專利名稱：玉竹二氫高異黃酮提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及玉竹二氫高異黃酮提取物及其制備方法，還涉及玉竹二氫高 異黃酮提取物在制備預(yù)防和/或治療糖尿病腎病產(chǎn)品中的用途，玉竹二氫高異黃酮類化合物 3-(4'-羥苯基)-5，7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮，3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6,8-二甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮和3-(4'-甲氧苯基)-5，7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮 在制備蛋白質(zhì)非酶糖基化終末產(chǎn)物抑制劑產(chǎn)品中的用途。
背景技術(shù)：
糖尿病腎病是常見的糖尿病慢性微血管并發(fā)癥之一，通常是指由于糖尿病引起的腎小球 基底膜增厚，系膜擴張以及胞外基質(zhì)增生，導(dǎo)致腎小球的高濾過和蛋白尿。早期表現(xiàn)為尿中 排出微量白蛋白，繼之出現(xiàn)臨床蛋白尿，最后進展為慢性腎功能不全，己成為終末期腎衰的 主要病因。DN發(fā)病與高血糖引起糖代謝異常相關(guān)的機制主要有蛋白質(zhì)非酶糖基化終末產(chǎn)物 生成增多、多元醇代謝途徑異常和蛋白激酶C激活等。
已有大量證據(jù)表明，持續(xù)高血糖引起機體多種蛋白質(zhì)非酶糖基化，由此形成的非酶糖基 化終末產(chǎn)物在糖尿病腎病的發(fā)病機制中起重要作用，作為糖尿病腎病治療的新靶點，蛋白質(zhì) 非酶糖基化終末產(chǎn)物抑制劑將成為一類新型的糖尿病腎病治療藥物。
玉竹始載-丁《〈神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，源于百合科黃精屬植物玉竹Po(ygo朋f臓 (Mill.) Druce的干燥根莖，為中國藥典2005年版一部所收載。具有養(yǎng)陰潤燥，生津止渴之功 能，用于肺胃陰傷，燥熱咳嗽，咽干口渴，內(nèi)熱消渴。迄今為止，從玉竹中分離鑒定了二氫 高異黃酮(Wang Dongmei，等.Natural Product Research, 2009， 23 (6): 580)，甾體皂苷 (林厚文，等.藥學(xué)學(xué)報，1994， 29 (3): 215)， 二肽(秦海林，等.中國中藥雜志，2004， 29(1): 42)等類型化合物。玉竹二氫高異黃酮類化合物有促進乳腺癌細胞凋亡(Rafi Mohamed M,，等.Food Chemistry, 2007， 104， 332)和抗菌作用(Wang Dongmei，等.Natural Product Research, 2009， 23 (6): 580)。關(guān)于玉竹二氫高異黃酮預(yù)防和/或治療糖尿病腎病作用未見 報道。

發(fā)明內(nèi)容
本案發(fā)明人采用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)實驗性糖尿病大鼠模型探討玉竹乙醇提取物對糖尿病大 鼠腎臟保護作用研究中發(fā)現(xiàn)，玉竹乙醇提取物降低糖尿病大鼠血中糖化血紅蛋白水平和尿白
4蛋白排泄率，抑制腎皮質(zhì)蛋白質(zhì)非酶糖基化終末產(chǎn)物的形成，同時改善腎臟病理病變。進一 步采用活性指標(biāo)指導(dǎo)下的導(dǎo)向分離方法研究玉竹預(yù)防和/或治療糖尿病腎病作用物質(zhì)基礎(chǔ)，首 次發(fā)現(xiàn)了玉竹二氫高異黃酮類化合物3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡 喃-4-酮，3-(4，-羥苯基)-5,7-二羥基-6,8-二甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮和3-(4'-甲氧苯基)-5，7-二羥 基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮對蛋白質(zhì)非酶糖基化終末產(chǎn)物的形成具有明顯地抑制 作用。在此基礎(chǔ)上，本案發(fā)明人制備了玉竹二氫高異黃酮提取物并發(fā)現(xiàn)了玉竹二氫高異黃酮 提取物預(yù)防和/或治療糖尿病腎病作用，因而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供一種玉竹二氫高異黃酮提取物及其制備方法和用途。
本發(fā)明的玉竹二氫高異黃酮提取物，從玉竹根莖中提取，其中含有3-(4'-羥苯基)-5,7-二 羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮，3-(4'-羥苯基)-5，7-二羥基-6,8-二甲基-苯丙二氫吡 喃-4-酮和3-(4'-甲氧苯基)-5,7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮，上述成分是由下
述式i-m表示的化合物。
本發(fā)明的玉竹二氫高異黃酮提取物中3-(4'-羥苯基)-5，7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二 氫吡喃-4-酮，3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6,8-二甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮和3-(4'-甲氧苯基)-5，7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮的含量之和大于等于15%。
本發(fā)明提供玉竹二氫高異黃酮提取物的制備方法，該方法包括以下步驟
a) 玉竹根莖粗粉用第一溶劑回流提取，濾過，提取液合并，提取液減壓濃縮；
b) 將步驟a)獲得的提取物加水溶解，經(jīng)大孔吸附樹脂柱色譜，用水洗脫至洗脫液近無色， 棄去洗脫液；
c) 用第二溶劑洗脫至洗脫液近無色，棄去洗脫液；d)用第三溶劑洗脫至洗脫液近無色，收集洗脫液，洗脫液減壓濃縮、干燥得玉竹二氫高 異黃酮提取物。
在以上步驟中，其中步驟a)的第一溶劑為0~100%乙醇或丙酮水溶液；步驟b)大孔吸 附樹脂包括非極性或弱極性大孔吸附樹脂。步驟c)的第二溶劑為10~50%乙醇水溶液，步驟 d)的第三溶劑為60~100%乙醇水溶液。
本發(fā)明提供玉竹二氫高異黃酮提取物的制備方法，優(yōu)選的包括以下步驟
a) 玉竹根莖粗粉加70 90%乙醇水溶液回流提取，濾過，提取液合并，減壓回收乙醇；
b) 將步驟a)獲得的提取物加水溶解，經(jīng)大孔吸附樹脂柱色譜，用水洗脫至洗脫液近無色， 棄去洗脫液；
c) 用20~40°/。乙醇水溶液洗脫至洗脫液近無色，棄去洗脫液；
d) 用60 80%乙醇水溶液洗脫至洗脫液近無色，收集洗脫液，洗脫液液減壓濃縮、干燥得 玉竹二氫高異黃酮提取物。
本發(fā)明的玉竹二氫高異黃酮提取物在制備預(yù)防和/或治療糖尿病腎病產(chǎn)品中的用途。 本發(fā)明采用單次腹腔注射鏈脲佐菌素建立實驗性糖尿病大鼠模型，這是目前國內(nèi)外比較 常用的一種造模方法，可以觀察到糖尿病發(fā)病到腎臟損害的全過程，接近人類糖尿病腎病的 發(fā)病情況。結(jié)果可見造模80天后大鼠血糖、糖化血紅蛋白明顯增高，體重明顯下降，血清肌 酐、尿素氮含量增高，尿蛋白排泄率明顯增加，腎指數(shù)、腎小球體積明顯增大，腎臟病理檢 查可見，腎小球肥大，腎小球基底膜增厚，系膜區(qū)增寬，腎小囊腔呈裂隙狀，系膜基質(zhì)增生， 腎小管上皮細胞肥大，腎小管上皮細胞空泡化及顆粒變性，管腔變窄。腎小球囊玻璃滴狀病 變，位于腎小球毛細血管基底膜和內(nèi)皮之間形成腎小球毛細血管帽狀病變，導(dǎo)致腎小囊粘連， 管腔狹窄及擴張。給予玉竹二氫高異黃酮提取物治療后血清肌酐、尿素氮及尿蛋白排泄率明 顯降低，病理改變程度明顯減輕，腎小球肥大、基底膜增厚，系膜區(qū)增寬，系膜基質(zhì)增生等 一系列病變均有不同程度改善，表明玉竹二氫高異黃酮提取物對減輕糖尿病大鼠腎臟病變程 度有明顯作用。造模80天后大鼠糖化血紅蛋白和腎皮質(zhì)蛋白質(zhì)非酶糖基化終末產(chǎn)物含量明顯 增高，表明血糖持續(xù)增高后，蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)增高；玉竹二氫高異黃酮提取物連續(xù)給 藥后可明顯降低腎皮質(zhì)中蛋白質(zhì)非酶糖基化終末產(chǎn)物含量，但對血糖及糖化血紅蛋白作用不 明顯，說明其保護作用可能不是通過對糖代謝的調(diào)節(jié)，而是通過改善高糖所誘導(dǎo)的腎組織中 生物活性物質(zhì)異常代謝實現(xiàn)的；糖化血紅蛋白是非酶糖基化早期產(chǎn)物，玉竹二氫高異黃酮提 取物明顯降低蛋白質(zhì)非酶糖基化終末產(chǎn)物含量，對血糖和糖化血紅蛋白作用不明顯，表明其 對蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)的抑制作用并非依賴于血糖濃度的降低，而是特異性阻斷早期蛋白
6質(zhì)非酶糖基化產(chǎn)物向蛋白質(zhì)非酶糖基化終末產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，從而減少蛋白質(zhì)非酶糖基化終末產(chǎn) 物的形成。腎臟免疫組化檢測結(jié)果顯示造模后腎小球囊及腎小管轉(zhuǎn)化生長因子-Pl表達均明顯 增高，玉竹二氫高異黃酮提取物連續(xù)給藥后對其有明顯抑制作用。mRNA及蛋白質(zhì)印跡結(jié)果 顯示造模后腎皮質(zhì)轉(zhuǎn)化生長因子-(31表達均明顯增高，玉竹二氫高異黃酮提取物對其有降低趨 勢。上述結(jié)果表明玉竹二氫高異黃酮提取物可用于制備預(yù)防和Z或治療糖尿病腎病產(chǎn)品，也可 以含有玉竹二氫高異黃酮提取物的藥物組合物制備預(yù)防和/或治療糖尿病腎病產(chǎn)品中。
本發(fā)明的玉竹二氫高異黃酮類化合物3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二 氫吡喃-4-酮，3-(4'-羥苯基)-5，7-二羥基-6,8-二甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮和3-(4'-甲氧苯基)-5,7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮在制備蛋白質(zhì)非酶糖基化終末產(chǎn)物抑制劑產(chǎn)品中 的用途。
本發(fā)明采用體外D-葡萄糖-牛血清白蛋白蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)體系測定三種玉竹二氫 高異黃酮類化合物的抑制作用，化合物3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡 喃—4-酮，3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6，8-二甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮和3-(4'-甲氧苯基)-5,7-二羥 基-6-甲基_8-氧甲基_苯丙二氫吡喃-4-酮半數(shù)抑制濃度1(:50值分別為56.30 //M， 46.05 //M和 107.10pM，低于陽性對照氨基胍半數(shù)抑制濃度IC5o值123.48/zM。
本發(fā)明玉竹二氫高異黃酮提取物的制備方法工藝簡單，操作方便，技術(shù)易掌握，能耗小， 溶劑可回收循環(huán)使用，生產(chǎn)成本低。
本發(fā)明玉竹二氫高異黃酮提取物的制備方法優(yōu)點為其中3-(4'-羥苯基)-5，7-二羥基-6-甲基 -8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮，3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6,8-二甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮和 3-(4'-甲氧苯基)-5,7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮的含量之和大于等于15%，這 是以前技術(shù)尚未報道的，由于含量高，從而提高了療效，滿足制備預(yù)防和/或治療糖尿病腎病 產(chǎn)品的需要。
本發(fā)明玉竹二氫高異黃酮提取物可用于制備預(yù)防和/或治療糖尿病腎病產(chǎn)品優(yōu)點為作用 機制明確，改善高糖所誘導(dǎo)的腎組織中生物活性物質(zhì)異常代謝，特異性阻斷早期蛋白質(zhì)非酶 糖基化產(chǎn)物向蛋白質(zhì)非酶糖基化終末產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，預(yù)防和/或治療糖尿病腎病。
本發(fā)明還提供用本發(fā)明的玉竹二氫高異黃酮提取物以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑制 備的藥物制劑。這些藥物制劑選自以下劑型片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、 泡騰片劑、舌下片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、微囊劑、微球劑、顆粒劑、丸劑、滴 丸劑、散劑、膏劑、口服液、混懸劑、溶液劑、氣霧劑、注射劑，注射乳劑、凍干粉針，還 可以根據(jù)需要制備成緩釋或控釋制劑。本發(fā)明的含有玉竹二氫高異黃酮提取物的藥物制劑，在制備藥物制劑時可加入藥物可接 受的載體，所述藥物可接受的載體來自抗氧劑、鏊合劑、表面活性劑、填充劑、崩解劑、 濕潤劑、溶劑、緩釋材料、腸溶材料、pH調(diào)節(jié)劑、矯味劑、色素等，常用載體如:甘露糖醇、 右旋糖苷、乳糖、葡萄糖、山梨醇、木糖醇、注射用水、注射用乙醇、氯化鈉、硅衍生物、 纖維素、纖維素衍生物、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐溫80、瓊脂、碳酸鈣、聚乙二醇、 環(huán)糊精、磷脂類材料、滑石粉、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣等。
以下通過具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明，并非對本發(fā)明的限定，依照本領(lǐng)域公知 的現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的實施方式并不限于具體實施例。
具體實施例方式
實施例1
HPLC法測定玉竹二氫高異黃酮提取物中3-(4'-羥苯基)-5，7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙 二氫吡喃-4-酮，3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6,8-二甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮和3-(4'-甲氧苯 基)-5,7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮含量的方法
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗
以十八烷基硅垸鍵合硅膠為填充劑；以水為流動相A，以甲醇為流動相B，線性梯度洗 脫0min (A60%， B40%) —lOmin (A 40%， B60%) — 30 min (A 30%， B70%)— 40min(A0%， B 100 %);流速l.OmL.min-';檢測波長為254 nm。理論塔板數(shù)按3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6,8-二甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮峰計算，不低于4000。
溶液的制備
對照品溶液的制備
精密稱取3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮，3-(4'-羥苯 基)-5,7-二羥基-6,8-二甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮和3-(4，-甲氧苯基)-5,7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮對照品適量，加甲醇制成每1 mL含3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6-甲基-8-氧 甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮12 〃g、 3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6，8-二甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮28 ^g、 3-(4，-甲氧苯基)-5,7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮lOpg的溶液。
供試品溶液的制備
取玉竹二氫高異黃酮提取物O.l g，精密稱定，加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至100ml量瓶中，加甲 醇至刻度，搖勻，精密吸取10ml，置50ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液 作為供試品溶液。
樣品測定方法精密吸取供試品溶液和對照品溶液各20/4，按色譜條件進樣測定，外標(biāo)一點法計算玉竹 二氫高異黃酮提取物中3-(4'-羥苯基)-5，7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮，3-(4'-羥苯基)-5，7-二羥基-6，8-二甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮和3-(4'-甲氧苯基)-5,7-二羥基-6-甲基-8-氧 甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮的含量。
實施例2
取玉竹根莖粗粉100Kg，加9倍量乙醇回流提取3次，每次2小時，濾過，提取液合并， 減壓回收得提取物。取提取物加水溶解，加于HPD100大孔吸附樹脂柱上，用水洗脫至洗脫 液近無色，棄去洗脫液，用50%乙醇洗脫至洗脫液近無色，棄去洗脫液，用乙醇洗脫至洗脫液 近無色，收集洗脫液，減壓回收得玉竹二氫高異黃酮提取物642g。采用實施例l的方法測定 玉竹二氫高異黃酮提取物中3-(4'-羥苯基)-5，7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮， 3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6，8-二甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮和3-(4'-甲氧苯基)-5,7-二羥基-6-甲基 -8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮的含量之和為18.28 %。
實施例3
取玉竹根莖粗粉100 Kg,加12倍量90%乙醇回流提取3次，每次2小時，濾過，提取 液合并，減壓回收得提取物。取提取物加水溶解，加于HPD200大孔吸附樹脂柱上，用水洗 脫至洗脫液近無色，棄去洗脫液，用40%乙醇洗脫至洗脫液近無色，棄去洗脫液，用90%乙醇 洗脫至洗脫液近無色，收集洗脫液，減壓回收得玉竹二氫高異黃酮提取物895g。采用實施例 1的方法測定玉竹二氫高異黃酮提取物中3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫 吡喃-4-酮，3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6,8-二甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮和3-(4'-甲氧苯基)-5，7-二 羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮的含量之和為19.37 %。
實施例4
取玉竹根莖粗粉100 Kg，加8倍量70%乙醇回流提取3次，每次2小時，濾過，提取液 合并，減壓回收得提取物。取提取物加水溶解，加于AB8大孔吸附樹脂柱上，用水洗脫至洗 脫液近無色，棄去洗脫液，用30%乙醇洗脫至洗脫液近無色，棄去洗脫液，用80%乙醇洗脫至 洗脫液近無色，收集洗脫液，減壓回收得玉竹二氫高異黃酮提取物726g。采用實施例l的方 法測定玉竹二氫高異黃酮提取物中3-(4'-羥苯基)-5，7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃 -4-酮，3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6，8-二甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮和3-(4'-甲氧苯基)-5,7-二羥基 -6—甲基_8_氧甲基—苯丙二氫吡喃—4-酮的含量之和為19.50%。
實施例5
取玉竹根莖粗粉100 Kg，加10倍量50%乙醇回流提取3次，每次2小時，濾過，提取液合并，減壓回收得提取物。取提取物加水溶解，加于AB8大孔吸附樹脂柱上，用水洗脫至 洗脫液近無色，棄去洗脫液，用20%乙醇洗脫至洗脫液近無色，棄去洗脫液，用70%乙醇洗脫 至洗脫液近無色，收集洗脫液，減壓回收得玉竹二氫高異黃酮提取物985g。采用實施例l的 方法測定玉竹二氫高異黃酮提取物中3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡 喃-4-酮，3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6，8-二甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮和3-(4'-甲氧苯基)-5,7-二羥 基-6_甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮的含量之和為16.11%。
實施例6
取玉竹根莖粗粉100Kg，加10倍量水回流提取3次，每次2小時，濾過，提取液合并， 減壓回收得提取物。取提取物加水溶解，加于DIOI大孔吸附樹脂柱上，用水洗脫至洗脫液近 無色，棄去洗脫液，用10%乙醇洗脫至洗脫液近無色，棄去洗脫液，用60%乙醇洗脫至洗脫液 近無色，收集洗脫液，減壓回收得玉竹二氫高異黃酮提取物1203g。采用實施例1的方法測定 玉竹二氫高異黃酮提取物中3-(4'-羥苯基)-5，7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮， 3-(4，-羥苯基)-5,7-二羥基-6，8-二甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮和3-(4'-甲氧苯基)-5，7-二羥基-6-甲基 -8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮的含量之和為15.06%。
實施例7
取玉竹根莖粗粉100 Kg，加8倍量卯％乙醇回流提取3次，每次2小時，濾過，提取液 合并，減壓回收得提取物。取提取物加水溶解，加于DIOI大孔吸附樹脂柱上，用水洗脫至洗 脫液近無色，棄去洗脫液，用30。/。乙醇洗脫至洗脫液近無色，棄去洗脫液，用70%乙醇洗脫至 洗脫液近無色，收集洗脫液，減壓回收得玉竹二氫高異黃酮提取物780g。采用實施例l的方 法測定玉竹二氫高異黃酮提取物中3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃 -4-酮，3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6,8-二甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮和3-(4'-甲氧苯基)-5,7-二羥基 -6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮的含量之和為20.19%。
實施例8
取玉竹根莖粗粉IOO Kg，加10倍量70%乙醇回流提取3次，每次2小時，濾過，提取 液合并，減壓回收得提取物。取提取物加水溶解，加于AB8大孔吸附樹脂柱上，用水洗脫至 洗脫液近無色，棄去洗脫液，用30%乙醇洗脫至洗脫液近無色，棄去洗脫液，用90°/。乙醇洗脫 至洗脫液近無色，收集洗脫液，減壓回收得玉竹二氫高異黃酮提取物826g。采用實施例1的 方法測定玉竹二氫高異黃酮提取物中3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡 喃-4-酮，3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6,8-二甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮和3-(4'-甲氧苯基)-5,7-二羥 基_6-甲基_8_氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮的含量之和為19.48%。實施例9
取玉竹根莖粗粉100 Kg，加12倍量70%丙酮回流提取3次，每次2小時，濾過，提取 液合并，減壓回收得提取物。取提取物加水溶解，加于AB8大孔吸附樹脂柱上，用水洗脫至 洗脫液近無色，棄去洗脫液，用30%乙醇洗脫至洗脫液近無色，棄去洗脫液，用90%乙醇洗脫 至洗脫液近無色，收集洗脫液，減壓回收得玉竹二氫高異黃酮提取物756g。采用實施例1的 方法測定玉竹二氫高異黃酮提取物中3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡 喃-4-酮，3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6,8-二甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮和3-(4'-甲氧苯基)-5,7-二羥 基-6—甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮的含量之和為21.87%。
實施例10
取玉竹根莖粗粉100Kg，加9倍量丙酮回流提取3次，每次2小時，濾過，提取液合并， 減壓回收得提取物。取提取物加水溶解，加于HPD100大孔吸附樹脂柱上，用水洗脫至洗脫 液近無色，棄去洗脫液，用50%乙醇洗脫至洗脫液近無色，棄去洗脫液，用乙醇洗脫至洗脫液 近無色，收集洗脫液，減壓回收得玉竹二氫高異黃酮提取物509 g。采用實施例1的方法測定 玉竹二氫高異黃酮提取物中3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮， 3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6，8-二甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮和3-(4'-甲氧苯基)-5,7-二羥基-6-甲基 -8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮的含量之和為21.21%。
實施例11
取玉竹根莖粗粉100Kg，加8倍量90%丙酮回流提取3次，每次2小時，濾過，提取液 合并，減壓回收得提取物。取提取物加水溶解，加于DIOI大孔吸附樹脂柱上，用水洗脫至洗 脫液近無色，棄去洗脫液，用30%乙醇洗脫至洗脫液近無色，棄去洗脫液，用70%乙醇洗脫至 洗脫液近無色，收集洗脫液，減壓回收得玉竹二氫高異黃酮提取物636g。采用實施例l的方 法測定玉竹二氫高異黃酮提取物中3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃 —4-酮，3-(4，-羥苯基)-5，7-二羥基-6,8-二甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮和3-(4'-甲氧苯基)-5，7-二羥基 -6—甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮的含量之和為23.71%。
實施例12
取玉竹根莖粗粉IOO Kg，加12倍量90%丙酮回流提取3次，每次2小時，濾過，提取 液合并，減壓回收得提取物。取提取物加水溶解，加于HPD200大孔吸附樹脂柱上，用水洗 脫至洗脫液近無色，棄去洗脫液，用40%乙醇洗脫至洗脫液近無色，棄去洗脫液，用90%乙醇 洗脫至洗脫液近無色，收集洗脫液，減壓回收得玉竹二氫高異黃酮提取物777g。采用實施例 1的方法測定玉竹二氫高異黃酮提取物中3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃—4-酮，3-(4，-羥苯基)-5,7-二羥基-6,8-二甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮和3-(4'-甲氧苯基)-5,7-二 羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮的含量之和為21.26%。 實施例13
取玉竹根莖粗粉100Kg，加8倍量70%丙酮回流提取3次，每次2小時，濾過，提取液 合并，減壓回收得提取物。取提取物加水溶解，加于AB8大孔吸附樹脂柱上，用水洗脫至洗 脫液近無色，棄去洗脫液，用30%乙醇洗脫至洗脫液近無色，棄去洗脫液，用80%乙醇洗脫至 洗脫液近無色，收集洗脫液，減壓回收得玉竹二氫高異黃酮提取物849g。采用實施例1的方 法測定玉竹二氫高異黃酮提取物中3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃 -4-酮，3-(4'-羥苯基)-5，7-二羥基-6,8-二甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮和3-(4'-甲氧苯基)-5,7-二羥基 -6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮的含量之和為18.99%。
實施例14
取玉竹根莖粗粉100 Kg，加10倍量50%丙酮回流提取3次，每次2小時，濾過，提取 液合并，減壓回收得提取物。取提取物加水溶解，加于AB8大孔吸附樹脂柱上，用水洗脫至 洗脫液近無色，棄去洗脫液，用20%乙醇洗脫至洗脫液近無色，棄去洗脫液，用70%乙醇洗脫 至洗脫液近無色，收集洗脫液，減壓回收得玉竹二氫高異黃酮提取物920g。采用實施例1的 方法測定玉竹二氫高異黃酮提取物中3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡 喃-4-酮，3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6，8-二甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮和3-(4'-甲氧苯基)-5，7-二羥 基-6-甲基-8—氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮的含量之和為17.34%。
實施例15
取玉竹根莖粗粉100 Kg，加10倍量10%丙酮回流提取3次，每次2小時，濾過，提取 液合并，減壓回收得提取物。取提取物加水溶解，加于DIOI大孔吸附樹脂柱上，用水洗脫至 洗脫液近無色，棄去洗脫液，用10%乙醇洗脫至洗脫液近無色，棄去洗脫液，用60%乙醇洗脫 至洗脫液近無色，收集洗脫液，減壓回收得玉竹二氫高異黃酮提取物924g。采用實施例1的 方法測定玉竹二氫高異黃酮提取物中3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡 喃-4—酮，3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6,8-二甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮和3-(4'-甲氧苯基)-5，7-二羥 基—6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮的含量之和為16.33%。
實施例16
玉竹二氫高異黃酮提取物用藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑制備的藥物制劑。這些藥物制 劑選自以下劑型片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、泡騰片劑、舌下片劑、膠囊 劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、微囊劑、微球劑、顆粒劑、丸劑、滴丸劑、散劑、膏劑、口服液、
12混懸劑、溶液劑、氣霧劑、注射劑，注射乳劑、凍千粉針，還可以根據(jù)需要制備成緩釋或控 釋制劑，在制備藥物制劑時可加入藥物可接受的載體，所述藥物可接受的載體來自抗氧劑、 鏊合劑、表面活性劑、填充劑、崩解劑、濕潤劑、溶劑、緩釋材料、腸溶材料、pH調(diào)節(jié)劑、 矯味劑、色素等，常用載體如甘露糖醇、右旋糖苷、乳糖、葡萄糖、山梨醇、木糖醇、注 射用水、注射用乙醇、氯化鈉、硅衍生物、纖維素、纖維素衍生物、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、 甘油、吐溫80、瓊脂、碳酸鈣、聚乙二醇、環(huán)糊精、磷脂類材料、滑石粉、硬脂酸鎂、硬脂 酸鈣。上述制備工藝均為本領(lǐng)域常規(guī)操作，在此不加贅述。 實施例17
玉竹二氫高異黃酮提取物為原料制得的藥物制劑不僅包括申.獨使用玉竹二氫高異黃酮提 取物的藥物制劑，還包括添加玉竹二氫高異黃酮提取物作為活性成分的藥物制劑。
實施例18
玉竹二氫高異黃酮提取物的分離
取玉竹二氫高異黃酮提取物3.0g,經(jīng)十八烷基鍵合硅膠柱色譜，以甲醇-水(60: 40， 80: 20, 100: 0)梯度洗脫，得4個分離組分Fr. I (824 mg)， Fr. II (845 mg)， Fr. III (712 mg)， Fr.IV (577 mg)。 Fr. II經(jīng)制備高效液相色譜(色譜柱ShimPakODS， (p21.2x250 mm;流動 相甲醇-水=60: 40;流速3.0mliW;紫外檢測器UV 254 nm)得化合物3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮(102 mg)和3-(4'-羥苯基)-5，7-二羥基-6，8-二甲基 -苯丙二氫枇喃-4-西同(113 mg)。Fr. III經(jīng)制備高效液相色譜(色譜柱Shim PakODS， cp21.2x250 mm;流動相甲醇-水=70: 30;流速3.0ml.min";紫外檢測器UV254nm)得化合物3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6，8-二甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮 (91 mg)和3-(4'-甲氧苯基)-5,7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮(85mg)。
化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)鑒定
化合物3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮 '關(guān)MR (500 MHz, CD3OD) 5 : 7.06 (2H, d， J= 8.4 Hz, H-2，， 6，)， 6.74 (2H, d, J= 8.5 Hz, H-3，,5'), 4.30 (IH, dd, J= 11.4, 4.2 Hz， H-2a), 4.15 (1H, dd， /= 11.4, 6.9 Hz, H-2b), 3.73 (3H, s, 8-OCH3), 3.10(1H, dd,J= 13.8,4.6 Hz, H-9a), 2.81 (1H, m, H-3), 2.68 (1H, dd,J^ 13.8, 10.2 Hz, H-9b), 1.98 (3H， s, 6-CH3), '3C-NMR (125 MHz, CD3OD) 5 : 199.67 (C-4), 159.01 (C-5), 158.65 (C-7), 157.24 (C-4，)， 152.97 (C-8a), 131.17 (C-2'， 6，)， 130.18 (C-l，)， 129.15 (C-8), 116.41 (C-3,, 5'), 105.28 (C-6), 102.43 (C-4a)， 70.44 (C-2), 61.58 (8-OCH3), 48.25 (C-3), 33.23 (C-9)， 7.19 (6-CH3); HR ESI-MS附/z 3 31.1179 [M+H] + ?；衔?-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6,8-二甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮
'H-NMR (500 MHz, CD3OD) S : 7.05 (2H, d, /= 8.4 Hz, H墨2', 6'), 6.73 (2H, d， J= 8.5 Hz, H-3'， 5'), 4.23 (1H, dd, J= 11.4， 4.2 Hz， H-2a)， 4.07 (1H， dd, J= 11.4, 7.2 Hz， H-2b), 3.08 (1H, dd， J= 13.8， 4.6 Hz, H-9a), 2.75 (1H, m, H-3), 2.62 (1H, dd， ■/= 13.8, 10.3 Hz, H-9b), 1.99 (3H, s, 6-CH3)， 1.97 (3H, s, 8-CH3); 13C-NMR (500 MHz, CD3OD) 5 : 200.04 (C-4), 163.89 (C-7), 160.56 (C-5), 159.10 (C-8a), 157.12 (C-4')， 131.12 (C-2，， 6，)， 130.35 (C-l')， 116.37 (C-3'， 5，)， 104.76 (C-6)， 103.69 (C-8), 102.72 (C-4a), 70.03 (C-2), 48.12 (C-3)， 33.10 (C-9), 7.88 (8-CH3), 7.41 (6-CH3); ESI-MS w/i 313 [M-H]-。
化合物3-(4'-甲氧苯基)-5，7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮
'H-雨R (500 MHz, CD3OD) 5 : 7.16 (2H, d， J= 8.6 Hz, H-2，，6'), 6.87 (2H， (!，■/= 8.7 Hz, H-3，， 5'), 4.31 (1H， dd, J= 11.3, 4.2 Hz， H-2a), 4.15 (IH, dd, J= 11.3, 7.0 Hz, H-2b)， 3.13 (IH, dd, J= 13.8, 4,7 Hz, H-9a), 2.84 (IH, m， H-3)， 2.72 (IH, dd， ■/= 13.8, 10.0 Hz, H-9b), 3.77 (3H, s， 4'-OCH3), 3.73 (3H, s, 8-OCH3)， 1.98 (3H, s, 6-CH3); 13C-NMR (125 MHz， CD3OD) S : 199.55 (C-4), 160.01 (C-4')， 159.02 (C-5), 158.66 (C-7)， 152.95 (C-8a)， 131.45 (C-l,), 131.17 (C-2', 6')， 129.17 (C-8), 115.10 (C-3，， 5'), 105.31 (C-6), 102.44 (C-4a)， 70.48 (C-2)， 61.58 (8-OCH3), 55.70 (4，-OCH3), 48.17 (C-3), 33.16 (C-9)， 7.19 (6-CH3); HR ESI-MS附/z 343.1179 [M-H〗.。
實施例19
玉竹二氫高異黃酮提取物對實驗性糖尿病模型大鼠血糖和糖化血紅蛋白的影響 Wistar大鼠禁食12小時后，-次性腹腔注射鏈脲佐菌素(臨用吋以0.1 mol/L pH 4.5枸 櫞酸緩沖液配成0.6 %濃度)60 mg/kg， 5天后血糖大于16.7 mmol/L的大鼠作為實驗性糖尿 病模型用于實驗，隨機均分3組，分別為模型對照組，鹽酸氨基胍25mg/kg組，玉竹二氫高 異黃酮提取物40 mg/kg組。分組后各組大鼠每天灌胃給藥一次，連續(xù)80天，正常對照組及 模型對照組給予同體積蒸餾水(IO ml/kg)。連續(xù)給藥40和80天，大鼠尾尖采血，測血糖(GLU) 含量，連續(xù)給藥80天測糖化血紅蛋白(GHb)含量。結(jié)果見表l。
14表1玉竹二氫高異黃酮提取物對實驗性糖尿病模型大鼠血糖和糖化血紅蛋白的影響
組別劑量動物數(shù)GLU (mmol/L)GHb
mg/kgno天40天80天A值/10gHb
正常對照組86.49士0.86"'6.44±0.99*"6.44±0.92*"16.52±1.55**
模型對照組824.29±5.6925.33±6.7922.64±3.9221.06±3.15
鹽酸氨基胍25823.11士5.9423.38±3.4021.19±4.4120.17±3.88
玉竹二氫高異黃酮40823.24±5.4922.40±3.6221.95±3.5519.37士2.68
同模型對照組比較**P<0.01， ***P<0.001.
同正常對照組比較，模型對照組大鼠血糖和糖化血紅蛋白明顯增高。玉竹二氫高異黃酮
提取物40 mg/kg組和鹽酸氨基胍25 mg/kg組同模型對照組比較無明顯差異。 實施例20
玉竹二氫高異黃酮提取物對實驗性糖尿病模型大鼠腎功能的影響
Wistar大鼠禁食12小時后， 一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(臨用時以0.1 mol/L pH 4.5枸 櫞酸緩沖液配成0.6 %濃度)60 mg/kg， 5天后血糖大于16.7 mmol/L的大鼠作為實驗性糖尿 病模型用于實驗，隨機均分3組，分別為模型對照組，鹽酸氨基胍25 mg/kg組，玉竹二氫高 異黃酮提取物40 mg/kg組。分組后各組大鼠每天灌胃給藥一次，連續(xù)80天，正常對照組及 模型對照組給予同體積蒸餾水(10ml/kg)。實驗結(jié)束時苦味酸法測定血清肌酐(Cr)含量， 脲酶連續(xù)檢測法測定血清尿素氮(BUN)含量。實驗結(jié)束前一天大鼠禁食禁水，代謝籠收集 24小時尿液，考馬斯亮藍法測定尿蛋白濃度，根據(jù)公式尿蛋白濃度x24小時尿量計算尿蛋 白排泄率。結(jié)果見表2。
表2玉竹二氫高異黃酮提取物對實驗性糖尿病模型大鼠腎功能的影響
組別劑量動物數(shù)尿蛋白排泄率BUNCr
mg/kgnmg/24hmmol/Lmmol/L
正常對照組8*沐* 11.45±3.279.97±1.53*"68.67±6.37"*
模型對照組839.18士6.2131.17±9.87126.15±35.84
鹽酸氨基胍25826.10士6.23'"16.35士4.0廣80.42土8.39"
玉竹二氫高異黃酮40827.28士6.86"21.90±5.79*90.48± 15.44*
同模型對照組比較*P<0.05， **P<0.01， ***P<0.001.
同正常對照組比較，模型對照組大鼠血清肌酐和尿素氮水平明顯增高，尿蛋白排泄率明顯增高。玉竹二氫高異黃酮提取物40 mg/kg組和鹽酸氨基胍25 mg/kg組同模型對照組比較可 明顯降低血清肌酐和尿素氮含量，同時尿蛋白排泄率明顯降低。 實施例21
玉竹二氫高異黃酮提取物對實驗性糖尿病模型大鼠體重、腎指數(shù)、腎小球體積的影響 Wistar大鼠禁食12小時后， 一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(臨用時以0.1 mol/L pH 4.5枸 櫞酸緩沖液配成0.6 %濃度)60 mg/kg， 5天后血糖大于16.7 mmoI/L的大鼠作為實驗性糖尿 病模型用于實驗，隨機均分3組，分別為模型對照組，鹽酸氨基胍25mg/kg組，玉竹二氫高 異黃酮提取物40 mg/kg組。分組后各組大鼠每天灌胃給藥一次，連續(xù)80天，正常對照組及 模型對照組給予同體積蒸餾水(10ml/kg)。根據(jù)公式腎重量(g) /體重(g) J00計算腎指數(shù)。 結(jié)果見表3。
表3玉竹二氫高異黃酮提取物對實驗性糖尿病模型大鼠體重、腎指數(shù)、腎小球體積的影響
組別劑量動物數(shù)體重腎指數(shù)腎小球體積
mg/kgn(g)(g/100g體重)
正常對照組8it:** 510.6±53.90.62±0.07***557.9±150.9"*
模型對照組8196.1 ±47.12.81 ±0.72913.9±82.0
鹽酸氨基胍258271.5±60.8'1.10±0.16**82].3±174.4
玉竹二氫高異黃酮408255.0±58.7*1.16±0.17*806.3±218.8
同模型對照組比較*P<0.05， **P<0.01， ***P<0.001.
同正常對照組比較，模型對照組大鼠體重明顯增長明顯減慢，腎指數(shù)及腎小球體積明顯 增大。玉竹二氫高異黃酮提取物40 mg/kg組和鹽酸氨基胍25 mg/kg組同模型對照組比較體重 增長明顯加快，腎指數(shù)明顯減小，腎小球體積有明顯降低趨勢。
實施例22
玉竹二氫高異黃酮提取物對實驗性糖尿病模型大鼠腎皮質(zhì)AGEs含量的影響 Wistar大鼠禁食12小時后， 一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(臨用時以0.1 mol/L pH 4.5枸 橡酸緩沖液配成0.6 %濃度)60 mg/kg， 5天后血糖大于16.7 mmol/L的大鼠作為實驗性糖尿 病模型用于實驗，隨機均分3組，分別為模型對照組，鹽酸氨基胍25 mg/kg組，玉竹二氫高 異黃酮提取物40 mg/kg組。分組后各組大鼠每天灌胃給藥一次，連續(xù)80天，正常對照組及 模型對照組給予同體積蒸餾水(10 ml/kg)。腎皮質(zhì)糖基化終末產(chǎn)物AGEs測定
1)組織處理參考Soulis-Liparota的方法進行。步驟如下取適量腎皮質(zhì)，剪碎，在冷的PBS液中制成勻漿，6500rpm， 4T離心30min;棄上清液，沉淀中加入氯仿-甲醇(2: 1) 5 m1，4 'C輕輕攪拌，放置過夜去除脂質(zhì)；加入甲醇2 ml和蒸餾水0.5 ml水化，自然沉淀；6500 rpm, 4。C離心30min，棄上清液；沉淀用甲醇5 ml洗滌2次；蒸餾水5ml洗滌3次；沉淀 懸浮于含1 mg/ml胃蛋白酶的0.5 M冰醋酸溶液中，4 'C孵育18小時去除非膠原蛋白； 6500rpm， 4 。C離心30 min;棄上清液；沉淀用含0.1MCaCl2和0.05%甲苯的0.02Mtris-HCl 緩沖液(pH7.5)洗滌2次；加入含IV型膠原酶0.1mg/ml和蛋白酶K0.1mg/ml的0.02M Tris-HCl 緩沖液(pH7.5) 2ml， 37。C輕輕振蕩60h; 6500卬m， 4 "C離心30 min，上清液用于AGEs
2) 上清液中羥脯氨酸含量以樣本堿水解法試劑盒測定。
3) AGEs的熒光測定取部分膠原提取液以0.1mg/ml的IV型膠原酶和0.1mg/ml蛋白酶 K為空白對照，測定膠原相關(guān)的熒光(激發(fā)波長370nm/發(fā)射波長440nm)，以lmg/ml羥脯氨 酸的熒光值為一個AFU，其它熒光值與之相比所得之值即為該樣品的熒光單位。最終結(jié)果用 AFU/mg膠原蛋白(AFU/mgco11)表示。結(jié)果見表4。
表4玉竹二氫高異黃酮提取物對實驗性糖尿病模型大鼠腎皮質(zhì)AGEs含量的影響
劑量動物數(shù)AGEs
組別
mg/kgnAFU/mgCo11
正常對照組820.41 ±4.14*'
模型對照組828.39±4.97
鹽酸氨基胍25822.45土2.26"
玉竹二氫高異黃酮40821.58士2.48"
同模型對照組比較**P<0.01.
同正常對照組比較，模型對照組大鼠腎皮質(zhì)AGEs含量明顯增加。玉竹二氫高異黃酮提 取物40 mg/kg組和鹽酸氨基胍25 mg/kg組同模型對照組比較可使大鼠腎皮質(zhì)增高的AGEs 含量明顯降低。
實施例23
玉竹二氫高異黃酮提取物對實驗性糖尿病模型大鼠腎臟TGF(31表達的影響 Wistar大鼠禁食12小時后， 一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(臨用時以0.1 mol/L pH 4.5枸櫞酸 緩沖液配成0.6 %濃度)60 mg/kg， 5天后血糖大于16.7 mmol/L的大鼠作為實驗性糖尿病模 型用于實驗，隨機均分3組，分別為模型對照組，鹽酸氨基胍25mg/kg組，玉竹二氫高異黃酮提取物40 mg/kg組。分組后各組大鼠每天灌胃給藥一次，連續(xù)80天，正常對照組及模型 對照組給予同體積蒸餾水(10 ml/kg)。分別進行免疫組化染色腎組織TGF-卩1表達測定，蛋 白質(zhì)印跡雜交(Western blot)腎皮質(zhì)TGF-pi表達測定和逆轉(zhuǎn)錄多聚酶連反應(yīng)(RT-PCR)腎 皮質(zhì)TGF-卩1表達測定，結(jié)果見表5-7。
表5免疫組化染色半定量分析 玉竹二氫高異黃酮提取物對實驗性糖尿病模型大鼠腎臟TGF卩1表達的影響
組別劑量 mg/kg動物數(shù) n腎小球囊腎小管
正常對照組83.46±0.20***3.90±0.29
模型對照組85.12±0.225.18±0.40
鹽酸氨基胍2582.16±0.25***2.68±0.35*"
玉竹二氫高異黃酮408w氺* 1.19±0.382.08±0.35*"
同模型對照組比較***P<0.001.
模型組對照組陽性表達為皮髓交界處腎小球毛細血管袢周邊部及腎小囊臟層上皮細胞 (足細胞)，在細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，與腎臟損害，足細胞空泡變性、足突融合有關(guān)且 染色明顯高于背景的細胞為陽性細胞。部分區(qū)域腎小管上皮細胞及腎間質(zhì)，亦見相似表達，
尤其在靠近腎盞的髓質(zhì)部。玉竹二氫高異黃酮提取物40 mg/kg組和鹽酸氨基胍25 mg/kg組同 模型對照組比較，在腎小球囊陽性表達普遍較弱，并呈節(jié)段性深淺不一，光鏡檢查可見不連 續(xù)性中弱陽性表達。部分病例出現(xiàn)單一細胞表達，且染色較深，說明個別腎小球局灶節(jié)段性 硬化，足細胞增生。在髓質(zhì)部腎小管區(qū)，陽性表達較為彌散，著色強度亦普遍較弱。綜合評 分結(jié)果可見，模型對照組同正常對照組比較腎小球囊和腎小管染色強度明顯增強，玉竹二氫 高異黃酮提取物40 mg/kg組和鹽酸氨基胍25 mg/kg組同模型對照組比較大鼠腎小球囊及腎小 管染色程度明顯減輕，且低于正常對照組。表6蛋白質(zhì)印跡雜交測定玉竹二氫高異黃酮提取物對實驗性糖尿病模型大鼠腎皮質(zhì)TGF卩1 mRNA表達的影響
組別劑量 mg/kg動物數(shù) nTGF卩1 mRNA
正常對照組80.123土0.037
模型對照組80.142士0.078
鹽酸氨基胍2580.072士0.07"
玉竹二氨高異黃酮4080.121±0.025
同模型對照組比較**P<0.01.
模型對照組同正常對照組比較mRNA表達有所增高。鹽酸氨基胍25 mg/kg組同模型對照組比較mRNA表達明顯降低，玉竹二氫高異黃酮提取物40 mg/kg組同模型對照組比較mRAN表達有降低趨勢，同正常對照組接近。
表7逆轉(zhuǎn)錄多聚酶連反應(yīng)(RT-PCR)檢測玉竹二氫高異黃酮提取物對實驗性糖尿病模型大鼠腎皮質(zhì)TGFP1蛋白表達的影響
組別劑量 mg/kg動物數(shù) n灰度值
正常對照組80.39±0.30
模型對照組80.69±0.59
鹽酸氨基胍2580.25土0.24'
玉竹二氫高異黃酮4080.33±0.18
同模型對照組比較*P<0.05.
模型對照組同正常對照組比較腎皮質(zhì)TGFP1蛋白表達有所增高。鹽酸氨基胍25 mg/kg組同模型對照組比較腎皮質(zhì)TGFP1蛋白表達明顯降低，玉竹二氫高異黃酮提取物40 mg/kg組同模型組比較腎皮質(zhì)TGFP1蛋白表達有降低趨勢，同正常對照組接近。
實施例24
Wistar大鼠禁食12小時后， 一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(臨用時以0.1 mol/L pH 4.5枸櫞酸緩沖液配成0.6 %濃度)60 mg/kg， 5天后血糖大于16.7 mmol/L的大鼠作為實驗性糖尿病模型用于實驗，隨機均分3組，分別為模型對照組，鹽酸氨基胍25mg/kg組，玉竹二氫高異黃酮提取物40 mg/kg組。分組后各組大鼠每天灌胃給藥一次，連續(xù)80天，正常對照組及
19模型對照組給予同體積蒸餾水(10ml/kg)。腎臟以10%中性甲酸固定，石蠟包埋標(biāo)本切成4pm切片，烤片30min， 二甲苯脫蠟，經(jīng)梯度酒精至水洗，蘇木素染細胞核，清水沖洗，鹽酸酒精分化，氨水返藍。清水浸泡5min,伊紅染細胞漿，梯度酒精脫伊紅，二甲苯透明，中性樹膠封固，光鏡觀察，用點計數(shù)法測量腎小球截面積[A]，每個腎臟至少測量30個腎小球，按V=p/Kx[A]3/2，式中(3=1,38， K=1.10。
正常對照組腎小球結(jié)構(gòu)基本正常，少數(shù)動物出現(xiàn)腎小球肥大，即血管球直徑增大，腎小囊狹窄，考慮為肥胖導(dǎo)致的損害，模型對照組，部分動物(3/8)腎小球毛細血管袢肥大，腎小囊腔呈裂隙狀，基底膜輕度增厚，系膜輕度增生，腎小管上皮細胞空泡化及顆粒變性；部分動物(3/8)腎小球毛細血管基底膜彌漫增厚，系膜基質(zhì)增生，少量系膜細胞增生，形成彌漫性糖尿病腎小球硬化癥，部分可見KW結(jié)節(jié)形成，形成結(jié)節(jié)性糖尿病腎小球硬化癥；部分病例(2/8)可見腎小球囊玻璃滴狀病變，位于腎小球毛細血管基底膜和內(nèi)皮之間形成腎小球毛細血管帽狀病變，導(dǎo)致腎小囊粘連，管腔狹窄及擴張。玉竹二氫高異黃酮提取物40mg/kg組和鹽酸氨基胍25 mg/kg組同模型對照組比較上述病理改變程度均明顯減輕，2/8動物腎小球結(jié)構(gòu)趨于正常，3/8動物出現(xiàn)腎小球肥大，血管球直徑增大，腎小囊狹窄，鹽酸氨基胍組2/8動物腎小球毛細血管拌肥大，腎小囊腔呈裂隙狀，基底膜輕度增厚，系膜輕度增生，1/8動物腎小球毛細血管基底膜彌漫增厚，系膜基質(zhì)增生，少量系膜細胞增生，形成彌漫性糖尿病腎小球硬化癥；玉竹二氫高異黃酮提取物組較鹽酸氨基胍組略重。
實施例25
體外D-葡萄糖-牛血清白蛋白蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)體系測定三種玉竹二氫高異黃酮類化合物的抑制作用
體外糖基化反應(yīng)系統(tǒng)葡萄糖終濃度200mmol/L，牛血清白蛋白終濃度10 mg/ml，疊氮鈉0.2mg/ml， PBS緩沖液0.2 mol/L， pH為7.4。反應(yīng)體積為葡萄糖lml，牛血清白蛋白lml，PBS0.85ml，受試藥物0.15m，終體積3ml。配制化合物和氨基胍終濃度分別為1 mM， 0.5mM， 0.25 mM， 0.125 mM， 0.0625 mM， 0.03125 mM， 0.015625 mM，分別加入糖基化系統(tǒng)中。另設(shè)對照①不加藥物的完整糖基化系統(tǒng)；②加藥物不含葡萄糖的糖基化系統(tǒng)；③不加藥物不含葡萄糖的糖基化系統(tǒng)，反應(yīng)體系需無菌操作，糖基化和各對照體系均在37'C恒溫、密封條件下反應(yīng)。l周后，測定各管的熒光值(F)。
AGEs測定采用960MC型熒光分光光度計，激發(fā)波長370nm，發(fā)射波長440nm，靈敏度2，增益2。
計算各種藥物對糖基化反應(yīng)的抑制作用，以抑制率(IR)表示。計算公式IR-l-[藥物管
20(F)-對照管(2)(F)/[對照管(1 )(F)-對照管(3 )(F)] x 100% 。根據(jù)抑制率和藥物濃度按Logit法計算ICM)。
化合物3-(4，-羥苯基)-5,7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮，3-(4，-羥苯基)-5,7-二羥基-6,8-二甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮和3-(4'-甲氧苯基)-5，7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮半數(shù)抑制濃度IC5o值分別為56.30pM， 46.05 〃M和107.10〃M，低于陽性對照氨基胍半數(shù)抑制濃度IC5Q值123.48 //M 。
權(quán)利要求
1、玉竹二氫高異黃酮提取物，其特征在于從玉竹根莖中提取，其中含有3-(4’-羥苯基)-5，7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮(I)，3-(4’-羥苯基)-5，7-二羥基-6，8-二甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮(II)和3-(4’-甲氧苯基)-5，7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮(III)，上述成分是由下述式I-III表示的化合物。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉竹二氫高異黃酮提取物，其特征在于其中3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮，3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6,8-二甲基-苯丙二氫 吡喃斗酮和3-(4'-甲氧苯基)-5,7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮的含量之和大于 等于15%。
3、 權(quán)利要求1 2所述的玉竹二氫高異黃酮提取物的制備方法，其特征在于包括以下步驟a) 玉竹根莖粗粉用0 100%乙醇或丙酮水溶液回流提取，濾過，提取液合并，提取液減壓 濃縮；b) 將步驟a)獲得的提取物加水溶解，經(jīng)非極性或弱極性大孔吸附樹脂柱色譜，用水洗脫 至洗脫液近無色，棄去洗脫液；c) 用10 50%乙醇水溶液至洗脫液近無色，棄去洗脫液；d) 用60 100%乙醇水溶液洗脫至洗脫液近無色，收集洗脫液，洗脫液減壓濃縮、干燥得 玉竹二氫高異黃酮提取物。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的玉竹二氫高異黃酮提取物的制備方法，其特征在于，包括以下 步驟a) 玉竹根莖粗粉加70~90%乙醇水溶液回流提取，濾過，提取液合并，減壓回收乙醇；b) 將步驟a)獲得的提取物加水溶解，經(jīng)非極性或弱極性大孔吸附樹脂柱色譜，用水洗脫至洗脫液近無色，棄去洗脫液；C)用20~40%乙醇水溶液洗脫至洗脫液近無色，棄去洗脫液；d)用60 80%乙醇水溶液洗脫至洗脫液近無色，收集洗脫液，洗脫液液減壓濃縮、干燥得 玉竹二氫高異黃酮提取物。
5、 權(quán)利要求1所述的玉竹二氫高異黃酮提取物在制備預(yù)防和/或治療糖尿病腎病產(chǎn)品中 的用途。
6、 含有權(quán)利要求1所述的玉竹二氫高異黃酮提取物的藥物組合物在制備預(yù)防和/或治療 糖尿病腎病產(chǎn)品中的用途。
7、 玉竹二氫高異黃酮類化合物3-(4'-羥苯基)-5，7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃 -4-酮在制備蛋白質(zhì)非酶糖基化終末產(chǎn)物抑制劑產(chǎn)品中的用途。
8、 玉竹二氫高異黃酮類化合物3-(4'-羥苯基)-5,7-二羥基-6,8-二甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮 在制備蛋O質(zhì)非酶糖基化終末產(chǎn)物抑制劑產(chǎn)品中的用途。
9、 玉竹二氫高異黃酮類化合物3-(4'-甲氧苯基)-5，7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡 喃-4-酮在制備蛋白質(zhì)非酶糖基化終末產(chǎn)物抑制劑產(chǎn)品中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種玉竹二氫高異黃酮提取物及其制備方法，含有3-(4’-羥苯基)-5，7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮，3-(4’-羥苯基)-5，7-二羥基-6，8-二甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮和3-(4’-甲氧苯基)-5，7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮，含量之和大于等于15％；本發(fā)明還公開了玉竹二氫高異黃酮提取物在制備預(yù)防和/或治療糖尿病腎病產(chǎn)品中的用途，玉竹二氫高異黃酮類化合物3-(4’-羥苯基)-5，7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮，3-(4’-羥苯基)-5，7-二羥基-6，8-二甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮和3-(4’-甲氧苯基)-5，7-二羥基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氫吡喃-4-酮在制備蛋白質(zhì)非酶糖基化終末產(chǎn)物抑制劑產(chǎn)品中的用途。
文檔編號A61K31/352GK101664404SQ200910067518
公開日2010年3月10日 申請日期2009年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月11日
發(fā)明者師海波, 威 王 申請人:吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院