīng)用和發(fā)展。
[0003] 抗體偶聯(lián)藥物作為大分子祀向治療的代表藥物，目前已成功應(yīng)用于臨床治療不同 類型的腫瘤疾?。ɡ鏑D30-MMAE和T-DM1)。但由于抗體偶聯(lián)藥物其價格昂貴且不穩(wěn)定，其 替代藥物核酸適配體(Aptamer)的研發(fā)則成為未來的必然趨勢。
[0004] 核酸適配體(又稱化學(xué)抗體），具有精準(zhǔn)的祀向性。核酸適配體能夠快速而有效地 分辨出祀分子結(jié)構(gòu)上的細微差別，僅識別與其互補的空間結(jié)構(gòu)，并與之結(jié)合，但其本身對腫 瘤細胞不具備較強的殺傷力。另外，我國已發(fā)現(xiàn)近幾百種具有抗腫瘤活性的海洋毒素，但由 于其毒性反應(yīng)過強而使藥物開發(fā)中斷。核酸適配體與海洋毒素偶聯(lián)藥物，即毒性藥物與核 酸適配體相連接組成祀向適配體偶聯(lián)物，可W將藥物"精確"地運送到祀細胞，既有效地提 高了腫瘤局部的藥物濃度，又可極大地降低體內(nèi)其它組織、器官的毒性，從而達到真正祀向 增效減毒的作用。
[0005] 從隨機DNA配基文庫中，通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)技術(shù)篩選Aptamers是目前Aptamers的主 要獲得途徑。但總結(jié)發(fā)現(xiàn)，目前已知的Cell-沈LEX、Protein-SELEX、CE-S化EX等篩選方法， 具有篩選周期較長、親和性較差且失敗率較高等缺點，十分不利于Aptamers的發(fā)展和應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種用于高效快速篩選適配體的方法，通過W下步驟實現(xiàn)： 將肥K-293T細胞種于六孔板匯總，待六孔板中肥K-293T細胞生長至90%，將第一個孔上層 培養(yǎng)基吸出，用洗涂緩沖液洗涂兩次(緩慢加入50化1洗涂培養(yǎng)基，輕輕搖晃并吸出，W防細 胞脫落）；再加入預(yù)處理過的ssDNA文庫，置于4°C冰箱內(nèi)的水平搖床上，4°C、15rpm解育 30min。然后，將ssDNA文庫從上一個孔吸出，加入預(yù)先洗涂兩次的第二個孔中，4°C、15rpm解 育30min。方法同上，直至陰性篩選六輪后，吸出待用。將肥K-293T細胞瞬轉(zhuǎn)質(zhì)粒，4化后作為 陽性細胞，用洗涂緩沖液洗涂細胞兩次(緩慢加入50化1洗涂培養(yǎng)基，輕輕搖晃并吸出，防止 細胞脫落）；將陰性篩選六輪后的ssDNA文庫緩慢加入陽性細胞中，4°C、15rpm解育30min。解 育完畢后，用洗涂緩沖液，緩慢洗涂細胞Ξ次，再加入無 DNA酶水50化1，用細胞刮刀將細胞 收集入1.5ml離屯、管中。95°C加熱lOmin重懸ssDNA，再13000g離屯、5min收集篩選后的ssDNA 文庫。將第一輪篩選得到的ssDNA文庫進行PCR擴增、酶切純化后，干燥用做下一輪篩選文 庫，循環(huán)至篩選結(jié)束，篩選出具有特異性的核酸適配體。
[0007]本發(fā)明采用293T細胞作為篩選的陰性細胞，轉(zhuǎn)染CD33質(zhì)粒的293T細胞作為陽性細 胞進行適配體的篩選。
[000引洗涂緩沖液:4.5g Glucose，lnM MgCb 5ml，用DPBS溶解并定容至1L。
[0009] 本發(fā)明采用所述適配體篩選方法，W髓系分化抗原CD33位祀標(biāo)，經(jīng)過兩輪的篩選， 篩選出能夠特異性結(jié)合髓系分化抗原CD33蛋白的核酸適配體。并且通過流式細胞術(shù)驗證了 篩選出的適配體具有特異性W及高親和性。本發(fā)明的特點是在篩選時先進行六輪陰性篩選 去除非特異性結(jié)合，再進行陽性篩選，最終快速高效地篩選出具有特異性的核酸適配體。
【附圖說明】
[0010] 圖1是篩選過程中每一輪文庫流式細胞術(shù)親和性評價結(jié)果。
[0011] 圖2是適配體S30與S28親和性分析。
【具體實施方式】
[0012] 本發(fā)明結(jié)合附圖和實施例作進一步的說明。
[0013] 實施例1:祀向髓系分化抗原CD33核酸適配體的篩選
[0014] 1、緩沖液的配置
[0015] 洗涂緩沖液(4°C保存，有效期為30天）：
[0016] 4.5g Glucose，lnM MgCb 5ml，用DPBS溶解并定容至 1L。
[0017]結(jié)合緩沖液(4°C保存，有效期為30天）：
[001 引 4.5g Glucose，lnM MgCb 5ml，100mg tRNA，lg BSA，用DPBS溶解并定容至 1L。 [0019] 2、細胞株的準(zhǔn)備(購自中科院上海細胞庫）
[0020] 陰性細胞株:HEK-293T細胞
[0021] 陽性細胞株:HEK-293T細胞瞬轉(zhuǎn)CD33 4她
[0022] 3、ssDNA文庫的準(zhǔn)備
[0023] 將40D ssDNA文庫稀釋至50化1結(jié)合緩沖液中，滿旋并于95°C加熱5min后冰上驟冷 并置于冰上待用。
[0024] 4、陰性篩選(反篩）
[0025] 待六孔板中皿K-293T細胞生長至90%，將第一個孔上層培養(yǎng)基吸出，用洗涂緩沖 液洗涂兩次(緩慢加入50化1洗涂培養(yǎng)基，輕輕搖晃并吸出，W防細胞脫落）；再加入預(yù)處理 過的ssDNA文庫，置于4°C冰箱內(nèi)的水平搖床上，4°C、1虹pm解育30min。然后，將ssDNA文庫從 上一個孔吸出，加入預(yù)先洗涂兩次的第二個孔中，4°C、1虹pm解育30min。方法同上，直至陰 性篩選六輪后，吸出待用。
[0026] 5、陽性篩選(正篩）
[0027] 皿K-293T細胞瞬轉(zhuǎn)CD33，4化后作為陽性細胞，用洗涂緩沖液洗涂細胞兩次(緩慢 加入50化1洗涂培養(yǎng)基，輕輕搖晃并吸出，防止細胞脫落）；將陰性篩選六輪后的ssDNA文庫 緩慢加入陽性細胞中，4°C、1虹pm解育30min。解育完畢后，用洗涂緩沖液，緩慢洗涂細胞Ξ 次，再加入無 DNA酶水50化1，用細胞刮刀將細胞收集入1.5ml離屯、管中。95 °C加熱lOmin重懸 ssDNA，再13000g離屯、5min收集篩選后的ssDNA文庫。
[002引 6、PCR擴增
[00巧]PCR反應(yīng)體系(μ1):兩步擴增法50^^80^^1500μ1
[0030] 擴增步驟:將50化1模板5個循環(huán)擴增至80化1。取其中50μ1再次擴增至10化1，每擴 增3個循環(huán)取樣跑核酸膠，選擇最優(yōu)循環(huán)數(shù)。將剩余DNA作為模板按照最優(yōu)循環(huán)數(shù)擴增至 1500μ1 體系。
[0031] PCR 反應(yīng)體系(μ1):
[0036] 7、DNA 純化
[0037] 收集匯總PCR反應(yīng)液，對DM進行純化。DM純化方法同ssDNA的純化。
[0038] 8、測量ssDNA的濃度
[0039] 9、ssDNA的制備
[0040] 酶切后，純化ssDNA，干燥用做下一輪篩選文庫。
[0041] 循環(huán)Ξ輪后，將每一輪的文庫利用PCR擴增的方法帶上巧光標(biāo)簽，收集化60細胞， 用流式細胞術(shù)檢測細胞篩選時，每輪篩選后所得的DNA配基的親和性變化。其中，灰色代表 ssDNA原始文庫，藍色、紅色和綠色曲線分別代表第一、二、Ξ輪篩選后的DNA配基。結(jié)果顯 示，與原始文庫相比，第一輪篩選后得到的DNA配基已經(jīng)有了較好的親和性，且第二輪篩選 后得到的DNA配基的親和性進一步提高，而第Ξ輪篩選后所得的DNA配基的親和性不再提高 (如圖1)。因此，選取第二輪作為篩選結(jié)束。通過高通量測序的方法，獲得第二輪篩選文庫中 的適配體序列，并按照穩(wěn)定性從中挑選出S30與S28,利用流式細胞術(shù)對其親和性進行了分 析，流式細胞術(shù)結(jié)果表明兩條適配體均具有較好的親和性(如圖2)。
[0042]結(jié)果表明，經(jīng)過兩輪的篩選后，ssDNA文庫的親和性較第一輪有了較大的提高，并 且將第二輪篩選文庫測序所得的序列也具有較好的特異性和親和性，表明該方法能夠快速 有效地獲得具有較好特異性和親和性的核酸適配體。所述核酸適配體的序列如SEQ NO. 1-5 所示：
【主權(quán)項】
1. 一種高效快速篩選適配體的方法，其特征在于，通過以下步驟實現(xiàn):將HEK-293T細胞 種于六孔板匯總，待六孔板中HEK-293T細胞生長至90%，將第一個孔上層培養(yǎng)基吸出，用洗 滌緩沖液洗滌兩次；再加入預(yù)處理過的s s D N A文庫，置于4 °C冰箱內(nèi)的水平搖床上，4 °C、 15rpm孵育30min，然后，將ssDNA文庫從上一個孔吸出，加入預(yù)先洗滌兩次的第二個孔中，4 °C、15rpm孵育30min，重復(fù)以上方法，直至陰性篩選六輪后，吸出待用;將HEK-293T細胞瞬轉(zhuǎn) 質(zhì)粒，48h后作為陽性細胞，用洗滌緩沖液洗滌細胞兩次;將陰性篩選六輪后的ssDNA文庫緩 慢加入陽性細胞中，4°C、15rpm孵育30min，孵育完畢后，用洗滌緩沖液，緩慢洗滌細胞三次， 再加入無 DNA酶水500μ1，用細胞刮刀將細胞收集入1.5ml離心管中，95°C加熱lOmin重懸 ssDNA，再13000g離心5min收集篩選后的ssDNA文庫，將第一輪篩選得到的ssDNA文庫進行 PCR擴增、酶切純化后，干燥用做下一輪篩選文庫，循環(huán)至篩選結(jié)束，篩選出具有特異性的核 酸適配體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效快速篩選適配體的方法，其特征在于，洗滌緩沖液由 4.5g Glucose，lnM MgCl2 5ml，用DPBS溶解并定容至 1L。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效快速篩選適配體的方法，其特征在于，采用293T細胞 作為篩選的陰性細胞，轉(zhuǎn)染CD33質(zhì)粒的293T細胞作為陽性細胞進行適配體的篩選。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種高效快速篩選適配體的方法，以髓系分化抗原CD33位靶標(biāo)，在篩選時先進行六輪陰性篩選去除非特異性結(jié)合，再進行陽性篩選，篩選出能夠特異性結(jié)合髓系分化抗原CD33蛋白的核酸適配體。并且通過流式細胞術(shù)驗證了篩選出的適配體具有特異性以及高親和性。本發(fā)明方法設(shè)計合理，采用293T細胞作為篩選的陰性細胞，轉(zhuǎn)染CD33質(zhì)粒的293T細胞作為陽性細胞進行適配體的篩選，最終快速高效地篩選出具有特異性的核酸適配體。
【IPC分類】C40B30/04, C12N15/115, C12N15/10
【公開號】CN105671050
【申請?zhí)枴緾N201610201681
【發(fā)明人】那仁滿都拉, 楊暢, 付玉潔, 黃萍, 葛明華
【申請人】浙江大學(xué)
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2016年3月31日