專利名稱：用于pdgf受控釋放的纖維蛋白凝膠及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
總的來說，本發(fā)明涉及含有血小板衍生生長因子(PDGF)的纖維蛋白密封膠 (fibrin sealants)，通過原位可逆結(jié)合進行受控釋放，用于治療性應(yīng)用，包括肌肉骨骼和
血管疾病。
背景技術(shù)：
纖維蛋白密封膠是一類外科"膠水"，由人類凝血蛋白制成，典型地在手術(shù)過程中 用于控制出血。這些密封膠中的成分在使用過程中相互作用，形成了穩(wěn)定的由血液蛋白纖 維蛋白構(gòu)成的凝塊。目前，在外科手術(shù)中，纖維蛋白密封膠用于幾種不同的目的控制外科 醫(yī)生正在手術(shù)的區(qū)域中的流血，加速傷口愈合，封閉中空的身體器官或覆蓋由標(biāo)準(zhǔn)縫合產(chǎn) 生的孔，向外科手術(shù)過程中暴露的組織提供藥物的緩釋投送。 纖維蛋白密封膠一般由兩種人類血漿衍生的成分構(gòu)成(a)高度濃縮的纖維蛋白 原復(fù)合物(FC)，它主要由纖維蛋白原和纖連蛋白以及催化量的因子XIII和纖維溶酶原構(gòu) 成，以及(b)高效凝血酶。纖維蛋白密封膠也可以含有抑蛋白酶肽。通過凝血酶的作用， (可溶性)纖維蛋白原首先被轉(zhuǎn)變成纖維蛋白單體，它們自發(fā)地聚集，形成了所謂的纖維蛋 白凝塊。同時，存在于溶液中的因子XIII (FXIII)，在存在鈣離子的情況下被凝血酶活化成 因子XIIIa。聚集的纖維蛋白單體和可能存在的任何殘余纖連蛋白發(fā)生交聯(lián)，通過形成新 的肽鍵產(chǎn)生了高分子聚合物。通過這種交聯(lián)反應(yīng)，顯著增加了形成的凝塊的強度。 一般來 說，凝塊與傷口和組織表面粘附良好，導(dǎo)致了粘合和止血效應(yīng)(美國專利7，241，603)。因 此，纖維蛋白粘合劑通常用作雙組分粘合劑，它含有纖維蛋白原復(fù)合物(FC)組分以及凝血 酶組分，此外還含有鈣離子。 纖維蛋白密封膠的特殊優(yōu)點在于，粘合劑/凝膠不像外來物體一樣殘留在其施加 位點處，而是被完全再吸收，就像自然傷口愈合中那樣，并被新形成的組織代替。各種不同 細胞、例如巨噬細胞和隨后的成纖維細胞，遷移到凝膠中，裂解和重新吸收凝膠材料，并形 成新組織。纖維蛋白密封膠已經(jīng)被用于原位形成纖維蛋白凝膠，這些纖維蛋白凝膠已被用 于投送細胞和生長因子(Cox等，Tissue Eng 10 :942-954， 2004 ;Wong等，Thromb Haemost 89 :573-582,2003)。 對于組織修復(fù)來說，需要將生長因子和細胞定位于基質(zhì)、例如纖維蛋白凝膠中。 例如，纖維蛋白凝膠已被用于在各種不同的復(fù)雜混合物中投送TGF-I3，該混合物包含胎 牛血清、珊瑚顆粒和脂質(zhì)體(Fortier等，Am J Vet Res 58(1) :66-70， 1997 ;Arnaud等， Chirurgie PlastiqueEsthetique 39(4) :491-498，1994 ;Arnaud等，Calcif Tissue Int 54 :493-498，1994 ;Giannoni等，Biotechnology and Bioengineering 83(1) :121-123， 2003)。從纖維蛋白凝膠投送生長因子的可選手段，包括含有轉(zhuǎn)谷酰胺酶底物、抗體和與 生長因子結(jié)合的VEGF片段的結(jié)合物(參見例如美國專利Nos. 6， 506， 365， US 6， 713， 453和美國專利公布2003/0012818，在此以其全文引為參考)。也可以參見美國專利申請 20030012818，該專利申請描述了用于增進傷口愈合的藥物投送基質(zhì)。此外，已經(jīng)顯示纖維 蛋白凝膠誘導(dǎo)細胞生長(例如人類間充質(zhì)干細胞(HMSC))和增殖，以及在某種程度上誘導(dǎo) 成骨分化，這取決于基質(zhì)中FC和凝血酶的濃度(Catelas等，Tissue Eng 12:2385-2396， 2006)。 纖維蛋白密封膠將生長因子投送到身體中的特定位點的能力可能是有益的，但是 組織的適當(dāng)重新生長，需要向位點以特定的速率持續(xù)地/穩(wěn)定地供應(yīng)生長因子或細胞因 子，以便確保適合的治療。在治療蛋白在體內(nèi)具有短的半衰期的情況下，尤其是這樣。目前 使用的纖維蛋白密封膠，為所播散的藥物或藥劑提供了一定程度的延遲釋放，但是延長藥 劑在密封膠中的壽命的能力將改進長期體內(nèi)組織修復(fù)。 因此，在本技術(shù)領(lǐng)域中，對于開發(fā)用于體內(nèi)投送治療各種病癥和疾病的生長因子 的有效手段，開發(fā)用于生長因子從纖維蛋白凝膠的受控釋放的改進的方法，仍然存在著需 求。 發(fā)明簡述 本發(fā)明提供了含有血小板衍生生長因子(PDGF)的纖維蛋白密封膠組合物，通過 生長因子的可逆結(jié)合在體外和體內(nèi)進行受控釋放。本發(fā)明還提供了通過改變用于配制密封 膠的纖維蛋白原復(fù)合物(FC)組分的含量，改變PDGF蛋白從纖維蛋白密封膠中的釋放的方 法。為了治療病癥或疾病，考慮到了當(dāng)PDGF從纖維蛋白密封膠釋放后，保留其生物學(xué)活性， 使得PDGF可以在體外或體內(nèi)介導(dǎo)其預(yù)期的生物學(xué)活性。 —方面，本發(fā)明提供了用于改變血小板衍生生長因子(PDGF)蛋白從纖維蛋白密 封膠的釋放的方法，所述蛋白選自PDGF-AB和PDGF-BB，其中纖維蛋白密封膠通過將FC組 分、凝血酶組分和PDGF組分相混合而產(chǎn)生，方法包括，a)確定從具有已知PDGF起始量和已 知FC終濃度的第一種纖維蛋白密封膠中釋放的PDGF的量，以及b)改變在步驟(a)的第一 種纖維蛋白密封膠中使用的FC的已知終濃度以產(chǎn)生第二種纖維蛋白密封膠，其中第二種 密封膠中FC的濃度與第一種密封膠中FC的已知終濃度相比增加，使得從第二種密封膠釋 放PDGF的速率與從步驟(a)的第一種密封膠釋放PDGF相比降低了，并且其中第二種密封 膠具有與步驟(a)的第一種密封膠相同的PDGF起始量。 在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了用于改變PDGF蛋白從纖維蛋白密封膠的釋放的方法， 所述蛋白選自PDGF-AB和PDGF-BB，其中纖維蛋白密封膠通過將FC組分、凝血酶組分和 PDGF組分相混合而產(chǎn)生，方法包括，a)確定從具有已知PDGF起始量和已知FC終濃度的第 一種纖維蛋白密封膠中釋放的PDGF的量，以及b)改變在步驟(a)的第一種纖維蛋白密封 膠中使用的FC的已知終濃度以產(chǎn)生第二種纖維蛋白密封膠，其中第二種密封膠中FC的濃 度與第一種密封膠中FC的已知終濃度相比降低，使得從第二種密封膠釋放PDGF的速率與 從步驟(a)的第一種密封膠釋放PDGF相比增加了，并且其中第二種密封膠具有與步驟(a) 的第一種密封膠相同的PDGF起始量。 在一個實施方案中，第一或第二種密封膠中FC的終濃度在大約lmg/ml到大約 150mg/ml的范圍內(nèi)。在相關(guān)實施方案中，第一或第二種密封膠中FC的終濃度在大約5mg/ ml到大約75mg/ml的范圍內(nèi)。 在另一個實施方案中，考慮到了第一種纖維蛋白密封膠中FC的終濃度與第二種密封膠中FC的終濃度的差別為大約lmg/ml到大約149mg/ml。在另一個實施方案中，第一 種纖維蛋白密封膠中FC的終濃度與第二種密封膠中FC的終濃度的差別為大約5mg/ml到 大約75mg/ml。在另一個實施方案中，第一種纖維蛋白密封膠中FC的終濃度與第二種密封 膠中FC的終濃度的差別為大約10mg/ml到大約60mg/ml。 在某些實施方案中，考慮到了第一或第二種密封膠中凝血酶組分的終濃度在大約 1IU/ml到250IU/ml的范圍內(nèi)。在另一個實施方案中，第一或第二種密封膠中PDGF的終濃 度在大約lng/ml到大約lmg/ml的范圍內(nèi)。 另一方面，本發(fā)明考慮到了在需要的患者中受控釋放PDGF蛋白的方法，所述蛋 白選自PDGF-AB和PDGF-BB，包括給所述患者施用含有PDGF的纖維蛋白密封膠，其中至少 25%的PDGF在纖維蛋白密封膠中保留至少3天。 在相關(guān)方面中，本發(fā)明提供了在需要的患者中受控釋放PDGF蛋白的方法，所述蛋 白選自PDGF-AB和PDGF-BB，包括給所述患者施用含有PDGF的纖維蛋白密封膠，其中至少 20%的PDGF在纖維蛋白密封膠中保留至少10天。
考慮到了從纖維蛋白密封膠釋放的PDGF是有生物活性的。 在某些實施方案中，至少35 %到90 %的PDGF在纖維蛋白密封膠中保留至少3天。 在相關(guān)實施方案中，至少45%到75%的PDGF在纖維蛋白密封膠中保留至少3天。在另一 個實施方案中，至少60%的PDGF在纖維蛋白密封膠中保留至少3天。 在另一個實施方案中，至少25%到75X的PDGF在纖維蛋白密封膠中保留至少10 天。在相關(guān)實施方案中，至少45X到55X的所述PDGF在纖維蛋白密封膠中保留至少10天。
在相關(guān)實施方案中，考慮到了纖維蛋白密封膠可以在3天或10天或兩者的時間內(nèi) 具有上述范圍的釋放動力學(xué)。 在一個實施方案中，纖維蛋白密封膠通過將FC組分與凝血酶組分在混合物中混 合而產(chǎn)生。在另一個實施方案中，在將FC組分與凝血酶組分混合之前，將PDGF加入到FC 組分中。在另一個實施方案中，將PDGF加入到凝血酶組分中。 在相關(guān)實施方案中，考慮到了 PDGF的釋放可以每天以規(guī)則的量減少。例如，纖維 蛋白密封膠中PDGF的量可以以每天大約1%、每天大約2%、每天大約3%、每天大約4%、 每天大約5 % 、每天大約6 % 、每天大約7 % 、每天大約8 % 、每天大約9 %或每天大約10 %的 量減少，或可以根據(jù)用于配制纖維蛋白密封膠的FC濃度或凝血酶濃度來調(diào)整所需的釋放 本發(fā)明考慮到了密封膠中FC組分的終濃度在大約lmg/ml到大約150mg/ml的 范圍內(nèi)。也考慮到了在某些實施方案中，密封膠中凝血酶組分的終濃度在大約1IU/ml到 250IU/ml的范圍內(nèi)。在一個實施方案中，F(xiàn)C終濃度是大約5mg/ml 、大約10mg ml 、大約20mg/ ml或大約40mg/ml，凝血酶的終濃度是大約2IU/ml。 在一個實施方案中，密封膠中PDGF的終濃度在大約lng/ml到大約lmg/ml的范圍 內(nèi)。 在另一個實施方案中，考慮到了 PDGF是PDGF-AB。在一個實施方案中，至少60% 的所述PDGF-AB在所述纖維蛋白密封膠中保留至少3天，其中至少40%的所述PDGF-AB在 所述纖維蛋白密封膠中保留至少IO天。在另一個實施方案中，至少80X的所述PDGF-AB在 所述纖維蛋白密封膠中保留至少3天，并且其中至少60%的所述PDGF-AB在所述纖維蛋白密封膠中保留至少10天。 在相關(guān)實施方案中，考慮到了 PDGF是PDGF-BB。在一個實施方案中，至少55 %的 所述PDGF-BB在所述纖維蛋白密封膠中保留至少3天，并且其中至少25%的所述PDGF-BB 在所述纖維蛋白密封膠中保留至少10天。 在另一方面，本發(fā)明考慮到了用于治療患者的方法，該患者患有可以得益于PDGF 蛋白的原位受控釋放的病癥或疾病，所述蛋白選自PDGF-AB或PDGF-BB，所述方法包括給所 述患者施用含有PDGF蛋白的纖維蛋白密封膠，其中纖維蛋白密封膠提供了PDGF的受控釋 放，其中至少25X的PDGF在纖維蛋白密封膠中保留至少3天，并且所述PDGF以有效治療所 述病癥或疾病的速率釋放。 另一方面，本發(fā)明考慮到了用于治療患者的方法，該患者患有可以得益于生物活 性PDGF蛋白的原位受控釋放的病癥或疾病，所述蛋白選自PDGF-AB或PDGF-BB，所述方法包 括給所述患者施用含有PDGF蛋白的纖維蛋白密封膠，其中纖維蛋白密封膠提供了 PDGF的 受控釋放，其中至少20X的PDGF在纖維蛋白密封膠中保留至少IO天，并且所述PDGF以有 效治療所述病癥或疾病的速率釋放。 本發(fā)明還提供了使用含有選自PDGF-AB或PDGF-BB的PDGF蛋白的纖維蛋白密封 膠來制造藥物，用于治療患有可以得益于PDGF蛋白的原位受控釋放的病癥或疾病的患者， 其中纖維蛋白密封膠提供了如上所述的PDGF的受控釋放。 本發(fā)明考慮到，上述的釋放動力學(xué)適用于可以得益于PDGF蛋白的原位受控釋放
的患者的治療方法，或適用于使用纖維蛋白密封膠制造治療所述患者的藥物。 —方面，患者所患有的可以得益于PDGF蛋白的體內(nèi)受控釋放的疾病，對于本技術(shù)
領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說將是明顯的。在一個實施方案中，疾病或病癥選自肌肉骨骼疾病
或病癥、軟組織疾病或病癥，以及心血管疾病。 在一個實施方案中，使用本技術(shù)領(lǐng)域熟知的方法，將纖維蛋白密封膠施用于患者， 例如注射、噴灑、內(nèi)視鏡給藥，或預(yù)形成的凝膠，以本身或與其它材料的組合，以及本技術(shù)領(lǐng) 域的普通技術(shù)人員已知的其它方法。 本發(fā)明還提供了用于制備含有生物活性PDGF蛋白的纖維蛋白密封膠的試劑盒， 所述蛋白選自PDGF-AB或PDGF-BB，所述纖維蛋白密封膠具有所需PDGF釋放速率，試劑盒 包含，a)含有FC組分的第一個小瓶或第一個儲存容器，其中小瓶任選含有PDGF組分，以及 b)含有凝血酶組分的第二個小瓶或第二個儲存容器，當(dāng)?shù)谝粋€小瓶或第一個儲存容器不包 含PDGF組分時，所述試劑盒任選包含含有PDGF組分的第三個小瓶或第三個儲存容器，所述 試劑盒還包含其使用說明書。試劑盒也可以包含體外或體內(nèi)使用或給藥纖維蛋白密封膠的 器械。 從下面的詳細描述中，本發(fā)明的其它特點和優(yōu)點將變得明顯。但是，應(yīng)該理解，當(dāng) 說明本發(fā)明的具體實施方案時給出的詳細描述和具體實施例，僅僅是為了說明，因為在本 發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種不同的改變和修飾，對于本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員來說，將因這 些詳細描述而變得顯然。


圖1顯示了 PDGF-AB的量對它從TISSEEL VH S/D凝膠中的累積釋放的影響([FC]
9=20mg/ml，[凝血酶]=2IU/ml)。 圖2顯示了 PDGF-BB的量對它從TISSEEL VH S/D凝膠中的累積釋放的影響([FC] =20mg/ml，[凝血酶]=2IU/ml)。 圖3顯示了 FC濃度對PDGF-AB從TISSEEL VH S/D凝膠中的每日釋放(圖3A)和 累積釋放(圖3B)的影響([凝血酶]=2IU/ml)。 圖4顯示了 FC濃度對PDGF-BB從TISSEEL VH S/D凝膠中的每日釋放(圖4A)和 累積釋放(圖4B)的影響([凝血酶]=2IU/ml)。 圖5顯示了 TISSEEL VH S/D批次號對PDGF-AB累積釋放的影響([FC] = 20mg/ ml，[凝血酶]=2IU/ml)。 圖6顯示了 TISSEEL VH S/D批次號對PDGF-BB累積釋放的影響([FC] = 20mg/ ml，[凝血酶]=2IU/ml)。 圖7顯示了 PDGF-BB的量對它從TISSEEL VH凝膠中的累積釋放的影響([FC]= 20mg/ml，[凝血酶]=2IU/ml)。 圖8顯示了 FC濃度對PDGF-BB從TISSEEL VH凝膠中的每日釋放(圖8A)和累積 釋放(圖8B)的影響([凝血酶]=2IU/ml)。 圖9顯示了 TISSEEL VH批次號對PDGF-BB累積釋放的影響([FC] = 20mg/ml，[凝 血酶]=2IU/ml)。 圖10顯示了 PDGF-AB從TISSEEL VH S/D凝膠的釋放對培養(yǎng)在單層中最多7天的 HMSC增殖的影響。 圖11顯示了 PDGF-BB從TISSEEL VH S/D凝膠的釋放對培養(yǎng)在單層中最多7天的 HMSC增殖的影響。 圖12顯示了從TISSEEL VH S/D凝膠釋放的PDGF-AB對ALP活性的影響(根據(jù)增 殖進行歸一化)。 圖13顯示了從TISSEEL VH S/D凝膠釋放的PDGF-BB對ALP活性的影響(根據(jù)增 殖進行歸一化)。 圖14顯示了 PDGF-AB (圖14A)和PDGF-BB (圖14B)與來自TISSEEL VH S/D的FC 相互作用的傳感圖。圖14C顯示了 PDGF-AB與來自TISSEEL VH S/D的FC相互作用的結(jié)合 和解離速率常數(shù)的圖解測定。
發(fā)明詳述 本發(fā)明提供了含有PDGF的纖維蛋白凝膠，通過原位可逆結(jié)合進行受控釋放，用于 治療性應(yīng)用中，包括肌肉骨骼疾病、軟組織病癥和血管疾病的治療。本發(fā)明考慮到了從凝膠 釋放的PDGF保留其生物學(xué)活性，使得在體內(nèi)或體外從纖維蛋白密封膠的釋放調(diào)節(jié)了所需 的生物學(xué)活性。本發(fā)明還提供了用于確定可用于配制纖維蛋白密封膠、以獲得所需PDGF釋 放動力學(xué)的FC組分或凝血酶組分的濃度的方法。 除非另有定義，否則本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語，都與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng) 域的普通專業(yè)人員所通常理解的意義相同。下面的參考文獻，為專業(yè)技術(shù)人員提供了許多 在本發(fā)明中使用的術(shù)語的通用定義Singleton等，《微生物學(xué)和分子生物學(xué)詞典》(1994 年第二版)(DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2d ed.1994));《劍 橋科學(xué)技術(shù)詞典》(THE CAMBRIDGEDICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY) (Walker等，1988);《遺傳學(xué)詞匯》(第五版)(THE GLOSSARY OF GENETICS, 5TH ED.) ， R. Rieger等主 編，Springer Verlag(1991);以及Hale和Marham，《HARPER COLLINS生物學(xué)詞典》(THE HARPERCOLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY) (1991)。 在本文中引用的每個出版物、專利申請、專利和其它參考文獻，在其與本公開相一 致的程度上全文引為參考。 在這里指出，在本說明書和隨附的權(quán)利要求書中使用的不帶數(shù)量的名詞形式，包 含了復(fù)數(shù)的指稱，除非上下文清楚地表明不是這樣。 在本文中使用時，下面的術(shù)語具有屬于它們的意義，除非特別指明不是這樣。
本文中使用的術(shù)語"纖維蛋白密封膠"、"纖維蛋白凝膠"、"纖維蛋白粘合劑"、"纖 維蛋白凝塊"或"纖維蛋白基質(zhì)"可以相互交換使用，是指至少含有纖維蛋白原復(fù)合物(FC) 組分和凝血酶組分的三維網(wǎng)絡(luò)，它們可以用作細胞生長和生物活性材料隨時間釋放的支 架。 本文使用的術(shù)語"受控釋放"和"延遲釋放"具有同樣的意義，是指藥劑(例如生 長因子)在纖維蛋白凝膠中的持留。受控釋放不僅是由于生長因子通過擴散或通過被結(jié)合 的生長因子的解離、然后從凝膠中釋放，而緩慢和穩(wěn)定地分泌/釋放，而且還由于基質(zhì)的解 體和酶促裂解。 本文中使用的"原位形成"是指或者在生理溫度下和在注入身體的位點處形成， 或者纖維蛋白密封膠在適合的體外條件下形成。典型情況下，該術(shù)語用于描述纖維蛋白密 封膠中前體分子之間的共價連接的形成，這些前體分子在給藥前或給藥時是基本上未交聯(lián) 的。 本文中使用的"纖維蛋白原復(fù)合物(FC)組分"是指與凝血酶混合時產(chǎn)生凝塊狀 纖維蛋白密封膠的纖維蛋白/纖維蛋白原溶液。FC主要由纖維蛋白原和纖連蛋白構(gòu)成， 也可以包含催化量的FXIII和纖維溶酶原。FC組分也可以被稱為密封劑蛋白(Sealer Protein)。 本文中使用的"凝血酶組分"是指與FC組分混合時產(chǎn)生凝塊狀纖維蛋白密封膠的 凝血酶溶液。 本文中使用的"血小板衍生生長因子組分"或"PDGF組分"是指向液體形式的纖 維蛋白密封膠添加的生長因子溶液。PDGF組分、FC復(fù)合物組分和凝血酶組分中的每一種， 可以分別添加，以形成含有PDGF的纖維蛋白密封膠。任選，PDGF組分在與凝血酶組分混合 之前添加到FC組分中，或在與FC組分混合之前添加到凝血酶組分中。PDGF組分可以包含 PDGF-AB或PDGF-BB，或PDGF-AB和PDGF-BB兩者。 本文中使用的"重組人類PDGF"是指通過重組DNA技術(shù)獲得的重組的人類血小板 衍生生長因子(rh PDGF)。它可以通過本技術(shù)領(lǐng)域任何已知方法來生產(chǎn)。
本文中使用的術(shù)語"生物活性"或"生物學(xué)活性"，是指其中溶液中或纖維蛋白密封 膠中的蛋白，例如PDGF蛋白，當(dāng)與天然表達的(即當(dāng)重組表達或體內(nèi)表達時)蛋白相比時， 顯示出同樣的或類似的生物學(xué)活性的生物學(xué)性質(zhì)。 本文中使用的"可檢測的部分"、"可檢測標(biāo)記物"或"標(biāo)記物"，是指可以通過光譜 學(xué)、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)或化學(xué)手段檢測的組合物。例如，有用的標(biāo)記物包括32P、 弋、熒光染料、電子致密試劑、酶(例如在ELISA中常用的)、生物素_鏈親和素、洋地黃毒甙、其抗血清或單克隆抗體可得的半抗原和蛋白，或具有與靶互補的序列的核酸分子?？蓹z 測部分通常產(chǎn)生可測量的信號，例如放射活性、顯色或熒光信號，可用于對樣品中結(jié)合的可 檢測部分的量進行定量。
纖維蛋白密封膠 已有許多形式的纖維蛋白用作纖維蛋白密封膠。纖維蛋白凝膠可以從自體血漿、 冷沉淀血漿(例如纖維蛋白膠試劑盒，可以商購)、從血漿純化的纖維蛋白原、以及重組纖 維蛋白原和因子XIIIa合成。這些材料中的每種都提供了基本上相同的基質(zhì)，在生物化學(xué) 組成上有少許差別(Sierra DH，J Biomater A卯l， 7， 309-352 (1993))。這些材料之間在特 定酶學(xué)生物活性和總的愈合應(yīng)答方面存在相似性。 可用于本發(fā)明的纖維蛋白凝膠從纖維蛋白密封膠形成，它由兩種主要組分構(gòu)成 纖維蛋白原復(fù)合物(FC)和凝血酶。FC主要由纖維蛋白原和纖連蛋白構(gòu)成，也可以含有催化 量的FXIII和纖維溶酶原。FC和凝血酶組分一般源自于人類血槳，但是也可以由重組/遺傳 工程技術(shù)生產(chǎn)。纖維蛋白密封膠的例子描述在US 5，716，645、US 5， 962， 405、US6， 579， 537 中，包括TISSEEL VH和TISSEEL VH S/D (Baxter AG， Vienna, Austria)。
為了形成纖維蛋白凝膠，首先將FC復(fù)溶、融化或按照包裝說明書制備，根據(jù)需要 使用稀釋緩沖液進一步稀釋，將治療藥劑加入到液體FC中。可選地，治療藥劑可以加入到 凝血酶組分中。大多數(shù)可商購的纖維蛋白密封膠包含凝膠裂解抑制劑，例如抑蛋白酶肽，它 們可以由用戶自行斟酌添加到FC中。關(guān)于抑蛋白酶肽和其它凝膠裂解抑制劑的描述，提供 在W0 99/11301中。凝血酶組分也用CaCl2溶液復(fù)溶成液體形式，并根據(jù)需要使用稀釋緩沖 液進一步稀釋?？紤]到了將凝血酶組分與還含有PDGF的FC組分混合，以形成纖維蛋白凝 膠。纖維蛋白密封膠也被設(shè)計成缺乏抑蛋白酶肽成分(EVICEL，Ethicon，Inc，NewJersey)。
其它用于生產(chǎn)含有纖維蛋白原的、可以用作組織粘合劑的制備物的方法，包括從 冷沉淀物生產(chǎn)，任選具有使用乙醇、硫酸銨、聚乙二醇、甘氨酸或P -丙氨酸的進一步洗滌 和沉淀的步驟，以及分別從已知血漿分級方法范圍內(nèi)的血漿生產(chǎn)(參考例如《血漿蛋白分 級方法》(Methods of plasma protein fractionation) ， 1980， Curling主編，Academic Press，第3-15、33-36和57-74頁，或Blomb ck B.和M.，《人和牛纖維蛋白原的純化》 (Purification of human and bovine fibrinogen)，Arkiv Kemi 10，1959，p.415 f.)。纖 維蛋白密封膠也可以使用患者自己的血漿制造。例如，CRYOSEAL(Thermogenesis Corp.， Rancho Cordova, CA)或VIV0STAT(Vivolution A/S， Denmark)纖維蛋白密封膠系統(tǒng)，能夠 從患者的血漿生產(chǎn)自體纖維蛋白密封膠組分?？捎玫睦w維蛋白密封膠組分是冷凍干燥、深 凍液體或液體的形式。 以適合的濃度加入纖維蛋白凝膠組分，提供了所需的受控釋放的類型。可以以不 同的濃度添加FC組分，包括但不限于5mg/ml， 10mg/ml， 15mg/ml， 20mg/ml， 25mg/ml， 30mg/ ml ， 35mg/ml ， 40mg/ml ， 45mg/ml ， 50mg/ml ，直到150mg/ml (凝膠中的終濃度)，或需要的中間 濃度。此外，F(xiàn)C組分的濃度可以與任何適合濃度的凝血酶組分混合，包括但不限于lIU/ml， 2IU/ml， 5IU/ml， 7IU/ml，10IU/ml，15IU/ml， 20IU/ml， 25IU/ml， 30IU/ml， 35IU/ml， 40IU/ml， 50IU/ml，60IU/ml，70IU/ml，80IU/ml，90IU/ml，100IU/ml，125IU/ml，150IU/ml，175IU/ml， 200IU/ml，225IU/ml和250IU/ml，或需要的中間濃度。 考慮到了將藥劑例如PDGF添加到纖維蛋白密封膠組合物中，以便制造用于治療
12藥劑的受控釋放系統(tǒng)。PDGF可以以提供足夠延遲釋放劑型的任何濃度添加，在lng/ml到 lmg/mL PDGF的范圍內(nèi)。纖維蛋白密封膠中PDGF的示例濃度包括但不限于lng/ml，5ng/
ml， 10ng/ml， 15ng/ml， 20ng/ml， 40ng/ml， 50ng ml， 100ng/ml， 250ng/ml， 500ng/ml， lug.
ml， 5 li g/ml， 10 li g/ml， 25 u g/ml， 50 u g/ml， 100 u g/ml， 250 u g/ml， 500 u g/ml， 750 u g/ml 考慮到了在纖維蛋白密封膠中使用的FC或凝血酶的濃度是使得添加在纖維蛋白 凝膠中的PDGF，以治療有效的量在幾天到數(shù)周的過程中釋放。 一種情況下，PDGF從纖維蛋 白凝膠中釋放1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14 天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或更長時間。 PDGF以受控或延遲釋放的方式從纖維蛋白密封膠釋放，使得可以在持續(xù)的時間中 可以原位獲得PDGF?？紤]到了 PDGF的釋放可以以每天規(guī)則的量減少，例如PDGF水平的降 低可以為每天大約1 % 、每天大約2 % 、每天大約3 % 、每天大約4 % 、每天大約5 % 、每天大約 6%、每天大約7%、每天大約8%、每天大約9%、每天大約10%或以上。
在相關(guān)的實施方案中，考慮到了至少25X的PDGF在纖維蛋白凝膠中保留至少3 天。在另一個實施方案中，至少35 %到90 % ，至少45 %到75 % ，或至少60 %的PDGF在纖維 蛋白凝膠中保留至少3天。還考慮到了至少25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、 33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41 %、42%、43%、44%、45%、46%、47%、 48%、49%、50%、51 %、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61 %、62%、 63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71 %、72%、73%、74%、75%、76%、77%、 78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%或90 %的PDGF在纖 維蛋白凝膠中保留至少3天。 在另一個實施方案中，至少20X的PDGF在纖維蛋白凝膠中保留至少IO天。在另 一個實施方案中，至少25 %到75 % ，或45 %到55 %的PDGF保留至少10天。還考慮到了至 少20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、 35% 、36% 、37% 、38% 、39% 、40% 、41% 、42% 、43% 、44% 、45% 、46% 、47% 、48% 、49%、 50%、51 % 、52% 、53% 、54% 、55% 、56% 、57% 、58% 、59% 、60% 、61 % 、62% 、63% 、64%、 65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%或75%的PDGF在纖維蛋白凝膠 中保留至少10天。 本發(fā)明提供了通過改變纖維蛋白密封膠的組分的濃度，配制具有所需釋放動力學(xué) 的纖維蛋白密封膠的方法。在一方面，方法考慮到了確定從具有已知PDGF起始量和已知FC 終濃度的第一種纖維蛋白密封膠中釋放的PDGF的量，改變在步驟(a)的第一種纖維蛋白密 封膠中使用的FC的已知終濃度以產(chǎn)生第二種纖維蛋白密封膠、，其中第二種密封膠中FC的 濃度與第一種密封膠中FC的已知終濃度相比的增加或減少，與PDGF從步驟的第一種密封 膠釋放相比，調(diào)整了PDGF從第二種密封膠釋放的速率，并且其中第二種密封膠具有與步驟 中第一種密封膠相同的PDGF起始量。 在一個實施方案中，第一或第二種密封膠中FC的終濃度，在大約lmg/ml到大約 150mg/ml的范圍內(nèi)。在相關(guān)實施方案中，第一種纖維蛋白密封膠的FC濃度與第二種密封膠 中FC的終濃度的差別為大約lmg/ml到大約149mg/ml，為大約5mg/ml到大約75mg/ml，或為 大約10mg/ml到大約60mg/ml。在另一個實施方案中，第一種纖維蛋白密封膠的FC終濃度與第二種密封膠的FC終濃度的差別為大約lmg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、10mg/ ml 、 15mg/ml 、20mg/ml 、25mg/ml 、30mg/ml 、35mg/ml 、40mg/ml 、45mg/ml 、50mg/ml ，或這些濃度 之間的任何量，直到大約149mg/ml。 考慮到了可用于本發(fā)明的纖維蛋白密封膠可以與目的在于體外或體內(nèi)應(yīng)用的其 它材料或藥劑混合。這樣的藥劑包括其它的治療性藥劑，包括但不限于生長因子、細胞因 子、化學(xué)因子、凝血因子、酶、化學(xué)因子、可溶性細胞表面受體、細胞粘附分子、抗體、激素、細 胞骨架蛋白、基質(zhì)蛋白、蛋白伴侶、結(jié)構(gòu)蛋白、代謝蛋白，以及本技術(shù)領(lǐng)域已知的其它藥劑 (參見例如《醫(yī)生桌面參考》(第62版)(PhysiciansDesk Reference, 62nd Edition) ， 2008， Thomson Healthcare, Montvale， NJ)。 其它可用于纖維蛋白密封膠的材料包括可以與密封膠混合用于肌肉骨骼疾病 的材料，它們可以是承載材料，包括但不限于聚合物、珊瑚、陶瓷、玻璃、金屬、骨骼衍生 的材料、羥基磷灰石、合成的支架材料、這些材料的組合，以及本技術(shù)領(lǐng)域已知的其它材 料(參見例如Guehennec等(European Cells and Materials, 8 :1-11， 2004)，美國專利 7， 122， 057和美國專利6， 696， 073)。 在一個實施方案中，纖維蛋白凝膠可以用作載體系統(tǒng)，用于在可逆結(jié)合后、并通過 調(diào)整FC和凝血酶的濃度以受控方式投送生物學(xué)活性PDGF。 在本發(fā)明的一個實施方案中，當(dāng)纖維蛋白凝膠使用5mg/ml的FC和2IU/ml的凝血 酶(凝膠中的終濃度)由TISSEEL蒸汽加熱溶劑/去污劑(TISSEEL VH S/D)制成時，至少 大約65X的添加的PDGF-BB(15ng)在凝膠中保留到3天后。在本發(fā)明的另一個實施方案 中，當(dāng)纖維蛋白凝膠使用40mg/ml的FC和2IU/ml的凝血酶(凝膠中的終濃度)由TISSEEL VH S/D制成時，至少大約85X的添加的PDGF-BB(15ng)在凝膠中保留到3天后。因此，當(dāng) 使用由TISSEEL VH S/D制成的纖維蛋白凝膠時，PDGF-BB的持留隨著FC濃度的升高而增 加。 在本發(fā)明的另一個實施方案中，當(dāng)纖維蛋白凝膠使用20mg/ml的FC和2IU/ml的 凝血酶(凝膠中的終濃度)由不同批號的TISSEEL VH制成時，至少大約70X的PDGF-BB在 來自一個批號的凝膠中保留到10天后，在第二個批號的凝膠中有大約60%、第三個批號的 凝膠中有大約40%保留。這些批次之間的一個差別是因子XIII的含量(分別為42. 2U/ml、 33. 9U/ml和< 1U/ml)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，當(dāng)纖維蛋白凝膠使用20mg/ml的FC 和2IU/ml的凝血酶(凝膠中的終濃度)由不同批號的TISSEEL VH S/D制成時，至少大約 60%的PDGF-BB在來自所有批次的凝膠中保留到10天后。對于PDGF-AB的釋放來說，在三 批中的兩批中，至少大約75%保留到10天，至少68%的生長因子在第三批中保留到10天。
對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通專業(yè)人員來說，應(yīng)該理解，上面提出的實施方案是PDGF從 可商購纖維蛋白密封膠釋放的示例性實施方案，并不意味以任何方式限制了本發(fā)明。
PDGF蛋白 血小板衍生生長因子(PDGF)由血小板在傷口和骨折愈合的早期階段中分泌。已 經(jīng)顯示，它能剌激成骨細胞和間充質(zhì)祖細胞的遷移(Mehrotra等，J Cell Biochem 93: 741-52,2004 ;Fiedler等，J CellBiochem 93 :990-98， 2004)，但是它在骨折愈合和骨骼修 復(fù)中的作用還沒有完全確定。PDGF也調(diào)控血管發(fā)生的不同方面，血管發(fā)生本身在骨骼生長 過程中也是關(guān)鍵的。PDGF還在剌激血管發(fā)生中發(fā)揮作用，血管發(fā)生是組織的正常生長和發(fā)育所需的基本過程，并參與從已存在血管增殖新的毛細血管。增加血管發(fā)生的速率在某些 病癥中是有用的，例如與組織灌注減少相關(guān)的病癥，例如冠狀動脈和外周血管疾病，這僅僅 是舉幾個例子。PDGF-A (Genbank登記號NP_002598)和PDGF-B (Genbank登記號NP_002599)可 以同源二聚或異源二聚，產(chǎn)生三種不同的同工型PDGF-AA、 PDGF-AB或PDGF-BB。 PDGF-A 只能與PDGFa -受體結(jié)合(PDGFR-a包括PDGFR-a/a同源二聚體)。PDGF-B可以與 PDGFR-a和第二種PDGF受體(PDGFR-P)結(jié)合。更具體來說，PDGF-B可以與PDGFR-a / a 和PDGFR-P/e同源二聚體、以及PDGFR-a/p異源二聚體結(jié)合。 PDGF-AA和_BB對于間充質(zhì)來源的細胞來說是主要的有絲分裂原和化學(xué)吸引劑， 但是對于內(nèi)皮譜系的細胞沒有影響或影響很小，盡管PDGFR-a和-p 二者都表達在內(nèi)皮細 胞(EC)上。已經(jīng)顯示，PDGF-AB和PDGF-BB參與新形成血管的穩(wěn)定化/成熟作用(Isner等， Nature415 :234-9,2002 ;Vale等，J Interv Cardiol 14 :511-28， 2001 ;Heldin等，Physiol Rev 79 :1283-1316， 1999 ;Betsholtz等，Bioessays 23:494-507,2001)。然而，其它數(shù)據(jù) 顯示，PDGF-AA和PDGF-BB在體內(nèi)通過PDGFR- a信號傳導(dǎo)，抑制了 bFGF誘導(dǎo)的血管生成。 PDGF-AA是間充質(zhì)細胞遷移的最有力剌激物之一，但是它或者不剌激或者僅最小程度地剌 激EC遷移。在某些條件下，PDGF-AA甚至抑制EC遷移(Thommen等，J Cell Biochem. 64 : 403-13,1997 ;De Marchis等，Blood 99 :2045-53,2002 ;Cao等，F(xiàn)ASEB. J. 16 :1575-83， 2002)。然而，已經(jīng)顯示，PDGFR-a拮抗PDGFR-P誘導(dǎo)的SMC遷移(Yu等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 282 :697-700， 2001)，針對PDGF-AA的中和抗體增強了平滑肌細胞(SMC)的遷 移(Palumbo， R.等，Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 22 :405-11,2002)。因此，PDGF-A 和-B的血管生成/動脈生成活性，特別是當(dāng)通過PDGFR-a進行信號傳導(dǎo)時，還有爭論。
已報道，PDGF-AA和_BB在心血管和神經(jīng)干/祖細胞的增殖和分化中發(fā)揮重要作 用。PDGF-AA通過a v|3 3整聯(lián)蛋白剌激少突膠質(zhì)細胞前體增殖(Baron等，Embo. J. 21 : 1957-66， 2002)，而PDGF-BB誘導(dǎo)Flkl+胚胎干細胞分化成血管壁細胞(Carmeliet， P.， Nature 408 :43-45,2000 ;Yamashita等，Nature 408 :92-6， 2000)，并潛在增加了源自于存 活神經(jīng)元的神經(jīng)球(neurosphere) (Caldwell等，Nat Biotechnol. 19 :475-479,2001)。
PDGF蛋白已經(jīng)成功地混合用于纖維蛋白凝膠制劑中。Thomopoulous等(J Orth Res 25:1358-68,2007)制備了含有纖維蛋白原、凝血酶、肽組分和肝素的纖維蛋白凝膠， 并進一步添加了不同濃度的PDGF-BB，以確定生長因子的被動釋放動力學(xué)。研究顯示，生長 因子的釋放依賴于纖維蛋白凝膠中肝素的量。PDGF也已經(jīng)在含有血漿血小板T制備物的纖 維蛋白凝膠中檢測到(參見例如Yazawa等，JCraniofac Surg 15 :439-46， 2004)，并用于剌 激纖維蛋白支架中的胚胎干細胞(Willerth等，Stem Cells. 25 :2235-2244,2007)。
可用于本發(fā)明的PDGF分子包括全長蛋白、蛋白前體、蛋白亞基或片段、及其功能 性衍生物。指稱PDGF意味著包括這些蛋白的所有可能形式，包括天然來源的蛋白制備物。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語重組PDGF沒有隱含具體的限制，可以包括任何PDGF，異源的或 天然存在的，通過重組DNA技術(shù)獲得的，或其生物學(xué)活性衍生物。在某些實施方案中，該術(shù) 語涵蓋了蛋白和核酸，例如基因、前mRNA、mRNA，以及多肽、多態(tài)性變異體、等位基因、突變體 和種間同源物，它們(1)具有的氨基酸序列，在至少大約25、50、100、150、200個或以上氨基 酸的區(qū)域中，與參比核酸編碼的PDGF-AB或PDGF-BB多肽或本文描述的氨基酸序列，具有
15高于大約60%的氨基酸序列同一性，65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%，93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或以上的氨基酸序列同一性；(2)與針對含有本文描述的參比氨基酸序列、其免疫原性片段及其保守修飾變異體的免疫原產(chǎn)生的抗體、例如多克隆抗體，特異性結(jié)合；(3)在嚴(yán)緊雜交條件下，與編碼本文描述的參比氨基酸序列及其保守修飾變異體的核酸特異性雜交；(4)具有的核酸序列，在至少大約25、50、100、150、200、250、500、1000、1500、2000個或以上核苷酸(最多為成熟蛋白的核苷酸全長序列)的區(qū)域內(nèi)，與本文描述的參比核酸序列具有高于大約95 % 、高于大約96% 、97 % 、98% 、99 % ，或更高的核苷酸序列同一性。 多核苷酸或多肽序列典型情況下來自于哺乳動物，包括但不限于靈長動物例如人類，嚙齒動物例如大鼠、小鼠、倉鼠，奶牛、豬、馬、綿羊或任何其它哺乳動物。本發(fā)明的核酸和蛋白可以是重組分子(例如異源的和編碼野生型序列或其變異體的，或非天然存在的)。對于人類PDGF的結(jié)構(gòu)，參考由國家生物技術(shù)信息中心(National CenterforBiotechnology Information, NCBI)維護的Genbank數(shù)據(jù)庫人類PDGF-A (Genbank登記號NP_002598， NM_002607. 4) ， PDGF-B (Genbank登記號NP_002599， NM_002608) 。 PDGF-AB和PDGF-BB是PDGF-A和PDGF-B序列的同源或異源二聚體。 PDGF的生產(chǎn)可以包括本技術(shù)領(lǐng)域中已知的任何用于下述方面的方法(i)通過遺傳工程生產(chǎn)重組DNA，例如通過RNA的反轉(zhuǎn)錄和/或DNA的擴增，(ii)通過轉(zhuǎn)染將重組DNA導(dǎo)入原核或真核細胞，例如通過電穿孔或微注射，(iii)以例如連續(xù)或分批方式培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化細胞，(iv)表達PDGF，例如組成性地或在誘導(dǎo)后，以及(v)分離所述PDGF，例如從培養(yǎng)基或通過收獲轉(zhuǎn)化細胞，以便通過例如陰離子交換層析或親和層析獲得純化的PDGF。
PDGF可以通過在適合的原核或真核宿主系統(tǒng)中進行表達來生產(chǎn)，這些宿主系統(tǒng)的特點是生產(chǎn)可藥用的PDGF分子。常用的宿主細胞包括原核細胞例如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌，即任何大腸桿菌(E.coli)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈霉菌屬(Str印tomyces)、酵母菌屬(Saccharomyces)、沙門氏菌屬(Salmonella)等的菌株。真核細胞的例子是昆蟲細胞例如D. Mel-2、Sf4、Sf5、Sf9，以及Sf21和High 5 ;植物細胞和各種不同酵母細胞例如酵母菌屬(Saccharomyces)和畢赤氏酵母屬(Pichia);哺乳動物細胞例如CHO(中華倉鼠卵巢)細胞，幼倉鼠腎(朋K)細胞，人類腎293細胞，C0S-7細胞，HEK 293， SK-H印和H印G2，以及其它本技術(shù)領(lǐng)域已知的細胞。對用于生產(chǎn)或分離本發(fā)明的PDGF的試劑或條件沒有限制，可以使用本技術(shù)領(lǐng)域已知的或可商購的任何系統(tǒng)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，PDGF通過在現(xiàn)有技術(shù)中描述的方法獲得。 許許多多的載體可用于制備PDGF，它們可以從本技術(shù)領(lǐng)域眾所周知的真核和原核表達載體中選擇。用于原核表達的載體的例子包括但不限于質(zhì)粒，例如pRSET、 pET、 pBAD等，其中在真核表達載體中使用的啟動子包括lac、trc、trp、recA、araBAD等。用于真核表達的載體的例子包括但不限于(i)用于在酵母中表達的載體，例如pAO、pPIC、pYES、pMET，使用了啟動子例如A0X1、GAP、GAL1、AUG1等；(ii)用于在昆蟲細胞中表達的載體，例如pMT、pAc5、 pIB、 pMIB、 pBAC等，使用了啟動子例如PH、 p10、 MT、 Ac5、 OpIE2、 gp64、 polh等，以及(iii)用于在哺乳動物細胞中表達的載體，例如pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3、pBPV等，以及源自于病毒系統(tǒng)例如痘苗病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒等的載體，使用了啟動子例如CMV、 SV40、 EF-1、 UbC、 RSV、 ADV、 BPV和P -肌動蛋白啟動子。
16
含有編碼多肽的DNA或RNA的宿主細胞，在適合于細胞生長并表達DNA或RNA的
條件下進行培養(yǎng)。表達多肽的那些細胞可以使用已知的方法鑒定，重組蛋白可以使用已知
的方法分離和純化；對多肽生產(chǎn)可以擴增，也可以不擴增。鑒定可以通過例如篩選表現(xiàn)出指
示了編碼蛋白的DNA或RNA存在的表型的遺傳修飾的哺乳動物細胞來進行，例如PCR篩選，
通過Southern印跡分析進行篩選，或篩選蛋白的表達。可以通過在DNA構(gòu)建物中包含選擇
性標(biāo)記物，并將含有選擇性標(biāo)記物基因的轉(zhuǎn)染或感染細胞，在只適合于表達選擇性標(biāo)記物
基因的細胞存活的條件下進行培養(yǎng)，來實現(xiàn)已摻入編碼蛋白的DNA的細胞的篩選。導(dǎo)入的
DNA構(gòu)建物的進一步擴增，可以通過將遺傳修飾的細胞在適合于擴增的條件下培養(yǎng)來進行
(例如，將含有可擴增標(biāo)記物基因的遺傳修飾細胞，在存在一定濃度的藥物的情況下進行培
養(yǎng)，在該藥物濃度下，只有含有可擴增標(biāo)記物基因的多個拷貝的細胞能夠存活)。 在本發(fā)明的一個實施方案中，測試了從纖維蛋白凝膠釋放的PDGF的生物學(xué)活性。
人類間充質(zhì)干細胞(HMSC)在來自添加有PDGF的凝膠的培養(yǎng)基上清液中(即在含有釋放
的PDGF-BB的培養(yǎng)基中)培養(yǎng)成單層后，形態(tài)轉(zhuǎn)變成更細長的形狀，以及細胞增殖增加的趨
勢，都指示了釋放的生長因子的生物學(xué)活性。 確定樣品中蛋白濃度的方法 治療性蛋白，由于它們與內(nèi)源產(chǎn)生的、天然存在的蛋白的相似性，通常難以在血清 樣品中進行檢測。但是，測定已經(jīng)給藥的治療性多肽、其片段、變異體或類似物的量，以評估 治療性蛋白是否顯示出所需特征，例如較大的溶解性或穩(wěn)定性、對酶消化的抗性、改善的生 物學(xué)半衰期、以及本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員已知的其它特點，通常是有益的。方法還可以檢測 可能受到知識產(chǎn)權(quán)保護的治療性蛋白的授權(quán)使用。 本發(fā)明使用了方法來檢測PDGF從含有PDGF的纖維蛋白凝膠的釋放，并測定了蛋 白的釋放動力學(xué)。這些來自用不同濃度的FC組分制造的纖維蛋白密封膠的釋放動力學(xué)的 比較，有助于確定治療性目的所需的釋放速率。鑒定蛋白隨時間從纖維蛋白密封膠中釋放 的量的能力，幫助在半衰期、吸附性、穩(wěn)定性等的基礎(chǔ)上確定最適治療劑。檢測分析方法可 以是酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、閃爍親近分析(SPA)、表面等離子體 共振(SPR)，或其它本技術(shù)領(lǐng)域已知的結(jié)合分析方法。 —般來說，為了檢測樣品中PDGF的存在，將PDGF與PDGF結(jié)合劑進行結(jié)合，例如抗 體、可溶性受體或其它結(jié)合PDGF的蛋白或試劑。 對于生物學(xué)活性的檢測步驟或測試來說，可以將PDGF蛋白與可檢測部分或可檢 測標(biāo)記物連接。可檢測的部分或標(biāo)記物是指可以通過光譜學(xué)、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué) 或化學(xué)手段檢測的成分?？蓹z測部分通常產(chǎn)生可測量的信號，例如放射活性、顯色或熒光信 號，它們可用于對樣品中結(jié)合的可檢測部分的量進行定量。可檢測部分可以共價地、或通過 離子鍵、范德華力或氫鍵摻入蛋白或與蛋白結(jié)合，例如摻入放射活性核苷酸，或鏈親和素識 別的生物素化的核苷酸?？蓹z測部分可以是可直接或間接檢測的。間接檢測可以包括將第 二個可直接或間接檢測的部分與可檢測的部分結(jié)合。例如，可檢測部分可以是結(jié)合配偶體 的配體，例如生物素，它是鏈親和素的結(jié)合配偶體。結(jié)合配偶體本身可以是可直接檢測的， 例如，抗體可以用熒光分子進行標(biāo)記。信號定量方法的選擇可以通過例如閃爍計數(shù)、密度計 量、或流式細胞術(shù)來實現(xiàn)。 適合用于本發(fā)明的分析方法的標(biāo)記物的例子包括放射活性標(biāo)記物、熒光團、電子致密試劑、酶(例如在ELISA中常用的)、生物素、洋地黃毒甙，或半抗原以及蛋白，所述半抗 原以及蛋白可以例如通過將放射性標(biāo)記物摻入半抗原或肽被制造成可檢測的，或用于檢測 與半抗原或肽特異性反應(yīng)的抗體。還考慮到了其抗血清或單克隆抗體可以獲得的蛋白，或 具有與靶互補的序列的核酸分子，納米標(biāo)簽(nanotag)，分子量珠子，磁性試劑，含有熒光染 料的納珠或微珠，量子點，量子珠，熒光蛋白，帶有熒光標(biāo)記物的樹枝狀聚合物，微轉(zhuǎn)應(yīng)答器 (micro-transponder)，電子供體分子或分子結(jié)構(gòu)，或光反射顆粒。 考慮到的其它可用于本發(fā)明的標(biāo)記物包括但不限于熒光染料(例如熒光素異硫 氰酸酯，德克薩斯紅，羅丹明等)，放射性標(biāo)記物(例如3H、125I、35S、14C或32P)，酶(例如辣 根過氧化物酶，以及其它在ELISA中常用的酶)，以及比色標(biāo)記物例如膠體金、有色玻璃或 塑料珠(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠等)，和發(fā)光或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物(例如銪(Eu)、MSD Sulfo-Tag)。 標(biāo)記物可以按照本技術(shù)領(lǐng)域熟知的方法直接或間接與所需的分析組分偶聯(lián)。在具 體實施方案中，標(biāo)記物與組分共價結(jié)合，使用異氰酸酯或N-羥基琥珀酰亞胺酯試劑來結(jié)合 本發(fā)明的活性藥劑。在本發(fā)明的一種情況下，使用雙官能異氰酸酯試劑將標(biāo)記物結(jié)合到生 物聚合物上，形成標(biāo)記物生物聚合物結(jié)合物，其上沒有結(jié)合活性藥劑。標(biāo)記物生物聚合物結(jié) 合物可以用作中間體，用于合成本發(fā)明的標(biāo)記的結(jié)合物，或可用于檢測生物聚合物結(jié)合物。 正如上面指出的，可以使用廣泛的各種標(biāo)記物，標(biāo)記物的選擇取決于所需的靈敏度，與所需 分析組分結(jié)合的容易性，穩(wěn)定性要求，可用的儀器設(shè)備，以及廢棄規(guī)定等。非放射活性標(biāo)記 物通常通過間接方式結(jié)合。 一般來說，配體分子(例如生物素)被共價結(jié)合到分子上。然 后將配體與另一個分子(例如鏈親和素)結(jié)合，該另一個分子或者是本身可檢測的，或者與 信號系統(tǒng)共價結(jié)合，例如可檢測的酶、熒光化合物或化學(xué)發(fā)光化合物。 可用于本發(fā)明的方法的化合物也可以直接與信號產(chǎn)生化合物結(jié)合，例如通過與酶 或熒光團結(jié)合。適合用作標(biāo)記物的酶包括但不限于水解酶，特別是磷酸酶、酯酶和糖苷酶， 或氧化酶(oxidotase)，特別是過氧化物酶。適合用作標(biāo)記物的熒光化合物包括但不限于 上面列出的，以及熒光素衍生物、羅丹明及其衍生物、丹磺酰、傘形酮、曙紅、TRITC胺、奎寧、 熒光素W、吖啶黃、麗絲胺羅丹明、B磺酰氯erythroscein、釕(三、二吡啶鎗)、銪、德克薩 斯紅、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、黃素腺嘌呤二核苷酸等。適合用作標(biāo)記物的化學(xué)發(fā)光化合 物包括但不限于MSD Sulfa-TAG、銪(Eu)、釤(Sm)、螢光素和2， 3-二氫酞嗪二酮，例如魯 米諾。對于可用于本發(fā)明方法的各種不同的標(biāo)記和信號產(chǎn)生系統(tǒng)的綜述，參見美國專利 No. 4， 391， 904。 用于檢測標(biāo)記物的手段對于本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員來說是熟知的，取決于待檢測 的標(biāo)記物的類型。因此，例如，當(dāng)標(biāo)記物是放射活性時，檢測手段包括閃爍計數(shù)器(例如放 射免疫分析，閃爍親近分析)(Pitas等，Drug Metab Dispos. 34 :906-12,2006)或照相底 片，如同在放射自顯影中那樣。當(dāng)標(biāo)記物是熒光標(biāo)記物時，它的檢測可以通過用適當(dāng)波長的 光激發(fā)熒光團，并檢測產(chǎn)生的熒光(例如ELISA，流式細胞術(shù)，或本技術(shù)領(lǐng)域已知的其它技 術(shù))。熒光可以通過使用電子檢測器例如電荷耦含器件(CCDs)或光電倍增器等目測檢測。 同樣地，酶標(biāo)記物可以通過提供適合的酶的底物，并檢測得到的反應(yīng)產(chǎn)物來檢測。比色或化 學(xué)發(fā)光標(biāo)記物可以簡單地通過觀察與標(biāo)記物相關(guān)的顏色來檢測。其它適合用于本發(fā)明的方 法的標(biāo)記和檢測系統(tǒng)，對于本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員來說是顯而易見的。如此標(biāo)記的介導(dǎo)物
18和配體可用于疾病或健康狀況的診斷中。 方法任選包括至少一個或多個清洗步驟，其中在測量蛋白結(jié)合之前對結(jié)合的PDGF組合物進行洗滌，以減少由未結(jié)合的多肽引起的背景測量值。在多肽組合物溫育后以及檢測PDGF前PDGF的洗滌，在適當(dāng)?shù)木彌_液加去污劑中進行。適合的去污劑包括但不限于烷基二甲基胺氧化物，烷基葡萄糖苷，烷基麥芽糖苷，烷基硫酸鹽(例如十二烷基硫酸鈉(SDS))， NP-40，烷基硫代葡萄糖苷，甜菜堿，膽汁酸，CHAP系列，毛地黃皂苷、葡萄糖酰胺，卵磷脂/溶血卵磷脂，非離子性基于聚氧乙烯的去污劑、包括TRITON-X，聚山梨酸酯
例如TWEEN⑧20和TWEEN⑧80、 BRIJ 、 GENAPOL⑧.和THESIT⑧，季銨化合物
等。也可以參見《蛋白質(zhì)科學(xué)現(xiàn)代方法》附錄IB的增補11 (Current Protocolsin ProteinScience, Appendix 1B， S聊l. 11,1998， John Wiley禾口 Sons, Hoboken， NJ)。合適的去污劑可以使用常規(guī)的實驗方法來確定(參見Neugebauer， J.，《生物學(xué)和生物化學(xué)中去污劑的性質(zhì)與應(yīng)用指南》AGuide to the Properties and Use of Detergents in BiologyandBiochemistry， Calbiochem-Novabiochem Corp. ， La Jolla， Calif. ，1988)。
纖維蛋白密封膠的給藥方法 考慮到了使用本技術(shù)領(lǐng)域熟知的技術(shù)，將可用于本發(fā)明的纖維蛋白密封膠給藥到
對象，例如通過在所需位點注射或噴灑、使用內(nèi)視鏡、使用海綿狀載體、預(yù)制的密封膠或本技術(shù)領(lǐng)域已知的其它方法。在一個實施方案中，密封膠被注射或噴灑，并使其在原位形成凝膠。 考慮到了將這些纖維蛋白密封膠給藥于將得益于PDGF在體內(nèi)持續(xù)/受控釋放的對象，這對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通專業(yè)人員來說是明顯的，包括但不限于下面列出的病癥。在一個實施方案中，患者患有肌肉骨骼疾病，包括但不限于骨骼和軟骨、肌肉、相關(guān)韌帶以及其它結(jié)締組織的疾病；軟組織疾病或病癥，包括但不限于影響肌肉、纖維組織、脂肪、血管和滑液組織的病癥；或血管疾病。 在一個實施方案中，纖維蛋白密封膠用于代替骨骼移植物，因此可以應(yīng)用于許多相同的適應(yīng)癥中，包括但不限于脊柱融合器、不連缺損的愈合、骨骼增強、骨折修復(fù)加速、骨組織重建和牙齒再生。此外，在另一個實施方案中，密封膠可用于植入物整合。在植入物整合中，植入物可以用纖維蛋白密封膠包裹，誘導(dǎo)附近骨骼區(qū)域生長到植入物表面內(nèi)，防止松散和其它相關(guān)問題。在另一個實施方案中，富含生長因子的基質(zhì)可用于治愈皮膚中的慢性傷口。 其它的骨骼或軟骨疾病或病癥包括但不限于骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、骨營養(yǎng)不良、軟骨病、骨軟化、McC騰-Albright綜合征、Albers-Schonberg病、Paget' s病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、軟骨損傷、假體周圍骨質(zhì)溶解、成骨不全、轉(zhuǎn)移性骨病、骨軟骨瘤、骨生成、骨髓炎、骨病、骨骼石化癥、骨硬化、多軟骨炎、關(guān)節(jié)軟骨損傷、軟骨鈣質(zhì)沉著病、軟骨發(fā)育不全、髕骨軟化癥、軟骨肉瘤、肋軟骨炎、內(nèi)生軟骨瘤、拇強直、半月板損傷、髖臼盂唇撕裂、剝脫性骨軟骨炎(ocd)、復(fù)發(fā)性多軟骨炎，或任何將得益于剌激骨骼或軟骨形成的病癥。
含有PDGF蛋白的纖維蛋白密封膠也可用于治療將得益于增加的血管生成和血管生長的血管疾病或病癥，包括但不限于局部缺血/再灌注、心肌梗塞、充血性心力衰竭、動脈粥樣硬化、高血壓、再狹窄、冠狀動脈病(CAD)、中風(fēng)、血管或心臟鈣化、血栓形成、外周血管病、血管壁重塑、心室重塑、快速心室起搏、冠狀動脈微栓塞、壓力超負(fù)荷、主動脈彎曲、冠狀動脈結(jié)扎、血管性心臟病、辨膜疾病，包括但不限于由鈣化、風(fēng)濕性心臟病、心內(nèi)膜炎或人工瓣膜的并發(fā)癥引起的瓣膜變性；心絞痛、心力衰竭、高血壓、心房纖顫、心包疾病，包括但不限于心包積液和心包炎；心肌病、心臟肥大或心血管發(fā)育紊亂。
試劑盒 在本發(fā)明的范圍內(nèi)也考慮到了試劑盒。典型的試劑盒可以包括含有FC和凝血酶組分的纖維蛋白密封膠。在一個實施方案中，試劑盒還包括用于摻入到纖維蛋白密封膠中的PDGF蛋白。在一種情況下，每種組分可以包含在它自己的獨立的儲存容器、小瓶或器皿中。在相關(guān)情況下，PDGF可以與FC組分混合，而凝血酶組分可以在單獨的儲存容器中。在相關(guān)情況下，PDGF可以與凝血酶組分混合，而FC組分可以在單獨的儲存容器中。在相關(guān)實施方案中，儲存容器是小瓶、瓶子、袋子、儲液器、管子、泡罩、小袋、貼片等。配方的一種或多種成分可以是凍干的、冷凍干燥的、噴霧干燥的，或者采取任何其它可以復(fù)溶的形式。如果需要，也可以提供各種不同的復(fù)溶介質(zhì)。 試劑盒的成分可以采取冷凍、液體或凍干的形式。進一步還考慮到了試劑盒含有適合于將纖維蛋白凝膠給藥于對象的裝置。在另一個實施方案中，試劑盒還含有用于制備和給藥纖維蛋白密封膠的說明書。 從下面的實施例中，本發(fā)明的其它方面和詳細情況將變得明顯，這些實施例目的是說明而不是限制。
實施例 實施例1 :材料和方法
ff放動力學(xué) 使用單一 ([FC] = 20mg/ml ，[凝血酶]=2IU/ml)的纖維蛋白密封膠制劑(TISSEEL VH S/D， S/D是加入了病毒失活步驟以提供附加的安全性；Baxter AG， Vienna,Austria)，分析了重組(rh)-PDGF(R&DSystems)的濃度對釋放動力學(xué)的影響。分析了不同量的重組人類PDGF-AB或BB (對于0. 3ml凝膠為5ng， 10ng， 20ng， 40ng和80ng)。在制備凝膠時，將PDGF重新懸浮在FC組分中。 分析了 FC濃度對最初懸浮在纖維蛋白的FC組分中的PDGF-AB和PDGF-BB (固定在15ng/0. 3ml凝膠)的釋放動力學(xué)的影響。使用從5-40mg/ml (在凝膠中的終濃度)的不同濃度的FC，以及固定濃度的凝血酶(2IU/ml)，制備了四種不同的纖維蛋白凝膠制劑(TISSEELVH S/D)。 使用單一凝膠配方([FC] = 20mg/ml，[凝血酶]=2IU/ml，凝膠中的終濃度)，對三個不同產(chǎn)品批次的TISSEEL VH S/D纖維蛋白密封膠的PDGF-AB和BB(固定為15ng/0. 3ml凝膠，即50ng/ml凝膠)的釋放動力學(xué)進行了比較，以分析釋放動力學(xué)依賴于纖維蛋白密封膠產(chǎn)品批次的任何變化性。 分析了 PDGF-BB從TISSEEL VH的釋放動力學(xué)(PDGF-BB濃度的影響，F(xiàn)C濃度的影響，以及依賴于纖維蛋白密封膠產(chǎn)品批次的變化性)，以觀察使用TISSEEL VH和TISSEEL VHS/D時可能存在的差異。 對于所有使用TISSEEL VH S/D的實驗來說，凝膠在聚丙烯E卯endorf管中制備，而對于使用TISSEEL VH的實驗來說，凝膠在24孔聚苯乙烯培養(yǎng)板中制備。在所有情況下，將凝膠與標(biāo)準(zhǔn)的人類MSC(HMSC)生長培養(yǎng)基(Lonza Walkersville Inc. ， Walkersville， MD)在37°CT、5% C02中，溫育最多10天。每天更換培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)基樣品冷凍直到通 過ELISA(R&D Systems,Minne即olis，MN)測試PDGF的量為止。對于評估FC濃度的影響和 TISSEEL VH S/D批與批之間變化的實驗來說，在IO天的釋放后，使用尿激酶(lU/ml)將凝 膠溶解在完全培養(yǎng)基中。測試獲得的溶液中PDGF的量，以便證實最初添加到凝膠中的生長 因子的量的完全回收。
牛物學(xué)活件 釋放的PDGF對HMSC單層的影響 使用了一種TISSEEL VH S/D纖維蛋白制劑(20mg/ml的FC以及2IU/ml凝血酶， 均為在凝膠中的終濃度)，來分析從凝膠釋放的PDGF的生物學(xué)活性(將120ng PDGF-AB和 60ng PDGF-BB加入到FC組分中，然后將帶有添加的PDGF的凝膠聚合)。將第3天時從凝 膠收集的培養(yǎng)基上清液(不每天更換培養(yǎng)基)，用作HMSC單層的培養(yǎng)基。首先，將HMSC以 2500個細胞/cm2預(yù)先接種在12孔培養(yǎng)板中(10， 000個細胞/孔)，在37°C 、5% C02中溫育 4到5小時，以允許貼壁。然后，除去細胞培養(yǎng)基，用來自凝膠的培養(yǎng)基上清液替換。制備一 些不加PDGF的凝膠用作對照樣品，以便確保使用來自于添加有PDGF的凝膠的培養(yǎng)基時觀 察到的任何變化，確實是由釋放的PDGF誘導(dǎo)的，而不是由可能從凝膠自身釋放的某些其它 的潛在生物活性成分誘導(dǎo)的。含有新鮮制備的、添加有30ng(15ng/ml)rh-PDGF的培養(yǎng)基的 孔，被用作陽性對照。在陽性對照中添加30ng PDGF，是基于當(dāng)在實驗使用的凝膠制劑中添 加120ng PDGF-AB或60ng PDGF-BB時，在第3天時所發(fā)現(xiàn)的從凝膠釋放的PDGF的大約量， 因此將很接近地模擬測試條件，即在第3天時來自凝膠的、含有釋放的PDGF-AB或PDGF-BB 的培養(yǎng)基上清液。 細胞增殖和細胞形態(tài)學(xué)變化的分析在第1、4和7天時分析了細胞增殖 和形態(tài)學(xué)變化。將細胞培養(yǎng)基丟棄，將細胞用含有鈣黃綠素-AM和溴乙錠同二聚 體-l(Sigma-Aldrich Inc. ， St. Louis，MO)的存活/死亡(Live/Dead)染料溶液染色。將與 來自添加有PDGF的凝膠的培養(yǎng)基上清液溫育的細胞的增殖，同與來自未添加PDGF的凝膠 的上清液溫育的細胞以的增殖及與添加有30ng PDGF的新鮮制備的培養(yǎng)基溫育的細胞的增 殖(陽性對照)，進行了比較。細胞的增殖通過在50分鐘染色后用多孔板讀板器(Gemini, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)測量熒光強度來監(jiān)測。在增殖讀數(shù)后，將板用基本培 養(yǎng)基洗滌一次以除去殘留的染色劑，并使用裝備有數(shù)字圖像獲取系統(tǒng)(帶有用于圖像捕獲 的Spot軟件V. 2. 1.的Spot數(shù)字相機，Nikon)的倒置熒光顯微鏡(NikonEclipse TE200, Nikon Instruments Inc. ， Melville, NY)，觀察細胞形態(tài)學(xué)變4t。 細胞分化分析(軟骨形成和骨形成)為了分析在存在從纖維蛋白凝膠釋放的 PDGF的情況下，可能的HMSC軟骨形成或骨形成分化，在培養(yǎng)1、4、7天后，將細胞用愛茜藍 (Alcian Blue)(用于軟骨形成)或茜素紅(用于骨形成)染色。將與來自添加有PDGF的 凝膠的培養(yǎng)基溫育的細胞的染色強度，同與來自未添加PDGF的凝膠的培養(yǎng)基溫育的細胞 以及與添加有30ng PDGF的新鮮制備的培養(yǎng)基溫育的細胞(陽性對照)的染色強度，進行 了比較。 為了進行愛茜藍染色，將細胞用磷酸鹽緩沖溶液(PBS) (Invitrogen Corporation, San Diego， CA)清洗兩次，用聚甲醛(SigmaAldrich Inc.)固定IO分鐘，用0. IN HC1中的1X愛茜藍(Sigma Aldrichlnc.)染色30分鐘。將細胞用PBS洗5次(每次2 分鐘)，在裝備有數(shù)字圖像獲取系統(tǒng)(前面描述的帶有用于圖像捕獲的Spot軟件V.2. 1.的 Spot數(shù)字相機，Nikon)的倒置光學(xué)顯微鏡(Nikon Eclipse TE200)下觀察。為了進行茜素 紅染色，首先將細胞用PBS洗兩次，在冰冷的70%乙醇中固定10分鐘，用PBS中的2%茜素 紅(Sigma Aldrich Inc.)染色30分鐘。然后將細胞用PBS洗5次(每次2分鐘)，使用上 述的倒置光學(xué)顯微鏡觀察。 除了用茜素紅染色之外，在培養(yǎng)1、4和7天后測量了堿性磷酸酶(ALP)活性，作為 早期成骨分化的標(biāo)志物。將12孔培養(yǎng)板中的細胞用HBSS(Lonza Walkersville, Inc.)洗 滌兩次，用胰蛋白酶處理幾分鐘使它們分離。然后將細胞懸液轉(zhuǎn)移到Eppendorf管中，將孔 用0. 5ml基本培養(yǎng)基洗滌，然后轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的Eppendorf管中。然后將細胞離心5分鐘，用 0. 5ml含有NaHC03的Tyrode's鹽溶液(Sigma Aldrich， Inc.)洗一次。棄去上清液，將細 胞沉淀重新懸浮在50 ii 1 AMP緩沖液+MgCl2 (Sigma Aldrich， Inc.)中，轉(zhuǎn)移到96孔板中。 將管用25 1 AMP緩沖液+MgCl2洗滌，將其轉(zhuǎn)移到96孔板的相應(yīng)孔中。在96孔板的3個 孔中加入75iU AMP緩沖液+MgCl2，用作空白。最后，在每個孔中加入75iU p-NPP(對硝 基苯基磷酸酯，Sigma Aldrich, Inc.)底物儲液，然后將板在37。C放置30分鐘。在30分鐘 時，使用微孔板讀板器(Thermomax， Molecular Devices Corp.)分析所形成的與ALP活性 成比例的對硝基酚產(chǎn)物在405nm處的吸光度。將首先以IU/L測量的結(jié)果，根據(jù)增殖進行歸 一化。 PDGF-BB對接種在纖維蛋白凝膠中的HMSC的影響 為了分析添加在纖維蛋白凝膠中的PDGF-BB對接種在纖維蛋白凝膠中的HMSC和 接種在凝膠表面上的人臍帶血管內(nèi)皮細胞(HUVEC，Lonza Walkersville, Inc.)的行為的生 物學(xué)效應(yīng)，使用單一培養(yǎng)細胞(HMSC或HUVEC)或HMSC : HUVEC比率為4 : 1的共培養(yǎng)的 細胞，制備了含有10mg/ml FC和2IU/ml凝血酶(凝膠中的終濃度)的TISSEEL VH S/D凝 膠。在凝膠制備時，在一半的共培養(yǎng)凝膠中，在FC中添加PDGF-BB (60ng/0. 3ml凝膠)，以便 比較在添加或未添加PDGF-BB的凝膠中細胞的行為。將制備在24孔培養(yǎng)板中的凝膠，使用 含有血清添加物的內(nèi)皮細胞生長培養(yǎng)基(lml/凝膠)，在37°CT、5% C02中溫育最多21天。 在第1、7、14和21天分析細胞的形態(tài)學(xué)和增殖，以及成骨分化。細胞形態(tài)學(xué)，包括HUVEC重 新組織成互相連接的細胞_細胞網(wǎng)絡(luò)(血管形成分化的早期事件)，在用鈣黃綠素染料染 色后通過熒光顯微術(shù)觀察。細胞增殖，在用鈣黃綠素染料染色后，通過將凝膠在純化的、濃 縮的牛胰蛋白酶溶液中溶解后，測量細胞懸液的總熒光強度來分析。最后，在將凝膠在純化 的、濃縮的牛胰蛋白酶溶液中溶解、然后重新懸浮細胞后，測量ALP作為成骨分化的早期標(biāo) 志物(方案如前所述)。 通過表面等離子體共振測定PDGF的結(jié)合: 表面等離子體共振(SPR)是一種實時測量生物分子相互作用的技術(shù)。分析可以 確定具體的分析物是否與給定配體結(jié)合，并確定分析物與配體結(jié)合的結(jié)合親和性和化學(xué)計 量?；镜膶嶒灧椒ㄊ鞘紫葘㈠兘鸬男酒c配體偶聯(lián)。然后將在緩沖液(流動相)中制備 的分析物注射到流動池中，在那里它由緩沖液流運載通過鍍層的芯片。如果分析物與配體 之間發(fā)生生物分子相互作用，表面上質(zhì)量的局部增加導(dǎo)致金屬表面上折射率單位(P RIU) 的增加。(yRIU)的變化可以作為時間的函數(shù)作圖。
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在本研究中，重組人類PDGF-AB和重組人類PDGF-BB被用作分析物，TISSEEL VH S/D的FC組分被用作配體。磷酸鹽緩沖液(PBS，即生理鹽條件溶液)被用作緩沖液。將不 同濃度的每種PDGF同工型分別通過FC包被的傳感器芯片的表面。對于每個實驗和每種濃 度來說，測量結(jié)合和解離速率。
鄉(xiāng)充i十，條: 釋放動力學(xué)進行三份平行測試。增殖、ALP活性、愛茜藍和茜素染色的結(jié)果代表了 三組實驗。增殖和ALP活性進行了三份平行測試，染色實驗進行了雙份。每種PDGF濃度的 SPR分析進行了三分平行測試。統(tǒng)計學(xué)分析使用AN0VA檢驗進行，以5%作為顯著性水平。
實施例2 :PDGF濃度對它從TISSEEL VH S/D釋放的動力學(xué)的影響
使用由TISSEEL VH S/D制造的單一纖維蛋白凝膠制劑(FC濃度為20mg/ml，凝血 酶濃度為2IU/ml，均為凝膠中的終濃度)，分析了 PDGF濃度對它從纖維蛋白凝膠釋放的動 力學(xué)的影響。釋放動力學(xué)研究顯示，PDGF-AB和BB的釋放量，隨著最初添加到TISSEEL VH S/D的FC組分中的生長因子的量而增加(圖1和2)。 總體來說，累積釋放結(jié)果顯示，在IO天后，只有大約20 %到35%的最初添加的 PDGF-AB釋放了 (圖1)。如果考慮僅僅3天后的PDGF-AB累積釋放，PDGF-AB的累積釋放 是大約8-13% 。換句話說，這些結(jié)果顯示，在第10天時保留了大約65-80% ，在第3天時保 留了大約87-92%。 使用PDGF-BB的結(jié)果也服從同樣的趨勢，但表現(xiàn)出較高的總釋放，在10天后釋放 了大約45%到70% (圖2)。如果考慮僅僅3天后PDGF-BB的累積釋放，累積釋放是大約 20-35%。 這些結(jié)果表明，PDGF-AB和BB都與纖維蛋白具有強烈的結(jié)合相互作用。 實施例3 :FC濃度對PDGF從TISSEEL VH S/D釋放的動力學(xué)的影響 為了確定當(dāng)使用TISSEEL VH S/D纖維蛋白密封膠時FC濃度對PDGF釋放動力學(xué)
的影響，使用具有固定的凝血酶濃度(2IU/ml)，對4種不同F(xiàn)C濃度(5、10、20和40mg/ml，
為在凝膠中的終濃度)的TISSEEL VH S/D凝膠的釋放進行了分析。 ELISA結(jié)果顯示，對于所有被分析的FC濃度來說，第1天時有峰值釋放，隨后釋放 減少直到第10天(圖3A)。當(dāng)在凝膠中加入15ngPDGF-AB時，F(xiàn)C濃度(從5到40mg/ml) 對釋放動力學(xué)沒有顯著影響。累積釋放顯示，在10天后釋放起始量(15ng)的大約27%到 32% (圖38)，而3天后僅釋放10%到20%。換句話說，10天后的保留為大約70% ，而僅僅 3天后保留高達80-90X，并且不受FC濃度的影響，表明5mg/ml FC足夠結(jié)合15ng PDGF-AB。
但是，使用PDGF-BB的結(jié)果顯示出FC濃度對總釋放百分率的影響(圖4)。事實 上，第10天時，在較低FC濃度下PDGF-BB從TISSEELVH S/D的累積釋放較高(使用5mg/ ml FC為65%，使用40mg/ml FC為25X)。第3天時的累積釋放分析也顯示出了對FC濃 度的依賴性，使用5mg/ml FC時釋放為大約35X，使用40mg/ml FC時釋放為大約10X。換 句話說，這些結(jié)果顯示，10天后，最小保留為是大約35% (使用5mg/ml FC)，最大保留為大 約75% (使用40mg/ml FC)，而3天后，最小保留為大約65% ，最大保留為大約90% 。釋放 動力學(xué)對FC濃度的依賴性，表明通過改變FC濃度，PDGF-BB有可能受控釋放。
在將凝膠溶解以回收凝膠中殘留的PDGF-AB后，ELISA結(jié)果顯示，回收到了最初添 加的PDGF-AB量的至少85% 。在將凝膠溶解以回收凝膠中殘留的PDGF-BB后，ELISA結(jié)果顯示，回收到了最初添加的PDGF-BB量的65 %到75% 。因此，對于PDGF-BB來說回收不完
全，PDGF-BB的釋放百分率可能被略微低估了。 實施例4 :使用TISSEEL VH S/D不同產(chǎn)品批次的影響 當(dāng)觀察使用具有單一凝膠配方(20mg/ml FC和2IU/ml凝血酶，均為凝膠中的終濃 度)的TISSEEL VH S/D的不同F(xiàn)C產(chǎn)品批次的影響時，結(jié)果顯示，對于所有被分析的批次 來說，直到10天時具有恒定的釋放。取決于FC批次，10天后PDGF-AB的累積釋放在大約 23%到32%的范圍內(nèi)(圖5)，因此對于3個批次來說是相似的。取決于FC批次，10天后 PDGF-BB的累積釋放在大約38%到42%的范圍內(nèi)(圖6)，因此對于3個批次來說也是相似 的。 這些結(jié)果顯示，在纖維蛋白批次之間，PDGF的釋放沒有顯著差別，因此在釋放動力 學(xué)中不必?fù)?dān)心批次之間的差異。 在將凝膠溶解以回收凝膠中殘留的PDGF-AB后，ELISA結(jié)果顯示了最初加入的 PDGF-AB量被完全回收。在將凝膠溶解以回收凝膠中殘留的PDGF-BB后，ELISA結(jié)果顯示回 收了最初加入的PDGF-BB量的大約65%。因此，對于PDGF-BB來說回收不完全，PDGF-BB的 總釋放百分率可能被略微低估。 實施例5 :PDGF-BB從TISSEEL VH釋放的動力學(xué) 分析了 PDGF-BB從TISSEEL VH釋放的動力學(xué)，以觀察在使用TISSEEL VH和 TISSEEL VH S/D時可能存在的差別。 測量了 PDGF-BB濃度對從TISSEEL VH釋放的動力學(xué)的影響。結(jié)果顯示，釋放量隨 著最初添加到FC組分中的生長因子的量而增加(圖7)?？傮w來說，累積釋放結(jié)果顯示，10 天后，最初添加的PDGF-BB只有大約20%到40%被釋放，即比使用VH S/D時觀察到的釋放 低大約2倍。在僅僅3天后，結(jié)果顯示PDGF-BB的累積釋放為大約15-20%。但是，應(yīng)該指 出，這些值可能被低估了，這是因為對TISSEEL VH進行的實驗使用的是聚苯乙烯板(與此 相比TISSEEL VH S/D使用的是聚丙烯管)，PDGF可能與聚苯乙烯板非特異性結(jié)合。沒有測 量10天釋放實驗結(jié)束時凝膠中殘留的生長因子的回收來證實這種可能的低估。
當(dāng)觀察FC濃度對每日PDGF-BB從TISSEEL VH釋放的影響時，ELISA結(jié)果顯示，對 于所有被分析的濃度來說，第1天表現(xiàn)出峰值釋放，此后釋放減少， 一直到第10天(圖8A)。 結(jié)果還顯示出，當(dāng)在TISSEEL VH凝膠中加入15ng PDGF-BB時，F(xiàn)C濃度(從5到40mg/ml)不 影響釋放動力學(xué)，累積釋放顯示出在10天后，釋放了大約30 %到35 %的起始添加量(15ng) (圖8B)。該結(jié)果表明，來自TISSEEL VH的5mg/ml FC足夠結(jié)合15ng PDGF-BB。但是，至于 PDGF-BB濃度影響的結(jié)果，應(yīng)該指出，使用TISSEEL VH時的這些值由于使用了聚苯乙烯板， 可能被低估了。 最后，當(dāng)觀察使用具有單一凝膠配方(20mg/ml FC和2IU/ml凝血酶，均為凝膠中 的終濃度)的TISSEEL VH的不同F(xiàn)C產(chǎn)品批次的影響時，結(jié)果顯示，對于所有被分析的批次 來說，直到10天時具有恒定的釋放。10天后PDGF-BB的累積釋放在大約30%到60%的范 圍內(nèi)(圖9)，因此依賴于FC批次號，這與使用TISSEEL VH S/D時的結(jié)果相反。被分析的3 個批次的TISSEEL VH的一種差異是因子XIII的含量(批次1可以忽略，批次2為33. 9U/ ml，批次3為42. 2IU/ml)，表明在因子XIII的量與PDGF-BB從TISSEEL的釋放速率之間可 能存在關(guān)聯(lián)。
實施例6 :釋放的PDGF在體外對HMSC單層的生物學(xué)活性 人類間充質(zhì)干細胞(HMSC)是多能祖細胞，可以分化成不同的特化組織細胞類 型，包括軟骨細胞、成骨細胞、脂肪細胞和肌細胞(C即lan AI， J Orthop Res 9:641-650， 1991)。這些細胞的定向和分化由各種不同的因素介導(dǎo)，包括細胞相互作用，但是也包括特 異性生長因子。PDGF家族的成員已經(jīng)被鑒定為MSC成熟的調(diào)節(jié)劑。 測量了釋放的生長因子對HMSC的影響。正如在材料與方法部分中陳述的，在第3 天時(不每天更換培養(yǎng)基)，從纖維蛋白凝膠(將120ng PDGF-AB和60ng PDGF-BB添加到 FC組分中，然后對添加有PDGF的凝膠進行聚合)收集培養(yǎng)基上清液，并用作HMSC單層的培 養(yǎng)基。某些凝膠在制備時不加入PDGF，用作對照樣品，以便確保使用來自于添加有PDGF的 凝膠的培養(yǎng)基時觀察到的任何變化確實是由釋放的PDGF誘導(dǎo)的，而不是由可能從凝膠自 身釋放的某些其它的潛在生物活性成分誘導(dǎo)的。 用來自添加有PDGF-AB或PDGF-BB的TISSEEL VH S/D凝膠的培養(yǎng)基上清液、即含 有釋放的PDGF的培養(yǎng)基(最初用20mg/ml FC、2IU/ml凝血酶制備的凝膠)培養(yǎng)的HMSC，早 在第4天就顯示出細胞形態(tài)學(xué)的變化，在第7天時甚至更明顯。它們與用來自未添加PDGF 的凝膠的培養(yǎng)基上清液培養(yǎng)的細胞相比，具有更細長的形狀，與用含有新鮮添加的PDGF的 培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞更為類似。使用PDGF-BB時效果甚至更明顯。 將第4和7天時細胞的增殖根據(jù)第l天時的增殖(基線)進行歸一化。當(dāng)用來自 添加有PDGF的TISSEEL VH S/D凝膠的培養(yǎng)基上清液(即含有釋放的PDGF的培養(yǎng)基)培 養(yǎng)7天時，HMSC增殖趨于增加，但是差異不明顯(p >0.05)(圖IO和11)。用新鮮添加有 PDGF的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞的增殖，明顯較高。 用來自添加有PDGF的TISSEEL VH S/D凝膠的上清液培養(yǎng)的HMSC，與用來自未添 加PDGF的TISSEEL VH S/D凝膠的上清液和用含有新鮮添加的PDGF的培養(yǎng)基培養(yǎng)的HMSC 相比，其中的堿性磷酸酶(ALP)活性明顯較低(圖12和13)。 在直到7天時，所有時間點的愛茜藍(軟骨形成分化的指示劑)和茜素紅(晚期 骨形成分化的指示劑)都為陰性。 總的來說，在存在來自于TISSEEL VH S/D纖維蛋白凝膠的釋放的PDGF的情況下， 所有HMSC行為中觀察到的變化在使用PDGF-BB時都更明顯?？傮w上，結(jié)果顯示，從TISSEEL VH S/D纖維蛋白凝膠釋放的PDGF仍然是生物學(xué)活性的，主要誘導(dǎo)了 HMSC形態(tài)學(xué)的變化和 ALP活性的抑制。 實施例7 :PDGF-BB對接種在纖維蛋白凝膠中的HMSC和接種在纖維蛋白凝膠表面 上的HUVEC的影響 為了分析PDGF對接種在纖維蛋白凝膠中的HMSC和接種在凝膠表面上的人類臍帶 血管內(nèi)皮細胞(HUVEC， Lonza Walkersville Inc.)的行為的影響，按照在材料和方法中的 描述制備了含有細胞的凝膠。 簡單來說，使用單一培養(yǎng)細胞(HMSC或HUVEC)或以4 : 1的HMSC : HUVEC比率共 培養(yǎng)的細胞，制備了含有10mg/ml FC和2IU/ml凝血酶(在凝膠中的終濃度)的凝膠。在 凝膠制備時，在一半的共培養(yǎng)凝膠中，在FC中添加了重組PDGF-BB (60ng/0. 3ml凝膠)。使 用含有血清補充的內(nèi)皮細胞生長培養(yǎng)基(Lonza Walkersville Inc.)，在37°CT、5% C02中 將凝膠溫育21天。在第1、7、14和21天時，分析細胞形態(tài)學(xué)和增殖，以及成骨分化。
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熒光顯微術(shù)分析顯示，隨著時間，HMSC以較高的數(shù)量均勻地分散，當(dāng)接種在單一 培養(yǎng)物凝膠中時，具有更細長的形狀。它們在添加有PDGF-BB的共培養(yǎng)凝膠中也均勻地分 散和伸長，但是在未添加PDGF-BB的情況下，它們較小、數(shù)量較少，并傾向于朝向共培養(yǎng)凝 膠的底部遷移。在單一培養(yǎng)物凝膠和含有附加的PDGF-BB的共培養(yǎng)物凝膠中，與未添加 PDGF-BB的共培養(yǎng)凝膠相比，HUVEC重新組織成互相連接的細胞-細胞網(wǎng)絡(luò)(血管形成的早 期事件)開始得較早，發(fā)生的程度更高。 細胞增殖隨著時間而增加。在添加和未添加PDGF-BB的凝膠之間沒有觀察到明顯 的差別，但是在第7天和14天時，在含有添加的PDGF-BB的凝膠中注意到了更高增殖的趨 勢。ALP活性保持在低水平，表明添加到凝膠中的PDGF-BB沒有誘導(dǎo)接種在凝膠中的HMSC 的成骨分化。 實施例8 :通過表面等離子體共振(SPR)測定的PDGF的結(jié)合
SPR被用于研究PDGF-AB和PDGF-BB與TISSEEL VH S/D的FC組分之間的相互作 用的性質(zhì)。相互作用的傳感圖顯示在圖14A-14B中。對曲線的結(jié)合和解離部分進行了作 圖，并使用非線性回歸分析，分別擬合成單相指數(shù)結(jié)合和解離曲線(圖14C)。如圖14B所 示，PDGF-BB的解離曲線是雙峰的。這使得不能精確地測定PDGF-BB與TISSEELVH S/D的 FC組分之間相互作用的KD值。但是，SPR被成功地用于計算PDGF-AB與TISSEEL VH S/D的 FC組分的相互作用的K。值(在存在緩沖液(PBS，pH 7.4)的情況下)。對傳感圖結(jié)合相的 分析，提供了速率常數(shù)(K。b》，將它對分析物濃度進行了作圖(圖14C)。通過線性回歸對這 些圖進行了分析，獲得了斜率和截距，它們分別對應(yīng)于結(jié)合速率常數(shù)(K。n)和解離速率常數(shù) (K。ff)。平衡解離常數(shù)(KD)通過用解離速率常數(shù)除以結(jié)合速率常數(shù)來計算。
平衡解離常數(shù)(KD)也可以通過互補的方法(complementarymethod)來才確定，這 依賴于結(jié)合傳感圖的解離相。在這種方法中，PDGF-AB的解離速率常數(shù)(K。ff)從傳感圖的解 離相的非線性回歸分析計算。解離平衡常數(shù)(KD)通過用解離速率常數(shù)(K。ff)除以結(jié)合速率 常數(shù)(K。n)(它從傳感圖的結(jié)合相的分析獲得)來計算。 使用這兩種方法，PDGF-AB與TISSEEL VH S/D的FC組分結(jié)合的K。值為342±41nM。
歸納 上面測量的釋放動力學(xué)顯示，在纖維蛋白凝膠中添加的重組PDGF逐漸從凝膠釋 放，表明了PDGF與纖維蛋白(原)的結(jié)合相互作用。這種結(jié)合相互作用得到了 IO天后 累積釋放低于最初添加的PDGF量的進一步證實。PDGF-BB表現(xiàn)出比PDGF-AB釋放得更快 (PDGF-BB的持留更低)，F(xiàn)C濃度表現(xiàn)出影響了 PDGF-BB從TISSEEL VH S/D纖維蛋白凝膠 的釋放速率，表明不同的FC濃度可用于控制PDGF-BB的釋放速率?？偟膩碚f，這些結(jié)果表 明了這兩種形式的PDGF、特別是PDGF-AB，與纖維蛋白的結(jié)合相互作用。使用SPR時，結(jié)果 顯示PDGF-AB和PDGF-BB 二者都與TISSEEL的FC組分結(jié)合。最后，生物活性結(jié)果證實，釋 放的PDGF仍然是生物學(xué)活性的，主要誘導(dǎo)了 HMSC形態(tài)學(xué)的變化，但是不誘導(dǎo)骨形成和/或 軟骨形成的分化。 總的來說，本研究表明，纖維蛋白凝膠是用于投送生物活性PDGF的潛在載體系 統(tǒng)，并證明了 TISSEEL纖維蛋白密封膠的FC組分結(jié)合PDGF-AB和BB的內(nèi)在性質(zhì)。
對于本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員來說，預(yù)計可以對上面的說明性實施例中提出的本發(fā) 明進行大量改變和改變。因此，只有在隨附的權(quán)利要求書中出現(xiàn)的那些限制才對本發(fā)明生效c
權(quán)利要求
用于改變血小板衍生生長因子(PDGF)蛋白從纖維蛋白密封膠的釋放的方法，所述血小板衍生生長因子(PDGF)蛋白選自PDGF-AB和PDGF-BB，其中纖維蛋白密封膠通過將纖維蛋白原復(fù)合物(FC)組分、凝血酶組分和PDGF組分相混合而產(chǎn)生，該方法包括，a)確定從具有已知PDGF起始量和已知FC終濃度的第一種纖維蛋白密封膠中釋放的PDGF的量，以及b)改變在步驟(a)的第一種纖維蛋白密封膠中使用的FC的已知終濃度以產(chǎn)生第二種纖維蛋白密封膠，其中第二種密封膠中FC的濃度與第一種密封膠中FC的已知終濃度相比的增加，使從第二種密封膠釋放PDGF的速率與從步驟(a)的第一種密封膠釋放PDGF相比降低，并且其中第二種密封膠具有與步驟(a)的第一種密封膠相同的PDGF起始量。
2. 用于改變血小板衍生生長因子(PDGF)從纖維蛋白密封膠的釋放的方法，所述血小 板衍生生長因子蛋白選自PDGF-AB和PDGF-BB，其中纖維蛋白密封膠通過將FC組分、凝血酶 組分和PDGF組分相混合而產(chǎn)生，該方法包括，a) 確定從具有已知PDGF起始量和已知FC終濃度的第一種纖維蛋白密封膠中釋放的 PDGF的量，b) 改變在步驟(a)的第一種纖維蛋白密封膠中使用的FC的已知終濃度以產(chǎn)生第二種 纖維蛋白密封膠，其中第二種密封膠中FC的濃度與第一種密封膠中FC的已知終濃度相比 的降低，使從第二種密封膠釋放PDGF的速率與從步驟(a)的第一種密封膠釋放PDGF相比 增加，并且其中第二種密封膠具有與步驟(a)的第一種密封膠相同的PDGF起始量。
3. 權(quán)利要求1或2的方法，其中第一或第二種密封膠中FC的終濃度在大約lmg/ml到 大約150mg/ml的范圍內(nèi)。
4. 權(quán)利要求3的方法，其中第一或第二種密封膠中FC的濃度在大約5mg/ml到大約 75mg/ml的范圍內(nèi)。
5. 權(quán)利要求1或2的方法，其中第一種纖維蛋白密封膠中FC的終濃度與第二種密封膠 中FC的終濃度的差別為大約lmg/ml到大約149mg/ml。
6. 權(quán)利要求1或2的方法，其中第一種纖維蛋白密封膠中FC的終濃度與第二種密封膠 中FC的濃度的差別為大約5mg/ml到大約75mg/ml。
7. 權(quán)利要求1或2的方法，其中第一種纖維蛋白密封膠中FC的終濃度與第二種密封膠 中FC的濃度的差別為大約10mg/ml到大約60mg/ml。
8. 權(quán)利要求1或2的方法，其中第一或第二種密封膠中凝血酶組分的終濃度在大約 1IU/ml到250IU/ml的范圍內(nèi)。
9. 權(quán)利要求1或2的方法，其中PDGF的終濃度在大約lng/ml到大約lmg/ml的范圍內(nèi)。
10. 在需要的患者中受控釋放血小板衍生生長因子(PDGF)蛋白的方法，所述蛋白選自 PDGF-AB和PDGF-BB，該方法包括給所述患者施用含有PDGF的纖維蛋白密封膠，其中至少 25%的PDGF在纖維蛋白密封膠中保留至少3天。
11. 權(quán)利要求IO的方法，其中纖維蛋白密封膠通過將FC組分與凝血酶組分在混合物中 混合而產(chǎn)生。
12. 權(quán)利要求11的方法，其中在將FC組分與凝血酶組分混合之前，將PDGF加入到FC 組分中。
13. 權(quán)利要求10或11的方法，其中至少35%到90%的PDGF保留至少3天。
14. 權(quán)利要求10或11的方法，其中至少45X到75X的PDGF在纖維蛋白密封膠中保留 至少3天。
15. 權(quán)利要求10或11的方法，其中至少60%的PDGF在纖維蛋白密封膠中保留至少3天。
16. 權(quán)利要求10或11的方法，其中釋放的PDGF是有生物活性的。
17. 在需要的患者中受控釋放血小板衍生生長因子(PDGF)蛋白的方法，所述蛋白選自 PDGF-AB和PDGF-BB，該方法包括給所述患者施用含有PDGF的纖維蛋白密封膠，其中至少 20%的PDGF在纖維蛋白密封膠中保留至少10天。
18. 權(quán)利要求17的方法，其中纖維蛋白密封膠通過將纖維蛋白原復(fù)合物(FC)組分與凝 血酶組分在混合物中混合而產(chǎn)生。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中在將FC組分與凝血酶組分混合之前，將PDGF加入到FC 組分中。
20. 權(quán)利要求17或18的方法，其中至少25%到75X的PDGF保留至少10天。
21. 權(quán)利要求17或18的方法，其中至少45%到55X的所述PDGF在纖維蛋白密封膠中 保留至少10天。
22. 權(quán)利要求17或18的方法，其中釋放的PDGF是有生物活性的。
23. 權(quán)利要求11或18的方法，其中密封膠中纖維蛋白原復(fù)合物的終濃度在大約lmg/ ml到大約150mg/ml的范圍內(nèi)。
24. 權(quán)利要求11或18的方法，其中密封膠中凝血酶的終濃度在大約1IU/ml到250IU/ ml的范圍內(nèi)。
25. 權(quán)利要求11或18的方法，其中纖維蛋白原復(fù)合物的終濃度是40mg/ml，和凝血酶 的終濃度是大約2IU/ml。
26. 權(quán)利要求10或17的方法，其中密封膠中PDGF的終濃度是大約lng/ml到大約lmg/ml。
27. 權(quán)利要求10或17的方法，其中PDGF是PDGF-AB。
28. 權(quán)利要求27的方法，其中至少60%的所述PDGF-AB在所述纖維蛋白密封膠中保留 至少3天，并且其中至少40%的所述PDGF-AB在所述纖維蛋白密封膠保留至少10天。
29. 權(quán)利要求10或17的方法，其中PDGF是PDGF-BB 。
30. 權(quán)利要求29的方法，其中至少55%的所述PDGF-BB在所述纖維蛋白密封膠中保留 至少3天，并且其中至少25%的所述PDGF-BB在所述纖維蛋白密封膠中保留至少10天。
31. 權(quán)利要求10或17的方法，其中患者患有選自肌肉骨骼疾病或病癥、軟組織疾病或 病癥和心血管疾病的疾病。
32. 權(quán)利要求31的方法，其中肌肉骨骼病癥是骨疾病或骨病癥。
33. 權(quán)利要求32的方法，其中患者患有心血管疾病。
34. 用于治療患者的方法，該患者患有將得益于血小板衍生生長因子(PDGF)蛋白的原 位受控釋放的病癥或疾病，所述蛋白選自PDGF-AB和PDGF-BB，所述方法包括給所述患者施 用含有PDGF蛋白的纖維蛋白密封膠，其中纖維蛋白密封膠提供了 PDGF的受控釋放，其中至少25%的PDGF在纖維蛋白密封膠中保留至少3天，或其中至少20%的PDGF在纖維蛋白密封膠中保留至少10天，并且所述 PDGF以有效治療所述病癥或疾病的速率釋放。
35. 權(quán)利要求34的方法，其中纖維蛋白密封膠通過將纖維蛋白原復(fù)合物(FC)組分與凝 血酶組分在混合物中混合而產(chǎn)生。
36. 權(quán)利要求34的方法，其中在將FC組分與凝血酶組分混合之前，將PDGF加入到FC 組分中。
37. 權(quán)利要求34或35的方法，其中至少35%到90%的PDGF在纖維蛋白密封膠中保留 至少3天。
38. 權(quán)利要求34或35的方法，其中至少45%到75%的PDGF在纖維蛋白密封膠中保留 至少3天。
39. 權(quán)利要求34或35的方法，其中至少60%的PDGF在纖維蛋白密封膠中保留至少3天。
40. 權(quán)利要求34或35的方法，其中至少20X的所述PDGF在纖維蛋白密封膠中保留至 少10天。
41. 權(quán)利要求34或35的方法，其中至少25X到75X的PDGF保留至少10天。
42. 權(quán)利要求34或35的方法，其中至少45 %到55 %的所述PDGF在纖維蛋白密封膠中 保留至少10天。
43. 權(quán)利要求34或35的方法，其中釋放的PDGF是有生物活性的。
44. 權(quán)利要求34的方法，其中密封膠中FC的終濃度在大約lmg/ml到大約150mg/ml的 范圍內(nèi)。
45. 權(quán)利要求34的方法，其中密封膠中凝血酶的終濃度在大約1IU/ml到250IU/ml的 范圍內(nèi)。
46. 權(quán)利要求34的方法，其中纖維蛋白原復(fù)合物的終濃度是大約40mg/ml，和凝血酶的 終濃度是大約2IU/ml。
47. 權(quán)利要求34的方法，其中密封膠中PDGF的終濃度是大約lng/ml到大約lmg/ml。
48. 權(quán)利要求34的方法，其中PDGF是PDGF-AB。
49. 權(quán)利要求48的方法，其中至少80X的所述PDGF-AB在所述纖維蛋白密封膠中保留 至少3天，并且其中至少60%的所述PDGF-AB在所述纖維蛋白密封膠中保留至少10天。
50. 權(quán)利要求34的方法，其中PDGF是PDGF-BB。
51. 權(quán)利要求50的方法，其中至少55X的所述PDGF-BB在所述纖維蛋白密封膠中保留 至少3天，并且其中至少25%的所述PDGF-BB在所述纖維蛋白密封膠中保留至少10天。
52. 權(quán)利要求34的方法，其中患者患有選自肌肉骨骼疾病或病癥、軟組織疾病或病癥 和心血管疾病的疾病。
53. 權(quán)利要求52的方法，其中骨骼肌肉病癥是骨疾病或骨病癥。
54. 權(quán)利要求52的方法，其中患者患有血管疾病。
55. 用于制備含有血小板衍生生長因子(PDGF)蛋白的纖維蛋白密封膠的試劑盒，所述 血小板衍生生長因子(PDGF)蛋白選自PDGF-AB和PDGF-BB，并且所述纖維蛋白密封膠具有 所需的PDGF釋放速率，該試劑盒包含，a)含有纖維蛋白原復(fù)合物組分的第一個小瓶或第一個儲存容器，其中小瓶任選含有PDGF組分，以及b)具有凝血酶組分的第二個小瓶或第二個儲存容器，當(dāng)所述第一個小瓶或 第一個儲存容器不包含PDGF組分時，所述試劑盒任選包含具有PDGF組分的第三個小瓶或 第三個儲存容器，所述試劑盒還包含其使用說明書。
56. 用于制備含有血小板衍生生長因子(PDGF)蛋白的纖維蛋白密封膠的試劑盒，所述 血小板衍生生長因子(PDGF)蛋白選自PDGF-AB和PDGF-BB，并且所述纖維蛋白密封膠具有 所需的PDGF釋放速率，該試劑盒包含，a)含有纖維蛋白原復(fù)合物組分的第一個小瓶或第一個儲存容器，以及b)具有凝血酶 組分的第二個小瓶或第二個儲存容器，其中小瓶任選包含PDGF組分，當(dāng)所述第二個小瓶或 第二個儲存容器不包含PDGF組分時，所述試劑盒任選包含具有PDGF組分的第三個小瓶或 第三個儲存容器，所述試劑盒還包含其使用說明書。
57. 含有血小板衍生生長因子(PDGF)蛋白的纖維蛋白密封膠在制造用于治療患有將 得益于血小板衍生生長因子(PDGF)蛋白原位受控釋放的病癥或疾病的患者的藥物中的應(yīng) 用，所述血小板衍生生長因子(PDGF)蛋白選自PDGF-AB和PDGF-BB，并且所述纖維蛋白密封 膠具有所需的PDGF釋放速率。
全文摘要
總的來說，本發(fā)明涉及含有血小板衍生生長因子(PDGF)的纖維蛋白密封膠，通過原位受控釋放用于治療性應(yīng)用，包括肌肉骨骼病癥、軟組織病癥和血管疾病。
文檔編號A61K38/18GK101772350SQ200880102160
公開日2010年7月7日 申請日期2008年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月19日
發(fā)明者萬達·塞頓, 伊莎貝爾·卡特拉斯, 約瑟夫·德懷爾, 薩姆·L·海爾格森, 謝恩·多諾萬 申請人:巴克斯特國際公司;巴克斯特醫(yī)療保健股份有限公司