專利名稱：：一種葛花異黃酮提取物、其提取方法、藥物組合物及其在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種植物有效成份提取物，具體地說是一種葛花異黃酮提取物、其提取方法及其藥物組合物。
背景技術(shù)：
：葛花(FlosPuerariae)，又名葛條花，為豆科(Leguminosae)植物野葛(PuerariaLobata(Willd.)0hwi)的干燥花蕾。性涼，味甘，入歸陽明經(jīng)?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》、《本草綱目》等記載其具有解酒醒脾之功效，主治傷酒發(fā)熱煩渴、不思飲食、嘔逆吐酸、吐血、腸風(fēng)下血等癥。葛花在我國分布廣泛，植物資源豐富，其中黃酮、皂苷等有效成分，有很強(qiáng)的藥理活性。但國內(nèi)對其化學(xué)成分、藥理作用和臨床應(yīng)用的研究還不夠深入，目前在我國主要有葛花解醒湯用于臨床，葛花茶、葛花露等保健品上市。主要局限于解酒、保肝藥等?，F(xiàn)代藥理研究表明葛花中的異黃酮為其主要藥理活性成分，異黃酮為生物黃酮中的一種，其結(jié)構(gòu)與人體分泌的雌激素十分相似，又被稱為植物雌激素，近年來，國內(nèi)外對植物異黃酮生物活性有大量的研究報道，研究表明異黃酮化合物對人體雌激素水平有抑制和興奮雙重作用，因而在心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和抗腫瘤方面具有顯著的生物活性，其主要藥理作用有1、異黃酮對心血管作用。大豆異黃酮可以有效降低總膽固醇、LDL、極低密度脂蛋白，并抑制動脈粥樣斑塊的形成。Pan等報道，異黃酮能抑制有中風(fēng)傾向的自發(fā)高血壓大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞合成，從而抑制動脈粥樣硬化形成。還可抑制離體培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，從而延緩動脈粥樣硬化病理過程中新生血管的形成，阻止疾病的進(jìn)展。總之異黃酮對心血管系統(tǒng)的活性作用廣泛，如保護(hù)心肌、擴(kuò)張冠狀動脈、增加血流量、降低膽固醇、降血糖、抗心律不齊、抗血栓形成等。2、雌激素樣作用?？裳a(bǔ)充體內(nèi)雌激素不足，異黃酮通過與雌激素受體結(jié)合發(fā)揮微弱激素效應(yīng)；同時，對雌激素也有拮抗作用，由于與雌激素競爭結(jié)合雌激素受體，使得雌激素不能產(chǎn)生激素效應(yīng)，進(jìn)而對與雌激素相關(guān)的疾病具有保護(hù)作用。在起到預(yù)防和減輕婦女更年期綜合癥的作用的同時，可以減少雌激素替代治療造成的患乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險3、治療骨質(zhì)疏松。大量動物實驗結(jié)果證實異黃酮可以防止去卵巢大鼠骨丟失。不少流行病學(xué)資料提出了異黃酮護(hù)骨作用的可能機(jī)制為僅抑制骨吸收，而并不影響骨形成。最新研究表明，600mg/d的異黃酮與微量的雌激素(O.3mg/d雌激素本身不能夠增強(qiáng)橈骨的骨密度)能夠顯著增強(qiáng)絕經(jīng)后婦女的骨密度，減緩骨的丟失。4、抗腫瘤作用。異黃酮具有明顯的抗腫瘤作用，特別是與雌激素相關(guān)的腫瘤。目前已明確異黃酮抗癌的主要作用機(jī)制是異黃酮的植物雌激素作用，該作用可以抑制人及動物體內(nèi)雌激素水平過高引發(fā)的乳腺癌等，人們普遍認(rèn)為單獨服用大豆異黃酮或其配合化療治療可能是一種有效的抗腫瘤療法。除上述功能、作用外，異黃酮還具有抗氧化、抗衰老、抗真菌、抑制真菌活性的功能，另外有資料顯示日本目前正在研究通過異黃酮具有的雌激素調(diào)節(jié)作用，改善婦女皮膚，增強(qiáng)美容效果，還可加強(qiáng)對糖尿病及其他并發(fā)癥、腎肝疾病、牙周炎等疾病的預(yù)防和治療功效。現(xiàn)有技術(shù)中，葛花異黃酮的提取工藝多采用水提或醇提工藝，得到粗提物。為了得到異黃酮含量較高的提取物，多采用柱層析的方法進(jìn)行提純，如氧化鋁、硅藻土、硅膠等填充的層析柱，通過不同比例的溶劑進(jìn)行洗脫，收集需要的組分，回收溶劑可以得到相應(yīng)的產(chǎn)物。上述工藝所得到的產(chǎn)物含量較高，但是柱層析效率較低，洗脫液需要量很大；并且洗脫液多為有機(jī)溶劑的混合物，其配比直接影響產(chǎn)品質(zhì)量，產(chǎn)品質(zhì)量不易控制；洗脫液中產(chǎn)品的濃度一般較小，必須經(jīng)過濃縮干燥才能得到產(chǎn)品，需要耗費大量能量，勞動強(qiáng)度較大；洗脫后的溶劑分離提純較困難，不易循環(huán)使用，廢液較多，提取分離成本高，污染嚴(yán)重，嚴(yán)重制約著產(chǎn)品產(chǎn)量的提高和產(chǎn)品成本的降低。葛花苷(kakkalide，5，7-dihydroxy-6，4'-dimethoxyisoflavone-7-0-P-D_xylopyranosyl-6_0_P-D-glucopyranoside)是葛花異黃酮的有效成分之一，本發(fā)明的發(fā)明人對其進(jìn)行過深入的研究，就其抗心血管疾病及抗骨質(zhì)疏松的藥用用途申報了發(fā)明專利，專利申請?zhí)?00510043968.3。然而葛花苷卻存在水溶性較差的不足。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)是提供一種溶解度高、生物利用率好的葛花異黃酮提取物。本發(fā)明另一個技術(shù)任務(wù)是提供從葛花中提取葛花異黃酮提取物的提取方法。本發(fā)明的進(jìn)一步的技術(shù)任務(wù)是提供一種含有該葛花異黃酮提取物的藥物組合物。本發(fā)明再進(jìn)一步的技術(shù)任務(wù)是提供上述提取物在制備抗心腦血管病藥物及抗骨質(zhì)疏松癥藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案是利用索氏提取器從中藥葛花中提取葛花異黃酮提取物。該提取方法包括以下步驟a、干燥葛花用水或有機(jī)溶劑提取，提取液濃縮得提取物浸膏；b、提取物浸膏以l:520的質(zhì)量比與氧化鋁混合拌料，20目篩制粒，裝入索氏提取器，用有機(jī)溶劑連續(xù)提取，所述有機(jī)溶劑為乙酸乙酯、甲酸乙酯、醋酸丁酯、丙酮、丁酮、甲醇或乙醇，所述氧化鋁粒度為50400目；C、提取液直接回收溶劑，干燥得異黃酮含量不低于50%的異黃酮提取物；或者，提取液冷卻析出固體，固體過濾經(jīng)少量乙醇洗滌得到葛花異黃酮提取物，所得提取物中異黃酮成分含量不低于70%。為了適應(yīng)更為嚴(yán)格的應(yīng)用要求，步驟c所得葛花異黃酮提取物用有機(jī)溶劑重結(jié)晶，還可以得到異黃酮成分含量不低于80%的葛花異黃酮提取物，所述有機(jī)溶劑為丙酮、醇、醇-水混合物或乙酸乙酯，其中醇為甲醇、乙醇、異丙醇或正丁醇。優(yōu)選地，步驟a中的提取物浸膏可以通過以下兩種方法得到(一)干燥的葛花用有機(jī)溶劑提取，提取液減壓濃縮得異黃酮含量為10%-30%的提取物浸膏，所述有機(jī)溶劑為丙酮、醇類、水或水醇混合溶劑，所述醇類為甲醇、乙醇或異丙醇。(二)干燥的葛花用水提取，提取液濃縮成相對密度1.041.34的稠浸膏，稠浸膏中加入乙醇至乙醇濃度為4095%,靜置，取上清液濃縮成異黃酮含量為10%-30%的提取物浸膏。根據(jù)需要可以依據(jù)上述方法制備得到異黃酮含量在10%以上或50%以上或80%以上的葛花異黃酮提取物。用上述提取方法制備的葛花異黃酮提取物中含有葛花苷、尼泊爾鳶尾素、尼泊爾鳶尾素-7-O-e-葡萄糖苷、染料木素、染料木苷、印度黃檀苷和鷹嘴豆素甲等異黃酮類活性成分。經(jīng)發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，其溶解性大于單一異黃酮成分，便于制備口服制劑，生物利用度高；多種異黃酮成分協(xié)同作用可以更好的發(fā)揮異黃酮的生物活性，具有更為顯著的抗心腦血管疾病及抗骨質(zhì)疏松活性。本發(fā)明的藥物組合物含有有效量的上述葛花異黃酮提取物為有效成分，并含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。上述藥學(xué)上可接受的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)載體，例如稀釋劑、賦形劑如水等；填充劑如淀粉等；黏合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯垸酮等；濕潤劑如甘油等；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈉等；吸收促進(jìn)劑如季銨化合物；表面活性劑如十六垸醇等；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、聚乙二醇等。另外，還可以在組合物中加入其它輔劑，如香味劑、甜味劑等。本發(fā)明的提取物可以經(jīng)口服或注射等形式給藥，給藥量因給藥途徑不同而各有不同，對成人來說，每天100mg—300mg比較合適。用于口服給藥時，可將其制成常規(guī)的固體制劑，如顆粒劑、膠囊、片劑等；制成液體制劑如水或油懸浮劑或其它液體制劑，如糖漿等。用于非口服給藥時，可將其制成注射液、輸液劑等。本發(fā)明藥物組合物的各種劑型可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法制備。例如將提取物與一種或多種載體混合，然后將其制成所需劑型。本發(fā)明提純方法采用索式提取器提取，在少量有機(jī)溶劑的存在下就可以連續(xù)提取，與傳統(tǒng)的異黃酮提取工藝，如過大孔樹脂柱、氧化鋁柱、硅膠拄等相比，有機(jī)溶劑需要量只相當(dāng)于柱層析工藝的10%，就可以得葛花異黃酮含量大于50%的葛花提取物；過濾后的母液可直接作為索式提取器提取液使用，也可回收溶劑，循環(huán)使用，回收溶劑后的固體物仍為葛花異黃酮含量大于40%的葛花提取物。本工藝效率高、提取完全，使用單一溶劑提取，提取溶劑可回收循環(huán)使用，成本低、污染少，便于工業(yè)化生產(chǎn)。經(jīng)大量藥理試驗及動物試驗可得，本發(fā)明的葛花異黃酮提取物對改善和治療心、腦血管病及骨質(zhì)疏松癥有明顯效果。實施方式下面的制備實施例、試驗實施例可更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。〔制備實施例1〕異黃酮含量大于10%、50%葛花異黃酮的提取方法取干燥葛花5kg，加丙酮40kg,煮沸提取1.5小時，濾過，濾液備用；藥渣再加丙酮30kg煮沸提取l小時，濾過，合并兩次濾液，將合并后的濾液濃縮噴霧干燥即得異黃酮含量大于10%的葛花異黃酮提取物(綜褐色固體)。將上述提取物加乙醇配成相對密度1.1-1.3的浸膏，將此浸膏氧化鋁(粒度為200目)拌料，20目篩制粒，浸膏氧化鋁(1:8)，上索氏提取器，乙酸乙酯提取，提取液減壓濃縮，得到含異黃酮大于50%的葛花提取物，即得異黃酮含量為50%的葛花異黃酮提取物(棕黃色固體)。(制備實施例2〕異黃酮含量大于70%葛花異黃酮的提取方法取干燥葛花5kg，加水40kg，煮沸提取1.5小時，濾過，濾液備用，藥渣再加水30kg煮沸提取1小時，濾過，合并兩次濾液，將合并后的濾液真空濃縮，制成相對密度1.1-1.3的稠浸膏，將此稠浸膏氧化鋁拌料，浸膏氧化鋁(1:5)，上索氏提取器，丙酮提取，提取液冷卻析出固體，過濾收集固體，少量乙醇洗滌，得到含異黃酮大于70%的葛花提取物，即得異黃酮含量為70%的葛花異黃酮提取物(淺棕黃色固體)。(制備實施例3〕異黃酮含量大于80%葛花異黃酮的提取方法取干燥葛花5kg，加水30kg，煮沸提取2小時，濾過，濾液備用，藥渣再加水30kg煮沸提取l小時，濾過，合并兩次濾液，將合并后的濾液濃縮成相對密度1.1-1.3的稠浸膏，將此稠浸膏氧化鋁拌料，浸膏氧化鋁(1:10)上索氏提取器，乙酸乙酯提取，提取液濃縮，得到含異黃酮大于50%的葛花提取物，即得異黃酮含量為50%的葛花異黃酮提取物。(棕黃色固體)此提取液經(jīng)12倍乙醇重結(jié)晶得到得異黃酮含量大于80%的葛花異黃酮提取物(黃色淺黃色固體)。〔制備實施例4〕異黃酮含量大于30%葛花異黃酮的提取方法取干燥葛花5kg，加80%乙醇水溶液30kg，煮沸提取2小時，濾過，濾液備用，藥渣再加乙醇水溶液30kg煮沸提取l小時，濾過，合并兩次濾液，將合并后的濾液減壓干燥即得含有異黃酮大于30%的葛花異黃酮提取物，即得異黃酮含量為大于30%的葛花異黃酮提取物(深棕黃色固體)。制成相對密度1.2-1.3的稠浸膏，將此稠浸膏用氧化鋁拌料，浸膏氧化鋁(1:15)，上索氏提取器，丙酮提取，得到含異黃酮75%的葛花提取物，即得異黃酮含量為75%的葛花異黃酮提取物(淺棕黃色固體)。(制備實施例5〕異黃酮含量大于80%葛花異黃酮的提取方法取實施例1的得到的含異黃酮50%的提取物，用7倍量的80%乙醇水溶液重結(jié)晶，過濾干燥得到異黃酮含量大于80%的葛花異黃酮提取物，即得異黃酮含量為80%的葛花異黃酮提取物(黃色淺黃色固體)。(制備實施例6):異黃酮含量大于90%葛花異黃酮的提取方法取實施例4的得到的含異黃酮75%的提取物，用7倍量的乙醇重結(jié)晶，過濾干燥得到異黃酮含量大于90%的葛花異黃酮提取物，即得異黃酮含量為90%的葛花異黃酮提取物(淺黃色或類白色固體)。通過下面的試驗說明本發(fā)明提取物的活性。(試驗實施例1)葛花異黃酮提物對去勢雌性大鼠預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松模型的治療作用1、試驗材料1.1、受試物葛花異黃酮提物(70%)，由制備實施例2制得。1.2、陽性對照物鈣爾奇D片劑，規(guī)格30片/瓶，每片含碳酸鈣1500mg(元素鈣600mg)，維生素D125國際單位，批號0009033;由蘇州立達(dá)制藥有限公司生產(chǎn)。1.3、試驗動物Wistar大鼠1.4、給藥途徑灌胃；2、試驗方法2.1、建立動物模型本研究以雌性SD大鼠雙側(cè)卵巢切除術(shù)后的去勢大鼠模型為研究對象，該模型為目前國際公認(rèn)的研究骨質(zhì)疏松癥的標(biāo)準(zhǔn)模型。2.2、分組及給藥挑選術(shù)后4天、健康狀況良好的去勢大鼠按體重隨機(jī)分為，葛花異黃酮提物大劑量組(300mg/kg)、小劑量組(100mg/kg)、陽性對照組(500mg/kg)、模型對照組及正常對照組，每組10只；術(shù)后第4天開始灌胃給藥，每天1次，連續(xù)灌胃90天；3、試驗結(jié)果大劑量組(300mg/kg)對股骨直徑、重量與模型對照組相比差異非常顯著(P<0.01，表l)，骨強(qiáng)度大于模型對照組。葛花異黃酮提物大劑量，對大鼠股骨指標(biāo)有明顯影響，可能影響到骨吸收與骨形成平衡的復(fù)雜過程，<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>13.80±2.420.04±0.01*1003.74±0.040.42±0.031.08±0.1312.95±2.150.05±0.02*注*與模型對照組相比PO.01表2對大鼠骨質(zhì)疏松模型骨鈣沉積的影響(n=10,X±SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注**與模型對照組比較，P<0.014、病理組織學(xué)檢査結(jié)果股骨病理組織學(xué)檢査假手術(shù)組骨小梁排列密集，互相連接呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，骨小梁厚度大，其間距小，骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞正常。去勢模型組去除卵巢后骨小梁明顯變細(xì)，數(shù)量明顯減少，斷裂增多，碎裂形成紐扣狀碎骨片，髓腔擴(kuò)大，皮質(zhì)骨變薄。與假手術(shù)組比較，同樣倍數(shù)下骨小梁的連接中斷點明顯增多，骨小梁髓腔間距增大，正常骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞減少，骨細(xì)胞空陷凹增多。陽對組與模型組比較骨小梁稍規(guī)則，數(shù)目增多，厚度增加，斷裂少，髓腔間隙變小，但骨小梁數(shù)目及厚度仍低于假手術(shù)組。同樣倍數(shù)下成骨細(xì)胞數(shù)目多于模型組、少于假手術(shù)組，正常骨細(xì)胞接近假手術(shù)組。葛花異黃酮提取物大劑量組與模型組比較骨小梁較規(guī)則，數(shù)目明顯增多，厚度增加，斷裂少，髓腔間隙明顯變小，骨小梁數(shù)目及厚度稍低于假手術(shù)組。同樣倍數(shù)下骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞接近假手術(shù)組。葛花異黃酮提取物小劑量組與模型組比較骨小梁稍規(guī)則，數(shù)目輕度增多，厚度增加，斷裂少，髓腔間隙變小，骨小梁數(shù)目及厚度稍高于模型組。骨細(xì)胞空陷凹稍低于模型組，同樣倍數(shù)下骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞均稍高于模型組。5、結(jié)論試驗結(jié)果表明，葛花異黃酮提取物對股骨直徑、重量與模型對照組相比差異非常顯著(P〈0.01，表l)，骨強(qiáng)度大于模型對照組，病理組織學(xué)檢査結(jié)果證實，對大鼠骨質(zhì)疏松模型骨小粱和破骨細(xì)胞的數(shù)量有非常顯著性差異(P<0.01，表2)。因此，葛花異黃酮提取物作為抗骨質(zhì)疏松藥有必要作進(jìn)一步的研究。(試驗實施例2)葛花異黃酮灌胃給藥對異丙腎上腺素所致大鼠心肌損傷的影響。1、藥品葛花異黃酮提物(70%):由制備實施例2制得。鹽酸異丙腎上腺素注射液每支lmg/2ml/支。批號5E2007。由上海禾豐制藥有限公司提供。2、動物Wistar雌性大鼠50只，體重200274g。由山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)有限公司提供，許可證號魯動質(zhì)字SCXK魯20030006。3、方法將大鼠隨機(jī)分為5組，即葛花異黃酮大劑量組100mg/kg、小劑量組50mg/kg、陽性藥葛根素80mg/kg、心肌損傷模型組和空白對照組。每組10只。灌胃給藥。給藥體積為2.0ml/250g。每天給藥1次，連續(xù)7天?？瞻讓φ战M和模型組給予等體積的蒸餾水。分別于第6天、第7天給藥后lh，除空白對照組外，其余各組均皮下多點注射鹽酸異丙腎上腺素4mg/kg，于第7天注射異丙腎上腺素4h后取血測定心肌酶譜，同時處死動物，迅速摘取心臟，取心尖部位于10%福爾馬林中固定，HE染色，進(jìn)行病理學(xué)檢査。4、結(jié)果1.葛花異黃酮對異丙腎上腺素所致大鼠心肌損傷的影響，結(jié)果詳見表3。結(jié)果表明，心肌損傷模型組心肌酶譜CK、CK-MB、AST、LDH明顯升高，與空白對照組有明顯差異(P<0.05)。葛花異黃酮大劑量組可以明顯降低異丙腎上腺素所致心肌酶譜(CK、CK-MB、AST、LDH)的增加，小劑量組可以降低AST、LDH，但對CK、CK-MB也有降低趨勢(P<0.07)，說明葛花異黃酮對異丙腎上腺素所致大鼠心肌損傷具有明顯的保護(hù)作用。表3葛花異黃酮對異丙腎上腺素所致大鼠心肌損傷心肌酶譜的影響(n=10，X±s)劑量CKCK-MBASTLDH組別Ong/kg)(U/L)(U/L)(U/L)(UL)空白對照組—137.67±28.50±110.67±112.17±22.083,6220.9618.69損傷模型組一393.00±60.83±34.78*189.33±484.33±279.47'51.23"194.30**葛花異黃酮100118.67±24.00±130.33±267.17±35.67"7.59*17.03"129.74s50149.33±30.00±133.83±274.83±41,266.8722,71s107.91"葛根素80112.83±22.00±131.91±259.95±39.39**9.47#18.28**135.72#注與空白對照組，*P<0.05;與損傷模型組，ttP〈0.05;5.心肌組織病理學(xué)檢查正常對照組心肌結(jié)構(gòu)正常，肌纖維排列整齊，心肌細(xì)胞無變性、壞死等形態(tài)學(xué)改變。間質(zhì)無水腫，無炎細(xì)胞浸潤。損傷模型組心肌廣泛融合性病變，肌纖維大片狀壞死、斷裂，心肌細(xì)胞核碎裂、溶解，僅殘存細(xì)胞形態(tài)，間質(zhì)水腫，壞死區(qū)有大量炎細(xì)胞浸潤。壞死區(qū)周圍肌纖維排列尚整齊，但心肌細(xì)胞腫脹，間質(zhì)水腫并可見大量炎細(xì)胞浸潤。葛花異黃酮大劑量組心肌組織片灶狀壞死、肌纖維斷裂，壞死范圍較模型組明顯變小，間質(zhì)水腫，壞死區(qū)亦有炎細(xì)胞浸潤。壞死區(qū)周圍肌纖維排列整齊，但部分心肌細(xì)胞腫脹，間質(zhì)水腫并可見炎細(xì)胞浸潤。葛花異黃酮小劑量組心肌組織片狀壞死、肌纖維斷裂，壞死范圍介于模型組與大劑量組之間，壞死區(qū)有大量炎細(xì)胞浸潤。壞死區(qū)周圍肌纖維排列整齊，但心肌細(xì)胞腫脹，間質(zhì)水腫并可見炎細(xì)胞浸潤。葛根素組心肌組織片灶狀壞死、肌纖維斷裂，壞死范圍較模型組明顯變小。壞死區(qū)周圍肌纖維排列整齊，部分心肌細(xì)胞腫脹，間質(zhì)水腫并可見炎細(xì)胞浸潤。6、小結(jié)a.葛花異黃酮對異丙腎上腺素所致大鼠心肌損傷具有明顯的保護(hù)作用。b.葛花異黃酮能減輕異丙腎上腺素對心肌的病理性損害。(試驗實施例3〕葛花異黃酮對大鼠急性不完全性腦缺血的影響1、藥物葛花異黃酮提物(70%):由制備實施例2制得。2、動物Wistar雌性大鼠50只，體重208282g。由山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)有限公司提供，許可證號魯動質(zhì)字SCXK魯20030006。3、方法葛花異黃酮對大鼠急性不完全性腦缺血的保護(hù)作用，Wistai"大鼠50只，體重208282gg(平均體重252.79士16.42g)，雌雄各半。隨機(jī)分為5組，即假手術(shù)組、腦缺血模型組、葛花異黃酮大劑量組100mg/kg、小劑量組50mg/kg、陽性對照藥葛根素組80mg/kg。每組10只。灌胃給藥。每日l次，連續(xù)給藥5天。給藥體積為2.0ml/200g，假手術(shù)組和腦缺血模型組均給予等容積的生理鹽水。于末次給藥后lh開始實驗。大鼠在25%烏拉坦(lg/kg)腹腔注射麻醉下，頸部正中切口，分離兩側(cè)頸總動脈，雙重結(jié)扎(假手術(shù)組僅穿雙線但不結(jié)扎)，造成急性不完全性腦缺血。結(jié)扎后3h每組各取10只快速斷頭取腦，裝入稱量瓶稱腦濕重，計算腦指數(shù)[腦指數(shù)=腦濕重/體重乂100%],然后置于11(TC烤箱中烘烤72小時至恒重，稱腦干重，計算腦含水量。4、結(jié)果葛花異黃酮對大鼠急性不完全性腦缺血的保護(hù)作用，結(jié)果見表4。表4.葛花異黃酮對急性不完全性腦缺血大鼠腦指數(shù)和腦含水量的影響(X±s，n=10)劑量腦指數(shù)腦含水量組別(mg/kg)(%)(%)假手術(shù)組—0.508±0.035**78.55±0.62**腦缺血模型組—0.563±0.03680.60±0.89葛花異黃酮1000.527±0.025*79.65±0.78*500.526±0.024'79.69±0.60'葛根素800.520±0.041*79.65±0.74*注與腦缺血模型組比較，*P<0.05，**P〈0.01結(jié)果表明，腦缺血模型組的腦指數(shù)和腦含水量明顯高于假手術(shù)組，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理有顯著性差異(P〈0.01)，說明腦缺血模型建立成功。葛花異黃酮大、小劑量組均明顯降低急性不完全性腦缺血大鼠的腦指數(shù)和腦含水量，表明葛花異黃酮可明顯減輕大鼠急性不完全性腦缺血所引起的腦水腫。5、小結(jié)葛花異黃酮可明顯減輕大鼠急性不完全性腦缺血所引起的腦水腫。(試驗實施例4〕溶解度測定實驗取實施例1中得到的葛花異黃酮提取物(50%)及葛花苷對照品各lg，分別置100ml容量瓶中，加水100ml25'C水浴中每隔5分鐘強(qiáng)力振搖30秒鐘，30分鐘后由于兩瓶中固體都沒有完全溶解，靜置過濾，取續(xù)濾液，采用高效液相色譜法，以葛花苷為對照品，用外標(biāo)法分別測定兩容量瓶中溶解的葛花苷的質(zhì)量，結(jié)果如下葛花苷對照品組0.0012g葛花異黃酮提取物組0.0076g實驗結(jié)果顯示葛花異黃酮組中溶解的葛花苷是葛花苷對照品組的6倍，說明葛花異黃酮中各成分間存在助溶作用，相同情況下可以增加其中黃酮、異黃酮單一成分的溶解度。下面的實施例說明包含由本發(fā)明提供的提取物的藥用制劑。(制劑實施例l〕片劑按照本領(lǐng)域己知的方法制備片劑，每片含有下述成份葛花異黃酮提取物(異黃酮含量80%)100mg、乳糖150mg、硬脂酸鎂3mg、聚乙烯吡咯烷酮7mg。(制劑實施例2〕膠囊按照本領(lǐng)域己知的方法制備膠囊，每個膠囊中含有下述成份葛花異黃酮提取物(異黃酮含量80%)50mg、乳糖85mg、淀粉20mg、硬脂酸鎂lmg、聚乙烯吡咯烷酮4mg?！仓苿嵤├?〕注射液按照本領(lǐng)域已知的方法制備注射液，每個注射液中含有下述成份葛花異黃酮提取物(異黃酮含量80%)40mg、注射用水2ml、聚乙二醇400200mg。用法葡萄糖注射液稀釋，肌肉注射，一日二次，每次l-2支；靜脈點滴,一日一次，每次2-3支。權(quán)利要求1、一種葛花異黃酮提取物的提取方法，包括以下步驟a、干燥葛花用水或有機(jī)溶劑提取，提取液濃縮得提取物浸膏；b、提取物浸膏以1∶5～20的質(zhì)量比與氧化鋁混合拌料，20目篩制粒，裝入索氏提取器，用有機(jī)溶劑連續(xù)提取，所述有機(jī)溶劑為乙酸乙酯、甲酸乙酯、醋酸丁酯、丙酮、丁酮、甲醇或乙醇，所述氧化鋁粒度為50～400目；c、提取液直接回收溶劑，干燥得異黃酮含量不低于50％的異黃酮提取物；或者，提取液冷卻析出固體，固體過濾經(jīng)少量乙醇洗滌得到葛花異黃酮提取物，所得提取物中異黃酮成分含量不低于70％。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，包括以下步驟a、干燥葛花用水或有機(jī)溶劑提取，提取液濃縮得提取物浸膏；b、提取物浸膏以l:520的質(zhì)量比與氧化鋁混合拌料，20目篩制粒，裝入索氏提取器，用有機(jī)溶劑連續(xù)提取，所述有機(jī)溶劑為乙酸乙酯、甲酸乙酯、醋酸丁酯、丙酮、丁酮、甲醇或乙醇，所述氧化鋁粒度為50400目；C、提取液直接回收溶劑，干燥得異黃酮含量不低于50%的異黃酮提取物；或者，提取液冷卻析出固體，固體過濾經(jīng)少量乙醇洗滌得到葛花異黃酮提取物，所得提取物中異黃酮成分含量不低于70%;d、步驟c所得葛花異黃酮提取物用有機(jī)溶劑重結(jié)晶，得到異黃酮成分含量不低于80%的葛花異黃酮提取物，所述有機(jī)溶劑為丙酮、醇、醇-水混合物或乙酸乙酯，其中醇為甲醇、乙醇、異丙醇或正丁醇。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，步驟a中干燥的葛花用有機(jī)溶劑提取，提取液減壓濃縮得異黃酮含量為10%-30%的提取物浸膏，所述有機(jī)溶劑為丙酮、醇類、水或水醇混合溶劑，所述醇類為甲醇、乙醇或異丙醇。4、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，步驟a中干燥的葛花用水提取，提取液濃縮成相對密度1.041.34的稠浸膏，稠浸膏中加入乙醇至乙醇濃度為4095%，靜置，取上清液濃縮成異黃酮含量為10%_30%的提取物浸5、權(quán)利要求l中提取方法提取的葛花異黃酮提取物。6、藥物組合物，其中含有有效量的權(quán)利要求5的提取物為有效成分，并含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。7、權(quán)利要求5提取物在制備抗心腦血管病藥物及抗骨質(zhì)疏松癥藥物中的應(yīng)用。8、權(quán)利要求2中提取方法提取的葛花異黃酮提取物。9、藥物組合物，其中含有有效量的權(quán)利要求8的提取物為有效成分，并含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。10、權(quán)利要求8提取物在制備抗心腦血管病藥物及抗骨質(zhì)疏松癥藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及從葛花中提取的葛花異黃酮提取物及該提取物的提取方法。本發(fā)明還涉以該提取物為活性成份的藥物組合物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的提取方法具有工藝效率高、污染少、便于工業(yè)化生產(chǎn)等特點；就葛花苷而言，本發(fā)明提取物中葛花苷的溶解度遠(yuǎn)大于單一成份時葛花苷的溶解度，具有更好地生物利用度。文檔編號A61K36/48GK101239092SQ200810014399公開日2008年8月13日申請日期2008年3月14日優(yōu)先權(quán)日2008年3月14日發(fā)明者英仲,魯劉,孫敬勇,左春旭,杰李,梁玉記,牟艷玲,菊王,王元書,解硯英申請人:山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所