專利名稱：：二(5-丁基-2-吡啶甲酸-n1,o2)合銅(ⅱ)在制備抗結(jié)核病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及金屬絡(luò)合物在抗結(jié)核菌領(lǐng)域的應(yīng)用，尤其涉及二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)在制備抗結(jié)核病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)引起的結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的傳染病，而且隨著耐藥菌株增加和在艾滋病人群中并發(fā)結(jié)核病等諸多原因，近年來全球結(jié)核病的發(fā)病呈增高趨勢。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估計(jì)，目前全球受Mtb感染的人口占世界人口的三分之一，其中5%10%的感染者成為結(jié)核病患者。我國每年出現(xiàn)活動性肺結(jié)核病人130萬例，其中傳染性肺結(jié)核約60萬例，是全球結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一。自20世紀(jì)50年代初，抗結(jié)核藥物相繼問世，使結(jié)核病的治療起到劃時(shí)代的變化。傳統(tǒng)的第一線抗結(jié)核藥物有異煙肼、鏈霉素、對氨水楊酸鈉，其他則為第二線藥物如利福平等老藥及利福霉素、喹諾酮類等新藥。然而由于結(jié)核病患者的治療管理尚不十分規(guī)范，不規(guī)則化療，濫用抗結(jié)核藥物，不執(zhí)行歸口管理等問題仍然嚴(yán)重，使結(jié)核病耐藥情況日益嚴(yán)重，且耐藥性的變化更趨向于多種藥物同時(shí)耐藥，尤其是對異煙肼和利福平同時(shí)耐藥的多重耐藥性結(jié)核(MDR-TB)發(fā)生率高，這給結(jié)核病的防治工作造成極大困難。海洋微生物由于其所處的特殊環(huán)境，發(fā)展出了各種獨(dú)特的代謝方式，這不僅確保其在極端環(huán)境中生存，也為人類提供了在陸地微生物中難以發(fā)現(xiàn)的大量新穎代謝產(chǎn)物，其中不少具有潛在的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，已被認(rèn)為是尋找藥理活性物質(zhì)的新源泉。此外，海洋微生物易于采集和培養(yǎng)，人工發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物比高等生物所含的物質(zhì)更易提純，成本更低，符合可持續(xù)發(fā)展的資源開發(fā)原則，所以從中篩選到的活性化合物更利于工業(yè)化生產(chǎn)。來源于紅樹林內(nèi)源真菌F^flWwmsp.ZZF51的銅離子絡(luò)合物——二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(11)，其結(jié)構(gòu)式如式(I)所示，為藍(lán)色晶體，化學(xué)式組成為C2oH24CuN204，分子質(zhì)量為419.1019。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(I)譚倪等人譚倪、邵長倫、何麗仙等，Cu(II)促進(jìn)海洋真菌Fusariumsp.ZZF51產(chǎn)生代謝產(chǎn)物二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)的研究，中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2008年第47巻第4期已經(jīng)給出式(I)所示銅離子絡(luò)合物的提取方法以及結(jié)構(gòu)分析，但未研究該銅離子絡(luò)合物的醫(yī)藥學(xué)性質(zhì)。目前尚未見有二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)具有抗結(jié)核活性的相關(guān)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供來源于海洋紅樹林內(nèi)源真菌的二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)在制備抗結(jié)核病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實(shí)現(xiàn)的發(fā)明人從紅樹林內(nèi)源真菌F^"n'wmsp.ZZF51的培養(yǎng)液的乙酸乙酯萃取部位，經(jīng)硅膠柱層析，在乙酸乙酯/石油醚(體積比為90/10)的洗脫液中得到二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(n)，其結(jié)構(gòu)式如式(I)所示，外觀為藍(lán)色晶體，化學(xué)式組成為(32(^240^204，分子質(zhì)量為419.1019，紅外光譜羰基吸收峰為1653cm—1，飽和脂肪烴基吸收峰為2929，1342,701(^1-1，核磁共振氫譜在化學(xué)位移S0.8961.668和10.01311.326出現(xiàn)兩組包狀吸收信號，顯微電鏡(能譜)給出化合物中含有銅元素，如下結(jié)構(gòu)被X射線單晶結(jié)物證實(shí)。本發(fā)明人先用卡介苗做應(yīng)試菌株，采用紙片擴(kuò)散法對二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)的抗結(jié)核菌活性進(jìn)行初步試驗(yàn)，根據(jù)初步試驗(yàn)的結(jié)果，本發(fā)明再用固體培養(yǎng)基稀釋法測定了該化合物對卡介苗、結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37RV株、臨床分離耐ISREMTB株、臨床分離耐ISEMTB株四種結(jié)核菌的最小抑菌濃度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)具有很強(qiáng)的抗結(jié)核菌活性，可作為治療結(jié)核菌感染疾病的先導(dǎo)化合物，也可用于制備治療結(jié)核病藥物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果1.本發(fā)明提供了一種新的可用于抗結(jié)核病治療的化合物——二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(11)，從而擴(kuò)大了抗結(jié)核菌藥物的種類；2.針對目前結(jié)核病發(fā)病率高、結(jié)核桿菌多重耐藥菌株及人體免疫缺陷病毒雙重感染的出現(xiàn)，使結(jié)核病發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢的現(xiàn)狀，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)二(5-丁基-2-妣啶甲酸-Nl，02)合銅(II)具有抗結(jié)核菌和耐藥性結(jié)核菌活性的特點(diǎn)，可用于抗結(jié)核藥物的制備，具有非常廣闊的應(yīng)用前景；3.二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)來源于海洋紅樹林內(nèi)生真菌，從真菌中提取化合物的方法簡單，而優(yōu)化培養(yǎng)方法將使大量發(fā)酵生產(chǎn)本化合物的成本低廉。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步地描述，但具體實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何限定。實(shí)施例l二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)的制備配制培養(yǎng)基，其配方為含葡萄糖10g/L、蛋白胨2g/L、酵母膏l(xiāng)g/L、粗海鹽2g/L，pH為7.0。采用上述培養(yǎng)基對紅樹林內(nèi)源真菌i^^n'wwsp.ZZF51進(jìn)行懸浮態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，在25"靜置培養(yǎng)22天，過濾，收集發(fā)酵液。將上述發(fā)酵液采用乙酸乙酯萃取，萃取物拌硅膠裝柱，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫，從體積比為9:l的乙酸乙酯和石油醚的洗脫液中得到絡(luò)合物粗品，經(jīng)一次制備薄層層析，一次重結(jié)晶純化后可制得純品二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)。實(shí)施例2固體培養(yǎng)基稀釋法測定二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(n)抗卡介苗絕對濃度從斜面上刮取卡介苗培養(yǎng)物，加入到3mlMiddlebrook7H9肉湯培養(yǎng)基中，加入少量玻璃珠，旋緊試管蓋，于渦旋振蕩器上劇烈振動研磨，與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁?MacFarlandNo.1)比濁，即配成lmg/ml的卡介苗菌懸液。將二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)用DMSO配成高濃度的原液，用含5%的吐溫-80無菌超純水稀釋原液至所需濃度，將稀釋好的二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)加入到4mlMiddlebrook7H11瓊脂培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基已經(jīng)12rC高壓蒸氣滅菌15分鐘、冷卻至5055。C)，混勻，制成含二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)濃度分別為60ug/ml、40yg/ml、30ug/ml、20ug/ml、15ug/ml禾口10ug/ml的斜面培養(yǎng)基。將濃度為lmg/ml的卡介苗菌懸液用接種環(huán)蘸取數(shù)環(huán)，分別接種于含二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)系列濃度的培養(yǎng)基和空白對照培養(yǎng)基斜面上，置于37。C培養(yǎng)48周，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果如表l所示。本實(shí)施例中所用Middlebrook7H9肉湯培養(yǎng)基和Middlebrook7H11瓊脂培養(yǎng)基為本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行結(jié)核菌培養(yǎng)時(shí)的常用培養(yǎng)基，其配方采用常規(guī)配方即可。實(shí)施例3固體培養(yǎng)基稀釋法測定二(5-丁基2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)抗結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37RV株絕對濃度從斜面上刮取結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37RV株培養(yǎng)物，加入到3mlMiddlebrook7H9肉湯培養(yǎng)基中，加入少量玻璃珠，旋緊試管蓋，于渦旋振蕩器上劇烈振動研磨，與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁?MacFarlandNo.1)比濁，即配成lmg/ml的H37RV株菌懸液。將二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)用DMSO配成高濃度的原液，用含5%的吐溫-80無菌超純水稀釋原液至所需濃度，將稀釋好的二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)按所需劑量加入到4mlMiddlebrook7H11瓊脂培養(yǎng)基中(該培養(yǎng)基已經(jīng)12rC高壓蒸氣滅菌15分鐘，并冷卻至5055°C)，混勻，制成含二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)濃度分別為60iig/ml、40iig/ml、30yg/ml、20ug/ml、15yg/ml禾n10ug/ml的斜面培養(yǎng)基。將濃度為lmg/ml的H37RV株菌懸液用接種環(huán)蘸取數(shù)環(huán)，分別接種于含二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)系列濃度的培養(yǎng)基和空白對照培養(yǎng)基斜面上，置于37。C培養(yǎng)48周，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果如表l所示。實(shí)施例4固體培養(yǎng)基稀釋法測定二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)抗結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐ISREMTB株絕對濃度從斜面上刮取結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐ISREMTB株(耐異煙肼、鏈霉素、利福平、乙胺丁醇結(jié)核桿菌臨床分離株)培養(yǎng)物，加入到3mlMiddlebrook7H9肉湯培養(yǎng)基中，加入少量玻璃珠，旋緊試管蓋，于渦旋振蕩器上劇烈振動研磨，與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁?MacFarlandNo.l)比濁，即配成lmg/ml的菌懸液。將二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)用DMSO配成高濃度的原液，用含5%的吐溫-80無菌超純水稀釋原液至所需濃度，將稀釋好的二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)按所需劑量加入到4mlMiddlebrook7H11瓊脂培養(yǎng)基中(該培養(yǎng)基已經(jīng)12rC高壓蒸氣滅菌15分鐘，并冷卻至5055。C)，混勻，制成含二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)濃度分別為60ug/ml、40yg/ml、30ug/ml、20ug/ml、15ug/ml和10ug/ml的斜面培養(yǎng)基。將濃度為lmg/ml的結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐ISREMTB株菌懸液用接種環(huán)蘸取數(shù)環(huán)，分別接種于含二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)系列濃度的培養(yǎng)基和空白對照培養(yǎng)基斜面上，置于37C培養(yǎng)48周，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果如表l所示。實(shí)施例5固體培養(yǎng)基稀釋法測定二(5-丁基-2-吡旋甲酸-Nl，02)合銅(II)抗結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐ISEMTB株絕對濃度從斜面上刮取結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐ISEMTB株(耐異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇結(jié)核桿菌臨床分離株)培養(yǎng)物，加入到3mlMiddlebrook7H9肉湯培養(yǎng)基中，加入少量玻璃珠，旋緊試管蓋，于渦旋振蕩器上劇烈振動研磨，與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁?MacFarlandNo.l)比濁，配成lmg/ml的結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐ISEMTB株菌懸液。將二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)用DMSO配成高濃度的原液，用含5%的吐溫-80無菌超純水稀釋原液至所需濃度，將稀釋好的二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)按所需劑量加入到4mlMiddlebrook7Hl1瓊脂培養(yǎng)基中(該培養(yǎng)基已經(jīng)12rC高壓蒸氣滅菌15分鐘，并冷卻至5055°C)，混勻，制成含二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)濃度分別為60ug/ml、40ug/ml、30ug/ml、20yg/ml、15ug/ml和10ug/ml的斜面培養(yǎng)基。將濃度為lmg/ml的結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐ISEMTB株菌懸液用接種環(huán)蘸取數(shù)環(huán)，分別接種于含二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)系列濃度的培養(yǎng)基和空白對照培養(yǎng)基斜面上，置于37。C培養(yǎng)48周，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果如表1所示。表l二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)抗卡介苗、結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37RV株、結(jié)核分枝桿菌臨床分離株耐ISREMTB株、結(jié)核分枝桿菌臨床分離株耐ISEMTB株的MIC(yg/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>權(quán)利要求1、二(5-丁基-2-吡啶甲酸-N1，O2)合銅(II)在制備抗結(jié)核病藥物中的應(yīng)用。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于所述二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)對卡介苗的最小抑菌濃度為15ug/ml，所述二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)對結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37RV株的最小抑菌濃度為15yg/ml，所述二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)對結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐ISREMTB株的最小抑菌濃度為40iig/ml，所述二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)對結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐ISEMTB株的最小抑菌濃度為10iig/ml。全文摘要本發(fā)明公開一種二(5-丁基-2-吡啶甲酸-N1，O2)合銅(II)在制備抗結(jié)核菌藥物中的應(yīng)用。二(5-丁基-2-吡啶甲酸-N1，O2)合銅(II)具有抗結(jié)核菌和耐藥性結(jié)核菌活性的特點(diǎn)，可用于抗結(jié)核菌藥物的制備，而且二(5-丁基-2-吡啶甲酸-N1，O2)合銅(II)來源于海洋紅樹林內(nèi)生真菌，從真菌中提取化合物的方法簡單，而優(yōu)化培養(yǎng)方法將使大量發(fā)酵生產(chǎn)本化合物的成本低廉，因此將二(5-丁基-2-吡啶甲酸-N1，O2)合銅(II)用于制備抗結(jié)核藥物具有非常廣闊的前景。文檔編號A61K31/44GK101669947SQ200910192549公開日2010年3月17日申請日期2009年9月22日優(yōu)先權(quán)日2009年9月22日發(fā)明者佘志剛,林永成,潘嘉慧,軍王,賴小敏申請人:中山大學(xué)