專利名稱：活化素-actriia拮抗劑和減少或抑制fsh分泌的用途的制作方法
活化素-ACTRI IA拮抗劑和減少或抑制FSH分泌的用途相關(guān)申請的交叉引用
本申請要求2007年9月18號提交的美國臨時申請序號60/994，399的權(quán)益。以 上引用申請的所有教導(dǎo)都通過參考納入本文。
背景技術(shù)：
促卵泡激素(FSH)由腦垂體釋放并調(diào)控性腺的功能以及配子的產(chǎn)生和成熟。通常 在先期釋放引發(fā)激素例如促性腺激素釋放激素之后，由性腺釋放FSH。FSH的釋放對于女性排卵和男性精子成熟是必需的。在女性中，F(xiàn)SH刺激卵巢中卵 泡粒膜細(xì)胞增殖并影響雌激素(一種參與卵泡成熟和排卵的激素)合成。男性中，F(xiàn)SH參 與精子細(xì)胞成熟。更具體而言，F(xiàn)SH在男性中作用于塞托利氏(Sertoli)細(xì)胞，認(rèn)為這些細(xì) 胞是激素的靶標(biāo)并且支持精子成熟過程(精子發(fā)生)。前列腺中也產(chǎn)生FSH，在這里它是細(xì) 胞生長的重要調(diào)節(jié)物。因此，F(xiàn)SH釋放的抑制劑可在男性和女性中用作避孕劑。除對生殖力的功能之外，F(xiàn)SH還在幾種疾病狀態(tài)中發(fā)揮作用。FSH受體的水平增加 與前列腺癌相關(guān)，其中最高的FSH受體水平與激素不應(yīng)性前列腺癌相關(guān)。前列腺癌是美國 男性中最常見的癌癥，每年新診斷病例超過230，000。2004年前列腺癌約導(dǎo)致了 30，000例 死亡(Jemal A, Tiwari R C, Murray T. Ghafoor A, Samuels A, Ward E, Feuer E J, Thun M J. Cancerstatistics 2004. CA Cancer J. Clin. 54 :8_29，2004)。用手術(shù)或輻射治療的個體 約有 40% 會發(fā)展復(fù)發(fā)性前列腺癌(Walsh P C，Retik A B，Vaughan E D，eds. Campbell' s Urology.第 7 版，Philadelphia，Pa. :WB Saunders Company ; 1998)。對復(fù)發(fā)性前列腺癌的 最常見治療是通過睪丸切除術(shù)、雌激素治療、抗雄激素給藥、和/或GnRH激動劑/拮抗劑治 療來抑制睪丸產(chǎn)生睪酮。這種治療通常緩解疾病2-3年，然后前列腺癌即變?yōu)椤凹に夭粦?yīng)性 的”，意思是前列腺癌發(fā)展出了盡管血液雄激素濃度降低到去勢水平但其仍然能夠生長的 能力。因此，需要用于治療前列腺癌特別是激素不應(yīng)性前列腺癌的改進(jìn)的組合物和方法。垂體瘤(腺瘤)是非癌性生長物，取決于腫瘤的具體位置，通常影響不同的激素 產(chǎn)生區(qū)域。垂體瘤約占顱內(nèi)腫瘤的15%，并且由于局部壓力作用、激素分泌過多或治療相 關(guān)的內(nèi)分泌缺乏，垂體瘤與高發(fā)病率(morbibity)相關(guān)(Heaney A. P.，et al. :Molecular Pathogenesis of Pituitary Tumors. OxfordTextbook of Endocrinology, ffass J. A. H. and Shalet S. M. , (Eds.), OxfordUniversity Press, Oxford, 2002 (in press))。絕 大部分垂體腺瘤是良性的，相對生長緩慢。然而，垂體瘤可導(dǎo)致一種或多種垂體激素產(chǎn)生過 多。FSH分泌型垂體瘤常導(dǎo)致多囊卵巢的發(fā)生并導(dǎo)致雌二醇水平升高。雌二醇水平的升高 進(jìn)而導(dǎo)致健康風(fēng)險，包括子宮內(nèi)膜癌和前列腺癌。因此，需要用于治療與FSH分泌型垂體瘤 相關(guān)癥狀的改進(jìn)的組合物和方法。因此，抑制FSH分泌的化合物可用于多種治療中。本公開的一個目的是提供可用于降低FSH水平的方法和組合物，這些方法和組合 物可用于，例如，避孕和用于治療多種FSH相關(guān)紊亂。發(fā)明概述
部分地，本公開涉及使用活化素拮抗劑以及ActRIIa拮抗劑減少或抑制FSH分 泌。具體而言，本公開提供了使用ActRIIa的可溶形式減少或抑制FSH分泌的方法，所述 ActRIIa的可溶形式用作活化素的抑制劑。雖然可溶性ActRIIa可通過活化素拮抗之外的 機(jī)制影響FSH分泌，然而可在活化素拮抗或ActRIIa拮抗或二者的基礎(chǔ)上選擇所需的治療 齊U。本文將這些治療劑統(tǒng)稱為活化素-ActRIIa拮抗劑。因此，在某些實(shí)施方案中，本公開 提供了使用活化素-ActRIIa拮抗劑在有此需要的患者中減少或抑制FSH分泌的方法，所述 活化素-ActRIIa拮抗劑包括例如，活化素結(jié)合(activin-binding) ActRIIa多肽、抗-活化 素抗體、抗-ActRIIa抗體、活化素-或ActRIIa-靶向的小分子和適配體、以及降低活化素 和ActRIIa表達(dá)的核酸。如美國專利公開號2007/0249022 (通過參考納入本文)所述，活 化素-ActRIIa拮抗劑可用于促進(jìn)骨生長和增加骨密度。如本文所述，這些拮抗劑還可用于 減少或抑制FSH分泌。在某些方面，本公開提供了使用多肽減少或抑制FSH分泌的方法，所述多肽包含能結(jié)合于活化素的可溶性活化素結(jié)合ActRIIa多肽。ActRIIa多肽可制成包含活化素結(jié)合 ActRIIa多肽和和藥學(xué)上可接受的載體的藥物制劑。所述活化素結(jié)合ActRIIa多肽結(jié)合于 活化素的Kd可小于1 μ M或小于100、10或InM。任選地，相比于⑶Fll和/或⑶F8，所述活 化素結(jié)合ActRIIa多肽選擇性結(jié)合活化素，并且其結(jié)合活化素的Kd任選至少比結(jié)合GDFll 和/或⑶F8的低10倍、20倍或50倍。雖然不希望受限于特定作用機(jī)制，但是預(yù)期超過 GDF11/GDF8抑制的這種程度的活化素抑制選擇性說明了對FSH分泌的作用，而沒有對肌肉 有一致的可測量的作用。在許多實(shí)施方案中，為引起少于15%、少于10%或少于5%的肌 肉增加，會選擇實(shí)現(xiàn)對FSH分泌理想作用的劑量的ActRIIa多肽。如尺寸排阻層析所測定， 就其他多肽組分而言，所述組合物的純度可以至少是95%，任選地，所述組合物的純度至少 是98%。這樣的制劑中使用的活化素結(jié)合ActRIIa多肽可以是本文公開的任意多肽，如具 有選自SEQ ID NOs :2、3、7或12的氨基酸序列的多肽，或與選自SEQ ID NOs :2、3、7、12或 13的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同性的多肽。活化素結(jié)合 ActRIIa多肽可以包括天然ActRIIa多肽的功能性片段，如包含選自SEQ ID NOs :1_3的序 列或缺少C末端10至15個氨基酸(“尾部”)的SEQ ID NO 2的序列的至少10、20或30 個氨基酸的功能性片段。在某些方面，本公開提供了在患有FSH相關(guān)紊亂的人對象中降低FSH水平的方 法。此方法可包括給予所述對象可有效降低對象中FSH活性的量的ActRIIa-Fc融合蛋 白。在某些方面，本公開提供了在需要延遲或抑制他或她的生殖細(xì)胞成熟的患者中降低 FSH水平的方法。此方法可包括給予可有效降低對象中FSH活性的量的ActRIIa-Fc融合 蛋白。ActRIIa-Fc融合蛋白可包含與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :2的氨基酸序列至少 90%、95%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。ActRIIa-Fc融合蛋白可以是由兩個多 肽形成的二聚體，兩個多肽中的每一個包含與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :2的氨基酸序列 至少90%、95%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。ActRIIa-Fc融合蛋白可包含三個 或更多個唾液酸部分，具體是三個、四個或五個唾液酸部分。ActRIIa-Fc融合蛋白可以由 CHO產(chǎn)生。ActRIIa-Fc融合蛋白可具有SEQ ID NO :7的氨基酸序列?？山o予ActRIIa-Fc 融合蛋白從而在患者中達(dá)到至少0. 3mg/kg的血清濃度，優(yōu)選達(dá)到0. 3至3mg/kg范圍內(nèi)的 血清濃度。ActRIIa-Fc融合蛋白可具有15-30天的血清半衰期，并且給予對象的頻率例如不多于每周一次、每月一次或每年一次。某些實(shí)施方案中，靜脈內(nèi)給藥或皮下給藥時， ActRIIa-Fc融合蛋白在正常的健康人中具有平均25至32天的血清半衰期和同等的生物利 用度(equivalent bioavailability)。ActRIIa-Fc融合蛋白可靜脈內(nèi)給藥或皮下給藥。相對于天然存在的ActRIIa多肽，可溶性活化素結(jié)合ActRIIa多肽可以包括一 個或多個氨基酸序列改變(例如在配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域)。改變的ActRIIa多肽的例子在 WO 2006/012627，第59-60頁中提供，通過參考納入本文。氨基酸序列的改變可以例如當(dāng) 在哺乳動物、昆蟲或其他真核細(xì)胞中生成時，改變多肽的糖基化，或者相對于天然存在的 ActRIIa多肽改變多肽的蛋白酶解裂解?；罨亟Y(jié)合ActRIIa多肽可以是融合蛋白，其具有作為一個結(jié)構(gòu)域的ActRIIa多 肽(例如ActRIIa的配體結(jié)合部分)和一個或多個另外的提供所需特性如改善的藥代動 力學(xué)、更易純化、靶向特定組織等的結(jié)構(gòu)域。例如融合蛋白的結(jié)構(gòu)域可以增強(qiáng)體內(nèi)穩(wěn)定性、 體內(nèi)半衰期、吸收/施用、組織定位或分布、蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成、融合蛋白的多聚化和/或 純化中的一種或多種?；罨亟Y(jié)合ActRIIa融合蛋白可以包括免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域(野 生型或突變型)或血清白蛋白或其他提供所需特性，如改善的藥代動力學(xué)、改善的可溶性 或改善的穩(wěn)定性的多肽部分。在優(yōu)選實(shí)施方案中，ActRIIa-Fc融合蛋白包含位于Fc結(jié)構(gòu) 域和胞外ActRIIa結(jié)構(gòu)域之間的相對無特定結(jié)構(gòu)的接頭。此無特定結(jié)構(gòu)的接頭可以對應(yīng)于 ActRIIa胞外結(jié)構(gòu)域C末端(所述“尾部”)的大致15個氨基酸無特定結(jié)構(gòu)區(qū)，或者其可以 是1、2、3、4或5個氨基酸，或5個與15、20、30、50個或更多氨基酸之間長度的相對無二級 結(jié)構(gòu)的人工序列，或兩者的混合物。接頭可以富含甘氨酸和脯氨酸殘基，并且可以例如含有 蘇氨酸/絲氨酸和甘氨酸的單序列或蘇氨酸/絲氨酸和甘氨酸的重復(fù)序列(例如TG4 (SEQ ID NO 15)或SG4 (SEQ ID NO 16)單態(tài)或重復(fù)序列)。融合蛋白可以包括純化子序列，如表 位標(biāo)記、FLAG標(biāo)記、多聚組氨酸序列以及GST融合體。任選地，可溶性ActRIIa多肽包括一 個或多個選自以下的修飾氨基酸殘基糖基化的氨基酸、PEG化的氨基酸、法尼基化的氨基 酸、乙?；陌被?、生物素化的氨基酸、綴合于脂質(zhì)部分的氨基酸、綴合于有機(jī)衍生化劑 的氨基酸。優(yōu)選地，藥物制劑基本上無熱原。一般地，優(yōu)選ActRIIa蛋白在哺乳動物細(xì)胞系 中表達(dá)，所述細(xì)胞系適當(dāng)?shù)亟閷?dǎo)ActRIIa蛋白的天然糖基化，以消除患者的不利免疫反應(yīng) 的可能性。人和CHO細(xì)胞系已被成功使用，并且預(yù)計(jì)其他普通哺乳動物表達(dá)體系會有用。如本文所述，被稱作ActRIIa-Fc的ActRIIa蛋白(該形式在ActRIIa部分和Fc 部分之間具有很小的連接子)具有所需的特性，包括相對于GDF8和/或GDFll選擇性結(jié)合 于活化素，高親和力配體結(jié)合以及動物模型中血清半衰期大于兩周。在某些實(shí)施方案中，本 發(fā)明提供使用ActRIIa-Fc多肽、以及包含這樣的多肽和藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物制 劑減少或抑制FSH分泌的方法。在某些方面，本公開提供了使用編碼可溶性活化素結(jié)合ActRIIa多肽的核酸減少 或抑制FSH分泌的方法。如上所述，分離的多核苷酸可以包含可溶性活化素結(jié)合ActRIIa 多肽的編碼序列。例如，如果沒有位于跨膜結(jié)構(gòu)域或胞漿結(jié)構(gòu)域中的，或位于胞外結(jié)構(gòu)域 與跨膜結(jié)構(gòu)域或胞漿結(jié)構(gòu)域之間的終止密碼子，分離的核酸可以包括ActRIIa胞外結(jié)構(gòu)域 (例如配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域)的編碼序列，以及將編碼部分或全部ActRIIa跨膜結(jié)構(gòu)域和/或胞 漿結(jié)構(gòu)域的序列。例如分離的多核苷酸可以包含全長ActRIIa多核苷酸序列，例如SEQID NO 4或5，或部分截短的形式，所述分離的多核苷酸進(jìn)一步包含3’末端之前至少600個核苷酸的或其他位置的轉(zhuǎn)錄終止密碼子，這樣所述多核苷酸的翻譯使得胞外結(jié)構(gòu)域任選地融 合到全長ActRIIa的截短部分。優(yōu)選的核酸序列是SEQ ID N0:14?？捎糜诒疚乃龇椒?中的核酸可操作地連接到用于表達(dá)的啟動子，并且本文提供用這樣的重組多核苷酸轉(zhuǎn)化的 細(xì)胞。優(yōu)選地，所述細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞，如CH0細(xì)胞。本公開還提供制備可溶性活化素結(jié)合ActRIIa多肽的方法，所述多肽可用于減少 或抑制FSH分泌。這樣的方法可包括在合適的細(xì)胞如中國倉鼠卵巢(CH0)細(xì)胞中，表達(dá)本文 公開的任何核酸(如SEQ ID NO :4、5或14)。這樣的方法可包括a)在適于可溶性ActRIIa 多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，其中所述細(xì)胞用可溶性ActRIIa表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)化；以及b)回 收這樣表達(dá)的可溶性ActRIIa多肽?？扇苄訟ctRIIa多肽可以以天然的、部分純化的或高 度純化的組分回收。純化可以通過一系列的純化步驟完成，包括例如任何順序的下述的一 個、兩個或三個或多個步驟蛋白A層析、陰離子交換層析(例如Q瓊脂糖)、疏水作用層析 (例如苯基瓊脂糖)、尺寸排阻層析和陽離子交換層析。在某些方面，本文公開的活化素ActRIIa拮抗劑，如可溶性活化素結(jié)合ActRIIa多 肽，可用于在患者中減少或抑制FSH分泌的方法中，包括例如，延遲前列腺癌發(fā)生、抑制前 列腺癌進(jìn)展、減小腫瘤尺寸、阻止腫瘤生長、延遲轉(zhuǎn)移發(fā)生或阻止轉(zhuǎn)移的方法。在某些實(shí)施 方案中，本公開提供在有此需要的患者中減少或抑制前列腺癌細(xì)胞生長或存活的方法。方 法可包括將有效量的活化素ActRIIa拮抗劑給予有此需要的對象。在某些方面，如本文所 述，本公開提供活化素-ActRIIa拮抗劑在制備用于治療或預(yù)防前列腺癌的藥物中的用途。 本公開還涉及包含活化素-ActRIIa拮抗劑和放射療法、化學(xué)療法(例如細(xì)胞毒試劑)、和/ 或內(nèi)分泌療法的組合療法。所述拮抗劑可以是ActRIIa-Fc融合蛋白，其中ActRIIa-Fc融 合蛋白包含與SEQ ID NO :3、6、7或13的氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在具有一種或多種前列腺癌風(fēng)險因子的患者中阻 止或延遲前列腺癌發(fā)生的方法。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在已診斷具有原發(fā)性前列 腺腫瘤或具有前列腺增生性病變的患者中防止或延遲轉(zhuǎn)移性疾病發(fā)生的方法。在人患者中 防止或延遲前列腺癌發(fā)生的方法可包括給予有此需要的人患者有效量的選自下組的多肽 a)包含與SEQ ID NO 2至少90%相同的氨基酸序列的多肽；b)包含與SEQ ID NO 3至少 90%相同的氨基酸序列的多肽；和c)包含選自SEQ ID NO 2的至少50個連續(xù)氨基酸的多 肽。本發(fā)明的其他實(shí)施方案涉及在患有前列腺癌的人患者中抑制活化素介導(dǎo)的信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法。某些實(shí)施方案中，所述方法包括給予人患者有效量的活化素-ActRIIa拮抗 劑。在另外的實(shí)施方案中，所述拮抗劑是選自下組的多肽a)包含與SEQ ID NO :2至少90% 相同的氨基酸序列的多肽；b)包含與SEQ ID NO 3至少90%相同的氨基酸序列的多肽；和 c)包含選自SEQ IDN0 2的至少50個連續(xù)氨基酸的多肽。某些實(shí)施方案中，F(xiàn)SH分泌的減少或抑制導(dǎo)致生殖力的下降。在女性中，給予活 化素-ActRIIa拮抗劑限制了卵泡粒膜細(xì)胞的增殖。在男性中，給予活化素-ActRIIa拮抗 劑抑制精子成熟。在某些方面，本公開提供了用于避孕的方法和組合物。某些實(shí)施方案 中，提供了組合物，該組合物包含活化素-ActRIIa拮抗劑和一種或多種避孕劑諸如孕激素 (progestin)、黃體激素(progesterone)禾口雌激素。某些實(shí)施方案中，提供了在患有FSH-分泌型垂體瘤的患者中減少或抑制FSH分泌的方法；該方法包括給予活化素-ActRIIa拮抗劑。在某些方面，本公開提供了鑒定可抑制癌細(xì)胞(例如前列腺癌細(xì)胞)的生長或存 活的試劑的方法。所述方法包括a)鑒定結(jié)合于活化素或ActRIIa多肽的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域 的測試試劑；和b)評價所述試劑對癌細(xì)胞的增殖、存活或凋亡的作用。


圖1顯示CH0細(xì)胞中所表達(dá)的ActRIIa-hFc的純化。該蛋白純化為邊界清晰的單 峰形式。圖2顯示ActRIIa-hFc結(jié)合至活化素和⑶F-11，通過BiaCore 分析測量。圖3顯示了 A-204報(bào)告基因檢測的示意圖。該圖顯示了報(bào)告載體 pGL3(CAGA)12(在 Dennler et al, 1998, EMBO 17 :3091_3100 中有描述)。CAGA12 基序出 現(xiàn)在TGF-3反應(yīng)性基因(PAI-.基因)中，因此該載體可通用于通過Smad 2和3的因子信 號傳導(dǎo)。圖4顯示了 A-204報(bào)告基因分析中ActRIIa-hFc (菱形)和ActRIIa-mFc (正方 形)對GDF-8信號傳導(dǎo)的作用。兩種蛋白都顯示出在皮摩爾濃度基本上抑制GDF-8介導(dǎo)的 信號傳導(dǎo)。圖5顯示了 A-204報(bào)告基因分析中三種不同的ActRIIa-hFc制劑對⑶F-11信號 傳導(dǎo)的作用。圖6顯示了 12周治療期之前(上圖)和之后(底圖)，對照和ActRIIa-mFc治療 的BALB/c小鼠的DEXA圖像的示例。更淺色度顯示了增加的骨密度。圖7顯示了 12周期間，ActRIIa-mFc對BALB/c小鼠骨礦密度作用的定量。治療分 為對照(菱形)、2mg/kg劑量ActRIIa-mFc (正方形)、6mg/kg劑量ActRIIa-mFc (三角形) 以及 10mg/kg 劑量 ActRIIa-mFc (圓圈)。圖8顯示了 12周期間，ActRIIa-mFc對BALB/c小鼠骨礦含量作用的定量。治療分 為對照(菱形)、2mg/kg劑量ActRIIa-mFc (正方形)、6mg/kg劑量ActRIIa-mFc (三角形) 以及 10mg/kg 劑量 ActRIIa-mFc (圓圈)。圖9顯示了經(jīng)過6周后，ActRIIa-mFc對切除卵巢(0VX)或假手術(shù)(SHAM) C57BL6小鼠小梁骨的骨礦密度作用的定量。治療分為對照(PBS)或10mg/kg劑量 ActRIIa-mFc(ActRIIa)。圖10顯示了經(jīng)過12周，ActRIIa-mFc對切除卵巢(0VX)C57BL6小鼠小梁骨的作 用的定量。治療分為對照(PBS，淺色棒形圖)或10mg/kg劑量ActRIIa-mFc (ActRIIa，深色 棒形圖)。圖11顯示了 6周或12周治療期后，ActRIIa-mFc對假手術(shù)C57BL6小鼠小梁骨作 用的定量。治療分為對照(PBS，淺色棒形圖)或10mg/kg劑量ActRIIa-mFc (ActRIIa，深色 棒形圖)。圖12顯示了經(jīng)過12周治療，切除卵巢小鼠骨密度的pQCT分析結(jié)果。治療分為對 照(PBS,淺色棒形圖)或ActRIIa-mFc (深色棒形圖)。Y軸:mg/ccm圖13描述了經(jīng)過12周治療，假手術(shù)小鼠骨密度的pQCT分析結(jié)果。治療分為對照 (PBS，淺色棒形圖)或ActRIIa-mFc (深色棒形圖)。Y軸:mg/ccm
圖14A和14B顯示了(A) 12周治療之后整體DEXA分析和⑶股骨離體(ex vivo) 分析。亮區(qū)描述了高骨密度的區(qū)域。圖15顯示了 12周治療之后，股骨中段的離體pQCT分析。治療分為媒介對照(PBS， 深色棒形圖)和ActRIIa-mFc (淺色棒形圖)。左側(cè)的四個棒形圖顯示總骨密度，而右側(cè)的 四個棒形圖顯示皮質(zhì)骨密度。每組四個棒形圖的第一對表示來自切除卵巢小鼠的數(shù)據(jù)，而 第二對棒形圖表示來自假手術(shù)小鼠的數(shù)據(jù)。圖16顯示了 12周治療之后，股骨中段的離體pQCT分析和骨干骨含量。治療分為 媒介對照(PBS，深色棒形圖)或ActRIIa-mFc (淺色棒形圖)。左側(cè)的四個棒形圖顯示總骨 含量，而右側(cè)的四個棒形圖顯示皮質(zhì)骨含量。每組四個棒形圖的第一對表示來自切除卵巢 小鼠的數(shù)據(jù)，第二對棒形圖表示來自假手術(shù)小鼠的數(shù)據(jù)。圖17顯示了股骨中段和股骨皮質(zhì)厚度的離體pQCT分析。治療分為媒介對 照(PBS，深色棒形圖)和ActRIIa-mFc(淺色棒形圖)。左側(cè)的四個棒形圖顯示骨內(nèi)膜 周長(endosteal circumference)，而右側(cè)的四個棒形圖顯示骨外膜周長(periosteal circumference)。每組四個棒形圖的第一對表示來自切除卵巢小鼠的數(shù)據(jù)，第二對棒形圖 表示來自假手術(shù)小鼠的數(shù)據(jù)。圖18描述了治療12周后股骨力學(xué)測試結(jié)果。治療分為對照(PBS，深色棒形圖) 和ActRIIa-mFc (淺色棒形圖)。左側(cè)的兩個棒形圖代表來自切除卵巢小鼠的數(shù)據(jù)，而后面 兩個棒形圖代表來自假手術(shù)小鼠的數(shù)據(jù)。圖19顯示了 Actrlla-mFc對小梁骨體積的作用。圖20顯示了 Actrlla-mFc對股骨遠(yuǎn)端的骨小梁結(jié)構(gòu)的作用。圖21顯示了 Actrlla-mFc對皮質(zhì)骨的作用。圖22顯示了 Actrlla-mFc對骨骼機(jī)械強(qiáng)度的作用。圖23顯示了在三個不同劑量下，不同劑量的ActRIIa-mFc對骨骼特性的影響。圖24顯示了骨組織形態(tài)學(xué)測量，表明ActRIIa-mFc具有合成代謝和抗吸收的雙重 活性。圖25顯示另外的組織形態(tài)學(xué)測量數(shù)據(jù)。圖26顯示首次接受試驗(yàn)的和攜帶腫瘤小鼠的小鼠股骨圖像，以及ActRIIa-mFc治 療對多發(fā)性骨髓瘤模型中骨形態(tài)的影響。攜帶多發(fā)性骨髓瘤(5T2)的小鼠相對于正常小鼠 (首次接受試驗(yàn)的)，表現(xiàn)出骨骼明顯的點(diǎn)蝕和降解。用ActRIIa-mFc治療消除了這種作用。圖27顯示實(shí)施例5所述的人臨床試驗(yàn)結(jié)果，其中無論ActRIIa-hFc是靜脈注射 (IV)或皮下注射(SC)給藥，曲線下面積(AUC)都與ActRIIa-hFc的給藥劑量線性相關(guān)。圖28顯示患者IV或SC給藥后，ActRIIa-hFc的血清水平比較。圖29顯示響應(yīng)不同劑量水平ActRIIa-hFc的骨堿性磷酸酶(BAP)水平。BAP是合 成代謝骨骼生長的標(biāo)志。圖30顯示ActRIIa-mFc (RAP-011)和雙膦酸鹽藥物(唑來磷酸)對小鼠的協(xié)同效應(yīng)。圖31顯示實(shí)施例6中所述的人臨床試驗(yàn)的結(jié)果，說明ActRIIa-hFc以時間-和劑 量依賴性方式降低了 FSH水平。圖32顯示對ActRIIa-hFc劑量的AUC分析，所述劑量實(shí)現(xiàn)了對FSH水平的各種程
9度的作用。發(fā)明詳述1.綜沭轉(zhuǎn)化生長因子0 (TGF-0 )超家族包含多種具有相同共有序列元件和結(jié)構(gòu)基序的 生長因子。已知這些蛋白對脊椎動物和無脊椎動物的許多細(xì)胞類型產(chǎn)生生物學(xué)作用。該超 家族的成員在胚胎發(fā)育過程中，在模式形成以及組織特化中執(zhí)行重要功能，并能影響多種 分化進(jìn)程，包括脂肪生成、肌生成、軟骨形成、心臟發(fā)生、造血、神經(jīng)生成以及上皮細(xì)胞分化。 該家族分為兩大分支BMP/GDF和TGF-0/活化素分支，其成員有不同的，通常是互補(bǔ)的作 用。通過利用TGF-0家族成員的活性，通?？赡軐?dǎo)致生物體內(nèi)重要的生理學(xué)變化。例如， 皮爾蒙特(Piedmontese)和比利時藍(lán)(Belgian Blue)牛品種帶有使肌肉質(zhì)量明顯增加的 GDF8(也稱為肌肉生長抑制素(myostatin))基因內(nèi)功能丟失的突變。Grobet et al.，Nat Genet. 1997，17(1) :71_4。此外，人體中⑶F8的非活性等位基因與肌肉質(zhì)量的增加，以及據(jù) 稱異常強(qiáng)度相關(guān)。Schuelke etal.，N Engl J Med 2004，350 :2682_8。活化素是屬于TGF-0超家族的二聚體多肽生長因子。有三種主要的活化素形式 (A、B和AB)，它們是兩個密切相關(guān)的3亞單位(分別是、日B3B和的同源/ 異源二聚體。人類基因組也編碼主要在肝臟中表達(dá)的活化素C和活化素E，還已知含有
或3 E的異源二聚體形式。在TGF-0超家族中，活化素是可以刺激卵巢內(nèi)以及胎盤細(xì)胞 中激素的產(chǎn)生，幫助神經(jīng)細(xì)胞存活，取決于細(xì)胞類型正性或或負(fù)性地影響細(xì)胞周期進(jìn)程，以 及至少在兩棲動物胚胎中誘導(dǎo)中胚層分化的獨(dú)特和多功能的因子(DePaolo et al. ,1991, Proc SocEp Biol Med. 198 500-512 ；Dyson et al.,1997,Curr Biol. 7:81_84 ；Woodruff, 1998，Biochem Pharmacol. 55 =953-963)。在幾種組織中，活化素信號傳導(dǎo)被其相關(guān)的異源 二聚體抑制素所拮抗。例如在垂體釋放促卵泡素(FSH)時，活化素促進(jìn)FSH分泌與合成，而 抑制素阻止FSH分泌與合成。其他的可調(diào)節(jié)活化素生物活性和/或與活化素結(jié)合的蛋白包 括卵泡抑制素(FS)、卵泡抑制素相關(guān)蛋白(FSRP)和a 2-巨球蛋白。TGF-0信號通過I和II型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體的異聚復(fù)合體介導(dǎo)，其通過 配體刺激而磷酸化并激活下游Smad蛋白(Massague, 2000，Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 169-178)。這些I型和II型受體是跨膜蛋白，由帶有富含半胱氨酸區(qū)的配體結(jié)合胞外結(jié)構(gòu) 域、跨膜結(jié)構(gòu)域和帶有預(yù)期絲氨酸/蘇氨酸特異性的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成。I型受體是信號傳 導(dǎo)所必須的；II型受體是結(jié)合配體以及表達(dá)I型受體所需的。I型和II型活化素受體在配 體結(jié)合后形成穩(wěn)定的復(fù)合物，使I型受體被II型受體磷酸化。兩種相關(guān)的II型受體ActRIIa和ActRIIb已被鑒定為活化素的II型受體 (Mathews and Vale,1991, Cell 65 :973_982 ；Attisano et al.，1992，Cell 68 :97_108)。 除活化素外，ActRIIa和ActRIlb可以與其他幾種TGF- ^家族蛋白，包括BMP7、Nodal、⑶F8 和GDF11 發(fā)生生化相互作用(Yamashita et al.，1995，J. Cell Biol. 130 :217_226 ；Lee and McPherron,2001, Proc.Natl. Acad. Sci. 98 9306-9311 ；Yeo and Whitman, 2001, Mol. Cell 7 949-957 ；Oh et al. ,2002, Genes Dev. 16 :2749_54)。ALK4 是主要的活化素，特別是活化 素A的I型受體，ALK-7同樣也可以作為活化素，特別是活化素B的受體。如本文所描述的，可溶性ActRIIa多肽(sActRIIa)顯示出顯著優(yōu)先結(jié)合于活化 素A (相對于其他TGF-0家族成員如⑶F8或⑶F11)，這種可溶性ActRIIa多肽可用于減少或抑制FSH分泌。然而不希望受限于任何特定的機(jī)制，考慮到通過這些研究中采用的 特定sActRIIa構(gòu)建物所展現(xiàn)的非常強(qiáng)的活化素結(jié)合(皮摩爾濃度的(pM)解離常數(shù))， 預(yù)期sActRIIa的作用主要是由活化素拮抗劑作用引起的?；罨?ActRIIa拮抗劑包括 例如活化素結(jié)合可溶性ActRIIa多肽，結(jié)合至活化素(特別是活化素A或B亞單位，也稱 為3A或0B)并中斷ActRIIa結(jié)合的抗體，結(jié)合至ActRIIa并中斷活化素結(jié)合的抗體，選 用于活化素或ActRIIa結(jié)合的非抗體蛋白(參見例如W0/2002/088171、W0/2006/055689 和TO/2002/032925中的這類蛋白的例子，及其設(shè)計(jì)和選擇方法)，以及選用于活化素或 ActRIIa結(jié)合的通常綴合到Fc結(jié)構(gòu)域的隨機(jī)肽。兩種具有活化素或ActRIIa結(jié)合活性的 不同蛋白(或其他部分)，特別是分別阻斷I型(例如可溶性I型活化素受體)或II型 (例如可溶性II型活化素受體)結(jié)合位點(diǎn)的活化素結(jié)合物，可以連接在一起以產(chǎn)生雙功能 性結(jié)合分子。核酸適配體、小分子和其他物質(zhì)抑制活化素-ActRIIa信號傳導(dǎo)軸。各種蛋白 具有活化素-ActRIIa拮抗劑活性，包括抑制素(即抑制素a亞單元，盡管抑制素并不在所 有組織中普遍拮抗活化素)、卵泡抑制素(如卵泡抑制素-288和卵泡抑制素-315)、FSRP、 活化素C、a (2)-巨球蛋白，以及M108A(在位置108由甲硫蛋白變?yōu)楸彼?突變體活化 素A。通?；罨氐奶娲问剑貏e是I型受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域有變化的那些可以結(jié)合至II型 受體，并且不能形成活性三元復(fù)合物，因而作為拮抗劑起作用。另外，抑制活化素A、B、C或 E、或尤其ActRIIa表達(dá)的核酸例如反義分子、siRNAs或核酶，可以用作活化素-ActRIIa 拮抗劑。所采用的活化素-ActRIIa拮抗劑可顯示相對于TGF-0家族的其他成員，尤其相 對于GDF8和GDF11的抑制活化素介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的選擇性?？扇苄訟ctRIIb蛋白確實(shí) 結(jié)合至活化素，然而野生型蛋白并不顯示相對于GDF8/11的結(jié)合至活化素的明顯選擇性。 然而，這些ActRIIb多肽以及具有不同的結(jié)合特性的ActRIIb的改變形式(參見例如TO 2006/012627，第55-59頁，通過參考納入本文)可能實(shí)現(xiàn)對癌細(xì)胞的所需效果。天然的或 改變的ActRIIb可以通過偶聯(lián)第二活化素選擇性結(jié)合物質(zhì)，而得到對活化素的更多的特異 性。本說明書所用的術(shù)語在本領(lǐng)域、本發(fā)明的上下文以及每個術(shù)語使用的的特定語境 中，通常有其一般的意思。某些術(shù)語在下文或本說明書中其他地方討論，用以在描述本發(fā)明 的組合物和方法以及怎樣制備和使用它們的方法中，向?qū)I(yè)人員提供額外的指導(dǎo)。術(shù)語的 任何應(yīng)用范圍或含義在其所使用的特定語境中是顯而易見的?！凹s”和“大約”通常意味著考慮到測量的性質(zhì)和精度時測量量的可接受誤差程度。 通常，典型的誤差程度在給定數(shù)值或數(shù)值范圍的20 %以內(nèi)，優(yōu)選10 %以內(nèi)，更優(yōu)選5 %以 內(nèi)?；蛘卟⑶矣绕涞卦谏飳W(xué)體系中，術(shù)語“大約”以及“約”可能意味著數(shù)量級范圍 內(nèi)的值，優(yōu)選給定值的5倍以內(nèi)，更優(yōu)選2倍以內(nèi)。除非另有說明，本文給定的數(shù)量是近似 的，這意味著未特意說明時，術(shù)語“大約”或“約”可以推斷。本發(fā)明的方法可以包括比較相互間序列的步驟，包括野生型的序列與一個或多個 突變體(序列變體)的比較。這樣的比較通常包括多聚物序列的比對，例如使用本領(lǐng)域公 知的序列比對程序和/或算法(例如BLAST、FASTA和MEGALIGN，僅舉幾例)。本領(lǐng)域熟練 技術(shù)人員容易意識到，在突變含有殘基插入或缺失的這種比對中，序列比對將在不包含所 述插入或缺失殘基的多聚物序列中引入“空位”(通常以破折號或“A”表示)。
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“同源性”，所有其語法形式和拼寫變化指的是具有“共同進(jìn)化起源”的兩種蛋白之 間的關(guān)系，包括同種生物體的超家族蛋白，以及不同種生物體的同源蛋白。如其序列相似 性所反映的，無論從相同性百分比或通過特定殘基或基序和保守位點(diǎn)的存在，這樣的蛋白 (及其編碼核酸)都具有序列同源性。術(shù)語“序列相似性”，其所有的語法形式指的是可能有或可能沒有共同進(jìn)化起源的 核酸或氨基酸序列之間的相同性或相對應(yīng)的程度。然而，在常見用法和本申請中，當(dāng)被如“高度”這樣的副詞修飾時，術(shù)語“同源的”可 指序列相似性，并且可能或可能不涉及共同進(jìn)化起源。術(shù)語“前列腺癌”指前列腺的任何增生性病變或增生性異常，包括例如良性病變、 惡變前和惡性病變、實(shí)體瘤和轉(zhuǎn)移性疾病(局部轉(zhuǎn)移例如III期，和更廣泛的轉(zhuǎn)移例如IV 期)。前列腺癌還涵蓋激素響應(yīng)性和非激素依賴性癌癥。激素不應(yīng)性前列腺癌對用抗激素 (尤其是抗雌激素)療法進(jìn)行的治療不響應(yīng)(refractory)。2. ActRIIa 多肽在某些方面，本發(fā)明涉及ActRIIa多肽。如本發(fā)明所用的術(shù)語“ActRIIa”指任何 種的活化素受體Ila型(ActRIIa)蛋白家族，以及通過突變或其他修飾源自這樣的ActRIIa 蛋白的變體。本文所指ActRIIa可以理解為指任何一種目前已鑒定的形式。ActRIIa家族 成員通常是跨膜蛋白，由具有富含半胱氨酸區(qū)的配體結(jié)合胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和具有 預(yù)測的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成。術(shù)語“ActRIIa多肽”包括包含任何天然生成的ActRIIa家族成員的多肽及其保 留有用活性的任何變體(包括突變體、片段、融合體和擬肽類形式)的多肽。例如，ActRIIa 多肽包括來自與ActRIIa多肽序列具有至少約80%相同性的序列的任何已知ActRIIa序列 的多肽，優(yōu)選至少85%、90%、95%、97%、99%或更高相同性。例如，本發(fā)明的ActRIIa多肽 可以結(jié)合至并抑制ActRIIa蛋白和/或活化素的功能。優(yōu)選地，ActRIIa多肽在體內(nèi)或用 垂體細(xì)胞進(jìn)行的體外測定中降低FSH水平。ActRIIa多肽的例子包括人ActRIIa前體多肽 (SEQ ID NO 1)以及可溶性人 ActRIIa 多肽(例如 SEQ ID NOs :2、3、7 和 12)。人ActRIIa前體蛋白序列如下MGAAAKLAFAVFLISCSSGA ILGRSETQECLFFNANWEKDRTgQTGV
EPC76DKDKRRHCFATWKHIS6SIEIVKQ6CWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPP YYNILLYSLVPLMLIAGIVICAFWVYRHHKMAYPPVLVPTQDPGPPPPSPLLG
LKPLQLLEVKARGRFGCVWKAQLLNEYVAVKIFPIQDKQSWQNEYEVYSLPGMKHENILQFIGAEKRGTSVDVDLWLITAFHEKGSLSDFLKANVVSWNELCHIAETMARGLAYLHEDIPGLKDGHKPAISHRDIKSKNVLLKNNLTACIADFGLALKFEAGKSAGDTHGQVGTRRYMAPEVLEGAINFQRDAFLRIDMYAMGLVLWELASRCTAADGPVDEYMLPFEEEIGQHPSLEDMQEVVVHKKKRPVLRDYWQKHAGMAMLCETIEECWDHDAEARLSAGCVGERITQMQRLTNIITTEDIVTVVTMVTNVDFPPKESSL(SEQ ID NO 1)
信號肽加單下劃線標(biāo)示；胞外結(jié)構(gòu)域以粗體標(biāo)示，并且可能的N-連接糖基化位點(diǎn) 加雙下劃線標(biāo)示。人ActRIIa可溶的(胞外)、加工的多肽序列如下
ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCY⑶KDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEG匪CNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO 2)胞外結(jié)構(gòu)域的C-末端“尾部”加下劃線標(biāo)示?！拔膊俊比笔?A 15序列)的序列如 下ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCY⑶KDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEG匪CNEKFSYFPEM (SEQ ID NO 3)編碼人ActRIIa前體蛋白的核酸序列如下(Genbank登錄號NM_001616的核苷酸 164-1705)ATGGGAGCTGCTGCAAAGTTGGCGTTTGCCGTCTTTCTTATCTCCTGTTCTTCAGGTGCTATACTTGGTAGATCAGAAACTCAGGAGTGTCTTTTCTTTAATGCTAATTGGGAAAAAGACAGAACCAATCAAACTGGTGTTGAACCGTGTTATGGTGACAAAGATAAACGGCGGCATTGTTTTGCTACCTGGAAGAATATTTCTGGTTCCATTGAAATAGTGAAACAAGGTTGTTGGCTGGATGATATCAACTGCTATGACAGGACTGATTGTGTAGAAAAAAAAGACAGCCCTGAAGTATATTTTTGTTGCTGTGAGGGCAATATGTGTAATGAAAAGTTTTCTTATTTTCCAGAGATGGAAGTCACACAGCCCACTTCAAATCCAGTTACACCTAAGCCACCCTATTACAACATCCTGCTCTATTCCTTGGTGCCACTTATGTTAATTGCGGGGATTGTCATTTGTGCATTTTGGGTGTACAGGCATCACAAGATGGCCTACCCTCCTGTACTTGTTCCAACTCAAGACCCAGGACCACCCCCACCTTCTCCATTACTAGGGTTGAAACCACTGCAGTTATTAGAAGTGAAAGCAAGGGGAAGATTTGGTTGTGTCTGGAAAGCCCAGTTGCTTAACGAATATGTGGCTGTCAAAATATTTCCAATACAGGACAAACAGTCATGGCAAAATGAATACGAAGTCTACAGTTTGCCTGGAATGAAGCATGAGAACATATTACAGTTCATTGGTGCAGAAAAACGAGGCACCAGTGTTGATGTGGATCTTTGGCTGATCACAGCATTTCATGAAAAGGGTTCACTATCAGACTTTCTTAAGGCTAATGTGGTCTCTTGGAATGAACTGTGTCATATTGCAGAAACCATGGCTAGAGGATTGGCATATTTACATGAGGATATACCTGGCCTAAAAGATGGCCACAAACCTGCCATATCTCACAGGGACATCAAAAGTAAAAATGTGCTGTTGAAAAACAACCTGACAGCTTGCATTGCTGACTTTGGGTTGGCCTTAAAATTTGAGGCTGGCAAGTCTGCAGGCGATACCCATGGACAGGTTGGTACCCGGAGGTACATGGCTCCAGAGGTATTAGAGGGTGCTATAAACTTCCAAAGGGATGCATTTTTGAGGATAGATATGTATGCCATGGGATTAGTCCTATGGGAACTGGCTTCTCGCTGTACTGCTGCAGATGGACCTGTAGATGAATACATGTTGCCATTTGAGGAGGAAATTGGCCAGCATCCATCTCTTGAAGACATGCAGGAAGTTGTTGTGCATAAAAAAAAGAGGCCTGTTTTAAGAGATTATTGGCAGAAACATGCTGGAATGGCAATGCTCTGTGAAACCATTGAAGAATGTTGGGATCACGACGCAGAAGCCAGGTTATCAGCTGGATGTGTAGGTGAAAGAATTACCCAGATGCAGAGACTAACAAATATTATTACCACAGAGGACATTGTAACAGTGGTCACAATGGTGACAAATGTTGACTTTCCTCCCAAAGAATCTAGTCTATGA (SEQ ID NO 4)
編碼人ActRIIa可溶性(胞外)多肽的核酸序列如下ATACTTGGTAGATCAGAAACTCAGGAGTGTCTTTTCTTTAATGCTAATTGGGAAAAAGACAGAACCAATCAAACTGGTGTTGAACCGTGTTATGGTGACAAAGATAAACGGCGGCATTGTTTTGCTACCTGGAAGAATATTTCTGGTTCCATTGAAATAGTGAAACAAGGTTGTTGGCTGGATGATATCAACTGCTATGACAGGACTGATTGTGTAGAAAAAAAAGACAGCCCTGAAGTATATTTTTGTTGCTGTGAGGGCAATATGTGTAATGAAAAGTTTTCTTATTTTCCAGAGATGGAAGTCACACAGCCCACTTCAAATCCAGTTACACCTAAGCCACCC(SEQ ID NO 5)在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及可溶性ActRIIa多肽及其在降低FSH水平中的用 途。如本文所述，術(shù)語“可溶性ActRIIa多肽”通常指包含ActRIIa蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的多 肽。本文所用的術(shù)語“可溶性ActRIIa多肽”包括ActRIIa蛋白的任何天然存在的胞外結(jié) 構(gòu)域及其任意變體(包括突變體、片段和擬肽類形式)。活化素結(jié)合ActRIIa多肽是保留結(jié) 合至活化素，特別是活化素AA、AB或BB的能力的多肽。優(yōu)選地，活化素結(jié)合ActRIIa多肽 以InM或更低的解離常數(shù)結(jié)合至活化素AA。下面提供人ActRIIa前體蛋白的氨基酸序列。 ActRIIa蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合至活化素，并且通常是可溶的，因而可稱為可溶性活化素結(jié) 合ActRIIa多肽?？扇苄缘幕罨亟Y(jié)合ActRIIa多肽的例子包括SEQ ID NOs :2、3、7、12和 13說明的可溶性多肽。SEQ ID N0:7被稱作ActRIIa-hFc，并在實(shí)施例中進(jìn)一步說明。其 他的可溶性活化素結(jié)合ActRIIa多肽包括除ActRIIa蛋白胞外結(jié)構(gòu)域之外的信號序列，例 如蜜蜂蜂毒肽前導(dǎo)序列(SEQ ID NO :8)、組織纖溶酶原激活劑(TPA)前導(dǎo)序列(SEQ IDN0 9)或者天然 ActRIIa 前導(dǎo)序列(SEQ ID N0:10)。SEQ ID NO 13 說明的 ActRIIa-hFc 多肽 使用TPA前導(dǎo)序列。ActRIIa多肽的功能活性片段可以通過篩選由編碼ActRIIa多肽的相應(yīng)核酸片段 重組制備的多肽獲得。另外，片段可以使用本領(lǐng)域已知的例如常規(guī)Merrifield固相f_Moc 或t-Boc化學(xué)技術(shù)進(jìn)行化學(xué)合成?？梢灾苽?重組或化學(xué)合成)并檢測所述片段，以鑒別 那些能作為ActRIIa蛋白或活化素介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的拮抗劑(抑制劑)而起作用的肽基片 段。ActRIIa多肽的功能活性變體可以通過篩選從編碼ActRIIa多肽的相應(yīng)誘變核 酸重組生成的修飾多肽的文庫獲得?？梢灾苽洳z測所述變體，以鑒別能作為ActRIIa蛋 白或活化素介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的拮抗劑(抑制劑)而起作用的那些。在某些實(shí)施方案中， ActRIIa多肽的功能性變體包括與選自SEQ IDNOs 2或3的氨基酸序列具有至少75%相同 性的氨基酸序列。在某些例子中，所述功能性變體與選自SEQ ID NOs :2或3的氨基酸序列 具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%相同性的氨基酸序列。功能性變體可以通過為諸如增強(qiáng)治療功效或穩(wěn)定性(例如離體保存期限以及體 內(nèi)抗蛋白降解)目的，修飾ActRIIa多肽的結(jié)構(gòu)而生成。這樣修飾的ActRIIa多肽當(dāng)被選 擇保留活化素結(jié)合時，被認(rèn)為是天然存在的ActRIIa多肽的功能性等同物。修飾的ActRIIa 多肽也可以例如通過氨基酸取代、缺失或添加制備。例如，可以合理預(yù)測，以異亮氨酸或纈 氨酸單獨(dú)取代亮氨酸，以谷氨酸單獨(dú)取代天冬氨酸，以絲氨酸單獨(dú)取代蘇氨酸，或者以結(jié)構(gòu) 相關(guān)的氨基酸類似取代氨基酸(例如保守突變)不會對產(chǎn)生的分子的生物學(xué)活性有大的 影響。保守取代是那些在其側(cè)鏈相關(guān)的氨基酸家族中發(fā)生的取代。ActRIIa多肽氨基酸 序列的變化是否產(chǎn)生功能同源物，可以容易地通過評估變體ActRIIa多肽以類似于野生型ActRIIa多肽的方式在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生應(yīng)答的能力來確定。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮了 ActRIIa多肽的特定突變，以改變該多肽的糖 基化?？蛇x擇這樣的突變，以便引入或消除一個或多個糖基化位點(diǎn)，例如0-連接或N-連接 糖基化位點(diǎn)。天冬酰胺連接的糖基化識別位點(diǎn)通常包括被適當(dāng)?shù)募?xì)胞糖基化酶特異識別的 三肽序列，天冬酰胺-X-蘇氨酸(或天冬酰胺-X-絲氨酸)(這里的“X”是任何氨基酸)。 所述改變也可以通過向野生型ActRIIa多肽(對于0-連接的糖基化位點(diǎn))添加一個或多 個絲氨酸或蘇氨酸殘基或用一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基取代野生型ActRIIa多肽(對 于0-連接的糖基化位點(diǎn))進(jìn)行。在糖基化識別位點(diǎn)的第一個或第三個氨基酸位點(diǎn)之一或 兩者上的各種氨基酸取代或缺失(和/或在第二個位點(diǎn)上的氨基酸缺失)導(dǎo)致在修飾的三 肽序列的非糖基化。另一增加ActRIIa多肽上糖類部分?jǐn)?shù)量的方法是通過化學(xué)或酶偶合糖 苷至ActRIIa多肽。依賴于所采用的偶合方式，所述糖可連接至(a)精氨酸和組氨酸；(b) 游離羧基基團(tuán)；(c)游離巰基基團(tuán)，如半胱氨酸的游離巰基；(d)游離羥基，如絲氨酸、蘇氨 酸或羥脯氨酸的游離羥基；(e)芳香殘基如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳香殘基；或(f) 谷氨酰胺的酰胺基團(tuán)。這些方法在1987年9月11號公開的W0 87/05330以及Aplin和 ffriston (1981)CRC Crit. Rev. Biochem.，pp. 259-306 中有描述，通過參考納入本文?？赏?過化學(xué)和/或酶學(xué)的方法完成去除ActRIIa多肽上的一個或多個糖類部分。化學(xué)去糖基化 可涉及例如ActRIIa多肽接觸化合物三氟甲磺酸或等效化合物。這種處理導(dǎo)致除了連接糖 (N-乙酰基葡萄糖或N-乙?；肴樘前?之外的大部分或所有糖的斷裂，而同時保持氨基 酸序列的完整?；瘜W(xué)去糖基化在 Hakimuddin et al. (1987)Arch. Biochem. Biophys. 259 52and by Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 118 131 中有進(jìn)一步的描述。ActRIIa 多肽糖 部分的酶切可通過使用Thotakura et al. (1987)Meth. Enzymol. 138 350所述的各種內(nèi)切 糖苷酶或外切糖苷酶實(shí)現(xiàn)。由于哺乳動物、酵母、昆蟲和植物細(xì)胞都可以引入可被所述肽的 氨基酸序列影響的不同糖基化模式，所以ActRIIa多肽的序列可以隨使用的表達(dá)體系酌情 改變。通常情況下，盡管預(yù)期其他的哺乳動物表達(dá)細(xì)胞系、具有基因工程糖基化酶的酵母細(xì) 胞系和昆蟲細(xì)胞也是有用的，但用于人類的ActRIIa多肽將在提供正確糖基化的哺乳動物 細(xì)胞系如HEK293細(xì)胞或CH0細(xì)胞系中表達(dá)。本公開進(jìn)一步考慮了生成突變體，尤其是ActRIIa多肽的成套組合突變體以及 截短突變體的方法；組合突變體的庫對于鑒別功能性變體的序列特別有用。篩選這樣組 合文庫的目的可能在于生成例如可作為激動劑或拮抗劑起作用，或者具有所有新活性的 ActRIIa多肽變體。各種篩選分析在下文提供，并且這樣的方法可用于評估變體。例如可篩 選ActRIIa多肽變體是否有結(jié)合至ActRIIa配體，防止ActRIIa配體結(jié)合至ActRII多肽， 或干擾ActRIIa配體引起的信號傳導(dǎo)的能力。ActRIIa多肽或其變體的活性也可以在基于細(xì)胞的測定或體內(nèi)測定中進(jìn)行檢測。 例如ActRIIa多肽變體對涉及FSH生成的基因表達(dá)的作用。如果需要，這可以在一個或多 個重組ActRIIa配體蛋白(例如活化素)存在下進(jìn)行，可轉(zhuǎn)染細(xì)胞以生成ActRIIa多肽和 /或其變體，以及任選的ActRIIa配體。同樣地，ActRIIa多肽可以給予小鼠或其他動物，并 評估FSH水平?？僧a(chǎn)生FSH的垂體細(xì)胞系是公知的，可測試ActRIIa蛋白在減少FSH產(chǎn)生 (尤其是在外源提供的活化素存在下)中的效力。另一個例子，可評估ActRIIa多肽變體 對癌細(xì)胞增殖或存活的作用。癌細(xì)胞可指活對象中構(gòu)成了實(shí)體瘤的細(xì)胞，或指起源于腫瘤并擴(kuò)散到活對象中其他位置的細(xì)胞(即，轉(zhuǎn)移細(xì)胞)。此外，癌細(xì)胞還指獲得自或衍生自腫 瘤或癌性生長物并經(jīng)體外培養(yǎng)的細(xì)胞。癌細(xì)胞還涵蓋了例如可體外培養(yǎng)或用于動物異種移 植物研究中的細(xì)胞系。癌細(xì)胞還指在(癌)轉(zhuǎn)移后通過細(xì)胞分裂衍生自轉(zhuǎn)移細(xì)胞的細(xì)胞。 這些細(xì)胞可以是激素響應(yīng)性的或非激素依賴性的?？稍谝环N或多種重組ActRIIa配體蛋白 (例如活化素)存在下評估癌細(xì)胞增殖或存活，可轉(zhuǎn)染細(xì)胞以產(chǎn)生ActRIIa多肽和/或其變 體，以及任選地，ActRIIa配體。同樣，可將ActRIIa多肽給予小鼠或其他動物，可評估一種 或多種檢測(指標(biāo))，例如腫瘤大小或相對于對照的細(xì)胞增殖或凋亡速率。可生成相對于天然存在的ActRIIa多肽，具有選擇性或通常增加的效價的組合來 源的變體。同樣地，突變可以導(dǎo)致比起相應(yīng)野生型ActRIIa多肽，具有顯著不同細(xì)胞內(nèi)半衰 期的變體。例如可以使改變的蛋白對蛋白水解或其他導(dǎo)致天然ActRIIa多肽被破壞或失活 的細(xì)胞過程更穩(wěn)定或者更不穩(wěn)定。這樣的變體以及編碼它們的基因可通過調(diào)節(jié)ActRIIa多 肽的半衰期，用于改變ActRIIa多肽水平。例如，短的半衰期可以導(dǎo)致更多的短暫生物學(xué)效 應(yīng)，并可更緊密地控制患者體內(nèi)的重組ActRIIa多肽的水平。在Fc融合蛋白中，可以在接 頭(如果有的話)和/或Fc部分進(jìn)行突變，從而改變所述蛋白的半衰期。組合文庫可以通過編碼每個包括至少部分可能的ActRIIa多肽序列的多肽文庫 的簡并基因文庫制備。例如合成寡核苷酸的混合物可以酶促連接入基因序列，這樣一組簡 并形式的可能ActRIIa多肽核苷酸序列可表達(dá)為單獨(dú)的多肽，或表達(dá)為一組更大的融合蛋 白(例如噬菌體展示的融合蛋白)。有很多種可從簡并寡核苷酸序列生成可能同源物文庫的方法。簡并基因序列的 化學(xué)合成可以在自動DNA合成儀中進(jìn)行，合成的基因隨后被連接到合適的載體進(jìn)行表達(dá)。 簡并寡核苷酸的合成在本領(lǐng)域是公知的(參見例如Narang，SA(1983)Tetrahedron 39 3 ； Itakura et al. ,(1981)Recombinant DNA,Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam :Elsevier pp273_289 ;Itakura et al. , (1984)Annu. Rev. Biochem. 53 323 ；Itakura et al. , (1984)Science 1981056 ；Ike et al. , (1983) Nucleic Acid Res. 11:477)。這樣的技術(shù)已經(jīng)在其他蛋白的定向進(jìn)化中被采用(參見例 如 Scott et al.，(1990)Science 249 386-390 ；Roberts et al.，(1992)PNAS USA 89: 2429-2433 ；Devlin et al.，(1990)Science 249 404-406 ；Cwirla et al.，(1990)PNAS USA 87 6378-6382 ；以及 U. S.專利號5，223，409,5, 198，346 和 5，096，815)?；蛘撸渌问降耐蛔兛捎糜谏山M合文庫。例如ActRIIa多肽變體可以通過使 用例如丙氨酸篩選突變等等的篩選(Ruf et al.，(1994)Biochemistry33 1565-1572 ；Wang et al.，(1994) J. Biol. Chem. 269 3095-3099 ；Balint et al.，(1993)Gene 137:109-118; Grodberg et al. , (1993)Eur. J. Biochem. 218 597-601 ；Nagashima et al. , (1993) J.Biol. Chem. 268 2888-2892 ；Lowman et al. ， (1991)Biochemistry 30 :10832—10838 ； 和 Cunningham et al.，(1989) Science244 :1081_1085)，通過接頭掃描誘變(Gustin et al.，(1993)Virologyl93 :653_660 ；Brown et al.，(1992)Mol. Cell Biol. 12 :2644_2652 ； McKnight etal.，(1982) Science 232:316)；通過飽和誘變(Meyers et al.，(1986) Science232 613)；通過 PCR 誘變(Leung et al.，(1989)Method Cell Mol Biol 1 11-19)；或通過隨機(jī)誘變，包括化學(xué)誘變等等(Miller et al.，(1992)A Short Course inBacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY ；以及 Greener et al.,
16(1994) Strategies in Mol Biol 7 :32_34)，從文庫生成并分離。接頭掃描誘變，特別是在 組合設(shè)定中，是有吸引力的鑒別截短(生物活性)形式ActRIIa多肽的方法。在本領(lǐng)域中，篩選通過點(diǎn)突變和截短得到的組合文庫的基因產(chǎn)物，以及就此而 言，篩選cDNA文庫得到具有某種特性基因產(chǎn)物的大量技術(shù)是公知的。對于快速篩選通過 ActRIIa多肽的組合突變產(chǎn)生的基因文庫，這樣的技術(shù)一般是適用的。最廣泛地用于篩選大 基因文庫的技術(shù)通常包括將所述基因文庫克隆到可復(fù)制的表達(dá)載體中，用獲得的載體文庫 轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞，并在其中檢測所需活性有利于相對容易分離編碼其產(chǎn)物被檢測的基因的 載體的條件下表達(dá)組合基因。優(yōu)選的檢測包括活化素結(jié)合分析和活化素介導(dǎo)的細(xì)胞信號傳 導(dǎo)分析。在某些實(shí)施方案中，除了 ActRIIa多肽中天然存在的任何修飾，本發(fā)明的ActRIIa 多肽可以進(jìn)一步包括翻譯后修飾。這樣的修飾包括但不限于乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸 化、脂質(zhì)化以及?；?。結(jié)果，修飾后的ActRIIa多肽可含有非氨基酸元件，如聚乙二醇、脂 質(zhì)、多糖或單糖以及磷酸。這樣的非氨基酸元件對ActRIIa多肽功能性的作用可如本文所 述對其他ActRIIa多肽變體進(jìn)行檢測。當(dāng)ActRIIa多肽通過剪切ActRIIa多肽的新生形式 在細(xì)胞內(nèi)生成時，翻譯后加工對蛋白正確折疊和/或功能可能也是重要的。不同細(xì)胞(例 如CH0、HeLa、MDCK、293、WI38、NIH-3T3或HEK293)對于這樣的翻譯后活性有特定細(xì)胞機(jī)制 和特有機(jī)理，可選用以確保ActRIIa多肽的正確修飾和加工。在某些方面，ActRIIa多肽的功能性變體或修飾形式包括具有至少部分ActRIIa 多肽和一個或多個融合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。公知的這樣的融合結(jié)構(gòu)域的例子包括但不限于 多組氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)、硫氧還蛋白、A蛋白、G蛋白、免疫球蛋白重鏈 恒定區(qū)(Fc)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)或人血清白蛋白。可以選擇融合結(jié)構(gòu)域，以賦予所需性 質(zhì)。例如一些融合結(jié)構(gòu)域?qū)τ谕ㄟ^親和層析分離融合蛋白尤其有用。為親和純化的目的， 采用親和層析相關(guān)的基質(zhì)如谷胱甘肽_、淀粉酶_以及鎳_或鈷綴合的樹脂。許多這樣的 基質(zhì)可以以“試劑盒”的形式獲得，如Pharmacia的GST純化體系以及使用(HIS6)融合伴侶 的QIAexpress 體系(Qiagen)。作為另外的例子，可以選擇融合結(jié)構(gòu)域，以有助于ActRIIa 多肽的檢測。這樣的檢測結(jié)構(gòu)域的例子包括各種熒光蛋白(如GFP)以及“表位標(biāo)記”，其通 常是可獲得其特異性抗體的短肽序列。公知的容易得到其特異單克隆抗體的表位標(biāo)記包括 FLAG、流感病毒血凝素(HA)以及c-myc標(biāo)記。在一些實(shí)例中，融合結(jié)構(gòu)域具有諸如Xa因子 或凝血酶的蛋白酶切位點(diǎn)，其允許相關(guān)的蛋白酶部分消化融合蛋白，從而從中釋放重組蛋 白。然后釋放的蛋白可通過隨后的層析分離從融合結(jié)構(gòu)域中分離。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案 中，ActRIIa多肽與體內(nèi)穩(wěn)定ActRIIa多肽的結(jié)構(gòu)域(“穩(wěn)定劑”結(jié)構(gòu)域)融合。“穩(wěn)定”指 增加血清半衰期的任何事務(wù)，而不考慮其是否由減少破壞、降低腎清除率或其他藥物代謝 動力學(xué)作用引起。已知與免疫球蛋白Fc部分的融合可賦予多種多樣的蛋白所需藥物代謝 動力學(xué)性質(zhì)。同樣地，與人血清白蛋白融合可賦予所需性質(zhì)?？蛇x擇的其他類型的融合結(jié) 構(gòu)域包括多聚(例如二聚、四聚)結(jié)構(gòu)域以及功能性結(jié)構(gòu)域(根據(jù)需要，其賦予另外的生物 學(xué)功能，例如進(jìn)一步刺激骨骼生長或肌肉生長)。作為特定的例子，本發(fā)明提供了包含融合于Fc結(jié)構(gòu)域的ActRIIa可溶性胞外結(jié)構(gòu) 域的融合蛋白(例如SEQ ID N0:6)。THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD(A)VSHEDPEVKFNW
YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK(A)VSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEffESNGQPENNYKTTPPVLDSDGPFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN(A)HYTQKSLSLSPGK *任選地，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域在例如Asp-265、賴氨酸322和Asn-434的殘基有一個或多個突 變。在某些例子中，具有一個或多個這些突變(例如Asp-265突變)的突變體Fc結(jié)構(gòu)域相 對于野生型Fc結(jié)構(gòu)域，結(jié)合至Fc γ受體的能力降低。在其他的例子中，具有一個或多個這 些突變(例如Asn-434突變)的突變體Fc結(jié)構(gòu)域相對于野生型Fc結(jié)構(gòu)域，結(jié)合至MHC I 類相關(guān)Fc受體(FcRN)的能力提高。可以理解，融合蛋白的不同元件可以以任何與所需功能性相一致的方式排列。例 如，ActRIIa多肽可置于異源結(jié)構(gòu)域的C末端，或者異源結(jié)構(gòu)域可置于ActRIIa多肽的C末 端。ActRIIa多肽結(jié)構(gòu)域和所述異源結(jié)構(gòu)域無需在融合蛋白中相鄰，并且另外的結(jié)構(gòu)域或氨 基酸序列可以包括在兩個結(jié)構(gòu)域任一個的C末端或N末端或兩個結(jié)構(gòu)域之間。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的ActRIIa多肽含有一個或多個可以穩(wěn)定ActRIIa多 肽的修飾。例如這樣的修飾增強(qiáng)ActRIIa多肽的體內(nèi)半衰期，增強(qiáng)ActRIIa多肽的循環(huán)半 衰期或減少ActRIIa多肽的蛋白降解。這樣的穩(wěn)定修飾包括但不限于融合蛋白(包括例如 包含ActRIIa多肽和穩(wěn)定劑結(jié)構(gòu)域的融合蛋白)、糖基化位點(diǎn)的修飾(包括例如糖基化位點(diǎn) 添加至ActRIIa多肽)以及糖部分的修飾(包括例如從ActRIIa多肽去除糖部分)。就融 合蛋白而言，ActRIIa多肽融合至如IgG分子的穩(wěn)定劑結(jié)構(gòu)域(如Fc結(jié)構(gòu)域)。如同本文 所使用的，術(shù)語“穩(wěn)定劑結(jié)構(gòu)域”不僅指提到的融合蛋白中的融合結(jié)構(gòu)域(例如Fe)，而且包 括如糖部分的非蛋白質(zhì)類修飾，或如聚乙二醇的非蛋白質(zhì)類聚合體。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明可獲得分離和/或純化形式的從其他蛋白分離或基本 上沒有其他蛋白的ActRIIa多肽。ActRIIa多肽通常通過重組核酸表達(dá)而產(chǎn)生。3.編碼ActRIIa多肽的核酸在某些方面，本發(fā)明提供了分離的和/或重組的編碼任何ActRIIa多肽(例如可 溶性ActRIIa多肽)的核酸，包括本文公開的片段、功能性變體和融合蛋白，本發(fā)明還公 開了核酸產(chǎn)生可用于減少FSH水平的蛋白的用途。例如SEQ ID N0:4編碼天然存在的人 ActRIIa前體多肽，而SEQ ID NO :5編碼加工的ActRIIa胞外結(jié)構(gòu)域。目標(biāo)核酸可以是單鏈 的或雙鏈的。這樣的核酸可以是DNA分子或RNA分子。這些核酸可以用于例如制備ActRIIa 多肽的方法，或用作直接治療劑(例如在基因治療方法中)。在某些方面，編碼ActRIIa多肽的目標(biāo)核酸進(jìn)一步理解為包括是SEQ IDNO 4或5 的變體的核酸。變體核苷酸序列包括不同之處在于一個或多個核苷酸取代、添加或缺失的 序列，如等位基因變體。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離或重組的與SEQ ID NO :4或5具有至少 80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%相同性的核酸序列的用途。本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員會理解，與SEQ ID NO 4或5，以及與SEQ ID NO :4或5的變體互補(bǔ)的核酸序列也包 括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸可以是分離的、重組的和/或 與異源核苷酸序列融合的，或DNA文庫中的。在其他的實(shí)施方案中，用于降低FSH水平的蛋白由核酸編碼，所述核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與SEQ ID NO :4或5中指定核苷酸序列、SEQ ID NO :4或5的互補(bǔ)序列或其片段的核苷酸序列雜交。如上所討論的，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易理解，促進(jìn)DNA雜交的適宜嚴(yán)謹(jǐn) 性條件可以改變。例如可以約45°C下，在6. Ox氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中進(jìn)行雜交，隨后 50°C下，以2. OXSSC洗滌。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可以選自501下，約2.0\55(的低 嚴(yán)謹(jǐn)性條件至50°C下，約0. 2XSSC的高嚴(yán)謹(jǐn)性條件。另外，洗滌步驟的溫度可以從約22°C 室溫的低嚴(yán)謹(jǐn)性條件至約65°C的高嚴(yán)謹(jǐn)性條件。溫度和鹽都可以變化，或者溫度或者鹽濃 度可在另一個變量改變時保持恒定。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在室溫下以6XSSC 的低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下雜交，隨后在室溫下以2X SSC洗滌的核酸。由于遺傳密碼子的簡并性，與SEQ ID NOs :4或5中所列核酸不同的分離核酸也包 括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如大量的氨基酸被不止一個三聯(lián)體指定。指定相同氨基酸的密碼 子或同義密碼子(例如對于組氨酸，CAU和CAC是同義的)可以導(dǎo)致不影響蛋白氨基酸序 列的“沉默”突變。然而，預(yù)期導(dǎo)致目標(biāo)蛋白氨基酸序列變化的DNA序列多態(tài)性會存在于哺 乳動物細(xì)胞中。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解，由于天然等位基因變異，編碼特定蛋白的核酸的 一個或多個核苷酸(至多約3-5%的核苷酸)的這些變異可以存在于給定種的個體中。任 意或全部這樣的核苷酸變異以及得到的氨基酸多態(tài)性在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組核酸可操作地連接到表達(dá)構(gòu)建物的一個或多個 調(diào)節(jié)核苷酸序列上。調(diào)節(jié)核苷酸序列通常適合用于表達(dá)的宿主細(xì)胞。本領(lǐng)域公知多種宿主 細(xì)胞的許多類型的合適表達(dá)載體和適宜調(diào)節(jié)序列。通常所述一個或多個調(diào)節(jié)核苷酸序列 可以包括但不限于啟動子序列、前導(dǎo)序列或信號序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始和終止序 列、翻譯起始和終止序列以及增強(qiáng)子或激活子序列。本領(lǐng)域已知的組成型的或誘導(dǎo)啟動子 被本發(fā)明所涵蓋。啟動子可以是天然存在的啟動子，也可以是組合超過一個啟動子元件的 雜合啟動子。表達(dá)構(gòu)建物可存在于細(xì)胞內(nèi)的游離體如質(zhì)粒上，或表達(dá)構(gòu)建物插入染色體內(nèi)。 在優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)載體含有選擇性標(biāo)記基因以供篩選轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。選擇性標(biāo)記 基因是本領(lǐng)域公知的，并且會隨采用的宿主細(xì)胞而變化。在本發(fā)明的某些方面，目標(biāo)核酸在包含編碼ActRIIa多肽的核苷酸序列的表達(dá)載 體中提供，并可操作地連接至至少一個調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列是本領(lǐng)域公認(rèn)的，被選擇來引 導(dǎo)ActRIIa多肽的表達(dá)。相應(yīng)地，術(shù)語調(diào)節(jié)序列包括啟動子、增強(qiáng)子和其他表達(dá)控制元件。 不范性的調(diào)節(jié)序列在 Goeddel ;GeneExpression Technology :Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990)中描述。例如，當(dāng)可操作地連接到DNA序列時，控制 DNA序列表達(dá)的任意各種表達(dá)調(diào)控序列可用于這些載體，以表達(dá)編碼ActRIIa多肽的DNA序 列。這樣有用的表達(dá)調(diào)控序列包括例如SV40的早期或晚期啟動子、tet啟動子、腺病毒或 巨細(xì)胞病毒立即早期啟動子、RSV啟動子、Iac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、TAC或TRC系統(tǒng)、由T7RNA聚 合酶引導(dǎo)表達(dá)的T7啟動子、噬菌體λ的主要操作基因和啟動子區(qū)、fd衣殼蛋白的調(diào)控區(qū)、 3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的啟動子、酸性磷酸酶的啟動子例如Pho5、酵母α -交 配因子的啟動子、桿狀病毒系統(tǒng)的多面體啟動子，以及其他已知調(diào)控原核細(xì)胞或真核細(xì)胞 或其病毒基因表達(dá)的序列，及其各種組合。應(yīng)當(dāng)理解，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可能取決于待轉(zhuǎn)化的 宿主細(xì)胞和/或想表達(dá)的蛋白類型的選擇等因素。此外，還應(yīng)當(dāng)考慮載體的拷貝數(shù)量、控制 拷貝數(shù)量和載體編碼的任何其他蛋白如抗生素標(biāo)記的表達(dá)的能力。本發(fā)明的重組核酸可以通過將克隆的基因或其部分連接到適于在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞(酵母、鳥類、昆蟲或哺乳動物)中，或在兩者中表達(dá)的載體而制備。制備重組 ActRIIa多肽的表達(dá)載體包括質(zhì)粒和其他載體。例如合適的載體包括下列類型的質(zhì)粒用 于在大腸桿菌等原核細(xì)胞中表達(dá)的來源于PBR322的質(zhì)粒、來源于pEMBL的質(zhì)粒、來源于pEX 的質(zhì)粒、來源于PBTac的質(zhì)粒以及來源于pUC的質(zhì)粒。
一些哺乳動物表達(dá)載體包含有助于載體在細(xì)菌中繁殖的原核序列，以及一個或 多個在真核細(xì)胞中表達(dá)的真核轉(zhuǎn)錄單元。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、 pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo 和 pHyg 來源的載體是適合轉(zhuǎn)染 真核細(xì)胞的哺乳動物表達(dá)載體的例子。這些載體中的一部分被來自細(xì)菌質(zhì)粒如PBR322的 序列所修飾，以有助于原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中的復(fù)制和藥物抗性篩選?；蛘撸《狙苌锶?牛乳頭瘤病毒(BPV-I)或Epstein-Barr病毒(pHEBo、pREP源的和p205)可用于在真核細(xì) 胞中蛋白的瞬時表達(dá)。其他的病毒(包括逆轉(zhuǎn)錄病毒的)表達(dá)體系的例子可以在下面基因 治療傳遞系統(tǒng)(gene therapy delivery system)的描述中找到。質(zhì)粒制備以及宿主生物 體轉(zhuǎn)化中采用的各種方法是本領(lǐng)域公知的。其它合適的原核和真核細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)以及通 用的重組過禾呈參見 MolecularCloning A Laboratory Manual, 3rd Ed. , ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)o 在一些例子中， 使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組多肽可能是合適的。這樣的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的例子包括 PVL來源的載體(如pVL1392、pVL1393和pVL941)、pAcUW來源的載體(例如pAcUWl)以及 pBlueBac來源的載體(如包含pBlueBac III的β-gal)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體被設(shè)計(jì)用來在CHO細(xì)胞中生成目標(biāo)ActRIIa多肽，如 Pcmv-Script ^{φ (Stratagene, La Jolla, Calif.) >pcDNA4 ^{φ (Invitrogen, Carlsbad, Calif.)和pCI-neo載體(Promega，Madison，Wise.)。顯然地，目標(biāo)基因構(gòu)建物可用于引起 目標(biāo)ActRIIa多肽在培養(yǎng)基中繁殖的細(xì)胞中的表達(dá)，例如產(chǎn)生蛋白包括融合蛋白或突變體 蛋白，用于純化。本公開還涉及用包括一個或多個目標(biāo)ActRIIa多肽的編碼序列(例如SEQ ID NO 4或5)的重組基因轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是任何的原核或真核細(xì)胞。例如本發(fā)明 的ActRIIa多肽可在細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌、昆蟲細(xì)胞(例如采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng))、酵母 或哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。其他合適的宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。因此本發(fā)明進(jìn)一步涉及制備目標(biāo)ActRIIa多肽的方法。例如用編碼ActRIIa多肽 的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞可在適宜條件下培養(yǎng)，以使ActRIIa多肽得以表達(dá)。ActRIIa多 肽可分泌并從含有ActRIIa多肽的細(xì)胞和培養(yǎng)基的混合物中分離?；蛘?，ActRIIa多肽可 留在細(xì)胞質(zhì)中或作為膜組分保留，收集、裂解細(xì)胞并分離蛋白。細(xì)胞培養(yǎng)物包括宿主細(xì)胞、 培養(yǎng)基和其他副產(chǎn)物。合適的細(xì)胞培養(yǎng)基是本領(lǐng)域公知的。目標(biāo)ActRIIa多肽可從細(xì)胞培 養(yǎng)基、宿主細(xì)胞或兩者中分離，采用本領(lǐng)域已知的純化蛋白的技術(shù)，包括離子交換層析、凝 膠過濾層析、超濾、電泳、使用ActRIIa多肽特定表位的特異性抗體的免疫親和純化，以及 使用能結(jié)合至融合到ActRIIa多肽的結(jié)構(gòu)域的物質(zhì)的親和純化(例如A蛋白柱可用于純化 ActRIIa-Fc融合蛋白)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，ActRIIa多肽是包含有助于其純化的結(jié)構(gòu)域 的融合蛋白。在優(yōu)選實(shí)施方案中，純化通過一系列柱層析步驟實(shí)現(xiàn)，包括例如以任何順序的 三個或多個的以下步驟A蛋白層析、Q瓊脂糖層析、苯基瓊脂糖層析、尺寸排阻層析以及陽 離子交換層析。純化可以通過病毒過濾和緩沖液更換完成。如本文所證明的，ActRIIa-hFc蛋白純化至如尺寸排阻層析確定的純度大于98%，如SDS PAGE確定的純度大于95%。此 純度水平足以在小鼠的骨骼上獲得所需效果，并在小鼠、大鼠和非人靈長類中得到可接受 的安全性曲線。在另一實(shí)施方案中，編碼純化前導(dǎo)序列的融合基因，如重組ActRIIa多肽所需部分N末端的多聚(His) /腸激酶切割位點(diǎn)序列，可供使用Ni2+金屬樹脂通過親和層析純化所 表達(dá)的融合蛋白之用。純化前導(dǎo)序列隨后可通過腸激酶處理去除，從而提供純化的ActRIIa 多月太(例如參見 Hochuli et al. , (1987) J. Chromatography 411 177 ；and Janknecht et al.，PNAS USA 88 8972)。制備融合基因的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。本質(zhì)上，編碼不同多肽序列的各種DNA片 段的連接是依據(jù)常規(guī)技術(shù)，采用平端或交錯末端連接、限制性酶消化以提供合適的末端、適 當(dāng)情況下填補(bǔ)粘性末端、堿性磷酸酶處理以避免不需要的連接，以及酶連接進(jìn)行的。在另一 實(shí)施方案中，融合基因可以通過常規(guī)技術(shù)包括自動DNA合成儀來合成。或者，基因片段的 PCR擴(kuò)增可使用錨定引物進(jìn)行，所述錨定引物導(dǎo)致兩個連續(xù)的可隨后退火產(chǎn)生嵌合基因序 列的基因片段之間互補(bǔ)突出端(complementary overhang)(參見例如CurrentProtocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. , John Wiley & Sons :1992)。4.可詵擇的活化素和ActRIIa拮抗劑本文顯示的數(shù)據(jù)證明了活化素-ActRIIa信號傳導(dǎo)拮抗劑可用于降低FSH水平。盡 管可溶性ActRIIa多肽，尤其ActRIIa-Fc是優(yōu)選的拮抗劑，并且盡管這樣的拮抗劑可通過 除了活化素拮抗以外的機(jī)制影響FSH，預(yù)期其他類型的活化素-ActRIIa拮抗劑是有用的， 包括抗活化素(例如A、B、C或E)抗體、抗ActRIIa抗體、反義物、抑制ActRIIa生成的RNAi 或核酶核酸，以及其他的活化素或ActRIIa抑制劑，特別是那些擾亂活化素-ActRIIa結(jié)合 的抑制劑。與ActRIIa多肽(例如可溶性ActRIIa多肽)特異性反應(yīng)的抗體，以及與ActRIIa 多肽競爭性結(jié)合至配體，或以其他方式抑制ActRIIa介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的物質(zhì)可用作 ActRIIa多肽活性的拮抗劑。同樣地，與活化素A多肽特異性反應(yīng)的抗體以及干擾ActRIIa 結(jié)合的物質(zhì)可用作拮抗劑。使用來自ActRIIa多肽或活化素多肽的免疫原，可通過標(biāo)準(zhǔn)方法(參見例如 Antibodies :A Laboratory Manual ed. by Harlow and Lane (Cold SpringHarbor Press 1988))制備抗蛋白/抗肽抗血清或單克隆抗體。哺乳動物，如小鼠、倉鼠或兔可用ActRIIa 多肽的免疫原形式或融合蛋白免疫，ActRIIa多肽的免疫原形式是能夠引發(fā)抗體反應(yīng)的 抗原片段。賦予蛋白或肽免疫原性的技術(shù)包括與載體的綴合或其他本領(lǐng)域公知的技術(shù)。 ActRIIa或活化素多肽的免疫原部分可在有佐劑的情況下施用。免疫過程可通過檢測抗體 在血漿或血清中的滴度來監(jiān)測。標(biāo)準(zhǔn)ELISA或其他免疫分析可與作為抗原的免疫原一起使 用，以評估抗體水平。用ActRIIa多肽的抗原制劑免疫動物之后，得到抗血清，如果需要可以從血清 中分離多克隆抗體。為產(chǎn)生單克隆抗體，可從免疫的動物收集產(chǎn)生抗體的細(xì)胞(淋巴細(xì) 胞)，并通過標(biāo)準(zhǔn)的體細(xì)胞融合步驟與骨髓瘤細(xì)胞等無限增殖的細(xì)胞融合，以產(chǎn)生雜交瘤 細(xì)胞。這樣的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，包括例如雜交瘤技術(shù)(最初由Kohler和Milstein 開發(fā)，(1975)Nature，256 :495-497)、人類 B 細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbar et al.，(1983)Immunology Today,4 72)以及生成人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole et al.， (1985)MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss，Inc. pp. 77-96)。雜交 瘤細(xì)胞可以通過免疫化學(xué)篩選，以產(chǎn)生與ActRIIa多肽特異性反應(yīng)的抗體，并且單克隆抗 體從包含這樣的雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基分離。本文所用的術(shù)語“抗體”意在包括也與目標(biāo)多肽特異性反應(yīng)的其片段?？贵w可采用傳統(tǒng)的技術(shù)片段化，并且如上所述以與全抗體相同方式的篩選片段用途。例如？(油)2片 段可以通過用胃蛋白酶處理產(chǎn)生?？梢蕴幚硭玫腇(ab)2片段，減少二硫橋來生成Fab片 段。本發(fā)明的抗體進(jìn)一步旨在包括由至少一個抗體⑶R區(qū)賦予的對ActRIIa或活化素多肽 有親和性的雙特異性的、單鏈的、嵌合的、人源化以及完全人源分子。抗體可進(jìn)一步包括連 接于其上的并能夠被檢測的標(biāo)簽(例如標(biāo)簽可以是放射性同位素、熒光化合物、酶或輔酶 因子)。在某些實(shí)施方案中，抗體是重組抗體，此術(shù)語包括了任意的部分通過分子生物學(xué) 技術(shù)產(chǎn)生的抗體，包括CDR移植的抗體或嵌合抗體，人的或組裝自文庫選擇抗體結(jié)構(gòu)域的 抗體、單鏈抗體以及單結(jié)構(gòu)域抗體(例如人Vh蛋白或駝類(camelicOVHH蛋白)。在某些實(shí) 施方案中，本發(fā)明的抗體是單克隆抗體，并且在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生新抗體的 方法。例如生成能特異結(jié)合至ActRIIa多肽或活化素多肽的單克隆抗體的方法，可包括將 一定量的包含有效刺激可檢測免疫反應(yīng)的抗原多肽的免疫原組合物給予小鼠，從小鼠獲得 抗體生成細(xì)胞(例如脾臟細(xì)胞)并將抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合得到產(chǎn)生抗體的雜交 瘤，并檢測產(chǎn)生抗體的雜交瘤以鑒別產(chǎn)生特異性結(jié)合至抗原的單克隆抗體的雜交瘤。一旦 獲得，即在任選的雜交瘤源的細(xì)胞生成能特異性結(jié)合至抗原的單克隆抗體的培養(yǎng)條件下， 在細(xì)胞培養(yǎng)基中繁殖雜交瘤。單克隆抗體可從細(xì)胞培養(yǎng)物純化。使用于抗體的形容詞“特異性地與之反應(yīng)”意在指如本領(lǐng)域通常理解的，抗體在感 興趣的抗原(例如ActRIIa多肽)和其他不感興趣的抗原之間有足夠的選擇性，這樣抗體 能用于最低程度地檢測特定類型生物樣品中感興趣的抗原的存在。在某些使用抗體的方法 中，如治療應(yīng)用中，更高程度的結(jié)合特異性可能是所需的。單克隆抗體通常更趨向(與多克 隆抗體相比)于有效地區(qū)分所需抗原以及交叉反應(yīng)多肽。影響抗體抗原相互作用特異性 的一個特征是抗體對抗原的親和力。盡管所需特異性可達(dá)到不同親和力的范圍，但通常優(yōu) 選的抗體的親和力(解離常數(shù))為約10_6、10_7、10_8、10_9或更少。假如活化素和ActRIIa間 異常緊密結(jié)合，則預(yù)期中和抗活化素或抗ActRIIa抗體通常有10,或更少的解離常數(shù)。另外，用于篩選抗體以鑒定所需抗體的技術(shù)可影響獲得的抗體的特性。例如如果 抗體要用于在溶液中結(jié)合抗原，則理想的可能是測試溶液結(jié)合。有各種測試抗體與抗原間 相互作用，以鑒別尤其可取的抗體的不同技術(shù)。這樣的技術(shù)包括ELISA、表面等離振子共振 結(jié)合分析(例如Biacore 結(jié)合分析，Biacore AB, Uppsala, Sweden)、夾心法(例如IGEN International, Inc.的順磁性磁珠體系，Gaithersburg，Maryland)、蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀 分析以及免疫組織化學(xué)。作為活化素或ActRIIa拮抗劑的核酸化合物的種類的例子包括反義核酸、RNAi構(gòu) 建物以及催化核酸構(gòu)建物。核酸化合物可以是單鏈的或雙鏈的。雙鏈化合物還可以包括突 出端或非互補(bǔ)區(qū)，這里一個或另外的鏈?zhǔn)菃捂?。單鏈化合物可包括自身互補(bǔ)區(qū)，意味著該 化合物可形成具有雙螺旋結(jié)構(gòu)的所謂“發(fā)夾”或“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)。核酸化合物可包括與由全長ActRIIa核酸序列或活化素β A或活化素β B核酸序列的不超過1000，不超過500，不超過 250，不超過100或不超過50、35、30、25、22、20或18個核苷酸組成的區(qū)互補(bǔ)的核苷酸序列。 互補(bǔ)區(qū)優(yōu)選是至少8個核苷酸，任選是至少10個或至少15個核苷酸，任選地在15和25個 核苷酸之間?；パa(bǔ)區(qū)可落在內(nèi)含子、靶轉(zhuǎn)錄物編碼序列或非編碼序列，如編碼序列部分的范 圍內(nèi)。通常核酸化合物會有約8至約500個核苷酸或堿基對的長度，任選地長度可以是約 14到約50個核苷酸。核酸可以是DNA(尤其作為反義核酸使用)、RNA或RNA:DNA雜合體。 任何一條鏈可包括DNA和RNA的混合物，以及不能容易地歸類為或DNA或RNA的修飾的形 式。同樣地，雙鏈化合物可以是DNA DNA,DNA RNA或RNA RNA,并且任何一條鏈還可以包括 DNA和RNA的混合物，以及不能容易地歸類為或DNA或RNA的修飾的形式。核酸化合物可 以包括任意的各種修飾，包括骨架(天然核酸的糖磷酸酯部分，包括核苷間連接鍵)或堿基 部分(天然核酸的嘌呤或嘧啶部分)的一個或多個修飾。反義核酸化合物優(yōu)選具有約15 至約30個核苷酸長度，并通 包含一個或多個修飾以改善穩(wěn)定性等特性，所述穩(wěn)定性如血 清中，細(xì)胞中或化合物可能的給藥位置，如胃(就口服給藥化合物而言)以及肺(對于吸入 的化合物)中的穩(wěn)定性。就RNAi構(gòu)建物而言，互補(bǔ)于靶轉(zhuǎn)錄物的鏈通常是RNA或其修飾形 式。其他鏈可以是RNA、DNA或任何其他變異。雙鏈或單鏈“發(fā)夾” RNAi構(gòu)建物的雙螺旋部 分優(yōu)選地有18到40個核苷酸長度，任選地約21到23個核苷酸長度，只要其作為Dicer底 物起作用。催化的或酶促核酸可以是核酶或DNA酶，還可含有修飾的形式。當(dāng)在生理?xiàng)l件 下以及無義或有義調(diào)控幾乎沒有或沒有作用的濃度下與細(xì)胞接觸時，核酸化合物可能抑制 約50%、75%、90%或更多的靶表達(dá)。優(yōu)選的檢測核酸化合物作用的濃度為1、5和10 μ M。 也可測試核酸化合物對體內(nèi)FSH水平、體外細(xì)胞系的FSH產(chǎn)生或FSH相關(guān)紊亂的作用。5.篩選方法在某些方面，本發(fā)明涉及使用ActRIIa多肽(例如可溶性ActRIIa多肽)和活化 素多肽，來鑒定是活化素-ActRIIa信號傳導(dǎo)通路的激動劑或拮抗劑的化合物(藥物)?？?檢測通過這種篩選鑒定的化合物，以評估它們在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)癌細(xì)胞尤其是前列腺癌細(xì) 胞生長或存活的能力。這些化合物可以例如在動物模型諸如小鼠異種移植物模型中檢測。 一種有用的動物模型是嚙齒類LAPC-4前列腺癌模型(描述于U. S. Pat No. 7，122，714)?？?例如通過植入LNCaP細(xì)胞來產(chǎn)生前列腺癌的其他動物模型。LNCaP細(xì)胞系是已建立的雄激 素響應(yīng)性前列腺癌細(xì)胞系，獲得自前列腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移物。有很多通過靶向活化素和ActRIIa信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來篩選減少或抑制FSH分泌的治療藥 物的方法。在某些實(shí)施方案中，可進(jìn)行化合物的高通量篩選，鑒別干擾活化素或ActRIIa介 導(dǎo)的對所選細(xì)胞系的作用的物質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，進(jìn)行該分析，篩選和鑒定特異性抑制 或減少ActRIIa多肽結(jié)合至活化素的化合物?；蛘撸龇治隹捎糜阼b定增強(qiáng)ActRIIa多 肽結(jié)合至活化素的化合物。在另一實(shí)施方案中，化合物可通過其與活化素或ActRIIa多肽 相互作用的能力來鑒定。各種分析形式是足夠的，并且根據(jù)本公開，那些本文沒有明確描述的仍然可被本 領(lǐng)域普通技術(shù)人員領(lǐng)會。如本文所描述的，可通過任何組合化學(xué)方法創(chuàng)造待測化合物(藥 物)?；蛘?，目標(biāo)化合物可以是天然存在的體內(nèi)或體外合成的生物分子。其作為組織生長 調(diào)節(jié)劑起作用的能力待測的化合物(藥物)可例如通過細(xì)菌、酵母、植物或其他生物體生成 (例如天然產(chǎn)物)，化學(xué)制備(例如小分子，包括擬肽類)，或重組制備。本文考慮的待測化合物包括非肽基有機(jī)分子、肽、多肽、擬肽類、糖、激素和核酸分子。在具體實(shí)施方案中，待測藥物是分子量小于約2，OOO道爾頓的小的有機(jī)分子。待測化合物可以單個的、離散的實(shí)體形式提供，或是在更大復(fù)雜度的文庫中，如組 合化學(xué)制備的庫中提供。這些庫可以包括例如乙醇、鹵代烷、胺、酰胺、酯、醛、醚以及其他類 的有機(jī)化合物。出現(xiàn)在檢測系統(tǒng)的待測化合物可以是分離形式或化合物的混合物形式，特 別是在起始篩選步驟中。任選地，化合物可以任選用其他化合物衍生化，并具有有助于化合 物分離的衍生化基團(tuán)。衍生化基團(tuán)的非限制性例子包括生物素、熒光素、地高辛、綠色熒光 蛋白、同位素、多組氨酸、磁珠、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)、光學(xué)可激活交聯(lián)劑或其任意組合。在許多檢測化合庫和天然提取物的藥物篩選程序中，為了使給定時期內(nèi)測量的化 合物數(shù)量最大化，高通量分析是可取的。在例如可用純化的或半純化的蛋白衍生化的無細(xì) 胞系統(tǒng)中進(jìn)行的分析通常優(yōu)選作為“初步”篩選，因?yàn)樗鼈兛杀粯?gòu)建成能允許快速開發(fā)，并 相對容易地檢測待測化合物介導(dǎo)的靶分子中的改變。此外，待測化合物的細(xì)胞毒性或生物 利用度的影響在體外系統(tǒng)中通常可以忽視，由于對ActRIIa多肽和活化素間結(jié)合親和力的 改變可能是明顯的，所述分析相反主要著重于藥物對分子靶標(biāo)的作用上。僅僅是舉例說明，在示例性篩選分析中，感興趣的化合物與分離并純化的通常能 結(jié)合至活化素的ActRIIa多肽相接觸。然后往化合物與ActRIIa多肽的混合物中加入含有 ActRIIa配體的組合物。ActRIIa/活化素復(fù)合物的檢測和定量提供了確定化合物抑制(或 增強(qiáng))ActRIIa多肽與活化素之間形成復(fù)合物的效力的方法?；衔锏男Я赏ㄟ^從使用 各種濃度的待測化合物獲得的數(shù)據(jù)作劑量反應(yīng)曲線進(jìn)行評估。此外，也可進(jìn)行對照分析，提 供比較用的基準(zhǔn)。例如在對照分析中，分離和純化的活化素加到含有ActRIIa多肽的組合 物中，在沒有待測化合物的情況下定量ActRIIa/活化素復(fù)合物的形成。應(yīng)當(dāng)了解，通常其 中反應(yīng)物的混合順序可變化，并且可以同時混合。此外，可使用細(xì)胞提取物和溶胞產(chǎn)物代替 純化的蛋白，以提供合適的無細(xì)胞分析系統(tǒng)。ActRIIa多肽與活化素間復(fù)合物的形成可以由各種技術(shù)檢測。例如，復(fù)合物形成 的調(diào)節(jié)可使用例如可檢測標(biāo)記的蛋白例如放射性標(biāo)記的(如32P、35S、14C或3H)、熒光標(biāo)記的 (如FITC)，或酶標(biāo)記的ActRIIa多肽或活化素，通過免疫分析或通過層析法檢測來定量。在某些實(shí)施方案中，可使用熒光偏振分析和熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)分析直接 或間接測量ActRIIa多肽及其結(jié)合蛋白間相互作用的程度。其他的檢測模式，包括例如基 于光波導(dǎo)(PCT公開WO 96/26432和美國專利No. 5，677，196)、表面等離振子共振(SPR)、表 面電荷傳感器以及表面力傳感器的那些。也可使用相互作用陷阱分析，也稱為“雙雜交分析”，以鑒定干擾或加強(qiáng)ActRIIa 多肽與其結(jié)合蛋白間相互作用的物質(zhì)。參見例如美國專利似.5，283，317;26作08 et al. (1993)Cell 72 :223_232 ；Madura et al. (1993)J BiolChem 268 :12046_12054 ；Bartel et al. (1993)Biotechniques 14 920-924 ；andlwabuchi et al. (1993)Oncogene 8 1693-1696)。在特定實(shí)施方案中，可使用反向雙雜交系統(tǒng)，鑒定使ActRIIa多肽與其結(jié)合蛋 白間相互作用解除的化合物(例如小分子或肽)。參見例如Vidal and Legrain, (1999) Nucleic Acids Res27 919-29 ；Vidal and Legrain, (1999)Trends Biotechnol 17 374-81 ；以及美國專利 Nos. 5，525，490 ；5，955，280 ；和 5，965，368。在某些實(shí)施方案中，化合物通過其與本文描述的ActRIIa或活化素多肽相互作用的能力來鑒定?；衔锱cActRIIa或活化素多肽之間的相互作用可以是共價的或非共價 的。例如這種相互作用可以使用體外生物化學(xué)方法，包括光交聯(lián)、放標(biāo)記配體結(jié)合，以及親 和層析，在蛋白水平上鑒定(Jakoby WBet al.，1974，Methods in Enzymology 46:1)。在 某些例子中，化合物可在基于機(jī)制的分析，例如檢測能結(jié)合至活化素活化素或ActRIIa多 肽的化合物的分析中篩選。這可包括固相或液相結(jié)合事件?；蛘?，編碼活化素或ActRIIa 多肽的基因可與報(bào)道基因系統(tǒng)(例如半乳糖苷酶、熒光素酶或綠色熒光蛋白)轉(zhuǎn)染到 細(xì)胞中，并任選通過高通量篩選來篩選文庫，或與文庫中的各成員一同轉(zhuǎn)染?？墒褂闷渌?于機(jī)制的結(jié)合分析，例如檢測自由能變化的結(jié)合分析。結(jié)合分析可用固定至孔、珠或芯片或 被固定化抗體捕獲或被毛細(xì)管電泳解離的靶標(biāo)進(jìn)行。被結(jié)合的化合物通?？刹捎帽壬ɑ?熒光或表面等離振子共振檢測。6.示范件治療應(yīng)用
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過給予個體治療有效量的活化素-ActRIIa拮 抗劑諸如例如ActRIIa多肽而在有此需要的個體中減少或抑制FSH分泌的方法。減少或抑 制FSH分泌的方法包括產(chǎn)生所述作用的所有方法，所述作用包括例如減少FSH轉(zhuǎn)錄、翻譯、 翻譯后處理和分泌。有多種試劑盒可用于檢測血漿FSH水平，包括MENOCHECK 。男性中FSH 的正常值在2-18mIU/ml血液范圍內(nèi)。女性中FSH的正常值在5_25mIU/mL范圍內(nèi)。健康女 性中高于50mIU/mL的水平與絕經(jīng)相關(guān)。可通過檢測唾液(eMHP )確定FSH的組織濃度。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過給予個體治療有效量的活化素-ActRIIa拮 抗劑(例如ActRIIa多肽)以減少或抑制FSH分泌從而在有此需要的個體中治療或預(yù)防前 列腺癌的方法。這些方法可用于對具有發(fā)展前列腺癌的高風(fēng)險的人(尤其是男性)的治療 性和預(yù)防性治療。由于每一位男性都處于發(fā)展前列腺癌的風(fēng)險中，具有發(fā)展前列腺癌的高 風(fēng)險的男性是與普通人群或處于某年齡段的男性人群相比，其風(fēng)險因素賦予更大發(fā)展該病 可能性的男性。示例性的風(fēng)險因素包括年齡、家族史或遺傳特性(genetic makeup)、生活方 式習(xí)慣(例如鍛煉和飲食)、以及暴露于輻射或其它致癌劑。本文所用的“預(yù)防”疾病或病癥的治療指在統(tǒng)計(jì)樣本中，相對于未治療對照樣本， 化合物在治療樣本中可減少該疾病或病癥的發(fā)生，或者相對于未治療樣本，可延遲該疾病 或病癥的一種或多種癥狀或特征的發(fā)生。例如，預(yù)防前列腺癌可指治療后沒有新的病變，或 者沒有或延遲轉(zhuǎn)移性疾病。術(shù)語“治療前列腺癌”系指相對于未治療對照或相對于治療前疾病的嚴(yán)重性，對該 疾病一種或多種癥狀或特征的改善。該術(shù)語并不必然地要求接受治療的患者痊愈或者該疾 病從患者完全根除。治療前列腺癌的藥劑可以是減輕該疾病一種或多種癥狀或特征嚴(yán)重性 的藥劑。請注意腫瘤生長與進(jìn)展受多種因素影響，包括細(xì)胞周期進(jìn)展與細(xì)胞分裂的媒介因 子、以及細(xì)胞死亡或凋亡的調(diào)節(jié)因子。因此，治療前列腺癌可涉及癌細(xì)胞增殖減少或細(xì)胞分 裂速率減少。替代性地或另外，治療前列腺癌可涉及癌細(xì)胞存活減少或凋亡增加。因此，在 某些實(shí)施方案中，治療前列腺癌可涉及細(xì)胞分裂減少和細(xì)胞死亡增多。不考慮機(jī)制，治療前 列腺癌的藥劑的有效性可通過可觀察的標(biāo)準(zhǔn)確定，例如比對照更少數(shù)量的癌細(xì)胞(由于增 殖減少、凋亡增力卩、或兩者)、或比對照減小的腫瘤尺寸。所以治療前列腺癌或者抑制腫瘤或 癌細(xì)胞生長預(yù)期與導(dǎo)致如此變化發(fā)生的機(jī)制無確定關(guān)聯(lián)。預(yù)防和治療都可在醫(yī)生或其他衛(wèi) 生保健提供者所提供的診斷和給予治療藥劑預(yù)期效果的分析中得到闡明。
當(dāng)觀察測試拮抗劑對人類前列腺癌進(jìn)展的效果時，可通過可測量疾病的減少或消 失、和/或沒有新病變、或防止轉(zhuǎn)移來評估效果。例如，活化素-ActRIIa拮抗劑可顯著地減 少或延遲患有非擴(kuò)散性和擴(kuò)散性前列腺癌的患者的前列腺癌進(jìn)展。此外，該拮抗劑可在具 有該疾病風(fēng)險因素的健康男性中預(yù)防或降低罹患前列腺癌的風(fēng)險。該拮抗劑還可在具有該 病史的患者中降低前列腺癌復(fù)發(fā)的風(fēng)險。因此，活化素-ActRIIa拮抗劑可用于在被認(rèn)為有風(fēng)險罹患該疾病的個體中預(yù)防或延遲前列腺癌的發(fā)生，并且該拮抗劑可用于選定的患者人群。合適的患者人群的實(shí)例包 括具有前列腺癌家族史的患者，例如父親或兄弟已被診斷患有該疾病的男性患者。在一種 實(shí)施方案中，用活化素-ActRIIa拮抗劑治療被認(rèn)為具有高度風(fēng)險罹患前列腺癌但尚未診 斷患有該疾病的患者。該治療可在該患者年齡到達(dá)30、40、50、60、或者70歲。本文公開的活化素-ActRIIa拮抗劑，尤其是ActRIIa-Fc蛋白，可用于治療或預(yù)防 患者的前列腺癌，包括患實(shí)體瘤的患者以及患轉(zhuǎn)移性癌癥的患者?；罨?ActRIIa拮抗 劑也可給予具有下列癥狀的人類對象前列腺癌前病變或良性病變，或者任何異常增殖性 病變，包括典型增生、非典型增生，以及非擴(kuò)散性或原位癌。本發(fā)明所述的拮抗劑還可用于 治療或預(yù)防激素依賴性或激素應(yīng)答性癌癥和非激素依賴性癌癥(例如激素不應(yīng)性前列腺 癌)。活化素-ActRIIa拮抗劑可證實(shí)在表達(dá)水平升高(相對于來源于正常前列腺組織的細(xì) 胞)的活化素(例如A、AB或B)或者水平升高的ActRIIa或ActRIIb的腫瘤中尤其有用。某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過給予個體治療有效量的活化素-ActRIIa拮抗 劑諸如例如ActRIIa多肽而在患有FSH分泌型垂體瘤的個體中減少或抑制FSH分泌的方 法。抑制這些垂體瘤中FSH的過多分泌對于減少腫瘤癥狀諸如雌激素水平增加和發(fā)展卵巢 囊腫是有用的治療。本發(fā)明方法優(yōu)選與常規(guī)癌癥療法諸如手術(shù)聯(lián)合使用，然而，單獨(dú)地抑制 FSH分泌可能是有效的治療，尤其是在禁忌用手術(shù)或放射治療的情況中。本發(fā)明意識到通過使用對象拮抗劑可增強(qiáng)傳統(tǒng)癌癥療法(化療、放射療法、光線 療法、免疫療法、和手術(shù)，尤其是前列腺切除術(shù))的有效性。因此，活化素-ActRIIa拮抗 劑可用于治療、預(yù)防、或控制前列腺癌的聯(lián)合療法。該拮抗劑可結(jié)合放射和/或手術(shù)治 療，以及細(xì)胞毒化療和/或內(nèi)分泌療法給予患者。這樣的聯(lián)合療法可協(xié)同作用并允許減 少每個單獨(dú)療法的劑量，由此減少每個療法高劑量時出現(xiàn)的有害副作用。在其它情況下， 某一療法難以治療的惡性腫瘤可對兩個或多個不同療法組成的聯(lián)合療法有應(yīng)答。因此， 本發(fā)明涉及活化素-ActRIIa拮抗劑與另一種傳統(tǒng)抗腫瘤藥劑同時或先后聯(lián)合給予，其目 的為增強(qiáng)該抗腫瘤藥劑的療效或克服對該抗腫瘤藥劑的細(xì)胞抗性。本公開還涉及與激素 療法聯(lián)合給予活化素-ActRIIa拮抗劑。活化素-ActRIIa拮抗劑還可用于聯(lián)合治療中以 減少由FSH分泌型垂體瘤引起的癥狀。僅為闡述目的，可用于聯(lián)合抗腫瘤療法的藥物化 合物包括氨魯米特、安吖啶、阿那曲唑、天門冬酰胺酶、卡介苗、比卡魯胺、博來霉素、布舍 瑞林(busere 1 in)、白消安、喜樹堿(campothecin)、卡培他濱、卡鉬、卡莫司汀、苯丁酸氮 芥、順鉬、克拉屈濱、氯膦酸鹽、秋水仙素、環(huán)磷酰胺、環(huán)丙孕酮、阿糖胞苷、達(dá)卡巴嗪、更生 霉素、柔紅霉素、雙烯雌酚、己烯雌酚、多西紫杉醇(docetaxel)、阿霉素、表阿霉素、雌二 醇、雌氮芥、鬼白乙叉苷、依西美坦、非格司汀(filgrastim)、氟達(dá)拉濱、氟氫可的松、氟尿 嘧啶、氟甲睪酮、氟他胺(flutamide)、吉西他濱、染料木黃酮、戈舍瑞林(goserelin)、羥 基脲、伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺、伊馬替尼、干擾素、依立替康、依羅替康、來曲唑、甲酰四氫葉酸、亮丙瑞林(leuprolide)、左旋咪唑、洛莫司汀(Iomustine)、氮芥、甲孕酮、甲地孕酮、 美法侖、巰基嘌呤、2-巰乙基磺酸鹽、氨甲喋呤、絲裂霉素、米托擔(dān)、米托蒽醌、巴魯米特 (nilutamide)、諾可唑、抑生長肽、奧沙利鉬、紫杉醇、帕米磷酸鹽、戊制菌素、光輝霉素、口卜 吩姆鈉(porfimer)、丙卡巴胼、雷替曲塞、利妥昔單抗、鏈脲菌素、蘇拉明、他莫昔芬、替莫唑 胺、替尼泊苷、睪酮、硫代鳥嘌呤、塞替派、二氯化二茂鈦、抑拓?fù)涿杆?、曲妥珠單抗、維A酸 (tretinoin)、長春花堿、長春新堿、脫乙酰長春花堿和脫水長春花堿。這些化療抗腫瘤化合物可基于其作用機(jī)制分為例如如下各組抗代謝物/抗癌 齊U，例如嘧啶類似物(5-氟尿嘧啶、氟尿苷、卡培他濱、吉西他濱和阿糖胞苷)和嘌呤類 似物、葉酸鹽(folate)拮抗劑和相關(guān)抑制劑(巰基嘌呤、硫代鳥嘌呤、噴司他丁和2-氯 脫氧腺苷(克拉屈濱))；抗增殖/抗有絲分裂藥劑，包括天然產(chǎn)物，例如長春花生物堿 (長春堿、長春新堿和長春瑞濱)，微管破壞劑例如紫杉烷(紫杉醇、多西他賽)、長春新 堿(vencristin)、長春堿(vinblastin)、諾考達(dá)唑、埃坡霉素和諾維本、表二鬼白毒素 (epidipodophyllotoxins)(鬼依托泊苷、替尼泊苷)、DNA損傷劑(放線菌素、安吖啶、蒽 環(huán)類、博來霉素、白消安、喜樹堿、卡鉬、苯丁酸氮芥、順鉬、環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺(Cytoxan)、 放線菌素D、柔紅霉素、多柔比星、表柔比星、六甲三聚氰胺奧沙利鉬、異環(huán)磷酰胺、美法侖、 美錄瑞塔明(merchlorehtamine)、絲裂霉素、米托蒽醌、亞硝基脲、普卡霉素、丙卡巴胼、紫 杉醇、泰索帝、替尼泊苷、三亞乙基硫代磷酰胺和依托泊苷(VP16))；抗生素，例如放線菌素 D(actinomycin D)、柔紅霉 素、多柔比星(阿霉素)、伊達(dá)比星、蒽環(huán)類、米托蒽醌、博來霉 素、普卡霉素(光神霉素)和絲裂霉素；酶類(L-天冬酰胺酶，其全身性代謝L-天冬酰胺， 抑制不能自己合成天冬酰胺的細(xì)胞)；抗血小板劑；抗增殖/抗有絲分裂烷化劑，例如氮芥 類(氮芥、環(huán)磷酰胺及其類似物、美法侖、苯丁酸氮芥)、氮丙啶和甲基三聚氰胺類(六甲三 聚氰胺和塞替派)、烷基磺酸鹽-白消安、亞硝基脲類(卡莫司汀(BCNU)及其類似物、鏈 脲菌素)、曲嗪類(trazenes)-達(dá)卡巴嗪(DTIC)；抗增殖/抗有絲分裂抗代謝物，例如葉酸 類似物(氨甲喋呤)；鉬絡(luò)合復(fù)合物(順鉬、卡鉬)、丙卡巴胼、羥基脲、米托擔(dān)、氨魯米特； 激素類、激素類似物(雌激素、他莫昔芬、戈舍瑞林、比卡魯胺、尼魯米特)和芳香酶抑制劑 (來曲唑、阿那曲唑)；抗凝血劑(肝素、合成肝素鹽和其它凝血酶抑制劑)；纖維蛋白溶解 劑(例如組織纖溶酶原激活物、鏈球菌激酶和尿激酶)、阿司匹林、潘生丁、噻氯匹定、氯吡 格雷、阿昔單抗；抗轉(zhuǎn)移劑；抗分泌劑(布雷韋林)(breveldin)；免疫抑制劑(環(huán)孢霉素、 他克莫司(Π(-506)、西羅莫司(雷帕霉素)、硫唑嘌呤、麥考酚酸酯)；抗血管形成化合物 (TNP-470、染料木黃酮)和生長因子抑制劑(血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)抑制劑、成纖維細(xì) 胞生長因子(FGF)抑制劑)；血管緊張素受體阻斷劑；一氧化氮供體；反義寡核苷酸；抗體 (曲妥珠單抗)；細(xì)胞周期抑制劑和分化誘導(dǎo)劑(維A酸)；mTOR抑制劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑 (多柔比星(阿霉素)、安吖啶、喜樹堿、柔紅霉素、放線菌素D、恩尼泊苷(eniposide)、表柔 比星、依托泊苷、伊達(dá)比星和米托蒽醌、抑拓?fù)涿杆?、依立替?、皮質(zhì)類固醇(可的松、地塞 米松、氫化可的松、甲基強(qiáng)的松龍、潑尼松和潑尼松龍)；生長因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激酶抑制劑；線 粒體機(jī)能障礙誘導(dǎo)劑和半胱氨酸蛋白水解酶激活劑；以及染色質(zhì)破壞劑。在某些實(shí)施方案中，可用于聯(lián)合療法的藥物化合物包括抗血管生成劑，例如 (1) “血管生成分子”的釋放抑制劑，例如bFGF (堿性成纖維細(xì)胞生長因子)；(2)血管生成 分子的中和劑，例如抗^bFGF抗體；以及⑶內(nèi)皮細(xì)胞對血管生成刺激應(yīng)答的抑制劑，包括膠原酶抑制劑、基膜更新抑制劑、血管生成抑制類固醇(angiostatic steroids)、源于真菌 的血管生成抑制劑、血小板因子4、血小板反應(yīng)蛋白、關(guān)節(jié)炎藥物(例如D-青霉胺和硫代蘋 果酸金)、維生素D3類似物、α干擾素等等。另外提議的血管生成抑制劑參見Blood等人， Bioch. Biophys. Acta.，1032 :89_118 (1990)，Moses 等人，Science，248 1408-1410 (1990)， Ingber 等人，Lab. Invest. ,59 44-51 (1988),以及美國專利 5, 092, 885,5, 112，946、 5，192, 744,5, 202, 352 ^P 6573256。此外，有多種化合物可用于抑制血管生成，例如，阻 斷VEGF介導(dǎo)的血管生成途徑的肽或試劑、內(nèi)皮抑素蛋白或其衍生物、血管新生抑制素的 賴氨酸結(jié)合片段、黑色素或促黑色素化合物、纖維蛋白溶酶原片段(例如纖維蛋白溶酶原 的Kringles 1-3)、肌鈣蛋白(tropoin)亞基、玻連蛋白α ν β 3的拮抗劑、源自Saposin B 的肽、抗生素或其類似物(例如四環(huán)素或新霉素)、包含地諾孕素的組合物、包含偶聯(lián)至肽 的MetAP-2抑制核心的化合物、化合物EM-138、查耳酮及其類似物、N-乙酰α連接的酸 性二肽酶(naaladase)抑制劑。參見，例如，美國專利 6，395，718、6，462，075、6，465，431、 6，475，784,6，482，802,6，482，810,6，500，431,6，500，924,6，518，298,6，521，439, 6，525，019,6, 538，103,6, 544，758,6, 544，947,6, 548，477,6, 559，126 和 6，569，845。
取決于聯(lián)合療法的性質(zhì)，可在其它療法正在施用時和/或之后繼續(xù)給予本發(fā)明的 治療性拮抗劑。本文所述的拮抗劑可以單劑量或多劑量給予。在一些情況下，在傳統(tǒng)療法 之前至少數(shù)天開始給予拮抗劑，而在另外的情況下，緊鄰施用傳統(tǒng)療法之前或施用傳統(tǒng)療 法時開始給予。本申請的一個方面提供對生育力有用的方法和組合物。通過給予活化素-ActRIIa 拮抗劑減少或抑制FSH分泌是抑制精子成熟的有用方法。在女性中，F(xiàn)SH的減少能夠限制 卵巢中卵泡粒膜細(xì)胞的增殖。通過給予活化素-ActRIIa拮抗劑減少或抑制FSH分泌是避 孕的有用方法。FSH減少還可以延遲卵巢內(nèi)卵泡的成熟，從而推遲女性中有限數(shù)目的卵泡 的成熟。這種治療具有增加自然受精可能性和在生命中較晚懷孕可能性的潛力。通過減少 FSH分泌而延遲卵巢內(nèi)卵泡的成熟還可用于防止卵母細(xì)胞耗竭(化療或設(shè)計(jì)用于快速治療 分裂中的細(xì)胞的類似治療的常見副作用)。本發(fā)明還提供新組合物，其包含一種或多種活化素-ActRIIa拮抗劑并聯(lián)合一 種或多種避孕劑。示例性避孕劑包括雌激素、孕激素、黃體激素(例如異炔諾酮、炔諾 酮、諾孕酯、炔諾孕酮、左炔諾孕酮、甲羥孕酮和去氧孕烯)、奧美昔芬(Ormeloxifene) (Centchroman)0某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過給予個體治療有效量的活化素-ActRIIa拮抗 劑諸如例如ActRIIa多肽以減少或抑制FSH分泌從而在有此需要的個體中治療或預(yù)防雌激 素相關(guān)紊亂的方法。由于FSH對雌激素合成的控制功能，F(xiàn)SH分泌的減少還可能有效治療雌 激素相關(guān)紊亂，諸如子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位、多囊卵巢病、功能失調(diào)性子宮出血和卵巢癌。7.藥物組合物在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的活化素-ActRIIa拮抗劑(例如ActRIIa多肽)與藥 學(xué)上可接受的載體一起配制。例如，ActRIIa多肽可單獨(dú)或作為藥物制劑(治療組合物)的 成分給藥。目標(biāo)化合物可以配制成以任何便利的方式用于人或獸藥的給藥形式。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療方法包括全身性施用組合物或以植入體或裝置 局部給藥。給藥時，用于本發(fā)明的治療組合物是無熱原的、生理上可接受的形式。在本發(fā)明的方法中，除了如上所述也可以任選地包括在上述組合物中的ActRIIa拮抗劑外，治療有效的藥物可與目標(biāo)化合物(例如ActRIIa多肽)同時或相繼給藥。通常ActRIIa拮抗劑會在胃腸外給藥，尤其是靜脈注射或皮下給藥。適合胃腸外 給藥的藥物組合物可包括一種或多種ActRIIa多肽以及與之組合的一種或多種藥學(xué)上可 接受的無菌等滲水溶液或非水溶液、分散劑、混懸劑或乳劑，或臨用前可復(fù)溶成無菌可注射 溶液或分散劑的無菌粉末，其可含有抗氧劑、緩沖劑、抑菌劑、使制劑與目標(biāo)受者的血液等 滲的溶質(zhì)或助懸劑或增稠劑?？杀槐景l(fā)明的藥物組合物采用的合適的水和非水載體的例子 包括水、乙醇、多羥基化合物(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等等)及其合適的混合物，植物油 如橄欖油，以及可注射有機(jī)酯如油酸乙酯。例如可通過使用包衣材料如卵磷脂，通過保持分 散劑的所需顆粒大小，并通過使用表面活性劑，可保持適當(dāng)?shù)牧鲃有浴Ｔ谀承?shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以口服給藥，例如以膠囊劑、扁囊劑、丸劑、片 齊 、錠劑(采用調(diào)味基質(zhì)，通常是蔗糖和阿拉伯樹膠或西黃蓍膠)、粉末劑、顆粒劑，或在含 水或非水液體中的溶液劑或混懸劑，或水包油或油包水的液體乳劑，或酏劑或糖漿劑，或軟 錠劑(采用惰性基質(zhì)，如凝膠和甘油，或蔗糖和阿拉伯樹膠)和/或漱口劑等等的形式，每 種都包含預(yù)定量的作為活性成分的藥物。藥物也可以以大丸劑、干藥糖劑或糊劑給藥。在口服給藥的固態(tài)劑型(膠囊劑、片劑、丸劑、糖衣丸、粉末劑、顆粒劑等等)中， 本發(fā)明的一種或多種治療化合物可與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體，如檸檬酸鈉或磷酸 二鈣，和/或任何下面的物質(zhì)混合(1)填充劑或膨脹劑，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露 醇和/或硅酸；(2)粘合劑，如羧甲基纖維素、藻酸鹽、凝膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿 拉伯樹膠；(3)濕潤劑如甘油；(4)崩解劑，如瓊脂-瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯淀粉、褐藻 酸、某些硅酸鹽以及碳酸鈉；(5)溶液緩釋劑，如石蠟；(6)吸收促進(jìn)劑，如季銨化合物；(7) 潤濕劑，如十六醇和甘油單硬脂酸酯；(8)吸收劑，如高嶺土和膨潤土；(9)潤滑劑，如滑石、 硬脂酸鈣、硬脂酸鎂和固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉及其混合物；以及(10)著色劑。在膠 囊劑、片劑以及丸劑的情況下，藥物組合物還可包含緩沖劑。使用如乳糖或奶糖以及高分子 量聚乙二醇等等這樣的輔料，相似類型的固態(tài)組合物也可用作軟的或硬的填充明膠膠囊的 填充劑。口服給藥的液態(tài)劑型包括藥學(xué)上可接受的乳劑、微乳劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑 和酏劑。除活性成分外，液態(tài)劑型可含有本領(lǐng)域常用的惰性稀釋劑，如水或其他溶劑，增溶 劑和乳化劑，如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1，3_ 丁二 醇、油(尤其是棉籽、落花生、玉米、胚芽、橄欖、蓖麻以及芝麻油)、甘油、四氫呋喃醇、聚乙 二醇以及山梨聚糖的脂肪酸酯及其混合物。除惰性稀釋劑外，口服組合物還可包括如潤濕 齊U、乳化和混懸劑、甜味劑、調(diào)味劑、著色劑、香味劑以及防腐劑的輔劑。除了活性化合物外，混懸劑可含有如乙氧基異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和山梨聚 糖酯、微晶纖維素、偏鋁酸(aluminum metahydroxide)、膨潤土、瓊脂-瓊脂和西黃蓍膠及 其混合物的助懸劑。本發(fā)明的組合物還可含有輔劑，如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。可通過包含 各種抗菌和抗真菌藥，如尼泊金類、氯丁醇、苯酚山梨酸等來確保防止微生物的活動。組合 物中包括等滲劑，如糖、氯化鈉等，這可能也是可取的。此外，注射藥物形式的延長吸收可通 過包含延遲吸收的物質(zhì)，如單硬脂酸鋁和凝膠產(chǎn)生。
可以理解，給藥方案會由主治醫(yī)師考慮各種改變本發(fā)明的目標(biāo)化合物(例如 ActRIIa多肽)作用的因素后確定。所述各種因素包括但不限于需要的FSH水平降低程度、 疾病嚴(yán)重性、患者年齡、性別和飲食、可能促進(jìn)骨丟失的任何疾病的嚴(yán)重程度、給藥時間以 及其他臨床因素。加到最終組合物中的其他已知生長因子也可影響劑量。進(jìn)程可通過定期 評估FSH水平或與待治療的FSH相關(guān)紊亂有關(guān)的其他癥狀來監(jiān)測。靈長類動物和人類實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明，當(dāng)化合物的給藥間隔和量足以達(dá)到約IOOOng/ ml的血清濃度時，ActRIIa-Fc對FSH的作用是可檢測的，在劑量為0. 3mg/kg或相當(dāng)?shù)那€ 下面積時出現(xiàn)對FSH的顯著效應(yīng)。在人類中，lOOOng/ml的血清水平可通過0. 3mg/kg或更 高的單劑量達(dá)到，1000ng/ml的血清藥物水平可通過0. 3mg/kg或更高的單劑量達(dá)到。觀察 到的分子的血清半衰期在約25天到35天之間，顯著長于大多數(shù)Fc融合蛋白，因此持久有 效的血清水平可例如通過根據(jù)每周或雙周給藥約0. 05-0. 5mg/kg，或采用更高的劑量和給 藥之間更長的時間間隔實(shí)現(xiàn)。例如，每月或雙月可使用例如0. 1、0. 3、0. 5、0. 7、1、2或3mg/ kg的劑量或之間的值，對骨骼的效果足夠持久，這樣每3、4、5、6、9、12或更多個月僅需給藥 一次。給藥之間更長的時間間隔進(jìn)一步由藥效持續(xù)時間支持，該藥效持續(xù)時間比血清中藥 物持續(xù)時間長。觀察人患者至少120天的PD作用。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了體內(nèi)產(chǎn)生ActRIIa多肽的基因治療。這樣的 治療會通過將ActRIIa多核苷酸序列引入患有如上所列疾病的細(xì)胞或組織中，實(shí)現(xiàn)其治療 效果。ActRIIa多核苷酸序列的遞送可使用重組表達(dá)載體如嵌合病毒或膠體分散體系實(shí)現(xiàn)。 ActRIIa多核苷酸序列的治療遞送優(yōu)選使用靶向脂質(zhì)體。本文所教導(dǎo)的各種可用于基因治療的病毒載體包括腺病毒、皰疹病毒、牛痘，或優(yōu) 選RNA病毒如逆轉(zhuǎn)錄病毒。優(yōu)選地，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是鼠類或鳥類逆轉(zhuǎn)錄病毒的衍生物?？?插入單個外源基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒的例子包括但不限于莫洛尼鼠類白血病病毒(MoMuLV)、 哈維鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠類乳腺腫瘤病毒(MuMTV)以及勞氏肉瘤病毒(RSV)。大量其 他的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可包含多個基因。所有這些載體可轉(zhuǎn)移或包含選擇性標(biāo)記的基因，從 而可鑒別并生成轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可通過連接例如糖、糖脂或蛋白質(zhì)而制成靶特 異性的。使用抗體實(shí)現(xiàn)優(yōu)選的靶向。本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到特異性多核苷酸序列可插入 到逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組中或連接到病毒包膜，以使含有ActRIIa多核苷酸的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 得以靶特異性遞送。在優(yōu)選實(shí)施方案中，載體靶向作用于骨骼或軟骨?；蛘?，組織培養(yǎng)細(xì)胞可通過常規(guī)磷酸鈣轉(zhuǎn)染，用編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因gag、pol 和erw的質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染。然后這些細(xì)胞用含有感興趣的基因的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。得到的細(xì)胞 將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體釋放到培養(yǎng)基中。另一 ActRIIa多核苷酸的靶向遞送系統(tǒng)是膠體分散系統(tǒng)。膠體分散系統(tǒng)包括大分 子復(fù)合物、納米膠囊、微球體、珠子以及基于脂質(zhì)的系統(tǒng)，包括水包油乳劑、膠束、混合膠束 以及脂質(zhì)體。本發(fā)明優(yōu)選的膠體系統(tǒng)是脂質(zhì)體。脂質(zhì)體是用作體外和體內(nèi)遞送載體的人工 膜囊。RNA、DNA以及完整的病毒粒子可包封在含水的內(nèi)部中，并以生物活性形式遞送到細(xì)胞 (見例如 Fraley, et al.，Trends Biochem. Sci.，6 :77，1981)。采用脂質(zhì)體載體高效轉(zhuǎn)運(yùn) 基因的方法是本領(lǐng)域已知的，參見例如Mannino，et al.，Biotechniques,6 :682，1988。月旨 質(zhì)體組合物通常是磷脂的組合，通常與留族化合物特別是膽固醇組合。也可使用其他的磷 脂或其他 的脂質(zhì)。脂質(zhì)體的物理特性依賴于PH、離子強(qiáng)度以及二價陽離子的存在。
用于生產(chǎn)脂質(zhì)體的脂質(zhì)的例子包括磷脂?；衔?，如磷脂酰甘油、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、腦苷脂和神經(jīng)節(jié)苷脂。示例性的磷脂包括蛋黃磷脂酰 膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿和二硬脂酰磷脂酰膽堿。脂質(zhì)體的靶向也可能基于例如器官特 異性、細(xì)胞特異性以及細(xì)胞器特異性，并且為本領(lǐng)域所知。
實(shí)施例本發(fā)明現(xiàn)在是一般性描述，通過參照下述實(shí)施例會更容易理解，包括的實(shí)施例僅 為解釋某些實(shí)施方案以及本發(fā)明實(shí)施方案的目的，并不打算用于限制本發(fā)明。實(shí)施例1 :ActRIIa_Fc融合蛋白申請人:構(gòu)建了具有融合至人或小鼠Fc結(jié)構(gòu)域的人ActRIIa胞外結(jié)構(gòu)域的可溶 性ActRIIa融合蛋白，兩結(jié)構(gòu)域之間用最小的接頭連接。構(gòu)建物分別稱為ActRIIa-hFc和 ActRIIa—mFc。從CHO細(xì)胞系純化的ActRIIa-hFc如下顯示(SEQ ID NO 7)ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCY⑶KDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEG匪CNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDYSHEDPEYKFNffYYDGYEYHNAKTKPREEQYNSTYRYYSYLTYLHQDffLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEffESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRffQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKActRIIa-hFc和ActRIIa-mFc蛋白在CHO細(xì)胞系中表達(dá)?？紤]了三種不同的前導(dǎo) 序列(i)蜜蜂蜂毒溶血肽(mellitin) (HBML) :MKFLVNVALVFMVVYISYIYA(SEQ ID NO 8)(ii)組織型纖溶酶原激活劑(TPA) :MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP(SEQ ID NO 9)(iii)天然的MGAAAKLAFAVFLISCSSGA(SEQ ID NO 10).選擇的形式采用TPA前導(dǎo)序列并具有以下未加工的氨基酸序列MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPGAAILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGV
EPCY⑶KDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEG匪CNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 13)該多肽由下面的核苷酸序列編碼ATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCCGGCGCCGCTATACTTGGTAGATCAGAAACTCAGGAGT
GTCTTTTTTTAATGCTAATTGGGAAAAAGACAGAACCAATCAAACTGGTGTT
GAACCGTGTTATGGTGACAAAGATAAACGGCGGCATTGTTTTGCTACCTGGA
AGAATATTTCTGGTTCCATTGAATAGTGAAACAAGGTTGTTGGCTGGATGATATCAACTGCTATGACAGGACTGATTGTGTAGAAAAAAAAGACAGCCCTGAAGTATATTTCTGTTGCTGTGAGGGCAATATGTGTAATGAAAAGTTTTCTTATTTTCCGGAGATGGAAGTCACACAGCCCACTTCAAATCCAGTTACACCTAAGCC
ACCCACCGGTGGTGGAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGTCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGAATTC(SEQ ID NO 14)ActRIIa-hFc和ActRIIa-mFc都格外易于重組表達(dá)。如圖1所示，蛋白純化為邊 界清晰的單峰蛋白。N末端測序顯示了-ILGRSTQE(SEQ ID NO=Il)的單個序列。純化可通 過一系列的柱層析步驟完成，包括例如任何順序的三個或多個以下步驟A蛋白層析、Q瓊 脂糖層析、苯基瓊脂糖層析、尺寸排阻層析以及陽離子交換層析。純化可通過病毒過濾以及 緩沖液更換完成。ActRIIa-hFc蛋白純化至如尺寸排阻層析確定的純度大于98%，如SDS PAGE確定的純度大于95%。ActRIIa-hFc和ActRIIa-mFc顯示了對配體，尤其是對活化素A的高親和性。 ⑶F-11或活化素A("ActA”)用標(biāo)準(zhǔn)胺偶聯(lián)步驟固定在Biacore CM5芯片上。ActRIIa-hFc 和ActRIIa-mFc蛋白加樣至系統(tǒng)，并測量結(jié)合。ActRIIa-hFc結(jié)合至活化素的解離常數(shù)(Kd) 為5Χ1(Γ12，蛋白結(jié)合至GDFll的Kd為9. 96Χ10Λ見圖2。ActRIIa-mFc表現(xiàn)類似。A-204報(bào)告基因分析用于評價ActRIIa-hFc蛋白對⑶F-Il和活化素A介導(dǎo)的信號 傳導(dǎo)的影響。細(xì)胞系人橫紋肌肉瘤(來自肌肉)。報(bào)告載體pGL3 (CAGA) 12 (在Dermler et al，1998，EMBO 17 :3091_3100中描述)。參見圖3。CAGA12基序存在于TGF-β應(yīng)答基 因(ΡΑΙ-1基因)中，因此這個載體可通用于通過Smad2和3的因子信號傳導(dǎo)。第一天把A-204細(xì)胞分到48孔板中。第二 天A-204 細(xì) 胞 用 IOyg pGL3(CAGA)12 或 pGL3 (CAGA) 12 (10 μ g) +pRLCMV (1 μ g)和 Fugene 轉(zhuǎn)染。第三天加入因子(用培養(yǎng)基+0. 1%BSA稀釋)。加入到細(xì)胞之前，需要將抑制劑 與因子預(yù)孵育1小時。6小時后，細(xì)胞用PBS洗滌，裂解細(xì)胞。此后是熒光素酶分析。通常在該分析中，在沒有任何抑制劑存在下，活化素A對報(bào) 告基因表達(dá)顯示約10倍的刺激作用，ED50 2ng/m。⑶F-Il 16倍刺激，ED50 1. 5ng/ml。⑶F-8顯示類似于⑶F-Il的效果。如圖4中所示，皮摩爾濃度的ActRIIa-hFc和ActRIIa-mFc抑制⑶F_8介導(dǎo)的信號 傳導(dǎo)。如圖5所示，三種不同的ActRIIa-hFc制劑抑制⑶F-Il信號傳導(dǎo)，IC50大約200pM。在藥代動力學(xué)研究中ActRIIa-hFc非常穩(wěn)定。大鼠給予lmg/kg、3mg/kg或IOmg/ kg劑量的ActRIIa-hFc蛋白，在24、48、72、144和168小時測量該蛋白的血漿水平。在單 獨(dú)的研究中，大鼠給予lmg/kg、10mg/kg或30mg/kg的劑量。大鼠中，ActRIIa-hFc的血清 半衰期為11-14天，兩周后藥物的循環(huán)水平相當(dāng)高(起始劑量lmg/kg、10mg/kg或30mg/kg 分別對應(yīng)11 μ g/ml、110l·! g/ml或304μ g/ml)。食蟹猴中，血漿半衰期顯著大于14天，藥物 的循環(huán)水平為25 μ g/ml、304 μ g/ml或1440 μ g/ml，分別對應(yīng)起始濃度lmg/kg、10mg/kg或 30mg/kg。人類中的初步結(jié)果顯示，血清半衰期在約20至30天之間。實(shí)施例2 =ActRIIa-mFc在體內(nèi)促講骨骼牛長正常雌性小鼠(BALB/c)給予lmg/kg/次、3mg/kg/次或10mg/kg/次水平的ActRIIa-mFc,每周給藥2次。骨礦密度和骨礦含量通過DEXA確定，見圖6。在BALB/c雌性小鼠中，DEXA掃描顯示ActRIIa-mFc治療使骨礦密度和含量顯著 增加(> 20% )。見圖7和8。因此，ActRIIa的拮抗引起正常雌性小鼠骨密度和含量增加。下一步檢測了 ActRIIa-mFc對骨質(zhì)疏松癥小鼠模型中骨骼的作用。Andersson et al. (2001)證實(shí)，切除卵巢的小鼠遭受重大的骨丟失(術(shù)后6周大 概丟失了 50%的小梁骨)，并且這些小鼠中的骨丟失可用候選治療藥物如甲狀旁腺激素糾 正。申請人:采用4-5周齡時切除卵巢(OVX)或假手術(shù)的C57BL6雌性小鼠。術(shù)后8周， 開始用ActRIIa-mFc (10mg/kg，每周兩次)或?qū)φ?PBS)治療。用CT掃描儀測量骨密度。如圖9所示，6周后相對于假手術(shù)對照，未治療的切除卵巢的小鼠顯示可觀的小梁 骨骨密度丟失。ActRIIa-mFc治療將骨密度恢復(fù)到假手術(shù)小鼠的水平。在治療6周和12周 時，ActRIIa-mFc引起OVX小鼠小梁骨的可觀增長。見圖10。6周治療后，相對于PBS對照， 骨密度增加了 24%。12周后，增加了 27%。在假手術(shù)小鼠中，ActRIIa-mFc也引起了小梁骨的可觀的增加。見圖11。6周和 12周后，相對于對照，治療產(chǎn)生了 35%的增加。在另外一組實(shí)驗(yàn)中，如上所述的切除卵巢(OVX)或假手術(shù)小鼠用 ActRIIa-mFc (10mg/kg，每周兩次)或?qū)φ?PBS)處理12周以上。類似于上述ActRIIa-mFc 的結(jié)果，接受ActRIIa-mFc的OVX小鼠早在治療4周時即顯示小梁骨密度增加了 15%，治 療12周后增加了 25% (圖12)。接受ActRIIa-mFc的假手術(shù)小鼠類似地早在治療4周時 即顯示小梁骨密度增加了 22%，治療12周后增加了 32% (圖13)。用ActRIIa-mFc治療12周后，全身以及離體股骨DEXA分析顯示，治療引起切除卵 巢的和假手術(shù)小鼠的骨密度增加(分別為圖14A和圖14B)。這些結(jié)果也被股骨中段的離體 PQCT分析所支持，證明了用ActRIIa-mFc治療12周后，總的和皮質(zhì)骨密度均顯著增加。媒介 處理的對照切除卵巢小鼠顯示骨密度與媒介處理的對照假手術(shù)小鼠相當(dāng)(圖15)。除骨密 度外，ActRIIa-mFC治療后骨含量增加。股骨中段的離體PQCT54分析證明，用ActRIIa-mFc 治療12周后，總的以及皮質(zhì)骨的骨含量均顯著增加，而切除卵巢的和假手術(shù)媒介對照處理的小鼠顯示相當(dāng)?shù)墓呛?圖16)。股骨中段的離體pQCT分析還顯示，ActRIIa-mFc治療 的小鼠沒有顯示骨外膜周長的變化，而ActRIIa-mFc治療導(dǎo)致骨內(nèi)膜周長減小，這表明皮 質(zhì)厚度的增加是由股骨內(nèi)表面的生長引起的(圖17)。股骨的力學(xué)測試確定了，ActRIIa-mFc能增加骨骼的外在特性(最大載荷、剛度以 及斷裂能)，其有助于骨骼內(nèi)在特性(極限強(qiáng)度)的顯著增加。用ActRIIa-mFc治療的去卵 巢小鼠顯示骨強(qiáng)度增加到超過假手術(shù)的、媒介處理對照的小鼠的水平，這表明骨質(zhì)疏松表 現(xiàn)型的完全逆轉(zhuǎn)(圖18)。這些數(shù)據(jù)證明，活化素-ActRIIa拮抗劑可增加正常雌性小鼠的骨密度，此外在骨 質(zhì)疏松小鼠模型中糾正骨密度、骨含量以及最終骨骼強(qiáng)度的缺陷。在另一組實(shí)驗(yàn)中，小鼠在4周時切除卵巢或假手術(shù)，在12周開始接受安慰劑或 ActRIIa-mFc (每周兩次，10mg/kg)(在圖19-24中也被稱作RAP-11)，再進(jìn)行12周。評價各 種骨骼參數(shù)。如圖19所示，ActRIIa-mFc增加OVX和SHAM手術(shù)小鼠的脊椎小梁骨體積與 總體積之比(BV/TV)。ActRIIa-mFc還改善小梁骨結(jié)構(gòu)(圖20)，增加皮質(zhì)厚度(圖21)并 改善骨骼強(qiáng)度(圖22)。如圖23所示，lmg/kg至10mg/kg劑量范圍的ActRIIa-mFc產(chǎn)生理 想的效果。骨組織形態(tài)測量在假手術(shù)小鼠的2周時間點(diǎn)進(jìn)行。圖24中的這些數(shù)據(jù)證明 ActRIIa-mFc具 有雙重作用，既抑制骨骼吸收又促進(jìn)骨骼生長。因此ActRIIa-mFc刺激骨 骼生長(合成代謝作用)并抑制骨骼吸收(抗分解代謝作用)。BV =骨體積；TV =總組織 體積。BV/TV是礦化的骨體積百分比的量度標(biāo)準(zhǔn)。ES =侵蝕表面；BS =骨表面。ES/BS是 骨侵蝕的量度標(biāo)準(zhǔn)，RAP-Oll所造成降低表明抗吸收或抗分解代謝作用。Ms/Bs是礦化表面 /骨表面比，是骨骼生長或合成代謝作用的指示物。類似地，骨礦質(zhì)接合速率(MAR)和每天 每個骨表面的骨形成速率(BFR/BSd)表明骨骼生長。測量成骨細(xì)胞(Nob/BPm)和破骨細(xì)胞 (Noc/BPm)，探索作用的機(jī)理。第二次骨骼組織形態(tài)學(xué)測量實(shí)驗(yàn)在雌性C57BL/6小鼠中進(jìn)行，12周齡時開始。小 鼠腹腔內(nèi)給藥10mg/kg ActRIIa-mFc，每周兩次，給藥兩周、四周、八周或十二周。每組最后 給藥之后五天處死，取骨骼進(jìn)行分析。安樂死前，小鼠用鈣黃綠素標(biāo)記9天和2天。如圖25 所示，計(jì)量學(xué)表明ActRIIa-mFc促進(jìn)骨骼生長和礦化，并具有合成代謝和抗分解代謝作用。 參見例如BV/TV比、ES/BS比和MS/BS比。合成代謝作用似乎持續(xù)整個給藥方案，而抗吸收 作用似乎在小鼠中存在時間短些。實(shí)施例3 =ActRIIa-mFc減輕或預(yù)防鼠類多發(fā)性骨髓瘤鼠模型中的骨損傷多發(fā)性骨髓瘤患者表現(xiàn)出骨丟失疾病，以破骨細(xì)胞活性增加以及成骨細(xì)胞的骨形 成減少為特征。小鼠骨髓瘤5T2MM模型是基于使用來自某種類型自發(fā)性腫瘤的腫瘤細(xì)胞 (5T2MM細(xì)胞)，該自發(fā)性腫瘤在老年小鼠中產(chǎn)生，并在小鼠中造成類似于在人多發(fā)性骨髓 瘤患者中看到的那些作用。例如參見Vanderkerken et al. ,Methods Mol Med. 2005 ； 113 191-205。檢測ActRIIa-mFc在此模型中的作用。注射入C57Bl/KaLwRij小鼠的5T2MM細(xì)胞促進(jìn)破骨細(xì)胞表面的增加，溶骨性病變 的形成，并造成骨面積減少。骨骼疾病與成骨細(xì)胞數(shù)量、成骨細(xì)胞表面的減少和礦化減少有關(guān)。攜帶5T2匪細(xì)胞的小鼠用ActRIIa-mFc (RAP-011) (10mg/kg，腹膜內(nèi)給藥，每周兩次)或媒介(vehicle)治療，從5T2MM注射時開始，總共12周。脛骨近端和腰椎骨的MicroCT 分析顯示，與首次接受實(shí)驗(yàn)的小鼠相比，攜帶5T2MM的小鼠小梁骨體積降低39%和21% (p < 0. 001和p < 0. 01)，小梁骨數(shù)量降低37%和15% (p < 0. 01和p < 0. 05)。當(dāng)與媒介 治療的小鼠比較時，RAP-011完全阻止了脛骨(p < 0. 001和p < 0. 05)和椎骨(p < 0. 01 和p<0. 05)中松質(zhì)骨體積和數(shù)量的5T2MM誘導(dǎo)的減少。當(dāng)與首次接受實(shí)驗(yàn)的小鼠相比時， RAP-011治療小鼠脛骨中骨體積高19% (p = 168)，椎骨中高12% (p < 0. 05)。RAP-011阻 止溶骨性骨病變的發(fā)展(P < 0. 05)。此效果如圖26所示。雖然在此研究中，數(shù)據(jù)的初步評 估沒有確定對血清病變蛋白(多發(fā)性骨髓瘤腫瘤細(xì)胞的生物標(biāo)志物)或骨髓瘤負(fù)荷有顯著 影響，但進(jìn)一步的分析表明，除一只治療動物外全部治療動物的血清病變蛋白都大大降低， 此外，健康骨髓的量大幅增加，表明骨髓瘤腫瘤細(xì)胞負(fù)荷減少。因此，ActRIIa-mFc可用于減少多發(fā)性骨髓瘤所致的骨骼疾病的影響，并治療腫瘤 細(xì)胞本身。實(shí)施例4 :ActRIIa-hFc蛋白的鑒定采用組織血纖維蛋白溶酶原前導(dǎo)序列SEQ ID NO :9，ActRIIa-hFc融合蛋白在 PAID4載體(SV40ori/增強(qiáng)子，CMV啟動子)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CH0-DUKXB11細(xì)胞中表達(dá)。如上述 實(shí)施例1中純化的蛋白的序列為SEQ ID NO :7。Fc部分是人IgGlFc序列，如SEQ ID NO 7 所示。唾液酸分析表明，所述蛋白質(zhì)中含有平均每分子ActRIIa-hFc融合蛋白約1. 5至2. 5 摩爾的唾液酸。此純化的蛋白顯示在所有檢測動物中非常長的血清半衰期，包括在人類患者中有 25-32天的半衰期(見下面實(shí)施例6)。另外，CH0細(xì)胞表達(dá)的物質(zhì)對活化素B配體比報(bào)道 的對人293細(xì)胞中表達(dá)的ActRIIa-hFc融合蛋白有更高的親和力(del Re et al. ,J Biol Chem. 2004Decl7 ；279 (51) =53126-35.)。另外，使用tPa前導(dǎo)序列比其他前導(dǎo)序列生成的更 多，并且不像用天然前導(dǎo)序列表達(dá)的ActRIIa-Fc那樣，提供了高純度的N末端序列。使用 天然前導(dǎo)序列得到兩種主要種的ActRIIa-Fc，每個有不同的N末端序列。實(shí)施例5 人臨床試驗(yàn)實(shí)施例5中描述的蛋白在隨機(jī)、雙盲、安慰劑對照的研究中給予人類患者，進(jìn)行該 研究主要是為了評價所述蛋白在健康的絕經(jīng)后女性中的安全性。48個對象隨機(jī)分為6個組 群，接受或者單劑量的ActRIIa-hFc或者安慰劑(5個活性的1個安慰劑的)。劑量水平的 范圍從0. 01至3. 0mg/kg靜脈注射(IV)以及0. 03至0. lmg/kg皮下注射(SC)。所有對象 隨訪120天。如果對象在6個月的研究入圍中使用了影響骨骼代謝的藥物，則被排除而不 參與研究。對每個組群進(jìn)行安全性評價，確定劑量逐步上升。除了藥物代謝動力學(xué)(PK)分 析外，ActRIIa-hFc的生物活性還通過測量骨形成和吸收的生化標(biāo)志物以及FSH水平進(jìn)行 評估。在此研究中未見嚴(yán)重不良反應(yīng)報(bào)道。不良事件(AEs) —般是輕微和短暫的。對 AEs的初步分析包括頭痛、化驗(yàn)值升高、感冒癥狀、嘔吐(emesis)或嘔吐(vomiting)、靜脈 內(nèi)浸潤以及注射部位血腫。ActRIIa-hFc的PK分析顯示劑量的線性曲線圖，平均半衰期為約25_32天。 ActRIIa-hFc的曲線下面積(AUC)與劑量線性相關(guān)，SC給藥后吸收基本完全(見圖27和 28)。這些數(shù)據(jù)表明，SC是可取的給藥辦法，因?yàn)樗峁┧幬锏纳锏刃院脱灏胨テ?，同時避免靜脈給藥頭幾天相關(guān)的藥物血清濃度峰值(見圖28)。ActRIIa-hFc造成合成代 謝骨骼生長標(biāo)記物骨特異性堿性磷酸酯酶(BAP)血清水平的快速持續(xù)的劑量依賴性增加， 以及骨吸收標(biāo)記物C末端1型膠原端肽和抗酒石酸酸性磷酸酶5b水平的劑量依賴性降低。 其他標(biāo)記物如P1NP顯示不確定的結(jié)果。BAP水平顯示在藥物最高劑量時接近飽和效應(yīng)，表 明在劑量0. 3mg/kg時實(shí)現(xiàn)對此合成代謝骨骼生物標(biāo)志物的半數(shù)最大效應(yīng)，增加的變化最 高達(dá)3mg/kg。藥物的藥效學(xué)作用和AUC之間的關(guān)系推算EC5(1為51，465(天*ng/ml)。見 圖29。在檢測的最高劑量水平，這些骨生物標(biāo)志物的變化持續(xù)大約120天。也有與活化素 抑制相一致的血清FSH水平的劑量依賴性降低。對0. 10mg/kg至高達(dá)3mg/kg劑量范圍內(nèi) 的ActRIIa-hFc觀察到FSH水平的明顯降低。1和3mg/kg劑量觀察到FSH水平30-40%的 降低，對3mg/kg劑量的個體患者觀察到相對于基線高達(dá)50%的FSH降低。應(yīng)注意到，絕經(jīng) 后女性顯示出相對恒定的升高的FSH水平，使得相對容易觀察到藥物對FSH的作用。在男 性和生育活躍的女性中，基線FSH水平可變化較大，難以評估具體的抑制程度，但是，活化 素-FSH信號轉(zhuǎn)導(dǎo)軸在這些個體中是完整的，預(yù)期ActRIIa-hFc將顯著抑制FSH的產(chǎn)生，即 使難以定量FSH在這些群體中的作用。計(jì)算為藥代動力學(xué)作用與藥物對FSH的作用的AUC 的關(guān)系，EC50 約為 250，000 (day*ng/ml)。參見圖 32給予健康絕經(jīng)后女性的單劑量ActRIIa在檢測的劑量水平范圍是安全和良好耐 受的。長期的PK和藥效學(xué)作用表明，間歇性給藥對未來研究是合適的。舉例來說，基于血 清半衰期的給藥可按每月一次，或按每二、三、四、五或六周一次的程度進(jìn)行。另外，由于藥 效學(xué)作用的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了藥物的血清殘留，給藥可以基于藥效學(xué)作用進(jìn)行，意味著每三 個月給藥一次，或每二、三、四、五、六甚至12個月給藥一次都可能對患者產(chǎn)生所需效果是 有效的。此臨床試驗(yàn)表明，對人而言ActRIIa-hFc是有骨形成增加和骨吸收減少的生物學(xué) 證據(jù)的骨合成代謝(osteoanabolic)藥物。實(shí)施例6 :ActRIIa-mFc和雙膦酸鹽的聯(lián)合用藥雙膦酸鹽是一類廣泛用于治療與低骨礦密度相關(guān)的疾病，包括骨質(zhì)疏松癥和癌癥 有關(guān)的骨流失的藥物。雙膦酸鹽具有很強(qiáng)的抗骨吸收活性，抑制破骨細(xì)胞。可能因?yàn)楣瞧?裂和骨骼生長都需要破骨細(xì)胞，雙膦酸鹽似乎減少作為最近已知合成代謝骨骼生長藥物 之一的甲狀旁腺激素(PTH)的作用(Blacket al.，N Engl J Med. 2003S印 25 ；349 (13) 1207-15 ；Samadfam et al.，Endocrinology. 2007Jun ； 148(6) :2778_87.)。為檢測ActRIIa治療對之前或同時接受雙膦酸鹽或其他抗吸收治療的患者的 效用，用組合的ActRIIa-mFc和雙膦酸鹽化合物唑來膦酸對小鼠進(jìn)行了測試。12周齡的 C57BL/6N小鼠作如下處理組1PBS組2ActRIIa_mFc (RAP-011) (10mg/kg)每周兩次(與組 3 和 4 一起)組3唑來膦酸(Z0L)單劑量(20mg/kg)組4Z0L(1 劑量)，三天后 ActRIIa-mFc (RAP-011) (lmg/kg)每周兩次組5Z0L(1 劑量)，三天后 ActRIIa-mFc (RAP-011) (10mg/kg)每周兩次給藥前和治療3和8周時，總BMD通過DEXA掃描(PIXI)測定。如圖30所示，總BMD在所有治療組中顯著增加，Z0L和ActRIIa-mFc的組合產(chǎn)生 最大效用。這些結(jié)果表明，ActRIIa-Fc蛋白可用于增加骨密度，甚至是在已經(jīng)接受雙膦酸鹽治療的患者中。實(shí)施例7 可詵擇的ActRIIa-Fc蛋白可根據(jù)本文描述的方法使用的多種ActRIIa變體描述于國際專利申請公開號 W02006/012627 (參見例如pp. 55-58)，全文通過參考納入本文?？蛇x擇的構(gòu)建物可能有C末 端尾部的缺失(ActRIIa胞外結(jié)構(gòu)域的最后15個氨基酸)。這樣的構(gòu)建物的序列如下(Fc 部分加下劃線)(SEQ ID NO 12)ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCY⑶KDKRRHCFATWKNISGSIEIV
KQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEG匪CNEKFSYFPEMTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNffYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDffLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEffESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRffQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK通過參考納入本文本文所提到的所有出版物和專利特此全部引作參考，好像每個出版物或?qū)＠鞔_ 且單獨(dú)地表明引作參考。盡管已經(jīng)討論過目標(biāo)事物的具體實(shí)施例，但是以上說明書是舉例說明性的而非限 制性的。通過閱讀此說明書和下面的權(quán)利要求，許多變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而 易見的。本發(fā)明全部范圍應(yīng)當(dāng)參照權(quán)利要求及其等同的全部范圍，和本說明書及這樣的變 化確定。
權(quán)利要求
在患有FSH相關(guān)紊亂的人對象中降低FSH水平的方法，該方法包括給予所述對象可有效降低對象中FSH活性的量的ActRIIa-Fc融合蛋白，其中ActRIIa-Fc融合蛋白包含與SEQ ID NO3的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中給予ActRIIa-Fc融合蛋白緩解或減輕了所述紊亂的至 少一種癥狀。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中ActRIIa-Fc融合蛋白包含與SEQID NO :3的氨基酸 序列至少95%相同的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中ActRIIa-Fc融合蛋白包含SEQID NO :3的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中ActRIIa-Fc融合蛋白包含SEQID NO :2的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中ActRIIa-Fc融合蛋白是由兩個多肽形成的二聚體，兩 個多肽中的每一個包含與SEQ ID NO :2的氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中ActRIIa-Fc融合蛋白包含三個或更多個唾液酸部分。
8.權(quán)利要求6所述的方法，其中ActRIIa-Fc融合蛋白在CH0細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生。
9.權(quán)利要求6所述的方法，其中ActRIIa-Fc融合蛋白包含三至五個唾液酸部分。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其中ActRIIa-Fc融合蛋白具有SEQID NO 7的氨基酸序列。
11.權(quán)利要求1所述的方法，其中給予ActRIIa-Fc融合蛋白以在患者中達(dá)到至少 0. 3mg/kg的血清濃度。
12.權(quán)利要求1所述的方法，其中ActRIIa-Fc融合蛋白的血清半衰期為15至30天。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中ActRIIa-Fc融合蛋白給予對象的頻率不多于每周一次。
14.權(quán)利要求12所述的方法，其中ActRIIa-Fc融合蛋白給予對象的頻率不多于每月一次。
15.權(quán)利要求6所述的方法，其中當(dāng)靜脈內(nèi)或皮下給藥時，ActRIIa-Fc融合蛋白在正常 的健康人中具有平均25至32天的血清半衰期和同等的生物利用度。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其中ActRIIa-Fc融合蛋白具有四個唾液酸部分/二聚體。
17.權(quán)利要求1所述的方法，其中ActRIIa-Fc融合蛋白皮下給藥。
18.權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法導(dǎo)致所述對象中骨骼肌質(zhì)量的 增加少于I0%o
19.權(quán)利要求1所述的方法，還包括給予人對象放射治療、內(nèi)分泌治療或細(xì)胞毒試劑。
20.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述FSH相關(guān)紊亂是前列腺癌，給予活化素-ActRIIa 拮抗劑導(dǎo)致前列腺癌發(fā)生的延遲、抑制前列腺癌進(jìn)展、延遲轉(zhuǎn)移的發(fā)生或減小腫瘤尺寸。
21.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述前列腺癌是激素不應(yīng)性前列腺癌。
22.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述FSH相關(guān)紊亂是FSH分泌型垂體瘤。
23.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述對象是具有一個或多個卵巢囊腫的女性，給予活 化素-ActRIIa拮抗劑減小囊腫尺寸、抑制囊腫生長或抑制新囊腫形成。
24.在需要延遲或抑制他或她的生殖細(xì)胞成熟的患者中抑制FSH產(chǎn)生的方法，該方法 包括給予可有效降低所述對象中FSH活性的量的ActRIIa-Fc融合蛋白，其中ActRIIa-Fc 融合蛋白包含與SEQ ID NO 3的氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列。
25.權(quán)利要求24所述的方法，其中ActRIIa-Fc融合蛋白包含與SEQIDN0 3的氨基酸 序列至少95%相同的氨基酸序列。
26.權(quán)利要求24所述的方法，其中ActRIIa-Fc融合蛋白包含SEQID NO 3的氨基酸 序列。
27.權(quán)利要求24所述的方法，其中ActRIIa-Fc融合蛋白包含SEQID NO 2的氨基酸 序列。
28.權(quán)利要求24所述的方法，其中ActRIIa-Fc融合蛋白是由兩個多肽形成的二聚體， 兩個多肽中的每一個包含與SEQ ID NO 2的氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列。
29.權(quán)利要求28所述的方法，其中二聚體中的每個多肽包含SEQIDN0:2的氨基酸序列。
30.權(quán)利要求29所述的方法，其中ActRIIa-Fc融合蛋白包含三個或更多個唾液酸部分。
31.權(quán)利要求30所述的方法，其中ActRIIa-Fc融合蛋白在CH0細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生。
32.權(quán)利要求30所述的方法，其中ActRIIa-Fc融合蛋白包含三至五個唾液酸部分。
33.權(quán)利要求24所述的方法，其中ActRIIa-Fc融合蛋白具有SEQID NO 7的氨基酸 序列。
34.權(quán)利要求29所述的方法，其中當(dāng)靜脈內(nèi)或皮下給藥時，ActRIIa-Fc融合蛋白在正 常的健康人中具有平均25至32天的血清半衰期和同等的生物利用度。
35.權(quán)利要求34所述的方法，其中ActRIIa-Fc融合蛋白具有四個唾液酸部分/二聚體。
全文摘要
在某些方面，本發(fā)明提供了用于降低患者中FSH水平的組合物和方法。所述患者可，例如，診斷為患有FSH相關(guān)紊亂或需要延遲或抑制生殖細(xì)胞成熟。
文檔編號A61K38/17GK101861161SQ200880117524
公開日2010年10月13日 申請日期2008年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月18日
發(fā)明者J·克諾普夫, J·西拉, M·L·謝爾曼 申請人:阿塞勒隆制藥公司