專利名稱：：?jiǎn)捂淔C(ScFc)區(qū)、包含其的結(jié)合多肽及與其相關(guān)的方法單鏈FC(ScFc)區(qū)、包含其的結(jié)合多肽及與其相關(guān)的方法相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求2007年5月14日提交的題為“含有遺傳融合的FC區(qū)的結(jié)合多肽及與其的相關(guān)方法”的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60/930，227號(hào)、代理人案號(hào)BGN-A247-1的優(yōu)先權(quán)，其完整內(nèi)容通過(guò)引用并入此處。此外，本說(shuō)明書(shū)中引用的任何專利、專利申請(qǐng)和參考文獻(xiàn)的內(nèi)容以其完整內(nèi)容通過(guò)引用并入此處。
背景技術(shù)：
：免疫球蛋白的Fc區(qū)介導(dǎo)效應(yīng)子功能，這些功能被劃分成兩類。第一類是獨(dú)立于抗原結(jié)合而發(fā)生的功能；這些功能賦予在循環(huán)中的持久性和通過(guò)胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)作用跨細(xì)胞屏障轉(zhuǎn)移的能力(參見(jiàn)Ward和Ghetie，TherapeuticImmunology277-94,1995,Capon等人.Nature1989)。IgG亞類免疫球蛋白的循環(huán)半衰期由Fc區(qū)對(duì)新生Fc受體或FcRn的親和性調(diào)節(jié)(參見(jiàn)Ghetie等人，NatureBiotechnol.邊637_640，1997;Kim等人Eur.J.Immunol.24542-548,1994；Dall，Acqua等人.(J.Immunol.169:5171_5180,2002)。第二大類效應(yīng)子功能包括免疫球蛋白與抗原結(jié)合后運(yùn)轉(zhuǎn)的功能。在IgG的情況，這些功能涉及補(bǔ)體級(jí)聯(lián)或攜帶Fcγ受體(FeyR)的細(xì)胞的參與。Fc區(qū)對(duì)FcγR的結(jié)合導(dǎo)致某些免疫效應(yīng)，例如，免疫復(fù)合體的胞吞作用，吞入和破壞免疫球蛋白包被的顆?；蛭⑸?也稱為抗體依賴性吞噬作用或ADCP)，清除免疫復(fù)合體，殺傷細(xì)胞裂解免疫球蛋白包被的靶細(xì)胞(稱為抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性或ADCC)，釋放免疫介質(zhì)，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)細(xì)胞活化，并調(diào)節(jié)免疫球蛋白產(chǎn)生。某些工程化的結(jié)合多肽(如，抗體變體(如，scFv)或抗體片段(如，F(xiàn)ab片段))，雖然從其較小的分子尺寸和/或一價(jià)獲益，也因?yàn)椴淮嬖诠δ蹻c區(qū)而有多種缺陷。例如，F(xiàn)ab片段具有短的體內(nèi)半衰期，因?yàn)槠淙鄙俳Y(jié)合FcRn所需的Fc區(qū)，并因?yàn)槠湫〉某叽缍芸斓乇荒I臟從血液濾出。盡管可能產(chǎn)生一價(jià)、含有Fc的結(jié)合多肽，現(xiàn)有方法要求共表達(dá)二聚的Fc區(qū)的兩個(gè)重鏈部分或化學(xué)結(jié)合二聚的Fc區(qū)于結(jié)合位點(diǎn)(如，F(xiàn)ab結(jié)構(gòu)域)。這些方法是無(wú)效的，因?yàn)楣脖磉_(dá)產(chǎn)生的產(chǎn)物是復(fù)雜的混合物，代表包括聚集體和無(wú)活性蛋白的起始材料的所有可能的配對(duì)。因此，期望的功能結(jié)合多肽產(chǎn)率低。另外，使用現(xiàn)有技術(shù)方法不可能有效地產(chǎn)生具有異聚的Fc區(qū)的結(jié)合分子(即，其中二聚的Fc區(qū)的重鏈部分序列不同)。因此，需要含有Fc的結(jié)合多肽，其可有效地和強(qiáng)有力地產(chǎn)生并保持期望的Fc效應(yīng)子功能。發(fā)明概述除其它以外，本發(fā)明特征為包含一個(gè)或多個(gè)遺傳融合的Fc區(qū)的Fc多肽(如，F(xiàn)c結(jié)合多肽)。尤其是，本發(fā)明多肽包含單鏈Fc區(qū)(“scFc”)，其中組成性Fc部分在單個(gè)多肽鏈中遺傳融合以使形成功能性、二聚的Fc區(qū)。在某些實(shí)施方案中，scFc的組成性Fc部分經(jīng)由Fc部分之間的多肽接頭(如，F(xiàn)c連接肽)串聯(lián)遺傳融合。因此，本發(fā)明scFc多肽包含單個(gè)連續(xù)氨基酸序列形成的scFc區(qū)，該單個(gè)連續(xù)(contiguous)氨基酸序列在作為一個(gè)連續(xù)核苷酸序列部分的單個(gè)可讀框(ORF)中編碼。相反，常規(guī)Fc多肽(如，常規(guī)免疫球蛋白)的Fc區(qū)是專性同二聚體，包含分開(kāi)的多肽鏈中的分開(kāi)的(即，未連接的)Fc結(jié)構(gòu)域或部分，其在翻譯后二聚化但不是串聯(lián)地共價(jià)連接。本發(fā)明單鏈Fc(ScFc)多肽提供優(yōu)于常規(guī)Fc多肽的多種益處。在某些方面，scFc多肽的遺傳融合的Fc區(qū)(即，scFc區(qū))可以可操作地連接于結(jié)合多肽的結(jié)合位點(diǎn)(如，連接于抗原結(jié)合片段(如，F(xiàn)ab)或scFv分子)以形成scFc結(jié)合多肽，從而對(duì)結(jié)合多肽賦予效應(yīng)子功能或改變現(xiàn)有的效應(yīng)子功能。本發(fā)明scFc結(jié)合多肽可為單體或多聚的(如，二聚的)。本發(fā)明新穎的scFc結(jié)合多肽具有一價(jià)結(jié)合多肽的益處(如，缺少可導(dǎo)致錯(cuò)誤細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和/或胞吞作用的細(xì)胞表面受體交聯(lián))，至少在一個(gè)實(shí)施方案中還具有Fc-介導(dǎo)的效應(yīng)子功能的益處(如由于被FcRn結(jié)合而半衰期增加，賦予FcyRI.FcγRII和FcγRIII結(jié)合和補(bǔ)體活化)，在一個(gè)實(shí)施方案中還具有能夠細(xì)調(diào)這種效應(yīng)子功能的益處。而且，本發(fā)明scFc結(jié)合多肽可易于以易于放大規(guī)模高產(chǎn)率生產(chǎn)的高度同質(zhì)的制品表達(dá)。例如，包含一個(gè)或多個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)(如，抗原結(jié)合位點(diǎn)，諸如一個(gè)或多個(gè)scFv或Fab片段)的結(jié)合多肽可連接到遺傳融合的Fc區(qū)(S卩，scFc區(qū))的N-或C-末端之一或兩者，并在單個(gè)遺傳構(gòu)建體中編碼，從而避免共表達(dá)兩個(gè)或多個(gè)鏈造成的多個(gè)分子的復(fù)雜混合物。本發(fā)明scFc多肽還提供產(chǎn)生在高度同質(zhì)的制品中具有異聚的scFc區(qū)的分子的機(jī)會(huì)。目前很難產(chǎn)生和純化含有異聚Fc的分子，其中構(gòu)成常規(guī)Fc區(qū)的兩個(gè)Fc部分互相不同，例如其中兩個(gè)Fc部分只有一個(gè)包含氨基酸修飾(如，單個(gè)CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域中的單個(gè)點(diǎn)突變)。在本申請(qǐng)教導(dǎo)下，異聚的scFc結(jié)合多肽中少于全部的scFc區(qū)Fc部分包含突變時(shí)，這種多肽現(xiàn)在可易于從單個(gè)遺傳構(gòu)建體獲得。這種分子易于放大規(guī)模來(lái)制造。一方面，本發(fā)明涉及包含(i)第一靶結(jié)合位點(diǎn)，和(ii)包含至少兩個(gè)遺傳融合的Fc部分的第一單鏈Fc(SCFC)區(qū)域的scFc結(jié)合多肽，其中scFc區(qū)的Fc部分是經(jīng)由置于所述Fc部分之間的多肽接頭序列遺傳融合的；且其中該scFc區(qū)賦予所述結(jié)合多肽至少一種效應(yīng)子功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及包含scFc區(qū)的scFc結(jié)合多肽，其中所述scFc區(qū)包含選自FcRn結(jié)合部分、FcyR結(jié)合部分和補(bǔ)體結(jié)合部分組成的組的結(jié)構(gòu)域(如，效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該結(jié)構(gòu)域是蛋白A或蛋白G結(jié)合部分。在某些實(shí)施方案中，所述scFc區(qū)是異聚的scFc區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述異聚的Fc區(qū)是半糖基化的。在一個(gè)實(shí)施方案中，該scFc區(qū)是異聚的scFc區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該scFc區(qū)是同聚的scFc區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該scFc區(qū)是完全糖基化的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該scFc區(qū)是無(wú)糖基化的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述scFc區(qū)是無(wú)巖藻糖基化的(afucosylated)。在某一實(shí)施方案中，所述多肽的scFc區(qū)是嵌合Fc區(qū)。例如，該scFc區(qū)可包含多個(gè)來(lái)自IgG2分子的CH2結(jié)構(gòu)域和多個(gè)來(lái)自IgG4分子的CH3結(jié)構(gòu)域。在其它實(shí)施方案中，所述scFc區(qū)可包含來(lái)自IgG2分子的CH2部分和來(lái)自IgG4分子的CH2部分。在其他的實(shí)施方案中，該scFc可包含修飾的或嵌合鉸鏈區(qū)，如，包含來(lái)自IgG4分子的中部鉸鏈區(qū)和來(lái)自IgGl分子的上部和下部鉸鏈區(qū)的嵌合鉸鏈。在其它實(shí)施方案中，鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基取代。在一個(gè)實(shí)施方案中，該scFc區(qū)包含兩個(gè)或多個(gè)Fc結(jié)構(gòu)域或部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fc部分的一個(gè)或多個(gè)是選自缺失CH2結(jié)構(gòu)域的Fc部分、缺失CH3結(jié)構(gòu)域的Fc部分和缺失鉸鏈的Fc部分組成的組的缺失結(jié)構(gòu)域的Fc部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fc部分的至少一個(gè)在所述Fc部分中EU約定(convention)氨基酸位置包含至少一個(gè)Fc突變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fc部分的兩個(gè)或多個(gè)在所述Fc部分中EU約定氨基酸位置包含一個(gè)或多個(gè)Fc突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合分子的至少一個(gè)Fc部分中選自234、236、239、241、246-252、254-256、275、277-288、294、296-298、301、303-307、309、310、312、313、315、328、332、334、338、342、343、350、355、359、360、361、374、376、378、381-385、387、389、413、415、418、422、426、428、430-432、434、435、438和441-446(EU編號(hào)公約)組成的組的至少一個(gè)氨基酸位置被突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)Fc突變位于結(jié)合分子至少一個(gè)Fc部分的鉸鏈結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)Fc突變位于CH2結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)Fc突變位于CH3結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，該CH3結(jié)構(gòu)域在獨(dú)立地選自結(jié)合分子的至少一個(gè)Fc部分的根據(jù)EU編號(hào)索引的350、355、361、389、415、441、443和446b組成的組的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置包含工程化的半胱氨酸或其含硫醇(thiol)的類似物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子在至少一個(gè)Fc部分的EU位置297具有減少的糖基化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該結(jié)合多肽在EU位置297是無(wú)巖藻糖基化的。在一個(gè)實(shí)施方案中，該多肽接頭的長(zhǎng)度是約50至約500個(gè)氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該多肽接頭的長(zhǎng)度是約50至約200個(gè)氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該多肽接頭的長(zhǎng)度是約1至約50個(gè)氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該多肽接頭的長(zhǎng)度是約10至約20個(gè)氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，該多肽接頭包含鉸鏈區(qū)或其部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，該鉸鏈區(qū)是嵌合鉸鏈區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該多肽接頭包含gly/ser肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，該gly/ser肽具有式(Gly4Ser)n，其中η是選自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10組成的組的正整數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該(Gly4Ser)nscFc接頭是(Gly4Ser)40在另一個(gè)實(shí)施方案中，該(Gly4Ser)ηscFc接頭是(Gly4Ser)30在一個(gè)實(shí)施方案中，該多肽接頭包含所述第一靶結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該多肽接頭包含生物學(xué)相關(guān)的肽或其部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，該生物學(xué)相關(guān)的多肽是抗排斥或抗炎肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該生物學(xué)相關(guān)的多肽選自細(xì)胞因子抑制肽、細(xì)胞粘附抑制肽、凝血酶抑制肽和血小板抑制肽組成的組。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)胞因子抑制肽是IL-I抑制肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，該第一結(jié)合位點(diǎn)遺傳融合于scFc區(qū)的N-末端。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該第一結(jié)合位點(diǎn)遺傳融合于scFc區(qū)的C-末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子還包含第二靶結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該第二靶結(jié)合位點(diǎn)可操作地連接于scFc區(qū)的N-末端。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該第二靶結(jié)合位點(diǎn)可操作地連接于scFc區(qū)的C-末端。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該結(jié)合位點(diǎn)貼(veneeronto)在scFc區(qū)的Fc部分(如，1、2或更多CH2結(jié)構(gòu)域和/或1、2或更多CH3結(jié)構(gòu)域)上。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)選自抗原結(jié)合位點(diǎn)、受體的配體結(jié)合部分和配體的受體結(jié)合部分組成的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗原結(jié)合位點(diǎn)衍生自抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體選自單克隆抗體、嵌合抗體、人類抗體和人源化抗體組成的組。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗原結(jié)合位點(diǎn)衍生自選自scFv、Fab、微型抗體(minibody)、雙鏈抗體(diabody)、三鏈抗體(triabody)、納米抗體(nanobody)、駱駝抗體(camelid)和Dab組成的組的抗體變體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該結(jié)合位點(diǎn)衍生自非免疫球蛋白的結(jié)合分子，如，非免疫球蛋白的結(jié)合分子選自adnectin、親和體(affibody)、DARPin和抗運(yùn)載蛋白(anticalin)組成的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含包括來(lái)自選自利妥昔單抗(Rituximab)、達(dá)克珠單抗(Daclizumab)、加利昔單抗(Galiximab)、CB6、Li33、5c8、CBElUBDA8、14A2、B3F6、2B8、LymULym2、LL2、Her2、5E8、Bi、MB1、BH3、B4、B72.3、CC49和5E10組成的組的抗體的至少一個(gè)CDR、可變區(qū)、或抗原結(jié)合位點(diǎn)的至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，受體的配體結(jié)合部分衍生自選自免疫球蛋白(Ig)超家族的受體、TNF受體超家族的受體、G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)超家族的受體、酪氨酸激酶(TK)受體超家族的受體、配體門(mén)控(ligand-gated，LG)超家族的受體、趨化因子受體超家族的受體、IL-1/Toll樣受體(TLR)超家族、神經(jīng)膠質(zhì)衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(⑶NF)受體家族的受體和細(xì)胞因子受體超家族組成的組的受體。在一個(gè)實(shí)施方案中，TNF受體超家族的所述受體是LTi3R。在另一個(gè)實(shí)施方案中，TNF受體超家族的所述受體結(jié)合TNFα。在另一個(gè)實(shí)施方案中，⑶NF受體家族的所述受體是GFRα3。在一個(gè)實(shí)施方案中，配體的受體結(jié)合部分衍生自抑制配體。在一個(gè)實(shí)施方案中，配體的受體結(jié)合部分衍生自活化配體。在一個(gè)實(shí)施方案中，該配體結(jié)合選自免疫球蛋白(Ig)超家族的受體、TNF受體超家族的受體、G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)超家族的受體、酪氨酸激酶(TK)受體超家族的受體、配體門(mén)控(LG)超家族的受體、趨化因子受體超家族的受體、IL-I/Toll樣受體(TLR)超家族和細(xì)胞因子受體超家族組成的組的受體。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合細(xì)胞因子受體超家族的受體的配體是β-干擾素。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二靶結(jié)合位點(diǎn)具有不同的結(jié)合特異性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二靶結(jié)合位點(diǎn)具有相同的結(jié)合特異性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子還包含兩個(gè)或多個(gè)scFc區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子結(jié)合于至少一個(gè)功能性部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，該功能性部分選自封閉部分、可檢測(cè)部分、診斷部分和治療部分組成的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，該封閉部分選自半胱氨酸加合物(cysteineadduct)、混合的二硫化物(mixeddisulfide)、聚乙二醇和聚乙二醇馬來(lái)酰亞胺組成的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，該可檢測(cè)部分選自熒光部分和同位素部分組成的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，該診斷部分能夠揭示疾病或病癥的存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，該治療部分選自抗炎劑、抗癌劑、抗神經(jīng)變性劑和抗傳染劑(anti-infectiveagent)組@白勺組。在一個(gè)實(shí)施方案中，該功能性部分結(jié)合于所述多肽接頭。在一個(gè)實(shí)施方案中，該功能性部分是經(jīng)由二硫鍵結(jié)合的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該功能性部分是經(jīng)由異雙官能接頭結(jié)合的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明scFc結(jié)合多肽和第二多肽的多聚的結(jié)合多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二多肽是結(jié)合多肽(如，scFc結(jié)合多肽)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二結(jié)合多肽包含(i)至少第一抗原結(jié)合部分，和(ii)至少第一scFc區(qū)，其中所述scFc區(qū)包含至少兩個(gè)Fc部分，且其中所述scFc區(qū)賦予所述結(jié)合多肽至少一種效應(yīng)子功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二結(jié)合多肽的scFc區(qū)包含scFc區(qū)的兩個(gè)Fc部分之間的接頭多肽(如，F(xiàn)c連接多肽)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該多聚的結(jié)合多肽是二聚的結(jié)合多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子的第一或第二結(jié)合部分結(jié)合于免疫細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞上存在的抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子的至少一個(gè)Fc部分屬于IgG同種型。在一個(gè)實(shí)施方案中，該IgG同種型屬于IgGl亞類。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子的至少一個(gè)Fc部分衍生自人類抗體。一方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明結(jié)合分子的藥物組合物。另一方面，本發(fā)明涉及包含編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，該核酸分子是在表達(dá)載體中。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含含有本發(fā)明核酸分子的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生結(jié)合多肽的方法，包括培養(yǎng)宿主細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明涉及治療或預(yù)防受治療者的疾病或病癥的方法，包括施用本發(fā)明結(jié)合分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，該疾病或病癥選自炎性病癥、神經(jīng)病癥、自身免疫病癥和腫瘤病癥組成的組。附圖簡(jiǎn)述圖IA-D是示例性本發(fā)明scFc結(jié)合多肽的示意圖。結(jié)合多肽包含抗原結(jié)合位點(diǎn)(如Fab區(qū))，其(通過(guò)例如人類IgGl鉸鏈)連接于遺傳融合的Fc區(qū)(即，單鏈Fc或“scFc”區(qū))，所述Fc區(qū)包含經(jīng)由多肽接頭連接的兩個(gè)Fc部分(圖1A)。Fab區(qū)、人類IgGl鉸鏈和scFc區(qū)都在單個(gè)連續(xù)基因或遺傳構(gòu)建體中編碼。表達(dá)該構(gòu)建體可產(chǎn)生scFc結(jié)合多肽的二聚形式(“dc”;圖1B)或單體(“sc”;圖1C)形式。包含單體scFc的重和輕鏈的結(jié)構(gòu)域組織描述于圖ID。圖2A-D顯示分離單體(“sc”)和二聚形式(“dc”)的scFc結(jié)合多肽的兩步驟純化方法的結(jié)果。純化方法采用親合層析隨后是凝膠過(guò)濾層析。圖2A顯示從蛋白A親合柱在低PH洗脫的級(jí)分的吸收譜。圖2B顯示在非還原條件下，包含二聚的(“dc”)和單體(“sc”)形式的結(jié)合多肽的那些洗脫級(jí)分的相應(yīng)的SDSPAGE分析。單體和二聚的形式兩者基本上以單峰形式從蛋白A柱洗脫。圖2C顯示在Superdex200凝膠過(guò)濾柱上對(duì)匯集的蛋白A洗脫液進(jìn)行大小排阻層析，將該混合物分離為兩個(gè)不同的峰。圖2D顯示凝膠過(guò)濾級(jí)分相應(yīng)的非還原SDSPAGE分析。峰分別代表純化的單體(“sc”)和二聚(“dc”)形式。圖3顯示在非還原(組A)和還原(組B)條件下以制備規(guī)模純化的二聚(“dc”)和單體(“Sc”)形式的scFc結(jié)合多肽的SDS-PAGE。各圖中，泳道1和2分別包含二聚形式("ds";205kDa)和單體(“SC”;105kDa)形式。泳道3包含對(duì)照人類IgGl抗體(Hu5c8；150kDa)。圖4A-B表征單體(sc)或二聚的(dc)scFc多肽結(jié)合于同三聚的sh⑶40L抗原的復(fù)合體。圖4A顯示從SEC-LS實(shí)驗(yàn)獲得的大小排阻層析的合成圖，進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)以確定各單獨(dú)成分和形成的各自復(fù)合體的分子量。在圖4B中，基于以SEC-LS獲得的單獨(dú)質(zhì)量、和復(fù)合體各自的計(jì)算分子量，預(yù)測(cè)因單體(i)或二聚化(ii)scFc多肽分別結(jié)合于shCD40L后形成的復(fù)合體。圖5顯示在單體(“sc”)scFc多肽或常規(guī)人類IgGl抗-CD40LmAbhu5C8存在下形成的含有shCD40L的復(fù)合體的洗脫譜合成圖。由在線LS確定分子量并標(biāo)在對(duì)復(fù)合體獲得的各峰上方。分別對(duì)單體scFc(“sc”)、5C8IgGl和shCD40L確定分子量是101.5kDa、150kDa和51kDa。圖6顯示ELISA結(jié)合測(cè)定的結(jié)果，比較單體scFc(sc)、二聚的scFc(dc)和常規(guī)人類IgGl抗-⑶40L抗體(Hu5C8)對(duì)包被在板上的抗原sh⑶40L的表觀結(jié)合親和性。一價(jià)scFc具有比WTmAb弱大約2倍的EC50，所述WTmAb由于其二價(jià)地結(jié)合配體的能力而具有顯著的親和力優(yōu)勢(shì)。圖7A顯示ELISA結(jié)合測(cè)定的結(jié)果，比較二聚的(“dc”)和單體(“sc”)形式的scFc結(jié)合多肽與常規(guī)IgGl抗體(Hu5C8)的表觀FcRn結(jié)合親和性。使用生物素化人和大鼠FcRn-Fc融合構(gòu)建體兩者確定FcRn結(jié)合。該測(cè)定中，降每一種含有Fc的構(gòu)建體包被在板上，以鏈霉抗生物素蛋白HRP檢測(cè)生物素化的大鼠或人類FcRn-Fc構(gòu)建體的結(jié)合。經(jīng)測(cè)定，人類FcRn-Fc(不是大鼠FcRn-Fc)結(jié)合于單體scFc多肽(“sc”)的c_值比Hu5C8或二聚的(“dc”)SCFC多肽的低3至4倍。圖7B顯示大鼠FcRn-Fc(“rFcRn-Fc”)、半糖基化的(“hemiglyscFc”)和完全糖基化的("fullyglyscFc”)5c8scFc以及將大鼠FcRn-Fc與所述scFc混合后形成的復(fù)合體的分析性SEC洗脫譜。用光散射分析確定各個(gè)峰中包含的單獨(dú)成分和復(fù)合體各自的分子量。對(duì)獲得的復(fù)合體確定的質(zhì)量表明，各scFc上的兩個(gè)FcRn結(jié)合位點(diǎn)是功能性的，預(yù)測(cè)它們形成如所示的包含2FCRnFC:2scFc的復(fù)合體。圖8描繪包含由接頭區(qū)串聯(lián)連接的兩個(gè)Fc部分的示例性單體形式(sc)的scFc結(jié)合多肽的分子模型。該模型提供異聚的scFc區(qū)的實(shí)例。scFc結(jié)合多肽包含在一個(gè)Fc部分(“Fe部分#2，，)造成去糖基化并在第二Fc部分(“Fe部分#1，，)的CH2結(jié)構(gòu)域造成糖基化(“糖#1”)的單個(gè)位點(diǎn)特異性Fc突變。圖9是分辨率為3人的scFc晶體結(jié)構(gòu)的前視圖和側(cè)視圖。獲得不存在F(ab)結(jié)構(gòu)域的scFc區(qū)的晶體。scFc顯示為疊加在巖藻糖基化的IgGlFc(pdb編碼2DTQ；黑色)上的灰色。重疊表示對(duì)417(1-碳原子偏移0.489々rmsd，這基本上是相同的骨架構(gòu)象。僅有的顯著差異是，scFc包括部分有序的(partiallyordered)鉸鏈區(qū)和在一半scFc包含不存在于巖藻糖基化的IgGlFc結(jié)構(gòu)的另外的半乳糖。對(duì)scFc結(jié)構(gòu)解析至3.0A分辨率，Rfree為35%，R因子為25%。圖10描繪使用本發(fā)明scFc多肽篩選雙特異性抗體功能時(shí)的益處。scFc區(qū)阻止結(jié)合結(jié)構(gòu)域的不希望的異質(zhì)組合。這種異質(zhì)性將造成為篩選雙特異性抗體獨(dú)特活性設(shè)計(jì)的復(fù)雜測(cè)定?！奥窂?”是異質(zhì)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域組合的實(shí)例，其通常在以下三個(gè)基因在真核體系中共表達(dá)以形成雙特異性抗體時(shí)發(fā)生㈧融合于Fc結(jié)構(gòu)域N-末端的單鏈F(ac)、scF(ab)；(B)融合于Fc的CH3的C-末端的F(ab)片段；(C)包含CL和VL結(jié)構(gòu)域的輕鏈。“路徑2”描繪通過(guò)置于其間的接頭序列將(A)和(B)融合成單個(gè)連續(xù)的遺傳構(gòu)建體如何造成兩個(gè)Fc部分遺傳融合以形成scFc多肽(D)的實(shí)例。共表達(dá)(C)和(D)造成同質(zhì)表達(dá)單個(gè)雙特異性HlAb。圖IlA-I是本發(fā)明示例性scFc結(jié)合多肽的圖解。圖IlA是在N-末端包含結(jié)合位點(diǎn)的scFc結(jié)合多肽的圖解。圖IlB是在C-末端包含結(jié)合位點(diǎn)的scFc結(jié)合多肽的圖解。圖IlC是在N-末端CH2-CH3域間區(qū)(interdomainregion)包含結(jié)合位點(diǎn)的scFc結(jié)合多肽的圖解。圖IlD是在C-末端CH2-CH3域間區(qū)包含結(jié)合位點(diǎn)的scFc結(jié)合多肽的圖解。圖IlE是在接頭多肽中包含結(jié)合位點(diǎn)的scFc結(jié)合多肽的圖解。圖IlF是包含貼在N-末端CH2結(jié)構(gòu)域上的結(jié)合位點(diǎn)的scFc結(jié)合多肽的圖解。圖IlG是包含貼在N-末端CH3結(jié)構(gòu)域上的結(jié)合位點(diǎn)的scFc結(jié)合多肽的圖解。圖IOH是包含貼在C-末端CH2結(jié)構(gòu)域上的結(jié)合位點(diǎn)的scFc結(jié)合多肽的圖解。圖IlI是包含貼在C-末端CH3結(jié)構(gòu)域上的結(jié)合位點(diǎn)的scFc結(jié)合多肽的圖解。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明scFc結(jié)合多肽可包含描述于圖IlA-I的特征的任意組合。圖12比較含有2種不同長(zhǎng)度G4S接頭(lxG4S相比于3xG4S，即，5相比于15個(gè)氨基酸)的scFc的蛋白表達(dá)譜。發(fā)現(xiàn)接頭長(zhǎng)度與scFc產(chǎn)率正相關(guān)，以致從包含更長(zhǎng)接頭的構(gòu)建體表達(dá)蛋白時(shí)，scFc產(chǎn)量比dcFc多。圖13描繪在大鼠中2周時(shí)間段內(nèi)測(cè)量的lxG4S和3xG4S連接的scFc多肽相對(duì)于野生型人類IgGl抗體(hu5c8)的血清濃度。3xG4SscFc具有長(zhǎng)的β-相半衰期(12天)，與WTIgGl(14天)相似。圖14Α和B描繪進(jìn)行Alphascreen測(cè)定以評(píng)價(jià)scFc多肽的FcγR結(jié)合活性的結(jié)果。顯示半糖基化的和完全糖基化的5C8SCFC對(duì)人類和獼猴Fcγ受體的結(jié)合與野生型(WT)和無(wú)糖基化的5c8IgGl的比較。scFc和WTIgGl對(duì)這些受體的體外結(jié)合表現(xiàn)非常相似，說(shuō)明scFc應(yīng)同樣能夠體內(nèi)接合Fcg受體。圖15顯示3xG4S連接的半糖基化的scFc在PNGaseF處理(以去糖基化)之前和之后的去卷積質(zhì)譜(deconvolutedmassspectra)。得到scFc輕鏈在去糖基化之前(圖15A)和之后(圖15B)的質(zhì)譜。對(duì)去糖基化的輕鏈確定的質(zhì)量是23，854Da。圖15C和D描繪去糖基化之前(圖15C)和之后(圖15D)scFc重鏈的質(zhì)譜。對(duì)去糖基化的scFc重鏈確定的質(zhì)量是75，703Da。圖16顯示由差示掃描量熱法(DSC)測(cè)量的，scFc分子與WThulgGImAb和Fc相比的熱穩(wěn)定性。完全糖基化的scFc(ASK048)的CH2結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性類似于WTIgGl0半糖基化的scFc具有略低的穩(wěn)定性，很可能歸因?yàn)橛傻诙﨔c部分的無(wú)糖基化的CH2造成的結(jié)構(gòu)域柔性增加。圖17描繪(G4S)1_連接的半糖基化的5C8scFcIgGl抗體構(gòu)建體的重鏈氨基酸序列(PEAG2066;SEQIDN0:1)。構(gòu)建體具有VH-CHl-鉸鏈結(jié)構(gòu)域-CH2(1)-CH3(1)-G4S接頭-鉸鏈結(jié)構(gòu)域-CH2(2)-CH3(2)的通式結(jié)構(gòu)，盡管第一個(gè)更N-末端的Fc部分(殘基222-447，SEQIDNO2)的糖基化模式是野生型，第二個(gè)更C-末端的Fc部分(殘基458-683，SEQIDNO3)包含氨基酸取代(T299A，EU編號(hào))，產(chǎn)生無(wú)糖基化的Fe。此外，該scFc在鉸鏈結(jié)構(gòu)域中包含C220S取代(EU編號(hào))。T299A和C220S突變的位置以粗體表示。在序列中，鉸鏈結(jié)構(gòu)域是斜體，CHl和CH3恒定結(jié)構(gòu)域加下劃線。圖18描繪對(duì)應(yīng)于圖17中pEAG2066重鏈序列的核苷酸序列(SEQIDNO4)?？贵w信號(hào)序列加下劃線。圖19A描繪示例性5C8抗體構(gòu)建體的輕鏈氨基酸序列(pEAG2027；SEQIDNO5)。圖19B描繪相應(yīng)的核苷酸序列(SEQIDNO:6)?？贵w信號(hào)序列加下劃線。圖20描繪包含同聚的scFc區(qū)的示例性完全糖基化的、lxG4S_連接的5C8IgGlscFc抗體構(gòu)建體的重鏈氨基酸序列(pEAG2146；SEQIDNO:7)，其中N-末端(殘基22-447)和C-末端(殘基458-683)Fc部分兩者都是糖基化的。構(gòu)建體的組成性Fc部分如圖17中的注解。圖21描繪對(duì)應(yīng)于圖17中pEAG2146重鏈序列的核苷酸序列(SEQIDNO8)?？贵w信號(hào)序列加下劃線。圖22描繪包含半糖基化的、lxG4S_連接的scFc區(qū)的示例性scFchu5C8IgGl抗體構(gòu)建體的重鏈氨基酸序列(PEAG2147;SEQIDNO:9)，其中第二個(gè)更C-末端的Fc部分(殘基458-683；SEQIDNO:10)包含改變的鉸鏈結(jié)構(gòu)域(GSEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGPSVFLF,SEQIDNO:11)，其中鉸鏈半胱氨酸殘基已被絲氨酸取代。序列如圖17中的注解。圖23描繪對(duì)應(yīng)于圖22中pEAG2147重鏈序列的核苷酸序列(SEQIDNO12)。抗體信號(hào)序列加下劃線。圖24描繪在人類IgGlmAb5C8中包含半糖基化的、(G4S)3連接的scFc區(qū)的示例性scFc抗體構(gòu)建體的重鏈氨基酸序列(pASK043;SEQIDNO:13)。構(gòu)建體的組成結(jié)構(gòu)域在圖中以各自的序列標(biāo)識(shí)符注解。圖25描繪對(duì)應(yīng)于圖24中pASK043重鏈序列的核苷酸序列(SEQIDNO14)。抗體信號(hào)序列加下劃線。圖26描繪包含完全糖基化的、(G4S)3連接的scFc區(qū)的示例性scFc5C8IgGl抗體構(gòu)建體的重鏈氨基酸序列(ASK048;SEQIDNO15)，其中兩個(gè)Fc部分都是糖基化的。構(gòu)建體的組成結(jié)構(gòu)域在圖中以各自的序列標(biāo)識(shí)符注解。圖27描繪對(duì)應(yīng)于圖26中ASK048重鏈序列的核苷酸序列(SEQIDNO16)?？贵w信號(hào)序列加下劃線。圖28描繪包含無(wú)糖基化的、(G4S)3連接的scFc區(qū)的示例性scFc5C8IgGl抗體構(gòu)建體的重鏈氨基酸序列(ASK052;SEQIDN0:17)。構(gòu)建體的組成結(jié)構(gòu)域在圖中以各自的序列標(biāo)識(shí)符注解。圖29描繪對(duì)應(yīng)于圖29中ASK052重鏈序列的核苷酸序列(SEQIDNO18)。抗體信號(hào)序列加下劃線。圖30描繪包含無(wú)糖基化的、(G4S)！連接的scFc區(qū)的示例性scFc5C8IgGl抗體構(gòu)建體的重鏈氨基酸序列(PASK053;SEQIDN0:19)。構(gòu)建體的組成結(jié)構(gòu)域在圖中以各自的序列標(biāo)識(shí)符注解。圖31描繪對(duì)應(yīng)于圖30中pASK053重鏈序列的核苷酸序列(SEQIDNO20)。抗體信號(hào)序列加下劃線。圖32描繪在人類抗-LINGOIgGlmAbLi33中包含半糖基化的、lxG4S_連接的scFc區(qū)的示例性抗-LINGOscFc抗體構(gòu)建體的重鏈氨基酸序列(pEAG2148;SEQIDNO:21)。盡管第一個(gè)更N-末端的Fc部分(殘基223-448)的糖基化模式是野生型，第二個(gè)更C-末端的Fc部分(殘基549-684)包含氨基酸取代，產(chǎn)生無(wú)糖基化的Fe。構(gòu)建體的組成結(jié)構(gòu)域如圖17中的注解。圖33描繪對(duì)應(yīng)于圖32中pEAG2148重鏈序列的核苷酸序列(SEQIDNO22)。抗體信號(hào)序列加下劃線。圖34A描繪示例性Li33scFc抗體構(gòu)建體的輕鏈氨基酸序列(pXW435；SEQIDNO23)。圖34B描繪相應(yīng)的核苷酸序列(SEQIDNO:24)。抗體信號(hào)序列加下劃線。圖35描繪在人類抗-LINGOIgGlmAbLi33中包含無(wú)糖基化的、3xG4S_連接的scFc區(qū)的示例性抗-LINGOscFc抗體構(gòu)建體的重鏈氨基酸序列(ASK050;SEQIDNO:25)。圖36描繪對(duì)應(yīng)于圖35中ASK050重鏈序列的核苷酸序列(SEQIDNO26)?？贵w信號(hào)序列加下劃線。圖37描繪在人類抗-LINGOIgGlmAbLi33中包含無(wú)糖基化的、lxG4S_連接的scFc區(qū)的示例性抗-LINGOscFc抗體構(gòu)建體的重鏈氨基酸序列(ASK051；SEQIDNO:27)。圖38描繪對(duì)應(yīng)于圖37中ASK051重鏈序列的核苷酸序列(SEQIDNO28)。抗體信號(hào)序列加下劃線。圖39顯示抗-LINGO的scFc抗體分子(EAG2148)的改進(jìn)的蛋白濃度依賴性溶解度特征。圖40A描繪在抗-⑶2嵌合IgGImAbCB6中包含完全糖基化的、3xG4S_連接的scFc區(qū)的示例性抗-CD2嵌合CB6scFcIgGl抗體構(gòu)建體的重鏈氨基酸序列(ASK058;SEQIDNO29)ο圖40B描繪CB6scFcIgGl抗體構(gòu)建體的輕鏈氨基酸序列(EAG2276；SEQIDNO56)。圖41描繪對(duì)應(yīng)于圖40中ASK058重鏈序列的核苷酸序列(SEQIDNO30)?？贵w信號(hào)序列加下劃線。圖41b描繪對(duì)應(yīng)于圖40B中EAG2276重鏈序列的核苷酸序列(SEQIDNO)。圖42描繪在抗-CD2嵌合IgGlmAbCB6中包含完全糖基化的、4xG4S_連接的scFc區(qū)的示例性抗-⑶2嵌合CB6scFcIgGl抗體構(gòu)建體的重鏈氨基酸序列(ASK062;SEQIDNO31)。圖43描繪對(duì)應(yīng)于圖42中ASK062重鏈序列的核苷酸序列(SEQIDNO32)?？贵w信號(hào)序列加下劃線。圖44描繪在抗-CD2嵌合IgGlmAbCB6中包含完全糖基化的、5xG4S_連接的scFc區(qū)的示例性抗-⑶2嵌合CB6scFcIgGl抗體構(gòu)建體的重鏈氨基酸序列(ASK063;SEQIDNO33)。圖45描繪對(duì)應(yīng)于圖44中ASK063重鏈序列的核苷酸序列(SEQIDNO34)?？贵w信號(hào)序列加下劃線。圖46描繪在抗-CD2嵌合IgGlmAbCB6中包含完全糖基化的、6xG4S_連接的scFc區(qū)的示例性抗-⑶2嵌合CB6scFcIgGl抗體構(gòu)建體的重鏈氨基酸序列(ASK064;SEQIDNO35)。圖47描繪對(duì)應(yīng)于圖46中ASK064重鏈序列的核苷酸序列(SEQIDNO36)?？贵w信號(hào)序列加下劃線。圖48描繪包含(645)3_連接的、完全糖基化的、融合于11卯131￡1計(jì)^1受體61^3胞外結(jié)構(gòu)域的scFc區(qū)的示例性GFRα3免疫粘附素蛋白的氨基酸序列(ASK-057；SEQIDNO37)。圖49描繪對(duì)應(yīng)于圖48中ASK-057氨基酸序列的核苷酸序列(SEQIDNO38)。信號(hào)序列加下劃線。圖50顯示非還原SDS-PAGE和分析性SEC-LS表征2_步驟純化后獲得的GFRα3scFc融合蛋白。圖51描繪包含半糖基化的、1XG4S-連接的融合于干擾素-β的scFc區(qū)(殘基1-67)的示例性干擾素-β免疫粘附素構(gòu)建體的氨基酸序列(PEAG2149；SEQIDNO:39)。盡管第一個(gè)更N-末端的Fc部分(殘基168-393)的糖基化模式是野生型，第二個(gè)更C-末端的Fc部分(殘基404-629)包含氨基酸取代，產(chǎn)生無(wú)糖基化的Fe。構(gòu)建體的組成結(jié)構(gòu)域如圖17中的注解。圖52描繪對(duì)應(yīng)于圖52中PEAG2149序列的核苷酸序列(SEQIDNO40)。信號(hào)序列加下劃線。圖53描繪包含半糖基化的、3xG4S_連接的融合于LTβR的scFc區(qū)的示例性LTβR免疫粘附素構(gòu)建體的氨基酸序列(EAG2190；SEQIDNO41)。圖54描繪對(duì)應(yīng)于圖54中EAG2190的序列的核苷酸序列(SEQIDNO42)。信號(hào)序列加下劃線。圖55描繪包含半糖基化的、3xG4S_連接的融合于LTβR的scFc區(qū)的示例性LTβR免疫粘附素構(gòu)建體的氨基酸序列(EAG2191；SEQIDNO43)。圖56描繪對(duì)應(yīng)于圖56中EAG2191的序列的核苷酸序列(SEQIDNO44)。信號(hào)序列加下劃線。圖57描繪LTβR:scFc融合多肽(EAG2190)的SDS-PAGE(圖58A)和分析性凝膠過(guò)濾(圖58B)。圖58A的泳道1和2是非還原的并分別包含1和2ug蛋白，而泳道4和5包含還原劑和分別2和Iug的LI33scFc.泳道3包含分子量標(biāo)準(zhǔn)，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量如所示的。圖58描繪N-去糖基化的還原的LTβR:scFc的質(zhì)譜測(cè)定(MS)。圖59描繪評(píng)價(jià)單體LTβRscFc對(duì)LTalb2的結(jié)合親和性的ELISA(圖59A)和FACS分析(圖59B)結(jié)果。圖60描繪本發(fā)明示例性半糖基化的、lxG4S_連接的scFc區(qū)(EAG2181)的氨基酸序列(圖60A；SEQIDNO45)和核苷酸序列(圖60B；SEQIDNO46)。所述scFc區(qū)的N禾口/或C-末端可融合于任何本領(lǐng)域公認(rèn)的結(jié)合位點(diǎn)。圖61描繪本發(fā)明示例性完全糖基化的、3xG4S_連接的scFc區(qū)(ASK054)的氨基酸序列(圖6IA；SEQIDNO47)和核苷酸序列(圖61B；SEQIDNO48)。所述scFc區(qū)的N和/或C-末端可融合于任何本領(lǐng)域公認(rèn)的結(jié)合位點(diǎn)。圖62描繪本發(fā)明示例性完全糖基化的、lxG4S_連接的scFc區(qū)(ASK055)的氨基酸序列(圖62A；SEQIDNO49)和核苷酸序列(圖62B；SEQIDNO50)。所述scFc區(qū)的N和/或C-末端可融合于任何本領(lǐng)域公認(rèn)的結(jié)合位點(diǎn)。圖63描繪示例性抗-LTβR抗體(BDA8)的重鏈(ASK016)的氨基酸序列(圖63Α；SEQIDΝ0:51)和核苷酸序列(圖63Β；SEQIDNO52)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明scFc結(jié)合多肽包含BDA8的結(jié)合位點(diǎn)。圖64描繪FDA-批準(zhǔn)的抗體或其它抗體的列表。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明scFc結(jié)合多肽可包含衍生自這些抗體中一種抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)。發(fā)明詳述本發(fā)明通過(guò)提供例如結(jié)合多肽而推動(dòng)本領(lǐng)域，所述結(jié)合多肽包含例如(i)至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)或結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和(ii)至少一個(gè)遺傳融合的Fc區(qū)(即，單鏈FC(“SCFC”)區(qū))。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，scFc區(qū)包含經(jīng)由置于Fc部分之間的接頭多肽(如，F(xiàn)c連接肽)遺傳融合的至少兩個(gè)Fc部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合位點(diǎn)可包含抗體分子的抗原結(jié)合片段(如，F(xiàn)(ab)或scFv)，其融合(如，經(jīng)由Fab或scFv的VH或VL)于scFc區(qū)的N-和C-末端之一或兩者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合結(jié)構(gòu)域可包含融合于遺傳融合的Fc區(qū)的N-和C-末端之一或兩者的受體融合蛋白。這種融合可C-末端地或N-末端地融合于期望的結(jié)合位點(diǎn)。從單個(gè)連續(xù)遺傳構(gòu)建體表達(dá)本發(fā)明結(jié)合多肽具有超出常規(guī)蛋白表達(dá)方法的多種益處，常規(guī)蛋白表達(dá)方法包括共表達(dá)兩個(gè)基因，一個(gè)表達(dá)第一Fc結(jié)構(gòu)域，分開(kāi)的第二基因由融合于第二Fc結(jié)構(gòu)域、以二硫鍵連接兩個(gè)多肽鏈的結(jié)合位點(diǎn)組成。這種常規(guī)構(gòu)建體的問(wèn)題包括所得分子群體中顯著的異質(zhì)性，以使期望的分子必須與不期望的分子純化分離，從而造成期望的分子總產(chǎn)率下降。本發(fā)明多肽與采用傳統(tǒng)Fc區(qū)或缺少這種區(qū)的其它分子相比的益處在以下討論，使用抗體分子或示例性其片段來(lái)示例通過(guò)表達(dá)融合于scFc的結(jié)合結(jié)構(gòu)域避免雜化(scrambling)難以構(gòu)建具有僅一個(gè)F(ab)臂的抗體、或具有僅一個(gè)融合的功能多肽的Fc融合蛋白?，F(xiàn)有方法要求共表達(dá)兩個(gè)基因一個(gè)編碼包含第一Fc部分(Fcl如，VH、CH1、鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域)的Ab的一條重鏈，第二基因編碼第二Fc部分(Fc2如，鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域)以獲得期望的分子。共表達(dá)造成分子的不期望地復(fù)雜的混合物，預(yù)測(cè)為Fcl+FclFcl+Fc2Fc2+Fc2的1:2:1混合物，但比例可與該理論預(yù)測(cè)大大不同，造成期望蛋白的次優(yōu)產(chǎn)率。以連接于常規(guī)、二聚的Fc的單個(gè)融合分子表達(dá)一價(jià)融合蛋白可尤其重要地阻止當(dāng)兩個(gè)相同分子接近地折疊時(shí)可發(fā)生的不恰當(dāng)折疊事件。這些錯(cuò)誤折疊的Fc融合蛋白難以與正確折疊的二價(jià)Fc蛋白分開(kāi)，因?yàn)閮烧咧g僅有的區(qū)別通常是異源的錯(cuò)折疊事件。本發(fā)明的scFc融合蛋白不會(huì)經(jīng)歷蛋白結(jié)構(gòu)域雜化，因?yàn)樵摌?gòu)建在折疊過(guò)程期間不將分子彼此接近地固定。通過(guò)增加FcRn結(jié)合來(lái)延長(zhǎng)抗體片段(如，F(xiàn)(ab))的半衰期通常期望抗體片段(如，F(xiàn)(ab))的治療應(yīng)用，因?yàn)槠淠軌蚍忾]細(xì)胞表面受體而無(wú)靶受體交聯(lián)，因此沒(méi)有隨后的不期望的信號(hào)傳導(dǎo)，諸如當(dāng)受體被二價(jià)抗體接合時(shí)可發(fā)生信號(hào)傳導(dǎo)。表面受體的這種交聯(lián)可導(dǎo)致受體聚集并下調(diào)細(xì)胞表面的靶受體。F(ab)構(gòu)建體基本上是一價(jià)，因此不會(huì)導(dǎo)致受體交聯(lián)或聚集。體內(nèi)應(yīng)用抗體片段諸如F(ab)的一個(gè)顯著缺點(diǎn)是，其血清持久性或半衰期差。向F(ab)片段加入Fc區(qū)造成類似完整mAb的藥代動(dòng)力學(xué)半衰期。通常F(ab)的半衰期通過(guò)在制備和純化F(ab)后化學(xué)加入PEG部分到特定硫醇而延長(zhǎng)。PEG化反應(yīng)對(duì)產(chǎn)物的制備增加了顯著的復(fù)雜性。PEG化化學(xué)反應(yīng)必須對(duì)各F(ab)優(yōu)化，并減少產(chǎn)率。PEG化還使最終產(chǎn)物分析復(fù)雜化，因?yàn)镻EG化的材料具有不同分子量。給抗體片段(如，F(xiàn)(ab))增加FcYRI、FcYRII和FcYRIII功能抗體片段諸如F(ab)和PEG化的F(ab)缺少與FcγRI、FcγRII和FcγRIII相互作用的能力。在某些情況期望接合Fc受體。例如抗-CD20抗體依賴ADCC依賴性清除不想要的癌性B-細(xì)胞的Fc官能性。此外，在抗體交聯(lián)受體將造成受體內(nèi)在化的情形，一價(jià)F(ab)比二價(jià)mAb優(yōu)選。如果藥物效力取決于Fc依賴性ADCC清除機(jī)制，這種內(nèi)在化可是不期望的。因此F(ab)片段連接于scFc本發(fā)明多肽代表最佳構(gòu)建體，因?yàn)槠鋵?shí)現(xiàn)期望的一價(jià)和Fcγ受體接合的特征。ScFc分子允許產(chǎn)牛異聚的Fc區(qū)。Fc區(qū)內(nèi)的位點(diǎn)特異性突變已用于產(chǎn)生具有改進(jìn)的Fc官能性的Fc-變體mAb。實(shí)例是增強(qiáng)對(duì)如，各種FcγRI、FcγRII和/或FcγRIII的親和性的突變。本發(fā)明的單鏈Fc(SCFC)分子可用于產(chǎn)生在僅一個(gè)Fc部分含有特定點(diǎn)突變或在scFc區(qū)兩部分中含有不同的點(diǎn)突變組合的異聚的scFc區(qū)。一個(gè)實(shí)例將是表達(dá)在兩個(gè)Fc部分中的僅一個(gè)含有Asn297糖基化的scFc構(gòu)建體。該分子顯示略微降低的FcR親和性，但對(duì)于FcγRIII結(jié)合無(wú)活性。為了提供對(duì)說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求的清楚理解，下面方便地提供以下定義。I.定義本文所用的術(shù)語(yǔ)“多肽”是指兩個(gè)或多個(gè)天然氨基酸或非天然氨基酸的聚合物。術(shù)語(yǔ)“氨基酸”包括丙氨酸(Ala或A)；精氨酸(Arg或R)；天冬酰胺(Asn或N)；天冬氨酸(Asp或D)；半胱氨酸(Cys或C)；谷氨酰胺(Gln或Q)；谷氨酸(Glu或E)；甘氨酸(Gly或G)；組氨酸(His或H)；異亮氨酸(lie或I)；亮氨酸(Leu或L)；賴氨酸(Lys或K)；甲硫氨酸(Met或M)；苯丙氨酸(Phe或F)；脯氨酸(Pro或P)；絲氨酸(Ser或S)；蘇氨酸(Thr或T)；色氨酸(Trp或W)；酪氨酸(Tyr或Y)；以及纈氨酸(Val或V)。非傳統(tǒng)氨基酸也在本發(fā)明范圍中，并包括正亮氨酸、鳥(niǎo)氨酸、正纈氨酸、高絲氨酸和其它氨基酸殘基類似物，例如Ellman等人Meth.Enzym.202:301_336(1991)中描述的那些。為了制備這些非天然存在的氨基酸殘基，可以使用例如Noren等人Science244182(1989)和Ellman等人(同上引文)的方法。簡(jiǎn)言之，這些方法包括用非天然存在氨基酸殘基化學(xué)活化抑制型tRNA之后體外轉(zhuǎn)錄和翻譯該RNA。引入非傳統(tǒng)氨基酸還可使用本領(lǐng)域已知的肽化學(xué)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“極性氨基酸”包括具有凈零電荷，但在其側(cè)鏈的不同部分具有非零的部分電荷的氨基酸(如1、1、3、￥、19、0。這些氨基酸可參與疏水相互作用和靜電相互作用。本文所用的術(shù)語(yǔ)“帶電荷氨基酸”包括在其側(cè)鏈上可具有非零的凈電荷的氨基酸(如R、K、H、E、D)。這些氨基酸可參與疏水相互作用和靜電相互作用。本文所用的術(shù)語(yǔ)“具有足夠立體容積的氨基酸”包括具有占據(jù)較大3維空間的側(cè)鏈的氨基酸。具有足夠立體容積的側(cè)鏈化學(xué)的示例性氨基酸包括酪氨酸、色氨酸、精氨酸、賴氨酸、組氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和甲硫氨酸、或其類似物或模擬物。“氨基酸取代"是指以第二、不同的"取代"氨基酸殘基取代預(yù)確定的氨基酸序列(起始多肽的氨基酸序列)中至少一個(gè)現(xiàn)有的氨基酸殘基?！鞍被岵迦?是指添加至少一個(gè)另外的氨基酸到預(yù)確定的氨基酸序列中。盡管插入通常由插入一個(gè)或兩個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，可進(jìn)行本文的較大的"肽插入"，如插入約三至約五個(gè)或甚至達(dá)約十、十五或二十氨基酸殘基。插入的殘基可以是天然存在的或非天然存在的，如上所述的?！鞍被崛笔?是指從預(yù)確定的氨基酸序列除去至少一個(gè)氨基酸殘基。本文所用的術(shù)語(yǔ)“蛋白”是指多肽或包含多于一個(gè)多肽的組合物。因此，蛋白可為單體或多聚體。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白是二聚體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的二聚體是同二聚體，包含兩個(gè)相同單體亞基或多肽(如，兩個(gè)相同scFc多肽)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的二聚體是異二聚體，包含兩個(gè)不相同的單體亞基或多肽(如，兩個(gè)不相同的scFc多肽)。二聚體的亞基可包含一條或多條多肽鏈(如，包含scFc分子的靶結(jié)合鏈)。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，該二聚體包含至少兩條多肽鏈(如，至少兩條scFc多肽鏈)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該二聚體包含兩條多肽鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該二聚體包含三條多肽鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該二聚體包含四條多肽鏈。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽是scFc多肽。本文所用的術(shù)語(yǔ)scFc多肽是指包含單鏈Fc(scFc)區(qū)的多肽。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽是結(jié)合多肽。本文所用的術(shù)語(yǔ)“結(jié)合多肽”是指包含至少一個(gè)特異性結(jié)合于靶分子(諸如抗原或結(jié)合伴侶)的靶結(jié)合位點(diǎn)或結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含免疫球蛋白抗原結(jié)合位點(diǎn)或受體分子負(fù)責(zé)配體結(jié)合的部分或配體分子負(fù)責(zé)受體結(jié)合的部分。本發(fā)明結(jié)合多肽優(yōu)選地還包含衍生自一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白(Ig)分子的至少兩個(gè)Fc部分。例如，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合多肽是包含遺傳融合的至少兩個(gè)Fc部分的scFc多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含另外的修飾。示例性修飾在以下詳述。例如，在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽可任選地包含遺傳融合的Fc區(qū)(即，scFc區(qū))的至少兩個(gè)Fc部分之間的柔性多肽接頭。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合多肽可被修飾以加入功能性部分(如，PEG、藥物或標(biāo)記)。本發(fā)明結(jié)合多肽包含至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含至少兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合多肽包含兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合多肽包含三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合多肽包含四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合位點(diǎn)彼此串聯(lián)連接。在其它實(shí)施方案中，結(jié)合位點(diǎn)位于結(jié)合多肽的不同位置。例如，一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)可連接到遺傳融合的Fc區(qū)(S卩，單鏈Fc(SCFC)區(qū))的一端或兩端。本文所用的術(shù)語(yǔ)“結(jié)合結(jié)構(gòu)域”或“結(jié)合位點(diǎn)”指結(jié)合多肽中介導(dǎo)與靶分子(例如抗原、配體、受體、底物或抑制劑)的特異性結(jié)合的部分、區(qū)或位點(diǎn)。示例性結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括抗原結(jié)合位點(diǎn)、配體的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或酶結(jié)構(gòu)域。術(shù)語(yǔ)“配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域”在本文中指天然受體(例如細(xì)胞表面受體)或其保留了至少定性的配體結(jié)合能力以及優(yōu)選地相應(yīng)天然受體的生物學(xué)活性的區(qū)域或衍生物。術(shù)語(yǔ)“受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域”在本文中指天然配體或其保留了至少定性的受體結(jié)合能力以及優(yōu)選地相應(yīng)天然配體的生物學(xué)活性的區(qū)域或衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽具有至少一個(gè)對(duì)靶向降低或消除的分子(例如細(xì)胞表面抗原或可溶性抗原)具有特異性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在優(yōu)選實(shí)施方案中，結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含抗原結(jié)合位點(diǎn)或由抗原結(jié)合位點(diǎn)組成(如，包含置入可選構(gòu)架區(qū)(如，任選地包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代的人類構(gòu)架區(qū))的抗體的可變重鏈序列和可變輕鏈序列或六個(gè)CDR)。術(shù)語(yǔ)“結(jié)合親和性”在本文中包括結(jié)合相互作用的強(qiáng)度并由此包括實(shí)際的結(jié)合親和性和表觀結(jié)合親和性。實(shí)際結(jié)合親和性是結(jié)合速率與解離速率的比。因此，賦予或優(yōu)化結(jié)合親和性包括改變這些成分之一或兩者以得到期望水平的結(jié)合親和性。表觀親和性可以包括例如相互作用的親和力。術(shù)語(yǔ)“結(jié)合自由能”或“結(jié)合的自由能”在本文中包括其本領(lǐng)域公認(rèn)的意義，并尤其應(yīng)用于溶劑中結(jié)合位點(diǎn)_配體或Fc-FcR相互作用。結(jié)合自由能的降低將增強(qiáng)親和性，而結(jié)合自由能的增加將降低親和性。術(shù)語(yǔ)“特異性”包括特異性結(jié)合(如，與其免疫反應(yīng))指定靶的可能結(jié)合位點(diǎn)數(shù)目。結(jié)合多肽可為單特異性的并包含特異性結(jié)合相同靶(如，相同表位)的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，或結(jié)合多肽可為多特異性的并包含特異性結(jié)合相同靶的不同區(qū)(如，不同表位)或不同靶的兩個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可制備具有對(duì)多于一個(gè)靶分子(如，多于一個(gè)抗原或相同抗原上多于一個(gè)表位)的結(jié)合特異性的多特異性結(jié)合多肽(如，雙特異性多肽)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性結(jié)合多肽具有對(duì)靶向于減少或消除的分子特異性的至少一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和對(duì)細(xì)胞上靶分子特異性的至少一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性結(jié)合多肽具有對(duì)靶向于減少或消除的分子特異性的至少一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和對(duì)藥物特異性的至少一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該多特異性結(jié)合多肽具有對(duì)靶向于減少或消除的分子特異性的至少一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和對(duì)前藥特異性的至少一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性結(jié)合多肽是四價(jià)抗體，具有對(duì)一個(gè)靶分子特異性的兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和對(duì)第二靶分子特異性的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“價(jià)”是指結(jié)合多肽或蛋白中可能的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的數(shù)目。各結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合一個(gè)靶分子。當(dāng)結(jié)合多肽包含多于一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域時(shí)，各結(jié)合結(jié)構(gòu)域可特異性結(jié)合相同或不同分子(如，可結(jié)合于不同配體或不同抗原、或相同抗原上的不同表位)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽是一價(jià)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽是多價(jià)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽是二價(jià)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽是三價(jià)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽是四價(jià)。在某些方面，本發(fā)明結(jié)合多肽采用多肽接頭。本文所用的術(shù)語(yǔ)“多肽接頭”是指連接多肽鏈的線性氨基酸序列中的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的肽或多肽序列(如，合成的肽或多肽序列)。例如，多肽接頭可用于連接結(jié)合位點(diǎn)到遺傳融合的Fc區(qū)。優(yōu)選地，這種多肽接頭對(duì)多肽分子提供柔性。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域經(jīng)由多肽接頭融合或連接于遺傳融合的Fc區(qū)(S卩，scFc區(qū))(多肽接頭的N-或C-末端連接于遺傳融合的Fc區(qū)的C-或N-末端，多肽接頭的N-末端連接于VH或VL結(jié)構(gòu)域的N-或C-末端)。在某些實(shí)施方案中，多肽接頭用于連接(如，遺傳融合)兩個(gè)Fc部分或結(jié)構(gòu)域。這種多肽接頭在本文也稱為Fc連接多肽。本文所用的術(shù)語(yǔ)“Fe連接多肽”具體地指連接(如，遺傳融合)兩個(gè)Fc部分或結(jié)構(gòu)域的連接多肽。本發(fā)明結(jié)合分子可包含多于一個(gè)肽接頭。本文所用的術(shù)語(yǔ)“正確折疊的多肽”包括其中多肽包含的所有功能結(jié)構(gòu)域都明確地有活性的多肽(如，本發(fā)明結(jié)合多肽)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“不正確折疊的多肽”包括其中多肽的至少一個(gè)功能結(jié)構(gòu)域不是活性的多肽。本文所用的“正確折疊的Fc多肽”或“正確折疊的Fc區(qū)”包含遺傳融合的Fc區(qū)(即，scFc區(qū))，其中至少兩個(gè)組成性Fc部分正確折疊以使所得scFc區(qū)包含至少一個(gè)效應(yīng)子功能。多肽或氨基酸序列"衍生自"指定的多肽或蛋白是指多肽的來(lái)源。優(yōu)選地，衍生自特定序列的多肽或氨基酸序列具有與該序列或其部分基本相同的氨基酸序列，其中該部分由至少10-20氨基酸、優(yōu)選地至少20-30氨基酸、更優(yōu)選地至少30-50氨基酸組成，或否則由于具有其序列來(lái)源而可被本領(lǐng)域技術(shù)人員鑒定。衍生自另一肽的多肽可具有相對(duì)于起始多肽的一個(gè)或多個(gè)突變，如，一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被另一氨基酸殘基取代，或具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基插入或缺失。優(yōu)選地，該多肽包含不是天然存在的氨基酸序列。這種變體必然與起始抗體具有少于100%的序列同一性或相似性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該變體的氨基酸序列與起始多肽的氨基酸序列例如在變體分子長(zhǎng)度內(nèi)有從約75%到少于100%的氨基酸序列同一性或相似性，更優(yōu)選地從約80%到少于100%，更優(yōu)選地從約85%到少于100%，更優(yōu)選地從約90%到少于100%(如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)，最優(yōu)選地從約95%到少于100%。在一個(gè)實(shí)施方案中，起始多肽序列和從其衍生的序列之間存在一個(gè)氨基酸差異。關(guān)于此序列的同一性或相似性在本文中定義為在序列比對(duì)和在必要時(shí)引入缺口以達(dá)到最大序列同一性百分?jǐn)?shù)后，候選序列中與起始氨基酸殘基相同的氨基酸殘基(即，相同殘基)的百分?jǐn)?shù)。優(yōu)選的本發(fā)明結(jié)合多肽包含衍生自人類免疫球蛋白序列的氨基酸序列(如，至少一個(gè)Fc部分或結(jié)構(gòu)域)。然而，多肽可包含來(lái)自另一哺乳動(dòng)物物種的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。例如，靈長(zhǎng)類Fc結(jié)構(gòu)域或結(jié)合位點(diǎn)可包括在本發(fā)明多肽中。可選地，一個(gè)或多個(gè)鼠氨基酸可存在于多肽中。優(yōu)選的本發(fā)明多肽不是免疫原性的。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)理解的是，本發(fā)明結(jié)合多肽可被改變以使其氨基酸序列與其所衍生自的天然存在或天然多肽不同，但保持天然多肽的期望活性。例如，可進(jìn)行在"“非必需"氨基酸殘基造成保守取代或變化的核苷酸或氨基酸取代。通過(guò)引入一個(gè)或多個(gè)核苷酸取代、添加或缺失到免疫球蛋白(如，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域、部分或抗原結(jié)合位點(diǎn))的核苷酸序列以使一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、添加或缺失引入到編碼的蛋白中，可產(chǎn)生編碼衍生自免疫球蛋白的結(jié)合多肽的非天然變體的分離的核酸分子。可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)引入突變，諸如定點(diǎn)誘變和PCR-介導(dǎo)的誘變。本發(fā)明結(jié)合多肽可在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基包含保守氨基酸取代，如，在必需或非必需氨基酸殘基。“保守氨基酸取代"是其中氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基代替的取代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族在本領(lǐng)域已定義，包括堿性側(cè)鏈(如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支鏈側(cè)鏈(如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香側(cè)鏈(如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，結(jié)合多肽中的非必需氨基酸殘基優(yōu)選地被相同側(cè)鏈家族的另一氨基酸殘基代替。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一串氨基酸可被結(jié)構(gòu)相似、側(cè)鏈家族成員順序和/或組成不同的串代替?？蛇x地，在另一個(gè)實(shí)施方案中，突變可隨機(jī)地沿著編碼序列全部或部分引入，諸如通過(guò)飽和誘變，所得的突變體可并入本發(fā)明結(jié)合多肽，并篩選其結(jié)合期望的靶的能力。在多肽背景中，“線性序列"或"序列"是氨基酸在多肽中以氨基到羧基末端的方向的順序，其中序列中彼此相鄰的殘基在多肽的初級(jí)結(jié)構(gòu)中是連續(xù)的。本文所用的術(shù)語(yǔ)“連接”、“融合的”或“融合”可互換使用。這些術(shù)語(yǔ)指兩個(gè)以上的元件或者組分通過(guò)任何方式(包括化學(xué)結(jié)合或重組方法)連接在一起?；瘜W(xué)結(jié)合方法(如，使用異雙官能交聯(lián)劑)是本領(lǐng)域已知的。本文所用的術(shù)語(yǔ)"遺傳融合的"或“遺傳融合”是指經(jīng)由其單獨(dú)肽構(gòu)架共_線性、共價(jià)鍵合或連接兩個(gè)或多個(gè)蛋白、多肽或其片段，通過(guò)遺傳表達(dá)編碼該蛋白、多肽或片段的單個(gè)多核苷酸分子。這種遺傳融合導(dǎo)致表達(dá)單個(gè)連續(xù)遺傳序列。優(yōu)選的遺傳融合符合讀框，艮口，兩個(gè)或多個(gè)可讀框(ORF)以保持這些原始ORF的正確閱讀框的方式融合以形成一個(gè)連續(xù)的更長(zhǎng)0RF。因此，所得的重組融合蛋白是含有兩個(gè)或多個(gè)蛋白區(qū)段的單個(gè)多肽，其中所述蛋白區(qū)段相應(yīng)于原始ORF編碼的多肽(這些區(qū)段在天然狀態(tài)下正常不如此連接)。盡管由此制備的閱讀框在整個(gè)融合遺傳區(qū)段上是連續(xù)的，但是蛋白區(qū)段可能在物理上或者空間上由例如符合讀框的多肽接頭分隔開(kāi)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“Fe區(qū)”應(yīng)定義為天然免疫球蛋白中由其兩個(gè)重鏈的各自Fc結(jié)構(gòu)域(或Fc部分)形成的部分。天然Fc區(qū)是同二聚的。相反，本文所用的術(shù)語(yǔ)“遺傳融合的Fc區(qū)”或“單鏈Fc區(qū)”(scFc區(qū))是指包含在單個(gè)多肽鏈(即，在單個(gè)連續(xù)遺傳序列中編碼)中遺傳連接的Fc結(jié)構(gòu)域(或Fc部分)的合成的Fc區(qū)。因此，遺傳融合的Fc區(qū)(即，scFc區(qū))是單體。本文所用的術(shù)語(yǔ)“Fe結(jié)構(gòu)域”是指單個(gè)免疫球蛋白重鏈中開(kāi)始于木瓜蛋白酶切割位點(diǎn)上游的鉸鏈區(qū)(即IgG的殘基216，重鏈恒定區(qū)的第一殘基作為114)，并結(jié)束于抗體C-末端的部分。因此，完整Fc結(jié)構(gòu)域包含至少鉸鏈結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域。本文所用的術(shù)語(yǔ)“Fe結(jié)構(gòu)域部分”或“Fe部分”包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列或衍生自Fc結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分包含以下至少一個(gè)鉸鏈(如，上、中和/或下鉸鏈區(qū))結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域、CH3結(jié)構(gòu)域、CH4結(jié)構(gòu)域、或其變體、部分或片段。在其它實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分包含完整Fc結(jié)構(gòu)域(即，鉸鏈結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域)。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分包含融合于CH3結(jié)構(gòu)域(或其部分)的鉸鏈結(jié)構(gòu)域(或其部分)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分包含融合于CH3結(jié)構(gòu)域(或其部分)的CH2結(jié)構(gòu)域(或其部分)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分由CH3結(jié)構(gòu)域或其部分組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分由鉸鏈結(jié)構(gòu)域(或其部分)和CH3結(jié)構(gòu)域(或其部分)組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分由CH2結(jié)構(gòu)域(或其部分)和CH3結(jié)構(gòu)域組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分由鉸鏈結(jié)構(gòu)域(或其部分)和CH2結(jié)構(gòu)域(或其部分)組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分缺少至少部分的CH2結(jié)構(gòu)域(如，全部或部分CH2結(jié)構(gòu)域)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的Fc區(qū)(scFc區(qū))包含F(xiàn)c分子的至少本領(lǐng)域已知結(jié)合FcRn所需的部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的Fc區(qū)(scFc區(qū))包含F(xiàn)c分子的至少本領(lǐng)域已知結(jié)合FcγR所需的部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的Fc區(qū)(scFc區(qū))包含F(xiàn)c分子的至少本領(lǐng)域已知結(jié)合蛋白A所需的部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的Fc區(qū)(scFc區(qū))包含F(xiàn)c分子的至少本領(lǐng)域已知結(jié)合蛋白G所需的部分。如本文所述的，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解的是任何Fc結(jié)構(gòu)域可被修飾以使其氨基酸序列與天然存在免疫球蛋白分子的天然Fc結(jié)構(gòu)域不同。在某些示例性實(shí)施方案中，該Fc部分保留效應(yīng)子功能(如，F(xiàn)cγR結(jié)合)。本發(fā)明多肽的Fc結(jié)構(gòu)域或部分可衍生自不同免疫球蛋白分子。例如，多肽的Fc結(jié)構(gòu)域或部分可包含衍生自IgGl分子的CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域和衍生自IgG3分子的鉸鏈區(qū)。在另一實(shí)例，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域或部分可包含部分地衍生自IgGl分子和部分地衍生自IgG3分子的嵌合鉸鏈區(qū)。在另一實(shí)例，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域或部分可包含部分地衍生自IgGl分子和部分地衍生自IgG4分子的嵌合鉸鏈。本文所用的術(shù)語(yǔ)"免疫球蛋白"包括具有兩個(gè)重鏈和兩個(gè)輕鏈的組合的多肽，無(wú)論其是否具備任何相關(guān)的特異性免疫反應(yīng)性。本文所用的術(shù)語(yǔ)"抗體"是指對(duì)目標(biāo)抗原(如腫瘤相關(guān)抗原)具有顯著的已知特異性免疫反應(yīng)活性的這樣的組件(如，完整抗體分子、抗體片段或其變體)?？贵w和免疫球蛋白包含輕鏈和重鏈，在它們之間帶有或不帶有鏈間的共價(jià)鍵合。脊椎動(dòng)物系統(tǒng)中的基本免疫球蛋白結(jié)構(gòu)相對(duì)較好地理解。如以下更詳細(xì)地討論的，通用術(shù)語(yǔ)“抗體”包括五類不同抗體，其可生化地區(qū)分。每類抗體的Fc部分明確地在本發(fā)明范圍內(nèi)，以下討論將通常針對(duì)IgG類的免疫球蛋白分子。對(duì)于IgG，免疫球蛋白包含兩個(gè)分子量大約23，000道爾頓的相同的多肽輕鏈，和兩個(gè)分子量53，000-70，000的相同重鏈。四條鏈由二硫鍵以〃Y〃構(gòu)型連接，其中輕鏈位于開(kāi)始于"Y"口并持續(xù)經(jīng)過(guò)可變結(jié)構(gòu)域的重鏈的外側(cè)。免疫球蛋白的輕鏈分為kappa或lambda(κ、λ)。每類重鏈可與κ輕鏈或λ輕鏈結(jié)合。大體上，當(dāng)免疫球蛋白由雜交瘤、B細(xì)胞、或遺傳工程化的宿主細(xì)胞產(chǎn)生時(shí)，輕鏈和重鏈彼此共價(jià)結(jié)合，兩個(gè)重鏈的"尾"部分通過(guò)共價(jià)二硫鍵或非共價(jià)鍵合而彼此結(jié)合。重鏈中，氨基酸序列從Y構(gòu)型叉端的N-末端開(kāi)始，到各鏈底部的C-末端。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了，重鏈分為Υ、μ、α、δ或ε(Υ、μ、α、δ、O，其中有一些亞類(如，Y1_Y4)。該鏈的性質(zhì)決定抗體的"類"分別是IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亞類(同種型)如，IgG1UgG2UgGyIgG4UgA1等是充分表征的，并已知賦予功能特化。各種這些類和同種型的修飾版本是參考本公開(kāi)內(nèi)容的本領(lǐng)域技術(shù)人員易于辨別的，因此在本發(fā)明范圍中。輕鏈和重鏈兩者分為結(jié)構(gòu)和功能同源性的區(qū)。術(shù)語(yǔ)“區(qū)”是指單個(gè)免疫球蛋白(在術(shù)語(yǔ)“Fe區(qū)”的情形)或單個(gè)抗體鏈的組分或部分，并包括恒定區(qū)或可變區(qū)，以及所述結(jié)構(gòu)域的更不連續(xù)的組分或部分。例如，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包括散布在“構(gòu)架區(qū)”或“FR”中的“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”，如本文定義的。免疫球蛋白的某些區(qū)可定義為“恒定”(C)區(qū)或“可變”(V)區(qū)，基于在“恒定區(qū)”的情形下各類成員的區(qū)中相對(duì)缺少序列變化，或在“可變區(qū)”的情形下各類成員的區(qū)中顯著變化。術(shù)語(yǔ)"恒定區(qū)"和"可變區(qū)"還可功能性地使用。在這方面，應(yīng)理解免疫球蛋白或抗體的可變區(qū)決定抗原識(shí)別和特異性。相反，免疫球蛋白或抗體的恒定區(qū)賦予重要的效應(yīng)子功能諸如分泌、經(jīng)胎盤(pán)的流動(dòng)性、Fc受體結(jié)合、補(bǔ)體結(jié)合和類似功能。各類免疫球蛋白的恒定區(qū)的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是已知的。免疫球蛋白重鏈和輕鏈的恒定區(qū)和可變區(qū)折疊為結(jié)構(gòu)域。術(shù)語(yǔ)“結(jié)構(gòu)域”是指重鏈或輕鏈多肽的獨(dú)立地折疊的球形區(qū)，包含例如經(jīng)由β"折疊片和/或鏈內(nèi)二硫鍵穩(wěn)定的肽環(huán)(如，包含3至4個(gè)肽環(huán))。免疫球蛋白輕鏈上的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域可互換地稱為“輕鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域”、“CL區(qū)”或“CL結(jié)構(gòu)域”。重鏈上的恒定結(jié)構(gòu)域(如鉸鏈、CH1、CH2或CH3結(jié)構(gòu)域)可互換地稱為“重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域”、“CH”區(qū)結(jié)構(gòu)域或“CH結(jié)構(gòu)域”。輕鏈上的可變結(jié)構(gòu)域可互換地稱為“輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域”、“VL區(qū)結(jié)構(gòu)域或“VL結(jié)構(gòu)域”。重鏈上的可變結(jié)構(gòu)域可互換地稱為“重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域”、“VH區(qū)結(jié)構(gòu)域”或“VH結(jié)構(gòu)域”。按照慣例可變和恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的編號(hào)隨它們更遠(yuǎn)離免疫球蛋白或抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)或氨基_末端而增大。每個(gè)重和輕免疫球蛋白鏈的N-末端是可變區(qū)，C-末端是恒定區(qū)；CH3和CL結(jié)構(gòu)域?qū)嶋H上分別包含重和輕鏈的羧基-末端。因此，輕鏈免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)域以VL-CL方向排列，而重鏈的結(jié)構(gòu)域以VH-CHl-鉸鏈-CH2-CH3方向排列。重鏈恒定區(qū)中的氨基酸位置，包括CH1、鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域中的氨基酸位置，在本文中根據(jù)EU索引編號(hào)系統(tǒng)(參見(jiàn)Kabat等人，在“SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(免疫學(xué)重要蛋白的序列)，，，U.S.D印t.HealthandHumanServices，第5版，1991)編號(hào)。相反，輕鏈恒定區(qū)(如CL結(jié)構(gòu)域)中的氨基酸位置在本文中根據(jù)Kabat索引編號(hào)系統(tǒng)(參見(jiàn)Kabat等人，同前)編號(hào)。根據(jù)Kabat索引編號(hào)系統(tǒng)，本文所用的術(shù)語(yǔ)“VH結(jié)構(gòu)域”包括免疫球蛋白重鏈的氨基末端可變結(jié)構(gòu)域，術(shù)語(yǔ)結(jié)構(gòu)域”包括免疫球蛋白輕鏈的氨基末端可變結(jié)構(gòu)域。本文所用的術(shù)語(yǔ)“CH1結(jié)構(gòu)域”包括免疫球蛋白重鏈的第一(最氨基末端)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，其例如從約EU位置118-215延伸。CHl結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白重鏈分子的VH結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)的氨基末端相鄰，不形成免疫球蛋白重鏈Fc區(qū)的一部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含衍生自免疫球蛋白重鏈分子(如，人類IgGl或IgG4分子)的CHl結(jié)構(gòu)域。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“鉸鏈區(qū)”包括重鏈分子中連接CHl結(jié)構(gòu)域和CH2結(jié)構(gòu)域的部分。該鉸鏈區(qū)包含大約25個(gè)殘基，并具有柔性，由此允許兩個(gè)N端抗原結(jié)合區(qū)獨(dú)立地移動(dòng)。鉸鏈區(qū)可以細(xì)分成三個(gè)不同結(jié)構(gòu)域上、中和下鉸鏈結(jié)構(gòu)域(Roux等人J.Immunol.1998，1614083)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“CH2結(jié)構(gòu)域”包括重鏈免疫球蛋白分子中從例如從大約EU位置231-340延伸的部分。CH2結(jié)構(gòu)域是獨(dú)特的，因?yàn)槠洳慌c另一結(jié)構(gòu)域緊密配對(duì)。相反地，兩個(gè)N連接的分支糖鏈置于完整天然IgG分子的兩個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含衍生自IgGl分子(如人類IgGl分子)的CH2結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含衍生自IgG4分子(如，人類IgG4分子)的CH2結(jié)構(gòu)域。在示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽包含CH2結(jié)構(gòu)域(EU位置231-340)或其部分。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“CH3結(jié)構(gòu)域”包括重鏈免疫球蛋白分子中自CH2結(jié)構(gòu)域的N端延伸大約110個(gè)殘基的部分，例如大約位置341-至446b(EU編號(hào)系統(tǒng))。CH3結(jié)構(gòu)域典型地形成抗體的C端部分。然而，在一些免疫球蛋白中，可以從CH3結(jié)構(gòu)域延伸出額外的結(jié)構(gòu)域以形成該分子的C端部分(例如，IgM的μ鏈和IgE的ε鏈中的CH4結(jié)構(gòu)域)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含衍生自IgGl分子(如，人類IgGl分子)的CH3結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含衍生自IgG4分子(如，人類IgG4分子)的CH3結(jié)構(gòu)域。本文所用的術(shù)語(yǔ)“CL結(jié)構(gòu)域”包括免疫球蛋白輕鏈的第一(最氨基末端)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，其延伸如從約Kabat位置107A-216。CL結(jié)構(gòu)域與VL結(jié)構(gòu)域相鄰。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含衍生自κ輕鏈(如，人類κ輕鏈)的CL結(jié)構(gòu)域。本文所用的術(shù)語(yǔ)“效應(yīng)子功能”指Fc區(qū)或其部分結(jié)合免疫系統(tǒng)的蛋白質(zhì)和/或細(xì)胞并介導(dǎo)各種生物學(xué)效應(yīng)的功能性能力。效應(yīng)子功能可以是抗原依賴性的或者抗原非依賴性的。效應(yīng)子功能減少是指一個(gè)或多個(gè)效應(yīng)子功能減少，而保持抗體可變區(qū)(或其片段)的抗原結(jié)合活性。效應(yīng)子功能如Fc對(duì)Fc受體或補(bǔ)體蛋白的結(jié)合的增加或減少，可以倍數(shù)改變的方式表示(如，改變1倍、2倍等等)并可基于，如，使用本領(lǐng)域已知的測(cè)定確定的結(jié)合活性的改變百分比而計(jì)算。本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗原依賴性效應(yīng)子功能”指正常在抗體結(jié)合相應(yīng)抗原后誘導(dǎo)的效應(yīng)子功能。典型的抗原依賴性效應(yīng)子功能包括結(jié)合補(bǔ)體蛋白質(zhì)(如Clq)的能力。例如，補(bǔ)體Cl組分與Fc區(qū)的結(jié)合可以激活經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)，導(dǎo)致調(diào)理作用和細(xì)胞病原體的裂解，該過(guò)程稱作補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDCC)。補(bǔ)體的激活也刺激炎癥反應(yīng)，并還可能涉及自身免疫超敏反應(yīng)。其它抗原依賴性效應(yīng)子功能由抗體通過(guò)其Fc區(qū)和細(xì)胞上的某些Fc受體(“FcR”)的結(jié)合所介導(dǎo)。有多種對(duì)不同抗體類型具有特異性的Fc受體，包括IgG(Y受體或IgYR)、IgE(ε受體或IgeR)、IgA(α受體或IgaR)和IgM(μ受體或IgyR)?？贵w與細(xì)胞表面上Fc受體的結(jié)合觸發(fā)許多重要的不同生物學(xué)反應(yīng)，包括免疫復(fù)合物的胞吞、抗體包被的顆?；蛭⑸锏耐倘牒推茐?也稱作抗體依賴性吞噬作用，或ADCP)、免疫復(fù)合物的清除、殺傷細(xì)胞對(duì)抗體包被的靶細(xì)胞的裂解(稱作抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，或ADCC)、炎性介質(zhì)的釋放、免疫系統(tǒng)細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)、免疫球蛋白產(chǎn)生的胎盤(pán)轉(zhuǎn)移和控制。某些Fc受體，F(xiàn)cy受體(FeYR)，在取消或增強(qiáng)免疫募集方面扮演著關(guān)鍵角色。FcγR表達(dá)在白細(xì)胞上，由三個(gè)不同類型組成FcyRI、FcyRII和FcγRIII(Gessner等X,Ann.Hemato1.,(1998)，76:231_48)。結(jié)構(gòu)上，這些FcγR均是免疫球蛋白超家族的成員，具有結(jié)合IgG的α鏈，該α鏈具有由兩個(gè)或三個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域組成的胞外部分。人類FcγRI(⑶64)表達(dá)在人單核細(xì)胞上，表現(xiàn)出對(duì)單體IgGl、IgG3和IgG4的高親和性結(jié)合(Ka=IO8-IO9IT1)。人類FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)對(duì)IgGl禾口IgG3具有低親和性(Ka<IO7M-1)，并僅能夠結(jié)合這些IgG同種型的復(fù)合形式或者多聚體形式。此外，F(xiàn)cyRII和FcYRIII類包含“A”和“B”兩種形式。FcγRIIa(CD32a)和FcγRIIIa(CD16a)通過(guò)跨膜結(jié)構(gòu)域結(jié)合在巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和一些T細(xì)胞表面，而FcYRIIb(⑶32b)和FcγRIIIb(⑶16b)通過(guò)磷脂酰肌醇聚糖(GPI)錨選擇性地結(jié)合在粒細(xì)胞(例如嗜中性粒細(xì)胞)的細(xì)胞表面。人類FcγRI、FcyRII和FcγRIII的相應(yīng)鼠同系物是FcγRlla、FcyRIIb/1禾口FcYRlo0本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗原非依賴性效應(yīng)子功能”指無(wú)論抗體是否已結(jié)合其相應(yīng)抗原均可以被抗體誘導(dǎo)的效應(yīng)子功能。典型的抗原非依賴性效應(yīng)子功能包括免疫球蛋白的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、循環(huán)半衰期和清除速率以及便于純化。結(jié)構(gòu)獨(dú)特的Fc受體“新生Fc受體”或“FcRn”，也稱作拯救受體(salvagereceptor)，在調(diào)節(jié)半衰期和細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)方面具有關(guān)鍵作用。從微生物細(xì)胞純化的其它Fc受體(如葡萄球菌蛋白A或G)能夠以高親和性結(jié)合Fc區(qū)并可用于促進(jìn)含有Fc的多肽的純化。與屬于免疫球蛋白超家族的FcγR不同，人類FcRn在結(jié)構(gòu)上類似于I型主要組織相容性復(fù)合物(MHC)的多肽(Ghetie和Ward，ImmunologyToday,(1997)，18(12):592_8)。FcRn典型地以異二聚體形式表達(dá)，該異二聚體由跨膜α鏈或重鏈與可溶性β鏈或輕鏈(β2微球蛋白)形成的復(fù)合物組成。FcRn與I型MHC分子有22-29%序列同一性，具有非功能性形式的MHC肽結(jié)合溝(Simister和Mostov,Nature,(1989)，337184-7)。與MHC—樣，F(xiàn)cRn的α鏈由三個(gè)胞外域(α1、α2、α3)組成，一個(gè)短的胞質(zhì)尾將蛋白錨定在細(xì)胞表面。α1和α2結(jié)構(gòu)域與抗體Fc區(qū)中的FcR結(jié)合位點(diǎn)相互作用(Raghavan等人，Immunity，(1994)，1:303-15)。FcRn在哺乳動(dòng)物的母體胎盤(pán)或者卵黃囊中表達(dá)，并且參與IgG自母體向胎兒的轉(zhuǎn)移。FcRn也在新生嚙齒動(dòng)物的小腸中表達(dá)，在此處FcRn參與母體IgG自攝入的初乳或乳跨刷狀緣上皮的轉(zhuǎn)移。FcRn也表達(dá)在許多物種的許多其它組織中，以及各種內(nèi)皮細(xì)胞系中。其也在成人血管內(nèi)皮、肌肉脈管系統(tǒng)和肝竇狀隙(h印aticsinusoid)中表達(dá)。據(jù)認(rèn)為FcRn通過(guò)結(jié)合IgG并將IgG回收至血清而在維持IgG的循環(huán)半衰期或血清水平中起額外作用。FcRn與IgG分子的結(jié)合是嚴(yán)格地pH依賴性的，在小于7.O的pH時(shí)具有最佳纟口口。本文所用的術(shù)語(yǔ)“半衰期”指特定結(jié)合多肽在體內(nèi)的生物學(xué)半衰期。半衰期可以通過(guò)從動(dòng)物的循環(huán)和/或其它組織中清除掉施用給受治療者的半數(shù)量所需要的時(shí)間來(lái)表示。在以時(shí)間函數(shù)的形式構(gòu)建了給定的結(jié)合多肽的清除曲線時(shí)，曲線通常是雙相的，具有快速的α相和較長(zhǎng)的β相。α相典型地表示施用的Fc多肽在血管內(nèi)間隙和血管外間隙之間的平衡，其部分地取決于多肽的大小。β相典型地表示結(jié)合多肽在血管內(nèi)間隙中的代謝。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文所用的術(shù)語(yǔ)“半衰期”指β相的結(jié)合多肽的半衰期。人類抗體在人類的典型β相半衰期是21天。如上所示，抗體的可變區(qū)允許其選擇性地識(shí)別并特異性結(jié)合抗原上的表位。S卩，抗體的VL結(jié)構(gòu)域和VH結(jié)構(gòu)域組合形成定義三維抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變區(qū)(Fv)。四級(jí)抗體結(jié)構(gòu)形成存在于Y各臂末端的抗原結(jié)合位點(diǎn)。更具體地，抗原結(jié)合位點(diǎn)由各重鏈和輕鏈可變區(qū)上的三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)定義。本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗原結(jié)合位點(diǎn)”包括特異性結(jié)合(與之免疫反應(yīng))抗原諸如細(xì)胞表面或可溶抗原的位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合位點(diǎn)包括免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)，且這些可變區(qū)形成的結(jié)合位點(diǎn)決定抗體的特異性?？乖Y(jié)合位點(diǎn)由可變區(qū)形成，在多肽之間不同。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含含有抗體分子(如，其序列是本領(lǐng)域已知的或本文所述的)的至少一個(gè)重或輕鏈CDR的抗原結(jié)合位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含含有一個(gè)或多個(gè)抗體分子的至少兩個(gè)CDR的抗原結(jié)合位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含含有一個(gè)或多個(gè)抗體分子的至少三個(gè)CDR的抗原結(jié)合位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含含有一個(gè)或多個(gè)抗體分子的至少四個(gè)CDR的抗原結(jié)合位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含含有一個(gè)或多個(gè)抗體分子的至少五個(gè)CDR的抗原結(jié)合位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含含有抗體分子的六個(gè)CDR的抗原結(jié)合位點(diǎn)?？砂ㄔ诒景l(fā)明結(jié)合多肽中的包含至少一個(gè)CDR的示例性抗體分子是本領(lǐng)域已知的，示例性分子如本文所述。本文所用的術(shù)語(yǔ)"OTR"或"互補(bǔ)決定區(qū)"是指見(jiàn)于重鏈和輕鏈多肽兩者的可變區(qū)中的不連續(xù)抗原組合位點(diǎn)。這些具體區(qū)已描述于Kabat等人，J.Biol.Chem.252,6609-6616(1977)禾口Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest.(免疫學(xué)重要蛋白的序列)(1991)，和Chothia等人，J.Mol.Biol.196901-917(1987)以及MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732_745(1996)，其中該定義包括彼此比較時(shí)氨基酸殘基的重疊或子集。列出包含如上引用的參考文獻(xiàn)各自定義的CDR的氨基酸殘基用于比較。優(yōu)選地，術(shù)語(yǔ)“⑶R”是基于序列比較如Kabat定義的⑶R。CDR定義__Kabat1Chothia2MacCallum3VhCDRI31-3526-3230-35VhCDR250-6553-5547-58VhCDR395-10296-10193-101VlCDRI24-3426-3230-36VlCDR250-5650-5246-55VlCDR3_89-9791-96_89-96_1殘基編號(hào)遵循Kabat等人(前述)的命名法2殘基編號(hào)遵循Chothia等人(前述)的命名法3殘基編號(hào)遵循MacCallum等人(前述)的命名法本文所用的術(shù)語(yǔ)“構(gòu)架區(qū)”或“FR區(qū)”包括是可變區(qū)部分但不是⑶R(如，使用Kabat定義的CDR)部分的氨基酸殘基。因此，可變區(qū)構(gòu)架的長(zhǎng)度是約100-120氨基酸但只包括CDR之外的那些氨基酸。對(duì)于重鏈可變區(qū)的具體實(shí)例和對(duì)于Kabat等人定義的⑶R，構(gòu)架區(qū)1對(duì)應(yīng)含有氨基酸1-30的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域；構(gòu)架區(qū)2對(duì)應(yīng)含有氨基酸36-49的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域；構(gòu)架區(qū)3對(duì)應(yīng)含有氨基酸66-94的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域，構(gòu)架區(qū)4對(duì)應(yīng)氨基酸103到可變區(qū)末端的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域。輕鏈的構(gòu)架區(qū)相似地被各輕鏈可變區(qū)⑶R間隔。相似地，使用Chothia等人或McCallum等人對(duì)CDR的定義，構(gòu)架區(qū)邊界被如上所述的各自CDR末端間隔。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，⑶R如由Kabat定義的。在天然存在的抗體中，各單體抗體上存在的六個(gè)CDR是短的不連續(xù)的氨基酸序列，當(dāng)抗體在水環(huán)境中呈現(xiàn)其三維構(gòu)型時(shí)特異性地定位以形成抗原結(jié)合位點(diǎn)。重和輕可變結(jié)構(gòu)域的其余部分的氨基酸序列顯示較少的分子間變化性，稱為構(gòu)架區(qū)。構(gòu)架區(qū)主要采用β-片層構(gòu)象，⑶R形成環(huán)，該環(huán)連接β-片層結(jié)構(gòu)，并在一些情況形成β-片層結(jié)構(gòu)的部分。因此，這些構(gòu)架區(qū)作用為形成支架，通過(guò)鏈間非共價(jià)相互作用對(duì)六個(gè)CDR提供正確方向的定位。定位的CDR形成的抗原結(jié)合位點(diǎn)限定與免疫反應(yīng)性抗原上的表位互補(bǔ)的表面。該互補(bǔ)表面促進(jìn)抗體對(duì)免疫反應(yīng)性抗原表位的非共價(jià)結(jié)合。CDR的位置易于被本領(lǐng)域技術(shù)人員鑒定。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含至少兩個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(如，在相同結(jié)合多肽中(如，在單個(gè)多肽的N-和C-末端兩者)或連接到本發(fā)明多聚結(jié)合蛋白的各組成結(jié)合多肽)，提供結(jié)合多肽與所選抗原的締合?？乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域不必衍生自相同免疫球蛋白分子。在這方面，可變區(qū)可或可不衍生自可被誘導(dǎo)以引起體液應(yīng)答并針對(duì)期望的抗原產(chǎn)生免疫球蛋白的任何類型動(dòng)物。如此，可變區(qū)可為例如哺乳動(dòng)物來(lái)源的，如，可為人類、鼠、非人類的靈長(zhǎng)類(諸如獼猴、短尾猴等)、狼、駱駝科動(dòng)物(如，駱駝、美洲駝和相關(guān)物種)。術(shù)語(yǔ)“抗體變體”或“修飾的抗體”包括不是天然產(chǎn)生的抗體，因?yàn)槿绫疚乃龅闹辽僖粋€(gè)氨基酸或氨基酸修飾具有不同于天然衍生的抗體的氨基酸序列或氨基酸側(cè)鏈化學(xué)反應(yīng)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體變體”包括合成形式的抗體，其被改變以使其不是天然存在的，如，包含至少兩個(gè)重鏈部分但不是兩個(gè)完整重鏈的抗體(諸如，結(jié)構(gòu)域缺失的抗體或微型抗體)；多特異性形式的抗體(如，雙特異性、三特異性、等)被改變以結(jié)合兩個(gè)或多個(gè)不同抗原或結(jié)合單個(gè)抗原上的不同表位)；與scFv分子連接的重鏈分子；單鏈抗體；雙鏈抗體；三鏈抗體；和具有改變的效應(yīng)子功能的抗體，以及類似抗體。本文所用的術(shù)語(yǔ)“scFv分子”包括由輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)或其部分和重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)或其部分組成的結(jié)合分子，其中各可變結(jié)構(gòu)域(或其部分)衍生自相同或不同抗體。scFv分子優(yōu)選地包含介于VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域之間的scFv接頭。ScFv分子是本領(lǐng)域已知的，并描述于如，美國(guó)專利第5，892，019號(hào)、Ho等人1989.Gene7751；Bird等人1988Science242:423；Pantoliano等人1991.Biochemistry30:10117;Milenic等人1991.CancerResearch516363；Takkinen等人1991.ProteinEngineering4:837。本文所用的“scFv接頭”是指介于scFv的VL和VH結(jié)構(gòu)域之間的部分。scFv接頭優(yōu)選地保持scFv分子在抗原結(jié)合構(gòu)象。在一個(gè)實(shí)施方案中，scFv接頭包含scFv接頭肽或由scFv接頭肽組成。在某些實(shí)施方案中，scFv接頭肽包含gly-ser多肽接頭或由gly-ser多肽接頭組成。在其它實(shí)施方案中，scFv接頭包含二硫鍵。本文所用的術(shù)語(yǔ)“gly-ser多肽接頭”是指由甘氨酸和絲氨酸殘基組成的肽。示例性gly/ser多肽接頭包含氨基酸序列(Gly4Ser)n。在一個(gè)實(shí)施方案中，η=1。在一個(gè)實(shí)施方案中，η=2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，η=3，S卩，(Gly4Ser)3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，η=4，即，(Gly4Ser)4。在另一個(gè)實(shí)施方案中，η=5。在另一個(gè)實(shí)施方案中，η=6。在另一個(gè)實(shí)施方案中，η=7。在另一個(gè)實(shí)施方案中，η=8。在另一個(gè)實(shí)施方案中，η=9。在另一個(gè)實(shí)施方案中，η=10。另一示例性gly/ser多肽接頭包含氨基酸序列Ser(Gly4Ser)n。在一個(gè)實(shí)施方案中，η=1。在一個(gè)實(shí)施方案中，η=2。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，η=3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，η=4。在另一個(gè)實(shí)施方案中，η=5。在另一個(gè)實(shí)施方案中，η=6。本文所用的術(shù)語(yǔ)“蛋白穩(wěn)定性”是指蛋白響應(yīng)于環(huán)境條件(如升高的溫度或降低的溫度)保持一種或多種物理性質(zhì)的領(lǐng)域公認(rèn)的量度。在一個(gè)實(shí)施方案中，該物理性質(zhì)是保持蛋白的共價(jià)結(jié)構(gòu)(如不存在蛋白水解裂解、不想要的氧化或脫酰胺)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該物理性質(zhì)是存在正確折疊狀態(tài)的蛋白(如，不存在可溶或不溶的聚集體或沉淀)。術(shù)語(yǔ)“糖基化”是指共價(jià)連接一個(gè)或多個(gè)糖類到多肽。通常，糖基化是翻譯后事件，可發(fā)生在胞內(nèi)、細(xì)胞周?chē)蚱涮崛∥?。術(shù)語(yǔ)糖基化包括，例如，N-連接的糖基化(其中一個(gè)或多個(gè)糖連接到天冬酰胺殘基)和/或0-連接的糖基化(其中一個(gè)或多個(gè)糖連接到具有羥基基團(tuán)的氨基酸殘基(如，絲氨酸或蘇氨酸)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“天然半胱氨酸”應(yīng)指在多肽的特定氨基酸位置天然發(fā)生的半胱氨酸氨基酸，其還未被人工修飾、引入或改變。術(shù)語(yǔ)“工程化的半胱氨酸殘基或其類似物”或“工程化的半胱氨酸或其類似物”應(yīng)指非天然半胱氨酸殘基或半胱氨酸類似物(如，含有硫醇的類似物諸如噻唑啉-4-羧酸和噻唑烷_(kāi)4羧酸(硫代脯氨酸，Th))，其通過(guò)合成手段(如通過(guò)重組技術(shù)、體外肽合成、通過(guò)酶促或化學(xué)偶合肽或這些技術(shù)的一些組合)引入到多肽不天然包含半胱氨酸殘基或其類似物的氨基酸位置。本文所用的術(shù)語(yǔ)“二硫鍵”包括兩個(gè)硫原子之間形成的共價(jià)鍵。氨基酸半胱氨酸包含可與第二硫醇基形成二硫鍵或橋的硫醇基。在大多數(shù)天然存在的IgG分子中，CHl和CL區(qū)被天然二硫鍵連接，兩個(gè)重鏈被對(duì)應(yīng)于使用Kabat編號(hào)系統(tǒng)的位置239和242(EU編號(hào)系統(tǒng)的位置226或229)的兩個(gè)天然二硫鍵連接。本文所用的術(shù)語(yǔ)“結(jié)合的半胱氨酸”應(yīng)指多肽中天然或工程化的半胱氨酸殘基，其與相同或不同多肽中存在的第二天然或工程化的半胱氨酸或其它殘基形成二硫鍵或其它共價(jià)鍵?！版渻?nèi)結(jié)合的半胱氨酸”應(yīng)指共價(jià)結(jié)合于相同多肽中存在的第二半胱氨酸的結(jié)合的半胱氨酸(即鏈內(nèi)二硫鍵)?！版滈g結(jié)合的半胱氨酸”應(yīng)指共價(jià)結(jié)合于不同多肽中存在的第二半胱氨酸的結(jié)合的半胱氨酸(即鏈間二硫鍵)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“游離半胱氨酸”是指多肽序列中的天然或工程化的半胱氨酸氨基酸殘基(和其類似物或模擬物，如噻唑啉-4-羧酸和噻唑烷-4羧酸(硫代脯氨酸，Th))，其以基本還原形式存在。游離半胱氨酸優(yōu)選地能夠被本發(fā)明效應(yīng)子部分修飾。術(shù)語(yǔ)“硫醇修飾劑”應(yīng)指能夠選擇性地與結(jié)合多肽中工程化的半胱氨酸殘基或其類似物(如，在結(jié)合多肽的多肽接頭中)的硫醇基反應(yīng)的化學(xué)劑，并從而提供將效應(yīng)子部分位點(diǎn)特異性化學(xué)添加或交聯(lián)于結(jié)合多肽的手段，從而形成修飾的結(jié)合多肽。優(yōu)選地該硫醇修飾劑利用自由半胱氨酸殘基中存在的硫醇或巰基官能團(tuán)。示例性硫醇修飾劑包括馬來(lái)酰亞胺、鹵代烷和芳基鹵、α"?；u和吡啶二硫化物。術(shù)語(yǔ)“功能性部分”包括優(yōu)選地向結(jié)合多肽添加期望功能的部分。優(yōu)選地，添加功能而不顯著改變多肽的內(nèi)在期望活性，例如不顯著地改變分子的抗原結(jié)合活性。本發(fā)明結(jié)合多肽可以包含一個(gè)或多個(gè)功能性部分，這些部分可以相同或不同。有用的功能性部分的例子包括但不限于效應(yīng)子部分、親和性部分和封閉部分。示例性封閉部分包括，具有足以減少糖基化的立體容積和/或電荷的部分，例如，通過(guò)封閉糖苷酶使多肽糖基化的能力。封閉部分可另外地或可選地減少效應(yīng)子功能，例如通過(guò)抑制Fc區(qū)結(jié)合受體或補(bǔ)體蛋白的能力。優(yōu)選的封閉部分包括半胱氨酸加合物、胱氨酸、混合的二硫化物加合物和PEG部分。示例性可檢測(cè)部分包括熒光部分、放射性同位素部分、不透射線部分(radiopaquemoieties)和類似部分。關(guān)于化學(xué)部分的結(jié)合，術(shù)語(yǔ)“連接部分”包括能夠連接功能性部分與結(jié)合多肽其余部分的部分?？蛇x擇連接部分以使其可裂解或不可裂解。不可裂解的連接部分通常具有高的系統(tǒng)穩(wěn)定性，但也可能具有不利的藥代動(dòng)力學(xué)。術(shù)語(yǔ)“間隔子部分”是設(shè)計(jì)以引入間隔到分子中的非蛋白部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，間隔子部分可為任選地取代的0至100原子的鏈，所述原子選自碳、氧、氮、硫等。在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇間隔子部分以使其可水溶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，間隔子部分是聚(亞烷基)二醇，如，聚乙二醇或聚丙二醇。術(shù)語(yǔ)“PEG化部分”或“PEG部分”包括聚(亞烷基)二醇化合物或其衍生物，其具有或不具有偶聯(lián)劑或被偶聯(lián)或活化部分衍生化(例如，使用硫醇基、三氟甲磺酸醋、三氟乙磺酸酯(tresylate)、氮雜環(huán)丙烷、氧雜環(huán)丙烷、或優(yōu)選地具有馬來(lái)酰亞胺部分，例如PEG-馬來(lái)酰亞胺)。其它合適的聚(亞烷基)二醇化合物包括但不限于馬來(lái)酰亞胺基一甲氧基PEG、活化的PEG聚丙二醇、以及帶電荷的或中性的如下類型的聚合物葡聚糖、多聚乙酰神經(jīng)氨酸、或其它基于糖的聚合物、氨基酸的聚合物、及生物素衍生物。本文所用的術(shù)語(yǔ)“效應(yīng)子部分”(E)可包含具有生物或其它功能活性的診斷和治療劑(如蛋白、核酸、脂質(zhì)、藥物部分和其片段)。例如，與未結(jié)合的多肽相比，包含結(jié)合于結(jié)合多肽的效應(yīng)子部分的結(jié)合多肽具有至少一個(gè)另外的功能或性質(zhì)。例如，細(xì)胞毒性藥物部分(如，效應(yīng)子部分)結(jié)合于結(jié)合多肽(如，經(jīng)由其多肽接頭)造成形成具有藥物細(xì)胞毒性作為第二功能(即除了抗原結(jié)合以外)的修飾的多肽。在另一實(shí)例，第二結(jié)合多肽結(jié)合于第一結(jié)合多肽可賦予另外的結(jié)合性質(zhì)。一方面，其中效應(yīng)子部分是遺傳編碼的治療或診斷蛋白或核酸，效應(yīng)子部分可合成或通過(guò)肽合成或重組DNA方法表達(dá)，這是本領(lǐng)域已知的。另一方面，其中效應(yīng)子是非遺傳編碼的肽或藥物部分，效應(yīng)子部分可人工合成或從天然來(lái)源純化。本文所用的術(shù)語(yǔ)“藥物部分”包括抗炎、抗癌、抗_感染(如，抗真菌、抗細(xì)菌、抗寄生蟲(chóng)、抗病毒等)和麻醉治療劑。在進(jìn)一步實(shí)施方案中，藥物部分是抗癌或細(xì)胞毒性劑。相容的藥物部分還可包含前藥。本文所用的術(shù)語(yǔ)“前藥”是指藥物活性劑的前體或衍生物形式，與母本藥物相比活性較低、反應(yīng)性較低或不易發(fā)生副作用，并能夠酶促活化或以其它方式體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)楦钚缘男问?。與本發(fā)明相容的前藥包括但不限于，含有磷酸酯的前藥、含有氨基酸的前藥、含有硫代磷酸酯的前藥、含有硫酸酯的前藥、含有肽的前藥、含有β-內(nèi)酰胺的前藥、任選地取代的含有苯氧基乙酰胺的前藥或任選地取代的含有苯乙酰胺的前藥、5_氟胞嘧啶和可轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒性更高的游離型藥物的其它5-氟尿苷前藥。本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)期望的藥物部分或其前藥進(jìn)行化學(xué)修飾以使該化合物的反應(yīng)更便于制備本發(fā)明修飾的結(jié)合蛋白的目的。藥物部分還包括本文所述的藥物部分的衍生物、藥學(xué)可接受的鹽、酯、酰胺和醚。衍生物包括對(duì)本文鑒定的藥物的修飾，所述修飾可改進(jìn)或不顯著降低特定藥物的期望的治療活性。本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗癌劑”包括損害贅生性細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或增殖并可以用于降低、抑制或破壞惡性腫瘤的藥劑。此類藥劑的例子包括但不限于細(xì)胞抑制劑、烷化劑、抗生素、細(xì)胞毒性核苷、微管蛋白結(jié)合劑、激素和激素拮抗劑及類似物。可以起到阻滯或減緩免疫反應(yīng)性細(xì)胞或惡性細(xì)胞生長(zhǎng)的作用的任何藥劑均在本發(fā)明范圍內(nèi)?！坝H和性標(biāo)簽”或“親和性部分”是連接于一個(gè)或多個(gè)結(jié)合多肽、多肽接頭或效應(yīng)子部分的化學(xué)部分以便在純化過(guò)程中將其與其它組分分離。示例性親和性結(jié)構(gòu)域包括His標(biāo)簽、甲殼質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域、麥芽糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域、生物素和類似結(jié)構(gòu)域?！坝H和性樹(shù)脂”是能夠以高親和性結(jié)合親和性結(jié)構(gòu)域以便將結(jié)合于親和性結(jié)構(gòu)域的蛋白與反應(yīng)混合物的其它組分分離的化學(xué)表面。親和性樹(shù)脂可包被到固體支持物或其部分表面上?？蛇x地，親和性樹(shù)脂可包含固體支持物。這種固體支持物可包括適當(dāng)?shù)匦揎椀膶游鲋?、微滴定板、珠或生物芯?如玻璃晶片)。示例性親和性樹(shù)脂包含鎳、甲殼質(zhì)、淀粉酶和類似物。術(shù)語(yǔ)“載體”或“表達(dá)載體”在本文中用來(lái)指根據(jù)本發(fā)明用作將期望多核苷酸引入細(xì)胞并使該期望多核苷酸在細(xì)胞中表達(dá)的運(yùn)載體的載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，該載體可以容易地選自質(zhì)粒、噬菌體、病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。一般地，與本發(fā)明相容的載體包含選擇標(biāo)記、適當(dāng)?shù)南拗菩晕稽c(diǎn)以利于期望基因的克隆、以及進(jìn)入真核或原核細(xì)胞并/或在其中復(fù)制的能力。為了本發(fā)明的目的，可采用多種表達(dá)載體系統(tǒng)。例如，一類載體利用衍生自動(dòng)物病毒諸如牛乳頭狀瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、桿狀病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒(RSV、MMTV或M0MLV)或SV40病毒的DNA元件。其它載體涉及使用具有內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)的多順?lè)醋酉到y(tǒng)。示例性載體包括美國(guó)專利第6，159，730和6，413，777號(hào)、美國(guó)專利申請(qǐng)第20030157641Al號(hào)中描述的載體。另外，已將DNA整合進(jìn)染色體的細(xì)胞可通過(guò)引入一個(gè)或多個(gè)允許選擇轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞的標(biāo)記而選擇。標(biāo)記可提供對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷宿主的原養(yǎng)型、殺生物劑抗性(如，抗生素)或?qū)χ亟饘僦T如銅的抗性。選擇標(biāo)記基因可直接連接于待表達(dá)的DNA序列，或可通過(guò)共轉(zhuǎn)化引入同一細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)。還可需要其它元件以最佳合成mRNA。這些元件可包括信號(hào)序列、剪接信號(hào)，以及轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和終止信號(hào)。在一個(gè)實(shí)施方案中，分泌信號(hào)，如，多種確立的細(xì)菌前導(dǎo)肽的任一種(如，pelB、phoA或ompA)可符合讀框地融合于本發(fā)明多肽N末端以獲得多肽的最佳分泌。(Lei等人(1988)，Nature,331:543;Better等人(1988)Science,2401041；MulIinax等人，(1990).PNAS,878095)。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”指已被載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其中所述載體利用重組DNA技術(shù)構(gòu)建并編碼至少一個(gè)異源基因。在描述從重組宿主分離蛋白的方法時(shí)，除非另行清楚規(guī)定，否則術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可以互換使用以指蛋白的來(lái)源。換言之，從“細(xì)胞”回收蛋白可以指從離心沉淀的完整細(xì)胞，或者從含有培養(yǎng)基和懸浮細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物回收。用于蛋白表達(dá)的宿主細(xì)胞系最優(yōu)選地是哺乳動(dòng)物來(lái)源；本領(lǐng)域技術(shù)人員有能力優(yōu)先確定最適于本文待表達(dá)的期望的基因產(chǎn)物的特定宿主細(xì)胞系。示例性宿主細(xì)胞系包括但不限于，DG44和DUXBlK中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系，DHFR-)、HELA(人類宮頸癌)、CVI(猴腎細(xì)胞系)、C0S(具有SV40T抗原的CVI衍生物)、R1610(中國(guó)倉(cāng)鼠成纖維細(xì)胞)、BALBC/3T3(小鼠成纖維細(xì)胞)、HAK(倉(cāng)鼠腎細(xì)胞系)、SP2/0(小鼠骨髓瘤)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA_lclBPT(牛內(nèi)皮細(xì)胞)、RAJI(人類淋巴細(xì)胞)和293(人類腎細(xì)胞)。CHO細(xì)胞是特別優(yōu)選的。宿主細(xì)胞系通?？蓮纳虡I(yè)機(jī)構(gòu)、美國(guó)組織培養(yǎng)物保藏中心或公開(kāi)文獻(xiàn)獲得。本發(fā)明多肽還可在非哺乳動(dòng)物細(xì)胞諸如細(xì)菌或酵母或植物細(xì)胞表達(dá)。在這方面，應(yīng)理解的是，各種單細(xì)胞非哺乳動(dòng)物微生物諸如細(xì)菌也可被轉(zhuǎn)化；即能夠在培養(yǎng)物或發(fā)酵中生長(zhǎng)的微生物。易于轉(zhuǎn)化的細(xì)菌包括腸桿菌科的成員，諸如大腸桿菌或沙門(mén)氏菌的株系；芽孢桿菌科，諸如枯草芽孢桿菌；肺炎球菌；鏈球菌、和流感嗜血桿菌。應(yīng)進(jìn)一步理解的是，當(dāng)在細(xì)菌中表達(dá)時(shí)，多肽通常是包涵體的部分。多肽必須被分離、純化，隨后組裝為功能分子。除了原核生物，還可使用真核微生物。釀酒酵母或普通面包酵母是最常用的真核微生物，而多種其它株系通常也可獲得，包括巴斯德畢赤酵母。對(duì)于在酵母中表達(dá)，通常使用質(zhì)粒YRp7，例如(Stinchcomb等人，(1979)，Nature，282:39;Kingsman等人，(1979)，Gene，7:141；Tschemper等人，(1980)，Gene，10157)。該質(zhì)粒已包含TRPl基因，其為缺少在色氨酸中生長(zhǎng)的能力的酵母突變株例如ATCCNO.44076或PEP4-l提供選擇標(biāo)記(Jones，(1977),Genetics,8512)。作為酵母宿主細(xì)胞基因組特征，trpl損傷的存在則提供有效環(huán)境來(lái)通過(guò)在不存在色氨酸時(shí)生長(zhǎng)檢測(cè)轉(zhuǎn)化。體外生產(chǎn)允許放大規(guī)模以獲得大量期望的本發(fā)明改變結(jié)合多肽。組織培養(yǎng)條件下培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并包括均一的懸浮培養(yǎng)，如在氣升式反應(yīng)器或連續(xù)攪拌反應(yīng)器中，或固定或捕獲的細(xì)胞培養(yǎng)，如在空心纖維、微囊中、在瓊脂糖微珠或陶瓷芯上。如果需要和/或期望，多肽溶液可通過(guò)常規(guī)層析方法純化，例如凝膠過(guò)濾、離子交換層析、疏水相互作用層析(HIC)、DEAE-纖維素上的層析或親合層析。本文所用的"腫瘤相關(guān)抗原"指一般地與腫瘤細(xì)胞相關(guān)(即，與正常細(xì)胞相比，以相同或更大程度存在)的任何抗原。更一般地，腫瘤相關(guān)抗原包含提供在贅生性細(xì)胞定位免疫反應(yīng)性抗體的任何抗原，不考慮其在非惡性細(xì)胞上的表達(dá)。該抗原可以是相對(duì)地腫瘤特異性的，其表達(dá)限制于惡性細(xì)胞表面?？蛇x地，該抗原見(jiàn)于惡性細(xì)胞和非惡性細(xì)胞兩者上。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽優(yōu)選地結(jié)合于腫瘤相關(guān)抗原。因此，本發(fā)明結(jié)合多肽可以來(lái)源于、產(chǎn)生自或形成自與腫瘤相關(guān)分子反應(yīng)的多種抗體的任何一種。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“惡性腫瘤，，指非良性的腫瘤或癌。本文所用的術(shù)語(yǔ)“癌’，包括以去調(diào)節(jié)的或失控的細(xì)胞生長(zhǎng)為特征的惡性腫瘤。示例性癌包括癌瘤、肉瘤、白血病和淋巴瘤。術(shù)語(yǔ)“癌”包括原發(fā)性惡性腫瘤(例如，其細(xì)胞尚未向受治療者身體內(nèi)非原始腫瘤所在地的位點(diǎn)遷移的惡性腫瘤)和繼發(fā)性惡性腫瘤(例如，由腫瘤轉(zhuǎn)移-腫瘤細(xì)胞向不同于原始腫瘤所在地的第二位點(diǎn)遷移_引起的惡性腫瘤)。如本文所用，短語(yǔ)“將得益于結(jié)合多肽的施用的受治療者”包括將從下述受益的受治療者，例如哺乳動(dòng)物受治療者用于例如檢測(cè)本發(fā)明結(jié)合多肽所識(shí)別的抗原的結(jié)合多肽的施用(例如，用于診斷方法)和/或用結(jié)合多肽進(jìn)行治療以減少或消除結(jié)合多肽所識(shí)別的靶。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，受治療者可以由可溶分子或顆粒分子(例如毒素或病原體)自循環(huán)或血清中的減少或清除而受益，或者由表達(dá)靶的細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)群體的減少或消除而受益。如上所述的，結(jié)合多肽可以以非結(jié)合形式使用，或者可以例如與藥物、前藥或同位素結(jié)合以形成修飾的結(jié)合多肽來(lái)施用于所述受治療者。IL包含單鏈Fc(“scFc”)區(qū)的結(jié)合多肽在某些方面，本發(fā)明提供在單個(gè)多肽鏈中包含至少一個(gè)遺傳融合的Fc區(qū)或其部分的結(jié)合多肽(即，包含單鏈FC(SCFC)區(qū)的結(jié)合多肽)。優(yōu)選的本發(fā)明多肽在同一線性多肽鏈中包含至少兩個(gè)Fc部分(如，2、3、4、5、6或更多Fc部分)或Fc部分。優(yōu)選地，至少兩個(gè)(更優(yōu)選地所有)Fc部分能夠折疊(如，分子內(nèi)或分子間折疊)以形成至少一個(gè)賦予多肽效應(yīng)子功能的功能scFc區(qū)。例如，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽能夠經(jīng)由其scFc區(qū)結(jié)合于Fc受體(如FcRn、FcYR受體(如，F(xiàn)cγRIII)、或補(bǔ)體蛋白(如Clq))以激發(fā)免疫效應(yīng)子功能(如，抗體-依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)、吞噬作用、或補(bǔ)體-依賴性細(xì)胞毒性(CDCC))。在某些實(shí)施方案中，遺傳融合的Fc區(qū)(即，scFc區(qū))的至少兩個(gè)Fc部分在連續(xù)線性氨基酸序列中彼此直接融合以使第一Fc部分的C-末端與第二Fc部分的N-末端之間沒(méi)有介入的氨基酸或肽。然而在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，遺傳融合的Fc區(qū)(即，scFc區(qū))的至少兩個(gè)Fc部分(更優(yōu)選地所有)經(jīng)由介于至少兩個(gè)Fc部分之間的多肽接頭(如，合成的接頭)遺傳融合。多肽接頭確保至少兩個(gè)Fc部分的最佳折疊、排列和/或并置以使scFc區(qū)能夠以適當(dāng)?shù)挠H和性結(jié)合Fc受體，從而激發(fā)效應(yīng)子功能。例如，在某些實(shí)施方案遺傳融合的Fc區(qū)(即，scFc區(qū))能夠分子內(nèi)折疊(參見(jiàn)如，圖1中的單體(“％”)8沖(3構(gòu)建體)，而在其它實(shí)施方案中，遺傳融合的Fc區(qū)(即，scFc區(qū))能夠形成二聚的scFc構(gòu)建體。在某些實(shí)施方案中，遺傳融合的Fc區(qū)(即，scFc區(qū))能夠以至少10-7M(如，至少10_8M、至少1(Γ9Μ、至少ΙΟ,Μ、至少I(mǎi)iT11M或至少I(mǎi)(T12M)的結(jié)合親和性結(jié)合Fc受體。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽可包含含有序列組成相同或大致相同的的Fc部分的scFc區(qū)(本文稱為“同聚的scFc區(qū)”)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽可包含含有序列組成不同的至少兩個(gè)Fc部分的scFc區(qū)(即，本文稱為“異聚的scFc區(qū)”)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含含有至少一個(gè)插入或氨基酸取代的scFc區(qū)。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，異聚的scFc區(qū)在第一Fc部分包含氨基酸取代(如，在EU位置297的天冬酰胺氨基酸取代)，但在第二Fc部分不包含。在某些實(shí)施方案中，scFc區(qū)是半糖基化的。例如，異聚的scFc區(qū)可包含第一糖基化的Fc部分(如，糖基化的CH2區(qū))和第二無(wú)糖基化的Fc部分(如，無(wú)糖基化的CH2區(qū))，其中接頭介于糖基化的Fc部分和無(wú)糖基化的Fc部分之間。在其它實(shí)施方案中，scFc區(qū)是完全糖基化的，即，所有Fc部分是糖基化的。在又進(jìn)一步的實(shí)施方案中，scFc區(qū)可為無(wú)糖基化的，即，F(xiàn)c部分都不是糖基化的。本發(fā)明結(jié)合多肽可組裝在一起或與其它多肽組裝以形成多聚的結(jié)合多肽或蛋白(本文中也稱為“多聚體”)。本發(fā)明多聚的結(jié)合多肽或蛋白包含至少一個(gè)本發(fā)明結(jié)合多肽。因此，本發(fā)明是指而不限于單體以及多聚的(如，二聚、三聚、四聚、和六聚)結(jié)合多肽或蛋白和類似物。在某些實(shí)施方案中，所述多聚體的組成結(jié)合多肽是相同的(即同聚的多聚體，如同二聚體、同三聚體、同四聚體)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明多聚的蛋白的至少兩個(gè)組成多肽不同(即異聚的多聚體，如異二聚體、異三聚體、異四聚體)。在某些實(shí)施方案中，至少兩個(gè)本發(fā)明結(jié)合多肽能夠形成二聚體。例如，在某些實(shí)施方案結(jié)合多肽的遺傳融合的Fc區(qū)(即，scFc區(qū))保持未折疊，以使其組成性Fc部分不互相締合，但與另一結(jié)合多肽中相應(yīng)Fc部分締合(參見(jiàn)如，圖1B中二聚的(“dc”)SCFC構(gòu)建體)。多種可選設(shè)計(jì)的結(jié)合多肽也在本發(fā)明范圍中。例如，一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)可以多種方向融合于、連接于或并入(如，貼在其上)本發(fā)明scFc區(qū)。圖11描繪這種scFc結(jié)合多肽的多種非限制性實(shí)例。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含融合于scFc區(qū)N-末端的結(jié)合位點(diǎn)(圖11A)。在另一示例性實(shí)施方案中，結(jié)合多肽在scFc區(qū)的C-末端包含結(jié)合位點(diǎn)(圖11B)。本發(fā)明結(jié)合多肽可在scFc區(qū)的C-末端和N-末端兩者包含結(jié)合位點(diǎn)。在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽可在scFc區(qū)的N-末端和/或C-末端域間區(qū)(如，第一N-末端的Fc部分(圖11C)或第二C-末端的Fc部分(圖11D)的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域之間)包含結(jié)合位點(diǎn)?？蛇x地，結(jié)合位點(diǎn)可并入Fc部分的鉸鏈和CH2結(jié)構(gòu)域之間的域間區(qū)。在其它實(shí)施方案中，結(jié)合多肽可在scFc區(qū)的接頭多肽中包含一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(圖11E)。在又進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽包含引入scFc區(qū)的Fc部分的結(jié)合位點(diǎn)。例如，結(jié)合位點(diǎn)可貼入N-末端CH2結(jié)構(gòu)域(圖IF)、N-末端CH3結(jié)構(gòu)域(圖1G)、C-末端CH2結(jié)構(gòu)域(圖1H)、和/或C-末端CH3結(jié)構(gòu)域(圖II)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體的⑶R環(huán)貼入scFc區(qū)的CH3結(jié)構(gòu)域之一或兩者。將⑶R環(huán)和其它結(jié)合部分貼入Fc區(qū)的CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域的方法公開(kāi)于例如，國(guó)際PCT公布第W008/003116號(hào)，其以引用的方式并入本文。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明scFc結(jié)合多肽可包含兩個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(如，2、3、4或更多結(jié)合位點(diǎn))，它們使用描述于圖11A-I的方向的任意組合連接、融合、或整合(如，貼在其上)到本發(fā)明的scFc區(qū)。A.Fc部分用于產(chǎn)生本發(fā)明結(jié)合多肽的Fc部分可從許多不同來(lái)源獲得。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合多肽的Fc部分衍生自人類免疫球蛋白。然而應(yīng)理解，F(xiàn)c部分可衍生自另一哺乳動(dòng)物物種的免疫球蛋白，包括例如，嚙齒類(如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)或非人類的靈長(zhǎng)類(如黑猩猩、短尾猴)物種。而且，結(jié)合多肽Fc結(jié)構(gòu)域或其部分可衍生自任何免疫球蛋白類，包括IgM、IgG、IgD、IgA禾口IgE，以及任何免疫球蛋白同種型，包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用人類同種型IgGl。多種Fc部分基因序列(如人類恒定區(qū)基因序列)以公眾可取得的保藏形式可獲得?？蛇x擇包含F(xiàn)c部分序列的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域?yàn)榫哂刑囟ㄐ?yīng)子功能(或缺少特定效應(yīng)子功能)或帶有特定修飾以減少免疫原性。已公開(kāi)了抗體和編碼抗體的基因的許多序列，適當(dāng)?shù)腇c部分序列(如鉸鏈、CH2、和/或CH3序列、或其部分)可使用領(lǐng)域公認(rèn)技術(shù)衍生自這些序列。隨后使用前述任一種方法可改變或合成獲得的遺傳材料以獲得本發(fā)明多肽。應(yīng)進(jìn)一步理解，本發(fā)明的范圍包括恒定區(qū)DNA序列的等位基因、變體和突變?？扇纾褂镁酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)和被選擇以擴(kuò)增目標(biāo)結(jié)構(gòu)域的引物克隆Fc部分的序列。為了從抗體克隆Fc部分的序列，可從雜交瘤、脾、或淋巴細(xì)胞分離mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為DNA，PCR擴(kuò)增抗體基因。PCR擴(kuò)增方法詳細(xì)描述于美國(guó)專利第4，683，195；4，683，202；4，800，159；4，965，188號(hào)；以及如，"PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(PCR方案方法和應(yīng)用指導(dǎo))”Innis等人編輯，AcademicPress,SanDiego,CA(1990)；Ho等人1989.Gene7751；Horton等人1993.MethodsEnzymol.217270)。PCR可以通用恒定區(qū)引物開(kāi)始或以基于公開(kāi)的重和輕鏈DNA和氨基酸序列的更特異性引物開(kāi)始。如上所述，PCR還可用于分離編碼抗體輕和重鏈的DNA克隆。這種情況可通過(guò)通用引物或更大的同源探針諸如小鼠恒定區(qū)探針篩選文庫(kù)。適于擴(kuò)增抗體基因的許多引物組是本領(lǐng)域已知的(如，基于純化的抗體的N-末端序列的5，引物(Benhar和Pastan.1994.ProteinEngineering71509)；快速擴(kuò)增cDNA末端(Ruberti，F(xiàn).等人1994.J.Immunol.Methods17333)；抗體前導(dǎo)序列(Larrick等人1989Biochem.Biophys.Res.Commun.1601250)?？贵w序列的克隆進(jìn)一步描述于Newman等人，1995年1月25日提交的美國(guó)專利第5，658，570號(hào)，其以引用的方式并入本文。本發(fā)明結(jié)合多肽可包含兩個(gè)或多個(gè)Fc部分(如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多Fc部分)。這些兩個(gè)或多個(gè)Fc部分可形成Fc區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分可為不同類型。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合多肽中存在的至少一個(gè)Fc部分包含鉸鏈結(jié)構(gòu)域或其部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含至少一個(gè)包含至少一個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域或其部分的Fc部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含至少一個(gè)包含至少一個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域或其部分的Fc部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含至少一個(gè)包含至少一個(gè)CH4結(jié)構(gòu)域或其部分的Fc部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含至少一個(gè)包含至少一個(gè)鉸鏈結(jié)構(gòu)域或其部分和至少一個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域或其部分(如，以鉸鏈-CH2方向)的Fc部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含至少一個(gè)包含至少一個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域或其部分和至少一個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域或其部分(如，以CH2-CH3方向)的Fc部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含至少一個(gè)包含至少一個(gè)鉸鏈結(jié)構(gòu)域或其部分、至少一個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域或其部分、和至少一個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域或其部分，例如以鉸鏈-CH2-CH3、鉸鏈-CH3-CH2、或CH2-CH3-鉸鏈的方向的Fc部分。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合多肽包含至少一個(gè)衍生自一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白重鏈的完整Fc區(qū)(如，包括鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的Fc結(jié)構(gòu)域，盡管這些不必衍生自相同抗體)。在其它實(shí)施方案中，結(jié)合多肽包含至少兩個(gè)衍生自一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白重鏈的完整Fc區(qū)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，完整Fc部分衍生自人類IgG免疫球蛋白重鏈(如，人類IgGl)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含至少一個(gè)包含完整CH3結(jié)構(gòu)域(根據(jù)EU編號(hào)抗體Fc區(qū)的約氨基酸341-438)的Fc部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含至少一個(gè)包含完整CH2結(jié)構(gòu)域(根據(jù)EU編號(hào)抗體Fc區(qū)的約氨基酸231-340)的Fc部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含至少一個(gè)包含至少CH3結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)鉸鏈區(qū)(根據(jù)EU編號(hào)抗體Fc區(qū)的約氨基酸216-230)、以及CH2結(jié)構(gòu)域的Fc部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含至少一個(gè)包含鉸鏈和CH3結(jié)構(gòu)域的Fc部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含至少一個(gè)包含鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的Fc部分。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分衍生自人類IgG免疫球蛋白重鏈(如，人類IgGl)。構(gòu)成本發(fā)明結(jié)合多肽的Fc部分的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域或其部分可衍生自不同免疫球蛋白分子。例如，本發(fā)明多肽可包含衍生自IgGl分子的CH2結(jié)構(gòu)域或其部分和衍生自IgG3分子的CH3區(qū)或其部分。在另一實(shí)例，結(jié)合多肽可包含包含部分地衍生自IgGl分子和部分地衍生自IgG3分子的鉸鏈結(jié)構(gòu)域的Fc部分。如本文所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的是，F(xiàn)c部分可被改變以使其氨基酸序列不同于天然存在的抗體分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含包含一個(gè)或多個(gè)截短的，但足以賦予Fc區(qū)Fc受體(FcR)結(jié)合特性的Fc部分的scFc區(qū)。例如，結(jié)合于FcRn的Fc結(jié)構(gòu)域部分(即，F(xiàn)cRn結(jié)合部分)包含IgGl的EU編號(hào)約氨基酸282-438。因此，本發(fā)明結(jié)合多肽的Fc部分可包含F(xiàn)cRn結(jié)合部分或由FcRn結(jié)合部分組成。FcRn結(jié)合部分可衍生自任何同種型，包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的重鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用來(lái)自人類同種型IgGl的抗體的FcRn結(jié)合部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用來(lái)自人類同種型IgG4的抗體的FcRn結(jié)合部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽缺少完整Fc區(qū)的一個(gè)或多個(gè)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，即，它們是部分或完全缺失的。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽將缺少全部CH2結(jié)構(gòu)域(ACH2構(gòu)建體)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，由于CH2結(jié)構(gòu)域?qū)贵w代謝率的調(diào)節(jié)性質(zhì)，這種構(gòu)建體可為優(yōu)選的。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含衍生自編碼Igh人類恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的載體(如，來(lái)自IDECPharmaceuticals,SanDiego)的CH2結(jié)構(gòu)域缺失的Fc區(qū)(參見(jiàn)如,WO02/060955A2和W002/096948A2)。該示例性載體被工程化以缺失CH2結(jié)構(gòu)域并提供表達(dá)結(jié)構(gòu)域-缺失的IgGji定區(qū)的合成的載體。應(yīng)理解，這些示例性構(gòu)建體優(yōu)選地被工程化以將結(jié)合CH3結(jié)構(gòu)域直接融合于各自Fc結(jié)構(gòu)域的鉸鏈區(qū)。在其它構(gòu)建體中可能期望提供一個(gè)或多個(gè)組成性Fc部分之間的肽間隔子。例如，肽間隔子可置于鉸鏈區(qū)和CH2結(jié)構(gòu)域之間和/或CH2和CH3結(jié)構(gòu)域之間。例如，可表達(dá)相容的構(gòu)建體，其中CH2結(jié)構(gòu)域已被缺失，剩余的CH3結(jié)構(gòu)域(合成的或非合成的)以5-20氨基酸肽間隔子連接于鉸鏈區(qū)?？杉尤脒@種肽間隔子，例如，以確保恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的調(diào)節(jié)元件保持自由和可接近，或鉸鏈區(qū)保持柔性。優(yōu)選地，與本發(fā)明相容的任何接頭肽將是相對(duì)非免疫原性的，并不阻止正確折疊scFc區(qū)。i)對(duì)Fc氨基酸的改變?cè)谀承?shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽中采用的Fc部分是改變的，如，通過(guò)氨基酸突變(如，添加、缺失、或取代)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“Fc部分變體”是指與Fc部分衍生自的野生型Fc相比具有至少一個(gè)氨基酸取代的Fc部分。例如，其中Fc部分衍生自人類IgGl抗體，與野生型氨基酸相比，變體在人類IgGlFc區(qū)的相應(yīng)位置包含至少一個(gè)氨基酸突變(如，取代)。Fc變體的氨基酸取代可位于Fc部分中的位置，該位置被提及為對(duì)應(yīng)于以抗體中Fc區(qū)提供的殘基位置編號(hào)(如上述使用EU編號(hào)公約)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可易于進(jìn)行比對(duì)以確定對(duì)應(yīng)于Fc部分中位置的是什么EU編號(hào)。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c變體在位于鉸鏈結(jié)構(gòu)域或其部分的氨基酸位置包含取代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c變體在位于CH2結(jié)構(gòu)域或其部分的氨基酸位置包含取代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c變體在位于CH3結(jié)構(gòu)域或其部分的氨基酸位置包含取代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c變體在位于CH4結(jié)構(gòu)域或其部分的氨基酸位置包含取代。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含包含多于一個(gè)氨基酸取代的Fc變體。本發(fā)明結(jié)合多肽可包含，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多氨基酸取代。優(yōu)選地，氨基酸取代在空間上定位為彼此間隔至少1氨基酸位置或更多，例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10氨基酸位置或更多。更優(yōu)選地，工程化的氨基酸在空間上定位為彼此間隔至少5、10、15、20或25氨基酸位置或更多。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)c變體賦予在包含所述野生型Fc結(jié)構(gòu)域的Fc區(qū)賦予的至少一個(gè)效應(yīng)子功能的改進(jìn)(如，F(xiàn)c區(qū)結(jié)合Fc受體(如FcyRI、FcyRII或FcyRIII)或補(bǔ)體蛋白(如Clq)的能力、或激發(fā)抗體-依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)、吞噬作用、或補(bǔ)體-依賴性細(xì)胞毒性(CDCC)的能力上的改進(jìn))。在其它實(shí)施方案中，F(xiàn)c變體提供工程化的半胱氨酸殘基。本發(fā)明結(jié)合多肽可采用已知賦予效應(yīng)子功能和/或FcR結(jié)合的改進(jìn)的領(lǐng)域公認(rèn)的Fc變體。具體地，本發(fā)明結(jié)合分子可包括，例如，在以下公開(kāi)的氨基酸位置的一個(gè)或多個(gè)的改變(如，取代)國(guó)際PCT公布W088/07089A1、W096/14339A1、W098/05787A1、W098/23289AUW099/51642A1、W099/58572A1、W000/09560A2、W000/32767A1、W000/42072A2、W002/44215A2、W002/060919A2、W003/074569A2、W004/016750A2、W004/029207A2、W004/035752A2、W004/063351A2、W004/074455A2、W004/099249A2、W005/040217A2、W004/044859、W005/070963A1、W005/077981A2、W005/092925A2、W005/123780A2、W006/019447AUW006/047350A2和W006/085967A2；美國(guó)專利公布第US2007/0231329、US2007/0231329,US2007/0237765,US2007/0237766,US2007/0237767,US2007/0243188、US20070248603、US20070286859、US20080057056號(hào)；或美國(guó)專利第5，648，260；5，739，277；5，834，250；5，869，046；6，096，871；6，121，022；6，194，551；6，242，195；6，277，375；6，528，624；6，538，124；6，737，056；6，821，505；6，998，253；7，083，784；和7，317，091號(hào)，其各自以引用的方式并入本文。在一個(gè)實(shí)施方案中，在公開(kāi)的氨基酸位置的一個(gè)或多個(gè)可進(jìn)行特定改變(如，特定取代本領(lǐng)域公開(kāi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在公開(kāi)的氨基酸位置的一個(gè)或多個(gè)可進(jìn)行不同改變(如，不同取代本領(lǐng)域公開(kāi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽可包含在對(duì)應(yīng)于Fc部分的“15埃接觸區(qū)”中的EU氨基酸位置的氨基酸位置包含氨基酸取代的Fc部分變體。15埃接觸區(qū)包括位于全長(zhǎng)野生型Fc部分的EU位置243至261、275至280、282_293、302至319、336至348、367、369,372至389、391、393、408和424-440的殘基。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含對(duì)Fc部分的氨基酸取代，這改變抗體的抗原-不依賴性效應(yīng)子功能，尤其是抗體的循環(huán)半衰期。與缺少這些取代的結(jié)合多肽相比，這種結(jié)合多肽表現(xiàn)出對(duì)FcRn的結(jié)合增加或減少，并因此分別具有血清中增加的或減少的半衰期。預(yù)料對(duì)FcRn有改進(jìn)的親和性的Fc變體具有更長(zhǎng)的血清半衰期，且這種分子在期望施用的多肽半衰期長(zhǎng)的哺乳動(dòng)物治療方法中具有有用的應(yīng)用，如，治療慢性疾病或病癥。相反，預(yù)料具有減少的FcRn結(jié)合親和性的Fc變體具有短的半衰期，這種分子可用于例如，施用于短的循環(huán)時(shí)間可為有益的哺乳動(dòng)物，如用于體內(nèi)診斷成像或起始多肽長(zhǎng)時(shí)間存在于循環(huán)中時(shí)具有毒副作用的情況。具有減少的FcRn結(jié)合親和性的Fc變體也較不可能穿過(guò)胎盤(pán)，因此，可用于治療孕婦的疾病或紊亂。此外，期望減少的FcRn結(jié)合親和性的其它應(yīng)用包括其中期望定位腦、腎和/或肝的那些應(yīng)用。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽表現(xiàn)出從脈管系統(tǒng)跨腎小球上皮的轉(zhuǎn)運(yùn)減少。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽表現(xiàn)從腦跨血腦屏障(BBB)進(jìn)入血管空間的轉(zhuǎn)運(yùn)減少。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有改變的FcRn結(jié)合的結(jié)合多肽包含在Fc部分的“FcRn結(jié)合環(huán)”中具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代的至少一個(gè)Fc部分(如，一個(gè)或兩個(gè)Fc部分)。FcRn結(jié)合環(huán)包含野生型全長(zhǎng)Fc部分的氨基酸殘基280-299(根據(jù)EU編號(hào))。在其它實(shí)施方案中，具有改變的FcRn結(jié)合親和性的本發(fā)明結(jié)合多肽包含在15人FcRn“接觸區(qū)”中具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代的至少一個(gè)Fc部分(如，一個(gè)或兩個(gè)Fc部分)。本文所用的術(shù)語(yǔ)15AFcRn“接觸區(qū)”包括在野生型全長(zhǎng)Fc部分的以下位置的殘基:243-261、275-280、282-293、302-319、336-348、367、369、372-389、391、393、408,424,425-440(EU編號(hào))。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有改變的FcRn結(jié)合親和性的本發(fā)明結(jié)合多肽包含在對(duì)應(yīng)以下EU位置任何一個(gè)的氨基酸位置具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代的至少一個(gè)Fc部分(如，一個(gè)或兩個(gè)Fc部分):256、277-281、283-288、303-309、313、338、342、376、381、384、385、387、434(如，N434A或N434K)、和438。改變FcRn結(jié)合活性的示例性氨基酸取代公開(kāi)于國(guó)際PCT公布第W005/047327號(hào)，其以引用的方式并入本文。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含包含例如與野生型Fc區(qū)相比改變多肽的抗原-依賴性效應(yīng)子功能(尤其是如ADCC或補(bǔ)體活化)的氨基酸取代的Fc變體。在示例性實(shí)施方案中，所述結(jié)合多肽表現(xiàn)對(duì)Fcγ受體(如，CD16)改變的結(jié)合。當(dāng)與野生型多肽相比時(shí)，這種結(jié)合多肽表現(xiàn)對(duì)FcRγ的結(jié)合增加或減少，并因此分別介導(dǎo)增強(qiáng)的或減少的效應(yīng)子功能。預(yù)料對(duì)FcγR具有增強(qiáng)的親和性的Fc變體將增強(qiáng)效應(yīng)子功能，且這種分子在期望破壞靶分子的哺乳動(dòng)物治療方法中具有有用的應(yīng)用，如腫瘤治療。相反，預(yù)期具有減少的FcγR結(jié)合親和性的Fc變體將減少效應(yīng)子功能，這種分子也可用于例如治療其中不期望破壞靶細(xì)胞的情況，如，當(dāng)正常細(xì)胞可表達(dá)靶分子，或當(dāng)長(zhǎng)期施用多肽可能造成不想要的免疫系統(tǒng)活化。在一個(gè)實(shí)施方案中，與包含野生型Fc區(qū)的多肽相比，包含scFc的多肽表現(xiàn)至少一種改變的抗原-依賴性效應(yīng)子功能，所述功能選自調(diào)理作用、吞噬作用、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性、抗原-依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)、或效應(yīng)子細(xì)胞調(diào)節(jié)組成的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合多肽表現(xiàn)對(duì)活化FcγR(如FcγRI、FcγRIIa或FcγRIIIa)改變的結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合多肽表現(xiàn)對(duì)抑制性FcγR(如FcγRIIb)改變的結(jié)合親和性。在其它實(shí)施方案中，具有增加的FcγR結(jié)合親和性(如增加的FcγRIIIa結(jié)合親和性)的本發(fā)明結(jié)合多肽包含在對(duì)應(yīng)于一個(gè)或多個(gè)以下位置的氨基酸位置具有氨基酸取代的至少一個(gè)Fc部分(如，一個(gè)或兩個(gè)Fc部分)239、268、298、332、334和378(EU編號(hào))。在其它實(shí)施方案中，具有減少的FcγR結(jié)合親和性(如減少的FcyRI、FcγRII或FcγRIIIa結(jié)合親和性)的本發(fā)明結(jié)合多肽包含在對(duì)應(yīng)于一個(gè)或多個(gè)以下位置的氨基酸位置具有氨基酸取代的至少一個(gè)Fc部分(如，一個(gè)或兩個(gè)Fc部分):234、236、239、241、251、252、261、265、268、293、294、296、298、299、301、326、328、332、334、338、376、378和435(EU編號(hào))。在其它實(shí)施方案中，具有增加的補(bǔ)體結(jié)合親和性(如增加的Clq結(jié)合親和性)的本發(fā)明結(jié)合多肽包含在對(duì)應(yīng)于一個(gè)或多個(gè)以下位置的氨基酸位置具有氨基酸取代的Fc部分(如，一個(gè)或兩個(gè)Fc部分)251、334、378和435(EU編號(hào))。在其它實(shí)施方案中，具有減少的補(bǔ)體結(jié)合親和性(如減少的Clq結(jié)合親和性)的本發(fā)明結(jié)合多肽包含在對(duì)應(yīng)于一個(gè)或多個(gè)以下位置的氨基酸位置具有氨基酸取代的Fc部分(如，一個(gè)或兩個(gè)Fc部分)239、294、296、301、328、333和376(EU編號(hào))。改變FcYR或補(bǔ)體結(jié)合活性的示例性氨基酸取代公開(kāi)于國(guó)際PCT公布第W005/063815號(hào)，其以引用的方式并入本文。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽可包含一個(gè)或多個(gè)以下特定取代S239D、S239E、M252T、H268D、H268E、I332D、I332E、N434A和N434K(即，在對(duì)應(yīng)于抗體Fc區(qū)中一個(gè)或多個(gè)這些EU編號(hào)位置的氨基酸位置的一個(gè)或多個(gè)這些取代)。本發(fā)明結(jié)合多肽還可包含改變結(jié)合多肽的糖基化的氨基酸取代。例如，結(jié)合多肽的scFc區(qū)可包含具有造成減少的糖基化(如，N-或0-連接的糖基化)的突變的Fc部分，或可包含野生型Fc部分的改變的糖形(如，低巖藻糖或無(wú)巖藻糖的聚糖)。在示例性實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分包含N-連接的聚糖減少的糖基化，通常見(jiàn)于氨基酸位置297(EU編號(hào))。在另一示例性實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分在氨基酸位置297(EU編號(hào))包含低巖藻糖或無(wú)巖藻糖的聚糖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合多肽具有或靠近糖基化基序或糖基化基序中的氨基酸取代，例如，包含氨基酸序列NXT或NXS的N-連接的糖基化基序。在特定實(shí)施方案中，結(jié)合多肽在對(duì)應(yīng)于Fc的299的氨基酸位置(EU編號(hào))包含氨基酸取代。減少或改變糖基化的示例性氨基酸取代公開(kāi)于國(guó)際PCT公布第W005/018572號(hào)和美國(guó)專利公布第2007/0111281號(hào)，其以引用的方式并入本文。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含具有位于溶劑暴露表面的工程化的半胱氨酸殘基或其類似物的至少一個(gè)Fc部分。優(yōu)選地工程化的半胱氨酸殘基或類似物不干擾scFc區(qū)賦予的效應(yīng)子功能。更優(yōu)選地，該改變不干擾scFc區(qū)結(jié)合Fc受體(如FcYRI、或補(bǔ)體蛋白(如Clq)、或激發(fā)免疫效應(yīng)子功能(如，抗體-依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)、吞噬作用、或補(bǔ)體-依賴性細(xì)胞毒性(CDCC))的能力。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含包含至少一個(gè)工程化的自由半胱氨酸殘基或其類似物的Fc部分，該工程化的自由半胱氨酸殘基或其類似物基本上不與第二半胱氨酸殘基成二硫鍵。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽可包含在CH3結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)以下位置具有工程化的半胱氨酸殘基或其類似物的Fc部分349-371、390、392、394-423、441-446和446b(EU編號(hào))。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含在以下任一位置具有工程化的半胱氨酸殘基或其類似物的Fc變體350、355、359、360、361、389、413、415、418、422、441、443和EU位置446b(EU編號(hào))。任何上述工程化的半胱氨酸殘基或其類似物隨后可使用領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)(如，以硫醇_反應(yīng)性異雙官能接頭結(jié)合)結(jié)合于功能性部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽可包含具有兩個(gè)或多個(gè)獨(dú)立選自本文所述的Fc部分的組成性Fc部分的遺傳融合的Fc區(qū)(S卩，scFc區(qū))。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分相同。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少兩個(gè)Fc部分不同。例如，本發(fā)明結(jié)合多肽的Fc部分包含相同數(shù)目的氨基酸殘基或其可長(zhǎng)度可相差一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基(如，約5個(gè)氨基酸殘基(如，1、2、3、4或5個(gè)氨基酸殘基)、約10個(gè)殘基、約15個(gè)殘基、約20個(gè)殘基、約30個(gè)殘基、約40個(gè)殘基或約50個(gè)殘基)。在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽的Fc部分的序列可在一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置不同。例如，至少兩個(gè)Fc部分可在約5個(gè)氨基酸位置(如，1、2、3、4或5個(gè)氨基酸位置)、約10個(gè)位置、約15個(gè)位置、約20個(gè)位置、約30個(gè)位置、約40個(gè)位置或約50個(gè)位置)不同。B.多肽接頭在某些方面，期望采用多肽接頭來(lái)遺傳融合本發(fā)明結(jié)合多肽scFc區(qū)的兩個(gè)或多個(gè)Fc結(jié)構(gòu)域或部分。這種多肽接頭本文稱為“Fc連接多肽”。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽接頭是合成的。關(guān)于多肽接頭本文所用的術(shù)語(yǔ)“合成的”包括肽(或多肽)，其包含在線性氨基酸序列中連接于自然界中不天然連接的序列(可天然存在或不存在)(如，F(xiàn)c部分序列)的氨基酸序列(可天然存在或不存在)。例如，所述多肽接頭可包含非天然存在的多肽，其是天然存在多肽的修飾的形式(如，包含突變諸如添加、取代或缺失)或包含第一氨基酸序列(可天然存在或不存在)。可采用本發(fā)明的多肽接頭，例如，以確保遺傳融合的Fc區(qū)(即，scFc區(qū))的Fc部分或結(jié)構(gòu)域并置以確保功能性scFc區(qū)的正確折疊和形成。優(yōu)選地，與本發(fā)明相容的多肽接頭將是相對(duì)非免疫原性的，不抑制結(jié)合蛋白的單體亞基之間的任何非共價(jià)締合。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽采用多肽接頭以在單個(gè)多肽鏈中符合讀框地連接任何兩個(gè)或多個(gè)Fc部分或結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)或多個(gè)Fc部分或結(jié)構(gòu)域可獨(dú)立地選自前述段落A中討論的任何Fc部分。例如，在某些實(shí)施方案中，多肽接頭可用于融合相同F(xiàn)c部分，從而形成同聚的scFc區(qū)。在其它實(shí)施方案中，多肽接頭可用于融合不同F(xiàn)c部分(如野生型Fc部分和Fc部分變體)，從而形成異聚的scFc區(qū)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽接頭可用于將第一Fc部分(如鉸鏈結(jié)構(gòu)域或其部分、CH2結(jié)構(gòu)域或其部分、完整CH3結(jié)構(gòu)域或其部分、FcRn結(jié)合部分、FcyR結(jié)合部分、補(bǔ)體結(jié)合部分、或其部分)的C-末端遺傳融合于第二Fc部分(如，完整Fc結(jié)構(gòu)域)的N-末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，合成的多肽接頭包含F(xiàn)c部分的部分。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽接頭可包含IgGl、IgG2、IgG3和/或IgG4抗體的免疫球蛋白鉸鏈結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽接頭可包含IgGl、IgG2、IgG3和/或IgG4抗體的CH2結(jié)構(gòu)域。在其它實(shí)施方案中，多肽接頭可包含IgGl、IgG2、IgG3和/或IgG4抗體的CH3結(jié)構(gòu)域。還可使用免疫球蛋白(如人類免疫球蛋白)的其它部分。例如，多肽接頭可包含CH1結(jié)構(gòu)域或其部分、CL結(jié)構(gòu)域或其部分、VH結(jié)構(gòu)域或其部分、或VL結(jié)構(gòu)域或其部分。所述部分可衍生自任何免疫球蛋白，包括例如IgGl、IgG2、IgG3和/或IgG4抗體。在示例性實(shí)施方案中，多肽接頭可包含至少部分的免疫球蛋白鉸鏈區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽接頭包含上部鉸鏈結(jié)構(gòu)域(如，IgGl、IgG2、IgG3或IgG4上部鉸鏈結(jié)構(gòu)域)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽接頭包含中部鉸鏈結(jié)構(gòu)域(如，IgGl、IgG2、IgG3或IgG4中部鉸鏈結(jié)構(gòu)域)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽接頭包含下部鉸鏈結(jié)構(gòu)域(如，IgGl、IgG2、IgG3或IgG4下部鉸鏈結(jié)構(gòu)域)。示例性鉸鏈結(jié)構(gòu)域部分列在下表1。此外，可采用這些示例性鉸鏈的任何亞_部分(如，IgG3中部區(qū)的重復(fù)部分(S卩，EPKS⑶TPPPCPRCP)。表1:IgGl、IgG2、IgG3和IgG4鉸鏈結(jié)構(gòu)域<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>在其它實(shí)施方案中，可構(gòu)建組合衍生自相同或不同抗體同種型的鉸鏈元件的多肽接頭。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽接頭包含包含至少部分的IgGl鉸鏈區(qū)和至少部分的IgG2鉸鏈區(qū)的嵌合鉸鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽接頭包含包含至少部分的IgGl鉸鏈區(qū)和至少部分的IgG3鉸鏈區(qū)的嵌合鉸鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽接頭包含包含至少部分的IgGl鉸鏈區(qū)和至少的部分IgG4鉸鏈區(qū)的嵌合鉸鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽接頭包含包含至少的部分IgG2鉸鏈區(qū)和至少的部分IgG3鉸鏈區(qū)的嵌合鉸鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽接頭包含包含至少部分的IgG2鉸鏈區(qū)和至少部分的IgG4鉸鏈區(qū)的嵌合鉸鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽接頭包含包含至少部分的IgGl鉸鏈區(qū)、至少部分的IgG2鉸鏈區(qū)和至少部分的IgG4鉸鏈區(qū)的嵌合鉸鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽接頭可包含IgGl上部和中部鉸鏈和單個(gè)IgG3中部鉸鏈重復(fù)基序。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽接頭可包含IgG4上部鉸鏈、IgGl中部鉸鏈和IgG2下部鉸鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽接頭包含gly-ser接頭或由gly-ser接頭組成。本文所用的術(shù)語(yǔ)“gly-ser接頭”是指一種由甘氨酸和絲氨酸殘基組成的肽。示例性gly/ser接頭包含式(Gly4Ser)n的氨基酸序列，其中n是正整數(shù)(如，1、2、3、4或5)。優(yōu)選的gly/ser接頭是(Gly4Ser)4。另一優(yōu)選的gly/ser接頭是(Gly4Ser)3。另一示例性gly-ser接頭是GGGSSGGGSG(SEQIDNO:24)。在某些實(shí)施方案中，所述gly-ser接頭可插入多肽接頭(如，本文所述的任何多肽接頭序列)的兩個(gè)其它序列之間。在其它實(shí)施方案中，gly-ser接頭連接在多肽接頭(如，本文所述的任何多肽接頭序列)的另一序列的一端或兩端。在其他的實(shí)施方案中，兩個(gè)或多個(gè)gly-ser接頭連續(xù)地并入多肽接頭。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽接頭包含至少部分的上部鉸鏈區(qū)(如，衍生自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4分子)、至少部分的中部鉸鏈區(qū)(如，衍生自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4分子)和一連串gly/ser氨基酸殘基(如，gly/ser接頭諸如(Gly4Ser)n)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽接頭包含諸如W002/060955所述的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽接頭包含氨基酸序列IGKTISKKAK。另一示例性多肽接頭包含序列(G4S)4GGGAS。特別優(yōu)選的多肽接頭包含氨基酸序列SLSLSPGGGGGSEPKSS。另一優(yōu)選的多肽接頭包含人類IgGl鉸鏈序列，如，DKTHTCPPCPAPELLGG。另一優(yōu)選的多肽接頭包含兩者的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽接頭包含非天然存在的免疫球蛋白鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域，如，不是天然見(jiàn)于包含該鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域的多肽的鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域和/或已被改變以使其氨基酸序列不同于天然存在的免疫球蛋白鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域的鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，可對(duì)鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域突變以制備本發(fā)明的多肽接頭。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽接頭包含不包含天然存在數(shù)目的半胱氨酸的鉸鏈結(jié)構(gòu)域，即，多肽接頭包含比天然存在的鉸鏈分子更少的半胱氨酸或更多數(shù)目的半胱氨酸。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，多肽接頭包含在對(duì)應(yīng)于氨基酸位置230(EU編號(hào)系統(tǒng))的氨基酸位置包含脯氨酸殘基的鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽接頭在對(duì)應(yīng)于位置231(EU編號(hào)系統(tǒng))的氨基酸位置包含丙氨酸殘基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽接頭在對(duì)應(yīng)于位置232(EU編號(hào)系統(tǒng))的氨基酸位置包含脯氨酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽接頭在對(duì)應(yīng)于位置226(EU編號(hào)系統(tǒng))的氨基酸位置包含半胱氨酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽接頭在對(duì)應(yīng)于位置226(EU編號(hào)系統(tǒng))的氨基酸位置包含絲氨酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽接頭在對(duì)應(yīng)于位置229(EU編號(hào)系統(tǒng))的氨基酸位置包含半胱氨酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽接頭在對(duì)應(yīng)于位置229(EU編號(hào)系統(tǒng))的氨基酸位置包含絲氨酸殘基。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽接頭包含生物相關(guān)的肽序列或其序列部分。例如，生物相關(guān)的肽序列可包括但不限于衍生自抗排斥肽或抗炎肽的序列。所述抗排斥肽或抗炎肽可選自細(xì)胞因子抑制肽、細(xì)胞粘著抑制肽、凝血酶抑制肽和血小板抑制肽組成的組。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，多肽接頭包含選自IL-1抑制或拮抗劑肽序列、促紅細(xì)胞生成素(EP0)-模擬肽序列、促血小板生成素(TP0)-模擬肽序列、G-CSF模擬肽序列、TNF-拮抗劑肽序列、整聯(lián)蛋白-結(jié)合肽序列、選擇蛋白拮抗劑肽序列、抗_病原肽序列、血管活性腸肽(VIP)模擬肽序列、鈣調(diào)蛋白拮抗劑肽序列、巨細(xì)胞拮抗劑、SH3拮抗劑肽序列、尿激酶受體(UKR)拮抗劑肽序列、生長(zhǎng)激素抑制素或皮質(zhì)抑素模擬肽序列、巨噬細(xì)胞和/或T-細(xì)胞抑制肽序列組成的組的肽序列。任何一種可采用作為多肽接頭的示例性肽序列公開(kāi)于美國(guó)專利第6，660，843號(hào)，其以引用的方式并入本文。在其它實(shí)施方案中，多肽接頭包含一個(gè)或多個(gè)任何一個(gè)下述結(jié)合位點(diǎn)(如，F(xiàn)ab、scFv分子、配體的受體結(jié)合部分、受體的配體結(jié)合部分等)。應(yīng)理解，通過(guò)引入一個(gè)或多個(gè)核苷酸取代、添加或缺失到編碼多肽接頭的核苷酸序列以使一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、添加或缺失引入多肽接頭，可產(chǎn)生這些示例性多肽接頭的變體形式。例如，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，諸如定點(diǎn)誘變和PCR-介導(dǎo)的誘變引入突變。“保守氨基酸取代"是氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基代替的取代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族已在本領(lǐng)域定義，包括堿性側(cè)鏈(如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，酸性側(cè)鏈(如，天冬氨酸、谷氨酸)，不帶電荷的極性側(cè)鏈(如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非極性側(cè)鏈(如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，β-支鏈側(cè)鏈(如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香側(cè)鏈(如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸殘基優(yōu)選地被相同側(cè)鏈家族的另一氨基酸殘基代替。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一串氨基酸可被結(jié)構(gòu)相似的而側(cè)鏈家族成員的順序和/或組成不同的一串氨基酸代替。本發(fā)明的多肽接頭的長(zhǎng)度為至少一個(gè)氨基酸并可有不同長(zhǎng)度。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽接頭的長(zhǎng)度是從約1至約50氨基酸。在該上下文中所用的術(shù)語(yǔ)約表示+/_兩個(gè)氨基酸殘基。因?yàn)榻宇^長(zhǎng)度必須是正整數(shù)，長(zhǎng)度為從約1至約50氨基酸的長(zhǎng)度，是指長(zhǎng)度從1至48-52氨基酸的長(zhǎng)度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽接頭的長(zhǎng)度是從約10-20氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽接頭的長(zhǎng)度是從約15至約50氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽接頭的長(zhǎng)度是從約20至約45氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽接頭的長(zhǎng)度是從約15至約25氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽接頭的長(zhǎng)度是從約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50或60氨基酸。可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)引入多肽接頭到多肽序列。修飾可由DNA序列分析證實(shí)。質(zhì)粒DNA可用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞用于穩(wěn)定地產(chǎn)生所產(chǎn)生的多肽。C.靶結(jié)合位點(diǎn)在某些方面，本發(fā)明結(jié)合多肽包含至少一個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)。因此，本發(fā)明結(jié)合多肽通常包含至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)和至少一個(gè)遺傳融合的Fc區(qū)(即，scFc區(qū))。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合位點(diǎn)可操作地連接(如，化學(xué)結(jié)合或遺傳融合(如，直接或經(jīng)由多肽接頭))于遺傳融合的Fc區(qū)的N-末端。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合位點(diǎn)可操作地連接(如，化學(xué)結(jié)合或遺傳融合(如，直接或經(jīng)由多肽接頭))于遺傳融合的Fc區(qū)的C-末端。在其它實(shí)施方案中，結(jié)合位點(diǎn)是經(jīng)由遺傳融合的Fc區(qū)的氨基酸側(cè)鏈可操作地連接的(如，化學(xué)結(jié)合或遺傳融合的(如，直接或經(jīng)由多肽接頭))。在某些示例性實(shí)施方案中，結(jié)合位點(diǎn)經(jīng)由人類免疫球蛋白鉸鏈結(jié)構(gòu)域或其部分(如，人類IgGl序列，如，DKTHTCPPCPAPELLGG(SEQIDNO81))融合于遺傳融合的Fc區(qū)(即，scFc區(qū))。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)和至少一個(gè)遺傳融合的Fc區(qū)。例如，結(jié)合位點(diǎn)可以可操作地連接于單個(gè)遺傳融合的Fc區(qū)的N-末端和C-末端兩者。在其它示例性實(shí)施方案中，結(jié)合位點(diǎn)可以可操作地連接于多個(gè)遺傳融合的Fc區(qū)(如，兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或更多scFc區(qū))的N-和C-末端兩者，所述多個(gè)遺傳融合的Fc區(qū)串聯(lián)連接在一起以形成遺傳融合的Fc區(qū)的串聯(lián)隊(duì)列。在其它實(shí)施方案中，兩個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)彼此串聯(lián)連接(如，經(jīng)由多肽接頭)，結(jié)合位點(diǎn)的串聯(lián)隊(duì)列可操作地連接(如，化學(xué)結(jié)合或遺傳融合(如，直接或經(jīng)由多肽接頭))于單個(gè)遺傳融合的Fc區(qū)(S卩，單個(gè)scFc區(qū))或遺傳融合的Fc區(qū)串聯(lián)隊(duì)列(S卩，串聯(lián)scFc區(qū))的C-末端或N-末端。在其它實(shí)施方案中，結(jié)合位點(diǎn)串聯(lián)隊(duì)列可操作地連接于單個(gè)遺傳融合的Fc區(qū)或遺傳融合的Fc區(qū)串聯(lián)隊(duì)列的C-末端和N-末端兩者。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽是三價(jià)結(jié)合多肽，包含三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。示例性三價(jià)本發(fā)明結(jié)合多肽是雙特異性或三特異性。例如，三價(jià)結(jié)合多肽可對(duì)一種特異性是二價(jià)(即，具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn))，對(duì)第二特異性是一價(jià)。在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽是四價(jià)結(jié)合多肽，包含四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。示例性四價(jià)本發(fā)明結(jié)合多肽是雙特異性。例如，四價(jià)結(jié)合多肽可對(duì)每種特異性是二價(jià)(即，具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn))。如上所述，在其它實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)可插入遺傳融合的Fc區(qū)(即，scFc區(qū))的兩個(gè)Fc部分之間。例如，一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)可形成全部或部分的本發(fā)明結(jié)合多肽接頭。優(yōu)選的本發(fā)明結(jié)合多肽包含至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(如，抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)、抗體變體或抗體片段)、配體的受體結(jié)合部分、或受體的配體結(jié)合部分。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含至少一個(gè)包含一個(gè)或多個(gè)任何一種前述生物相關(guān)肽的結(jié)合位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽具有至少一個(gè)對(duì)介導(dǎo)生物效應(yīng)的靶分子特異性的結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合位點(diǎn)調(diào)節(jié)細(xì)胞活化或抑制(如，通過(guò)結(jié)合細(xì)胞表面受體并造成傳輸活化或抑制信號(hào))。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合位點(diǎn)能夠起始信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，這造成細(xì)胞死亡(如，通過(guò)細(xì)胞信號(hào)誘導(dǎo)的途徑，通過(guò)補(bǔ)體固定或暴露于結(jié)合分子上存在的有效載荷(如，毒性有效載荷))，或調(diào)節(jié)受治療者的疾病或病癥(如，通過(guò)介導(dǎo)或促進(jìn)細(xì)胞殺傷，通過(guò)促進(jìn)裂解纖維蛋白塊或促進(jìn)血塊形成，或通過(guò)調(diào)節(jié)生物可獲得的物質(zhì)的量(如，通過(guò)增強(qiáng)或減少受治療者中配體諸如TNFa的量))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽具有至少一個(gè)對(duì)靶向?yàn)闇p少或消除的抗原特異性的結(jié)合位點(diǎn)，如，細(xì)胞表面抗原或可溶抗原，并具有至少一個(gè)遺傳融合的Fc區(qū)(S卩，scFc區(qū))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽結(jié)合靶分子(如抗原)造成如從組織或從循環(huán)減少或消除靶分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合多肽具有至少一個(gè)對(duì)靶分子特異性的結(jié)合位點(diǎn)，這可用于檢測(cè)靶分子的存在(如，以檢測(cè)污染物或診斷病癥或紊亂)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含至少一個(gè)將該分子靶向受治療者中的特定部位(如，腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞或血塊)的結(jié)合位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽可包含兩個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些結(jié)合位點(diǎn)相同。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些結(jié)合位點(diǎn)不同。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽可組裝在一起或與其它多肽組裝以形成具有兩個(gè)或多個(gè)多肽的結(jié)合蛋白(“結(jié)合蛋白”或“多聚體”)，其中多聚體的至少一個(gè)多肽是本發(fā)明結(jié)合多肽。示例性多聚的形式包括二聚的、三聚的、四聚的、和六聚的改變的結(jié)合蛋白和類似物。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白的多肽相同(即同聚的改變的結(jié)合蛋白，如同二聚體、同四聚體)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白的多肽不同(如異聚的)。i.抗原結(jié)合位點(diǎn)(a)抗體在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含抗體的至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。本發(fā)明結(jié)合多肽可包含使用領(lǐng)域公認(rèn)方案衍生自抗體的可變區(qū)或其部分(如VL和/或VH結(jié)構(gòu)域)。例如，可變結(jié)構(gòu)域可衍生自非人類的哺乳動(dòng)物如，鼠、豚鼠、靈長(zhǎng)類、兔或大鼠中產(chǎn)生的抗體，通過(guò)以抗原或其片段免疫該哺乳動(dòng)物。參見(jiàn)前述的Harlow&Lane，為所有目的通過(guò)引用并入。可通過(guò)多次皮下或腹膜內(nèi)注射相關(guān)抗原(如，純化的腫瘤相關(guān)抗原或細(xì)胞或包含這種抗原的細(xì)胞提取物)和佐劑產(chǎn)生免疫球蛋白。這種免疫通常引發(fā)免疫應(yīng)答，包括從活化的脾細(xì)胞或淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗原_反應(yīng)性抗體。盡管可變區(qū)可衍生自從免疫的哺乳動(dòng)物血清中收獲的多克隆抗體，但常常期望從脾、淋巴結(jié)或外周血中分離單獨(dú)淋巴細(xì)胞以提供同質(zhì)的單克隆抗體(MAb)制品，從其衍生期望的可變區(qū)。通常使用兔或豚鼠制備多克隆抗體。小鼠通常用于制備單克隆抗體。單克隆抗體可以針對(duì)片段、通過(guò)將抗原片段注射入小鼠中、制備“雜交瘤”和篩選雜交瘤獲得特異地結(jié)合抗原的抗體以制備。在此熟知的方法(Kohler等人，(1975),Nature,256495)中，將來(lái)自注射了抗原的小鼠的相對(duì)短壽命的或必死的淋巴細(xì)胞與永生的腫瘤細(xì)胞系(例如，骨髓瘤細(xì)胞系)融合，由此產(chǎn)生永生的且能夠產(chǎn)生B細(xì)胞遺傳編碼的抗體的雜交細(xì)胞或“雜交瘤”。通過(guò)選擇、稀釋、和重新培養(yǎng)含有形成單一抗體的特異基因的各單個(gè)株，將所得雜種分離成單個(gè)遺傳株。這些單個(gè)遺傳株產(chǎn)生針對(duì)期望抗原的同質(zhì)抗體，該抗體由于其純遺傳血統(tǒng)被稱作“單克隆的”。在適宜培養(yǎng)基中接種并培養(yǎng)由此制備的雜交瘤細(xì)胞，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有一種或多種抑制未融合的親本骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員明了，可以通過(guò)商業(yè)途徑從多種渠道獲得用于形成、選擇和培養(yǎng)雜交瘤的試劑、細(xì)胞系和培養(yǎng)基，而且標(biāo)準(zhǔn)化方案已經(jīng)成熟建立。一般地，分析培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中抗期望抗原的單克隆抗體的產(chǎn)生。優(yōu)選地，雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性通過(guò)免疫沉淀或體外試驗(yàn)，例如放射免疫測(cè)定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)來(lái)確定。鑒定到產(chǎn)生具有期望特異性、親和性和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，可以通過(guò)有限稀釋方法對(duì)這些克隆進(jìn)行亞克隆并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法(Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice(單克隆抗體的原理和操作)，第59-103頁(yè)(AcademicPress,1986))培養(yǎng)。還可以理解，可以從培養(yǎng)基、腹水或血清中，通過(guò)常規(guī)純化方法，例如，親合層析(如，蛋白-A、蛋白-G或蛋白-L親合層析)、羥基磷灰石層析、凝膠電泳或透析，分離這些亞克隆分泌的單克隆抗體。任選地，可以篩選與抗原的特定區(qū)域或期望片段結(jié)合但不與抗原的其它不相重疊片段結(jié)合的抗體。后一篩選可以通過(guò)確定抗體與抗原的一系列缺失突變體的結(jié)合并確定何種缺失突變體與抗體結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)。結(jié)合可以通過(guò)例如Western印跡或ELISA評(píng)價(jià)。顯示出與抗體特異結(jié)合的最小片段定義為該抗體的表位。可選地，可以利用競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)確定表位特異性，在競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)中被測(cè)抗體和參照抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗原。當(dāng)被測(cè)抗體和參照抗體競(jìng)爭(zhēng)時(shí)，則它們所結(jié)合的表位相同，或者充分接近以致一個(gè)抗體的結(jié)合干擾另一抗體的結(jié)合。編碼期望單克隆抗體的DNA可以容易地使用上述用于分離恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域序列的任何常規(guī)方法(例如，通過(guò)使用能夠特異地結(jié)合編碼鼠抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)分離和測(cè)序。所分離的和亞克隆的雜交瘤細(xì)胞是該DNA的優(yōu)選來(lái)源。更特別地，分離的DNA(可為合成的，如本文所述)可用于克隆期望的可變區(qū)序列以并入本發(fā)明結(jié)合多肽。在其它實(shí)施方案中，結(jié)合位點(diǎn)衍生自完全人類抗體。可在不能產(chǎn)生內(nèi)源性免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)中產(chǎn)生人類抗體或基本上人類抗體(見(jiàn)例如美國(guó)專利第6，075，181,5,939，595,5,591，669和5，589，369號(hào)，所有均并入本文作為參考)。例如，已經(jīng)描述過(guò)，在嵌合的種系突變小鼠中純合缺失抗體重鏈連接區(qū)將導(dǎo)致完全抑制內(nèi)源性抗體的產(chǎn)生。將人免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移至該種系突變小鼠中將導(dǎo)致在抗原攻擊后產(chǎn)生人類抗體。使用SCID小鼠產(chǎn)生人類抗體的另一優(yōu)選方法公開(kāi)在美國(guó)專利第5，811，524號(hào)中，此文獻(xiàn)并入本文作為參考。應(yīng)理解，與這些人類抗體相關(guān)的遺傳物質(zhì)也可以按本文中所述進(jìn)43行分離和操作。制備重組抗體的另一高度有效的方法公開(kāi)在Newman，Biotechnology,101455-1460(1992)。具體地，該技術(shù)導(dǎo)致產(chǎn)生靈長(zhǎng)類動(dòng)物源化抗體，該抗體含有猴可變結(jié)構(gòu)域和人類恒定序列。此參考文獻(xiàn)完整地并入本文作為參考。此外，該技術(shù)也描述在共同轉(zhuǎn)讓的美國(guó)專利第5，658，570,5,693，780和5，756，096號(hào)中，所有這些專利并入本文作為參考。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)顯微操作選擇淋巴細(xì)胞并分離可變基因。例如，可以從免疫的哺乳動(dòng)物分離外周血單核細(xì)胞，并體外培養(yǎng)大約7天。可以篩選培養(yǎng)物中符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的特異IgG?？煞蛛x來(lái)自陽(yáng)性孔的細(xì)胞。產(chǎn)生個(gè)體Ig的B細(xì)胞可以通過(guò)FACS或通過(guò)在補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血蝕斑試驗(yàn)中鑒定它們而被分離?？梢酝ㄟ^(guò)顯微操作將產(chǎn)生Ig的B細(xì)胞加入試管中，并可以使用例如RT-PCR擴(kuò)增VH和VL基因?？梢詫H和VL基因克隆入抗體表達(dá)載體中并將其轉(zhuǎn)染入細(xì)胞(例如真核或原核細(xì)胞)以表達(dá)。可選地，可以從來(lái)自所選動(dòng)物的可變基因序列文庫(kù)獲得可變(V)結(jié)構(gòu)域。可以用期望抗原篩選表達(dá)隨機(jī)組合的結(jié)構(gòu)域(例如，VH和VL結(jié)構(gòu)域)的文庫(kù)，以鑒定具有期望的結(jié)合特征的元件。此類篩選方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，可以將所有抗體基因組成成分克隆至λ噬菌體表達(dá)載體(Huse，WD等人(1989).Science，2476:1275)。此外，可以篩選在其表面上表達(dá)抗體的細(xì)胞(Francisco等人(1994)，PNAS，9010444；Georgiou等人(1997)，Nat.Biotech.,1529；Boder和Wittrup(1997)Nat.Biotechnol.15553；Boder等人(2000)，PNAS，9710701；Daugtherty,P.等人(2000)J.Immunol.Methods.243211)或病毒(如，Hoogenboom,HR.(1998),Immunotechnology41；Winter等人(1994).Annu.Rev.Immunol.12433；Griffiths,AD.(1998).Curr.Opin.Biotechnol.9102)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也明了，編碼抗體可變結(jié)構(gòu)域的DNA也可以使用本領(lǐng)域已知的方法而衍生自噬菌體、酵母或細(xì)菌中表達(dá)的抗體文庫(kù)。示例性方法列在例如，EP368684Bl；美國(guó)專利第5，969，108號(hào)；Hoogenboom等人，(2000)Immunol.Today21371；Nagy等人(2002)Nat.Med.8801；Huie等人(2001)，PNAS，982682；Lui等人(2002)，J.Mol.Biol.3151063，所有這些文獻(xiàn)均并入本文作為參考。幾份出版物(如，Marks等人(1992)，Bio/Technology10:779_783)已經(jīng)描述了通過(guò)鏈改組以及組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建大噬菌體文庫(kù)的策略以產(chǎn)生高親和性人類抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用核糖體展示代替噬菌體作為展示平臺(tái)(參見(jiàn)如，Hanes，等人(1998)，PNAS9514130；Hanes和Pluckthun.(1999)，Curr.Top.Microbiol.Immunol.243107；He禾口Taussig.(1997)，Nuc.AcidsRes.,255132；Hanes等人(2000),Nat.Biotechnol.181287；Wilson等人(2001)，PNAS,983750；或Irving等人(2001)J.Immunol.Methods248:31)。用于篩選的優(yōu)選文庫(kù)是人類可變基因文庫(kù)。也可以使用來(lái)自非人類來(lái)源的VL和VH結(jié)構(gòu)域。文庫(kù)可以是未進(jìn)行過(guò)實(shí)驗(yàn)的、來(lái)自于已免疫的受治療者的、或半合成的(Hoogenboom和Winter.(1992)·J.Mol.Biol.227381；Griffiths等人(1995)EMBOJ.133245；deKruif等人(1995)·J.Mol.Biol.248:97;Barbas等人(1992)，PNAS，89:4457)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以突變免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以產(chǎn)生具有更大異質(zhì)性的核酸分子文庫(kù)(Thompson等人(1996)，J.Mol.Biol.25677；Lamminmaki等人(1999)，J.Mol.Biol.291589；Caldwell和Joyce.(1992)，PCRMethodsAppl.228；Caldwell和Joyce.(1994)，PCRMethodsAppl.3:S136)?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)篩選方法選擇高親和性變體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以例如使用獲自晶體結(jié)構(gòu)的信息，利用本領(lǐng)域已知技術(shù)，改變VH和VL序列以增加抗體親和力。而且，可用于產(chǎn)生本發(fā)明結(jié)合多肽的可變區(qū)序列可從許多不同來(lái)源獲得。例如，如上討論的，許多人類基因序列可以公眾可得到的保藏形式獲得。已公開(kāi)了許多抗體和編碼抗體的基因的序列，可使用領(lǐng)域公認(rèn)技術(shù)從這些序列化學(xué)合成適當(dāng)?shù)目勺儏^(qū)序列(如VL和VH序列)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽中存在的至少一個(gè)可變區(qū)結(jié)構(gòu)域具催化性(Shokat和Schultz.(1990).Annu.Rev.Immunol.8335)。具有催化性結(jié)合特異性的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域可以使用本領(lǐng)域已知技術(shù)制備(見(jiàn)例如，美國(guó)專利第6，590，080號(hào)、美國(guó)專利第5，658，753號(hào))。催化性結(jié)合特異性可以通過(guò)許多與針對(duì)酶而鑒定的用于穩(wěn)定過(guò)渡態(tài)由此降低活化自由能的那些機(jī)制相似的基本機(jī)制起作用。例如，可以最佳地放置一般的酸性和堿性殘基以便參與催化活性位點(diǎn)中的催化反應(yīng)；可以形成共價(jià)的酶-底物中間體；催化抗體也可以具有對(duì)反應(yīng)合適的定向并增加反應(yīng)物有效濃度至少7個(gè)數(shù)量級(jí)(Fersht等人，(1968)，J.Am.Chem.Soc.905833)并由此極大地降低化學(xué)反應(yīng)的熵。最后，催化抗體可以轉(zhuǎn)化底物結(jié)合和/或隨后穩(wěn)定過(guò)渡態(tài)中間體時(shí)獲得的能量以驅(qū)動(dòng)反應(yīng)。可以通過(guò)使用帶互補(bǔ)電荷的分子作為免疫原，將酸性或堿性殘基引入抗原結(jié)合位點(diǎn)中。該技術(shù)已經(jīng)被證實(shí)可以成功地利用含有帶正電荷的銨離子的半抗原引發(fā)抗體(Shokat，等人，(1988)，Chem.Int.Ed.Engl.27:269_271)。在另一方法中，可以針對(duì)類似于期望反應(yīng)的過(guò)渡態(tài)中間體的尺寸、形狀和電荷的穩(wěn)定化合物(即，過(guò)渡態(tài)類似物)引發(fā)抗體。見(jiàn)美國(guó)專利第4，792，446號(hào)和美國(guó)專利第4，963，355號(hào)，這兩份專利描述了應(yīng)用過(guò)渡態(tài)類似物免疫動(dòng)物和產(chǎn)生催化抗體。這兩份專利特此并入作為參考。這些分子可以作為免疫結(jié)合物的一部分，例如和免疫原性載體分子例如KLH—起施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，改變的本發(fā)明抗體的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域由無(wú)VL鏈存在下穩(wěn)定的例如來(lái)源于駱駝科動(dòng)物的VH結(jié)構(gòu)域組成(Hamers-Casterman等人(1993).Nature，363446；Desmyter等人(1996).Nat.Struct.Biol.3803；Decanniere等人(1999).Structure，7:361;Davies等人(1996)ProteinEng.,9531；Kortt等人(1995).J.ProteinChem.,14167)。進(jìn)一步，本發(fā)明結(jié)合多肽可包含衍生自完全鼠、完全人類、嵌合、人源化、非人類的靈長(zhǎng)類或靈長(zhǎng)類動(dòng)物源化抗體的可變結(jié)構(gòu)域或CDR。可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，改變非人類抗體或其片段或結(jié)構(gòu)域，以降低其免疫原性。人源化的抗體是來(lái)源于非人類抗體的抗體，該抗體被修飾以保留或基本上保留親本抗體的結(jié)合性質(zhì)，但是在人體中具有比親本非人類抗體低的免疫原性。對(duì)于人源化靶抗體，可以通過(guò)各種方法實(shí)現(xiàn)，包括(a)將完整非人類可變結(jié)構(gòu)域嫁接在人類恒定區(qū)上以產(chǎn)生嵌合靶抗體；(b)將一個(gè)或多個(gè)非人類互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的至少一部分嫁接在人構(gòu)架區(qū)和恒定區(qū)上并保留或不保留關(guān)鍵的框架殘基；(c)移植完整的非人類可變結(jié)構(gòu)域，但是通過(guò)置換表面殘基用人類樣部分對(duì)其進(jìn)行“掩飾”。這些方法公開(kāi)在Morrison等人，(1984)，PNAS.81:6851_5；Morrison等人，(1988)，Adv.Immunol.44:65_92；Verhoeyen等人，(1988)，Science239:1534_1536；Padlan,(1991)，Molec.Immun.28489-498；Padlan,(1994)，Molec.Immun.31:169_217；以及美國(guó)專利第5，585，089,5,693，761和5，693，762號(hào)，所有這些文獻(xiàn)均特此完整地并入作為參考。也可以使用去免疫化來(lái)減少本發(fā)明結(jié)合多肽的免疫原性。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“去免疫化”包括修飾T細(xì)胞表位(參見(jiàn)，如W09852976A1、W00034317A2)。例如，分析VH和VL序列，從每個(gè)V區(qū)“作圖”人類T細(xì)胞表位，顯示產(chǎn)生表位相對(duì)于互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)及序列中其它關(guān)鍵殘基的位置。分析T細(xì)胞表位圖中的單個(gè)T細(xì)胞表位以鑒定導(dǎo)致最終抗體活性改變的風(fēng)險(xiǎn)最低的可選氨基酸替代。設(shè)計(jì)一系列可選的VH和VL序列以包含氨基酸替代組合，隨后將這些序列摻入一系列本發(fā)明多肽中，以進(jìn)行功能檢查。通常，制備和檢測(cè)12-24個(gè)變體抗體。之后，將包含修飾的V和人類C區(qū)的完整重鏈和輕鏈基因克隆至表達(dá)載體中，將所得質(zhì)粒引入細(xì)胞系以產(chǎn)生完整抗體。然后在適當(dāng)?shù)纳锘瘜W(xué)和生物學(xué)試驗(yàn)中比較這些抗體，鑒定最佳的變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)至少部分取代一個(gè)或多個(gè)CDR改變本發(fā)明結(jié)合多肽采用的可變結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可任選地改變可變結(jié)構(gòu)域，如，通過(guò)部分構(gòu)架區(qū)取代和序列改變。制備人源化可變區(qū)時(shí)，CDR可衍生自構(gòu)架區(qū)衍生自的抗體的相同類或甚至亞類抗體，然而設(shè)想CDR將衍生自不同類的抗體，優(yōu)選地衍生自不同物種的抗體。不必以來(lái)自供體可變區(qū)的完整CDR代替所有CDR以轉(zhuǎn)移一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合能力到另一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域。而是，可能僅需要轉(zhuǎn)移保持結(jié)合結(jié)構(gòu)域活性所必需的那些殘基。考慮列在美國(guó)專利第5，585，089、5，693，761和5，693，762號(hào)中的解釋，通過(guò)進(jìn)行常規(guī)實(shí)驗(yàn)或通過(guò)試錯(cuò)測(cè)試(trialanderrortesting)以獲得具有減少的免疫原性的功能抗原結(jié)合位點(diǎn)在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含至少一個(gè)來(lái)自識(shí)別期望的靶的抗體的⑶R。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的改變的抗體包含至少兩個(gè)來(lái)自識(shí)別期望的靶的抗體的CDR0在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的改變的抗體包含至少三個(gè)來(lái)自識(shí)別期望的靶的抗體的⑶R。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的改變的抗體包含至少四個(gè)來(lái)自識(shí)別期望的靶的抗體的CDR0在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的改變的抗體包含至少五個(gè)來(lái)自識(shí)別期望的靶的抗體的CDR0在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的改變的抗體包含所有六個(gè)來(lái)自識(shí)別期望的靶的抗體的CDR。可從其衍生結(jié)合位點(diǎn)以用于本發(fā)明結(jié)合分子的示例性抗體是本領(lǐng)域已知的。例如，當(dāng)前FDA批準(zhǔn)的抗體可用于衍生結(jié)合位點(diǎn)。示例性的這種抗體列在圖64。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽中采用的抗原結(jié)合位點(diǎn)可以與一種或多種腫瘤相關(guān)抗原免疫反應(yīng)。例如，為了治療癌癥或瘤形成，結(jié)合多肽的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域優(yōu)選與選定的腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合?？紤]到與瘤形成有關(guān)的已報(bào)道的抗原的數(shù)目和相關(guān)抗體的數(shù)目，本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了本發(fā)明結(jié)合多肽可包含來(lái)源于多種完整抗體中的任何一種的可變區(qū)序列或其部分。更一般地，這種可變區(qū)序列可以獲自或者來(lái)源于任何可以和與選定的狀況相關(guān)的抗原或標(biāo)記反應(yīng)的抗體(包括文獻(xiàn)中先已報(bào)道的那些抗體)。本發(fā)明結(jié)合多肽結(jié)合的示例性腫瘤相關(guān)抗原包括例如，PanB抗原(例如，在惡性和非惡性B細(xì)胞(例如非何杰金淋巴瘤中的B細(xì)胞)表面上發(fā)現(xiàn)的⑶20)和panT細(xì)胞抗原(如⑶2、⑶3、⑶5、⑶6、⑶7)。其它示例性腫瘤相關(guān)抗原包括但不限于MAGE-I、MAGE-3、MUC-I、HPV16、HPVE6&Ξ7、TAG-72、CEA,α-Lewisy、L6_抗原、CD19、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD37、CD44、CD52、CD56、CD80、間皮素(mesothelin)、PSMA,HLA-DR、EGF受體、VEGF、VEGF受體、Cripto抗原和HER2受體。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽可包含來(lái)自以前報(bào)道的與腫瘤相關(guān)抗原反應(yīng)的抗體的完整抗原結(jié)合位點(diǎn)(或可變區(qū)或其CDR序列)。能夠與腫瘤相關(guān)抗原反應(yīng)的示例性抗體包括:2B8、LymULym2、LL2、Her2、Bi、BR96、MB1、BH3、B4、B72.3、5E8、B3F6、5E10、a-CD33、a-CanAg,α-CD56、α-CD44v6、α-Lewis禾口a-CD30。更特別地，這些示例性抗體包括但不限于2B8和C2B8(Zevalin:和Rituxan，BiogenIdee,Cambridge)、Lym1和Lym2(Techniclone)、LL2(ImmunomedicsCorp.,NewJersey)、曲司珠單抗(IIerceptin,GenentechInc.,SouthSanFrancisco)、托西莫單抗(,BexxarCoulterPharm.,SanFrancisco)、阿倉(cāng)珠單抗(Alemtzumab)(,CampathMillenniumPharmaceuticals,Cambridge)、吉妥珠單抗奧佐米星(，MylotargWyeth-Ayerst，Philadelphia)、阿巴莫單抗(Abagovomab)(Menarini,Italy)>CEA-Scar(Immunomedics,MorrisPlains,NJ)、卡羅單抗(，ProstascintCytogenCorp.)、依決洛單抗(panorex，Johnson&Johnson,NewBrunswick,NJ)、伊戈伏單抗(CISBioIntl.，F(xiàn)rance)、米妥莫單抗(BEC2,ImcloneSystems,Somerville,NJ)、若莫單抗(Verluma'BoehringerIngleheim,Ridgefield,CT)、OvaRex(AltarexCorp.，ffaltham,MA)、沙妥莫單抗(Onoscint，CytogenCorp.)、阿泊珠單抗(REMITOGEN,ProteinDesignLabs,Fremont,CA)、拉貝珠單抗(CEACIDE,ImmunomedicsInc.，MorrisPlains,NJ)、中白妥珠單抗(OMNITARGGenentechInc.，S.SanFrancisco,CA)、帕尼木單抗(Vcctibix，Amgen,ThousandOaks,CA)、西妥昔單抗(Erbitux'ImcloneSystems,NewYork)、貝伐珠單抗(Avastin'GenentechInc.,SouthSanFrancisco)、BR96、BL22、LMB9、LMB2、MBl、BH3、B4、B72.3(CytogenCorp.)、SSl(NeoPharm)、CC49(NationalCancerInstitute)、Cantuzumabmertansine(ImmunoGen,Cambridge)>MNL2704(MilleneumPharmaceuticals,Cambridge)>比伐珠單抗mertansine(BoehringerIngelheim,Germany)>曲司珠單抗-DMl(Genentech,SouthSanFrancisco)、My9-6-DMl(ImmunoGen,Cabridge)、SGN-IO>-15、-25禾口一35(SeattleGenetics，Seattle)、和5E10(UniversityofIowa)。在其他的實(shí)施方案中，結(jié)合多肽可包含抗-CD23抗體(如，魯昔單抗)、抗-⑶80抗體(如，加利昔單抗)或抗-VL5/a5M-整聯(lián)蛋白抗體(如，Volociximab)的結(jié)合位點(diǎn)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽將與剛在上面列舉的抗體結(jié)合相同的腫瘤相關(guān)抗原。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽將衍生自Y2B8、C2B8、CC49和C5E10或與Y2B8、C2B8、CC49和C5E10結(jié)合相同抗原。可并入本發(fā)明結(jié)合分子的其它結(jié)合位點(diǎn)包括見(jiàn)于以下分子中的結(jié)合位點(diǎn)Orthoclone0KT3(抗-CD3)(Johnson&Johnson，Brunswick,NJ)、ReoPro(抗-GpIIb/glla)(Centocor,Horsham,PA)、Zenapax(抗-CD25)(Roche,Basel,Switzerland)、Remicade(抗-TNFa)(Centocor,Horsham,PA)、Simulect(抗-CD25)(Novartis,Basel,Switzerland)>Synagis(㈱-RSV)(Medimmune,Gaithersburg,MD)、Humira(抗-TNFα)(Abbott,AbbottPark,IL)、Xolair(抗-IgE)(Genentech,SouthSanFrancisco，CA)、Raptiva(抗-CD1la)(Genentech)、Tysabri(Biogenldec,Cambridge,MA)>LllCentis(抗-VEGF)(Genentech)禾口Soliris(AlexionPharmaceuticals,Cheshire,CT)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子可具有一個(gè)或多個(gè)衍生自一個(gè)或多個(gè)以下抗體的結(jié)合位點(diǎn)托西莫單抗(BEXXAR)、莫羅莫那(ORTHOCLONE)和替伊莫單抗(ZEVALIN)、西妥昔單抗(ERBITUX)、利妥昔單抗(MABTHERA/RITUXAN)、英夫利昔單抗(REMICADE)、阿昔單抗(REOPRO)和巴利昔單抗(SIMULECT)、依法珠單抗(RAPTIVA，貝伐珠單抗(AVASTIN)、阿侖珠單抗(CAMPATH')、曲司珠單抗(HERCEPTIN)、吉妥珠單抗(MYLOTARG)、帕利珠單抗(SYNAGIS)、奧馬珠單抗(XOLAIR)、達(dá)克珠單抗(ZENAPAX)、那他珠單抗(TYSABRI)和雷珠單抗(LUVENTIS)、阿達(dá)木單抗(HUMIRA)和帕尼木單抗(VECTIBIX)。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合多肽與Rituxan結(jié)合相同的腫瘤相關(guān)抗原。Rituxan(也稱作利妥昔單抗、IDEC-C2B8和C2B8)是FDA批準(zhǔn)的第一個(gè)用于治療人類B細(xì)胞淋巴瘤的單克隆抗體(見(jiàn)，美國(guó)專利第5，843，439；5,776，456和5，736，137號(hào)，均并入此處作為參考)。Y2B8(90Y標(biāo)記的2B8;；Zevalin替伊莫單抗)是C2B8的鼠親本抗體。Rituxan是嵌合的抗-CD20單克隆抗體，其具有生長(zhǎng)抑制性并且據(jù)報(bào)道可以體外敏化某些淋巴瘤細(xì)胞系使其對(duì)化療劑引起的細(xì)胞凋亡作用易感。該抗體有效地結(jié)合人類補(bǔ)體，具有強(qiáng)的FcR結(jié)合，可以通過(guò)補(bǔ)體依賴性(⑶C)和抗體依賴性(ADCC)機(jī)制在體外有效地殺傷人淋巴細(xì)胞(Reff等人，Blood83:435-445(1994)))。本領(lǐng)域技術(shù)人員明了，本發(fā)明結(jié)合多肽可包含C2B8或2B8的可變區(qū)或⑶R，以提供在治療表現(xiàn)⑶20+惡性腫瘤的患者時(shí)具有甚至更大效果的結(jié)合多肽。在本發(fā)明其它實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽將與CC49結(jié)合相同的腫瘤相關(guān)抗原。CC49結(jié)合人腫瘤相關(guān)抗原TAG-72，該抗原與人類來(lái)源的某些腫瘤細(xì)胞(尤其是LS174T腫瘤細(xì)胞系)表面結(jié)合。LS174T是LS180結(jié)腸腺癌系的變體。本發(fā)明結(jié)合多肽可包含已經(jīng)開(kāi)發(fā)的許多對(duì)TAG-72具有結(jié)合特異性的鼠單克隆抗體衍生的抗原結(jié)合位點(diǎn)。這些單克隆抗體之一稱作B72.3，其是由雜交瘤B72.3產(chǎn)生的鼠IgGl。B72.3是使用人類乳腺癌提取物作為免疫原開(kāi)發(fā)的第一代單克隆抗體(見(jiàn)Colcher等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，78:3199_3203(1981)；和美國(guó)專利第4，522，915和4，612，252號(hào)，所有文獻(xiàn)均并入本文作為參考)。其它抗TAG-72的單克隆抗體稱作"CC"(代表結(jié)腸癌)。如schlom等(美國(guó)專利第5，512，443號(hào)，并入本文作為參考)所述，CC單克隆抗體是使用以B72.3純化的TAG-72制備的第二代鼠單克隆抗體家族。由于它們對(duì)TAG-72相對(duì)良好的結(jié)合親和力，以下CC抗體是優(yōu)選的CC49、CC83、CC46、CC92、CC30、CC11和CC15。Schlom等人還制備了人源化CC49抗體(公開(kāi)在PCT/US99/25552中)和單鏈Fv(SCFv)構(gòu)建體(公開(kāi)在美國(guó)專利第5，892，019號(hào)中)的變體，所有這些文獻(xiàn)也并入本文作為參考。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了，所有前述抗體、構(gòu)建體或重組體及其變體均可以是合成的并用于為產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合多肽提供結(jié)合位點(diǎn)。除了以上討論的抗TAG-72抗體，不同研究組還報(bào)道了對(duì)缺失結(jié)構(gòu)域的CC49和B72.3抗體的構(gòu)建和部分表征(例如，Calvo等人CancerBiotherapy,8(1):95_109(1993)，Slavin-Chiorini等人Int.J.Cancer5397-103(1993)禾口Slavin—Chiorini等人Cancer.Res.55=5957-5967(1995)。因此，結(jié)合多肽還可包含衍生自這些抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)、可變區(qū)或CDR。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含與CD23抗原結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)(美國(guó)專利第6，011，138號(hào))。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽與5E8抗體結(jié)合相同表位。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含至少一個(gè)來(lái)自抗CD23抗體(例如5E8抗體(如，魯昔單抗))的CDR(例如，1、2、3、4、5或6個(gè)CDR)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽與CRIPT0-I抗原(W002/088170A2或W003/083041A2)結(jié)合。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽與B3F6抗體結(jié)合相同表位。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明改變的抗體包含至少一個(gè)來(lái)自抗CRIPT0-I抗體，例如B3F6抗體的CDR(如，1、2、3、4、5或6個(gè)CDR)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽結(jié)合于TNF受體(“TNFR”)超家族成員的抗原。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子結(jié)合至少一個(gè)對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的靶，如，通過(guò)結(jié)合于細(xì)胞表面受體，諸如TNF家族受體?！稗D(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)”是指通過(guò)結(jié)合細(xì)胞，結(jié)合分子將對(duì)細(xì)胞表面受體的胞外影響轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞響應(yīng)，如，通過(guò)調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。術(shù)語(yǔ)“TNF受體”或“TNF受體家族成員”是指屬于腫瘤壞死因子(“TNF”)受體超家族的任何受體。TNF受體超家族(“TNFRSF”)的成員特征是胞外區(qū)具有兩個(gè)或多個(gè)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(各40氨基酸)，布置為半胱氨酸結(jié)(參見(jiàn)Dempsey等人，CytokineGrowthFactorRev.(2003).14(3-4)193-209)結(jié)合其同族TNF配體后，TNF受體通過(guò)直接或間接地與稱為T(mén)RAF(TNF受體相關(guān)因子)的細(xì)胞質(zhì)適體蛋白相互作用而轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)。TRAF可引起多種激酶級(jí)聯(lián)的活化，最終造成活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑諸如NF-KB、JNK、ERK、p38和PI3K，這反過(guò)來(lái)調(diào)節(jié)從免疫功能和組織分化到凋亡的細(xì)胞過(guò)程。多種TNF受體家族成員的核苷酸和氨基酸序列是本領(lǐng)域已知的并包括至少29個(gè)人類基因TNFRSF1A(TNFR1，也稱為DR1、CD120a、TNF-R-Ip55、TNF-R、TNFRI、TNFAR、TNF-R55、p55TNFR、p55R或TNFR60,GenBankGINo.4507575；還參見(jiàn)美國(guó)專利第5，395，760號(hào)))，TNFRSF1B(CD120b,也稱為p75、TNF-R、TNF-R-II,TNFR80、TNFR2、TNF-R75、TNFBR或p75TNFR；GenBankGINo.4507577)，TNFRSF3(淋巴毒素3受體(LT3R)，也稱為T(mén)NFR2-RP、CD18、TNFR-RP、TNFCR或TNF-R-III;GINo.4505038和20072212)，TNFRSF4(0X40，也稱為ACT35、TXGP1L或CD134抗原；GINo.4507579和8926702)，TNFRSF5(CD40,也稱為p50或Bp50；GINo.4507581禾口23312371)，TNFRSF6(FAS,也稱為FAS-R、DcR_2、DR2、CD95、AP0-1或APT1；GenBankGINo.4507583、23510421、23510423、23510425、23510427、23510429、23510431禾口23510434))，TNFRSF6B(DcR3、DR3;GenBankGINo.4507569,23200021,23200023,23200025,23200027,23200029,23200031,23200033,23200035,23200037和23200039)，TNFRSF7(CD27,也稱為T(mén)p55或S152；GenBankGINo.4507587)，TNFRSF8(CD30,也稱為Ki-1或D1S166E；GenBankGINo.4507589和23510437)，TNFRSF9(4-1-BB，也稱為CD137或ILA；GINo.5730095和728738)，TNFRSF10A(TRAIL-R1,也稱為DR4或Apo2；GenBankGINo.21361086)，TNFRSF10B(TRAIL-R2，也稱為DR5、KILLER、TRICK2A或TRICKB；GenBankGINo.22547116和22547119)，TNFRSF10C(TRAIL-R3,也稱為DcRl、LIT或TRID；GenBankGINo.22547121)，TNFRSF10D(TRAIL-R4,也稱為DcR2或TRUNDD)，TNFRSF11A(RANK；GenBankGINo.4507565；參見(jiàn)美國(guó)專利第6，562，948；6，537，763；6，528，482；6，479，635；6，271，349；6，017，729號(hào))，TNFRSF11B(骨保護(hù)素(0PG)，也稱為0CIF或TR1；GINo.38530116,22547122和33878056)，TNFRSF12(移位鏈-相關(guān)膜蛋白(TRAMP)，也稱為DR3、WSL-ULARD、WSL-LR、DDR3、TR3、APO-3、Fnl4或TffEAKR；GenBankGINo.7706186；美國(guó)專利申請(qǐng)公布第2004/0033225A1號(hào))，TNFRSF12L(DR3L)，TNFRSF13B(TACI；GINo.6912694)，TNFRSF13C(BAFFR；GINo.16445027)，TNFRSF14(皰疹病毒進(jìn)入介導(dǎo)子(HVEM)，也稱為ATAR、TR2、LIGHTR或HVEA；GenBankGINo.23200041、12803895和3878821)，TNFRSF16(低親和性神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(LNGFR)，也稱為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白受體或p75(NTR)；GenBankGINo.128156和4505393)，TNFRSF17(BCM,也稱為BCMA；GINo.23238192)，TNFRSF18(AITR，也稱為GITR;GenBankGINo.4759246、23238194和23238197)，TNFRSF19(Troy/Trade,也稱為T(mén)AJ；GenBankGINo.23238202和23238204)，TNFRSF20(RELT,也稱為FLJ14993;GINo.21361873和23238200)，TNFRSF21(DR6)，TNFRSF22(SOBa,也稱為T(mén)nfrh2或2810028K06Rik)和TNFRSF23(mSOB,也稱為T(mén)nfrhl)。其它TNF家族成員包括EDARl(外胚葉發(fā)育不全A受體，也稱為Downless(DL)、ED3、ED5、ED1R、EDA3、EDA1R、EDA-A1R；GenBankGINo.11641231；美國(guó)專利第6，355，782號(hào))、XEDAR(也稱為EDA-A2R;GenBankGINo.11140823)；和CD39(GINo.2135580和765256)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明改變的抗體結(jié)合于缺少死亡結(jié)構(gòu)域的TNF受體家族成員。在一個(gè)實(shí)施方案中，缺少死亡結(jié)構(gòu)域的TNF受體牽涉在組織分化中。在更特定實(shí)施方案中，組織分化中牽涉的TNF受體選自LTβR、RANK、EDARUXEDAR,Fnl4、Troy/Trade和NGFR組成的組。在另一個(gè)實(shí)施方案中，缺少死亡結(jié)構(gòu)域的TNF受體牽涉在免疫調(diào)節(jié)中。在更特定實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)中牽涉的TNF受體家族成員選自TNFR2、HVEM、CD27、CD30、CD40、4-1BB、0X40和GITR組成的組。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽結(jié)合于屬于TNF配體超家族的TNF配體。TNF配體結(jié)合TNF受體超家族的不同受體并表現(xiàn)彼此15-25%的氨基酸序列同源性(Gaur等人，Biochem.Pharmacol.(2003)，66(8)1403-8)。許多TNF受體(配體)超家族(“TNFSF”)成員的核苷酸和氨基酸序列是本領(lǐng)域已知的并包括至少16個(gè)人類基因TNFSFl(也稱為淋巴毒素-α(LTA)、TNFβ或LT，GINo.34444和6806893)，TNFSF2(也稱為T(mén)NF、TNFa或DIF；GINo.25952111)，TNFSF3(也稱為淋巴毒素-β(LTB)、TNFC或p33)，TNFSF4(也稱為0X_40L、gp34、CD134L或tax-轉(zhuǎn)錄活化的糖蛋白l、34kD(TXGPl)；GINo.4507603)，TNFSF5(也稱為CD40LG、IMD3、HIGMl、CD40L、hCD40L、TRAP、CD154或gp39；GINo.4557433)，TNFSF6(也稱為FasL或APT1LG1；GenBankGINo.4557329)，TNFSF7(也稱為CD70、CD27L或CD27LG；GINo.4507605)，TNFSF8(也稱為CD30LG、CD30L或CD153；GINo.4507607)，TNFSF9(也稱為4-1BB-L或ILA配體；GINo.4507609)，TNFSF10(也稱為T(mén)RAIL、Apo-2L或TL2；GINo.4507593)，TNFSFl1(也稱為T(mén)RANCE、RANKL,OPGL或ODF；GINo.4507595禾口14790152)，TNFSFl2(也稱為Fnl4L、TWEAK、DR3LG或AP03L；GINo.4507597和23510441)，TNFSF13(也稱為APRIL)，TNFSF14(也稱為L(zhǎng)IGHT、LTg或HVEM-L；GINo.25952144和25952147)，TNFSF15(也稱為T(mén)Ll或VEGI)，或TNFSF16(也稱為AITRL、TL6、hGITRL或GITRL;GINo.4827034)。其它TNF配體家族成員包括EDARl&XEDAR配體(EDI;GINo.4503449；Monreal等人(1998)AmJHumGenet.63380)、Troy/Trade配體、BAFF(也稱為T(mén)ALLl；GINo.5730097)和NGF配體(如NGF-β(GINo.4505391)、NGF-2/NTF3；GINo.4505469)、NTF5(GINo.5453808))、BDNF(GINo.25306267、25306235、25306253,25306257,25306261,25306264；IFRDl(GINo.4504607))。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽結(jié)合于LTβR抗體(如與CBEll或BDA8抗體結(jié)合相同表位(即，與之競(jìng)爭(zhēng)))。示例性抗-1^01抗體列在1098/017313和1002/30986，其以引用的方式并入本文。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的改變的抗體包含來(lái)自抗-LTiiR抗體如，CBEll抗體或BDA8抗體的至少一個(gè)⑶R(如，1、2、3、4、5或6個(gè)OTR)。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽結(jié)合TRAIL-R2(如與14Α2抗體結(jié)合相同表位(即，與之競(jìng)爭(zhēng)))。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽包含來(lái)自抗-TRAIL-R2抗體如，14Α2抗體的至少一個(gè)CDR(如，1、2、3、4、5或6個(gè)CDR)。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽與抗-CD2抗體(如，嵌合CB6(“chB6”)抗體)結(jié)合相同表位?？蓮钠溲苌景l(fā)明結(jié)合多肽的示例性抗-CD2抗體包括小鼠抗體CB6以及其嵌合版本，如，實(shí)施例中公開(kāi)的IgGlchCB6抗體。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明抗-CD2結(jié)合多肽包含選自SEQIDNO:29(ASK058)、SEQIDNO:31(ASK062)、SEQIDNO:33(ASK063)和SEQIDNO:35(ASK064)組成的組的重鏈序列。本發(fā)明的又一些其它實(shí)施方案包含衍生自C5E10或與C5E10結(jié)合相同腫瘤相關(guān)抗原的改變的抗體。如列在共同待決申請(qǐng)第09/104，717號(hào)的，C5E10是識(shí)別表現(xiàn)為對(duì)前列腺腫瘤細(xì)胞系(如DU145、PC3或NDl)特異性的大約115kDa的糖蛋白決定子的抗體。因此，結(jié)合本發(fā)明，特異性結(jié)合C5E10抗體識(shí)別的相同腫瘤相關(guān)抗原的多肽可單獨(dú)使用或由本發(fā)明方法與效應(yīng)子部分結(jié)合，從而提供可用于改進(jìn)地治療腫瘤病癥的修飾的多肽。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，起始多肽將衍生自具有ATCC登錄號(hào)PTA-865的雜交瘤細(xì)胞系或包含從具有ATCC登錄號(hào)PTA-865的雜交瘤細(xì)胞系分泌的C5E10抗體的抗原結(jié)合區(qū)的所有或部分。所得多肽隨后可結(jié)合于下述的治療效應(yīng)子部分并根據(jù)本文方法施用于患有前列腺癌的患者。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽結(jié)合于可用于治療自身免疫或炎性疾病或病癥的分子。例如，結(jié)合多肽可結(jié)合免疫細(xì)胞(如，B或T細(xì)胞)上存在的抗原或負(fù)責(zé)自身免疫疾病或病癥的自身抗原。與自身免疫或炎性病癥相關(guān)的抗原可為前述的腫瘤相關(guān)抗原。因此，腫瘤相關(guān)抗原也可是自身免疫或炎性相關(guān)病癥。本文所用的術(shù)語(yǔ)“自身免疫疾病或病癥”是指受治療者的病癥或狀態(tài)，其中免疫系統(tǒng)攻擊身體自身的細(xì)胞，導(dǎo)致組織破壞。自身免疫疾病包括一般性自身免疫疾病，即，其中自身免疫反應(yīng)同時(shí)發(fā)生在許多組織的自身免疫疾病，或器官特異性自身免疫疾病，即，其中自身免疫反應(yīng)靶向單個(gè)器官的自身免疫疾病。本發(fā)明方法和組合物可診斷、預(yù)防或治療的自身免疫疾病的實(shí)例包括但不限于，Crohn氏疾病；炎性腸病(IBD)；系統(tǒng)性紅斑狼瘡；潰瘍性結(jié)腸炎；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；Goodpasture氏綜合征；Grave氏?。粯虮炯谞钕傺?；尋常性天皰瘡；重癥肌無(wú)力；硬皮??；自身免疫性溶血性貧血；自身免疫性血小板減少性紫瘢；多肌炎和皮肌炎；惡性貧血；Sjogren氏綜合征；強(qiáng)直性脊柱炎；脈管炎；I型糖尿?。簧窠?jīng)病癥，多發(fā)性硬化癥，和自身免疫疾病導(dǎo)致的繼發(fā)性疾病。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽結(jié)合與炎性疾病或病癥相關(guān)的靶分子。本文所用的術(shù)語(yǔ)“炎性疾病或病癥”包括因炎癥而引起的(至少部分地)或惡化的病癥或病癥，例如血流增加、水腫、免疫細(xì)胞的活化(例如增生、細(xì)胞因子產(chǎn)生或增強(qiáng)的吞噬作用)。例如，本發(fā)明的結(jié)合多肽可以異常量例如可有利于改變例如有益于受治療者的量結(jié)合區(qū)域中的涉及或存在的炎性因子(例如，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、TNFa、白介素、血漿蛋白、細(xì)胞因子、脂質(zhì)代謝物、蛋白酶、毒性自由基、線粒體蛋白、細(xì)胞凋亡蛋白、粘附分子等)或炎性因子。發(fā)炎過(guò)程是活組織對(duì)損傷的應(yīng)答。炎癥的原因可以是由于物理?yè)p傷、化學(xué)物質(zhì)、微生物、組織壞死、癌癥或其它因素。急性炎癥持續(xù)時(shí)間短，例如，僅僅持續(xù)數(shù)天。然而，如果其持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，則可以稱作慢性炎癥。炎性病癥包括急性炎性病癥、慢性炎性病癥、和復(fù)發(fā)性炎性病癥。急性炎性病癥一般具有相對(duì)短的持續(xù)期，并且持續(xù)大約數(shù)分鐘至大約1到2天，但它們也可以持續(xù)幾周。急性炎性病癥的主要特征包括血流增加、體液和血漿蛋白滲出(水腫)以及白細(xì)胞如嗜中性粒細(xì)胞滲出。慢性炎性病癥一般有較長(zhǎng)的持續(xù)期，例如數(shù)周至數(shù)月至數(shù)年或甚至更長(zhǎng)，并且在組織學(xué)上其與淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的存在以及血管和結(jié)締組織的增生有關(guān)。復(fù)發(fā)性炎性病癥包括在一段時(shí)間后復(fù)發(fā)的或周期性發(fā)作的病癥。復(fù)發(fā)性炎性病癥的例子包括哮喘和多發(fā)性硬化。一些病癥可以落入一種或多種分類中。炎性病癥一般的特征在于發(fā)熱、潮紅、腫大、疼痛和喪失功能。炎性病癥的示例性原因包括但不限于微生物感染(例如細(xì)菌、病毒和真菌感染)、物理因素(例如，燒傷、輻射和創(chuàng)傷)、化學(xué)因素(例如，毒素和腐蝕性物質(zhì))、組織壞死和各種類型的免疫反應(yīng)。炎性病癥的例子包括但不限于骨關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，急性和慢性感染(細(xì)菌、病毒和真菌)；急性和慢性支氣管炎，鼻竇炎和其它呼吸感染，包括普通感冒；急性和慢性腸胃炎和結(jié)腸炎；急性和慢性膀胱炎和尿道炎；急性呼吸窘迫綜合征；囊性纖維化；急性和慢性皮炎；急性和慢性結(jié)膜炎；急性和慢性漿膜炎(心包炎、腹膜炎、滑膜炎、胸膜炎和腱炎)；尿毒癥性心包炎；急性和慢性膽囊炎；急性和慢性陰道炎；急性和慢性眼色素層炎；藥物反應(yīng)；和燒傷(熱的、化學(xué)的和電的)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽結(jié)合于CD40L抗體(如，與5C8抗體結(jié)合相同表位(即，與之競(jìng)爭(zhēng)))。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽包含來(lái)自抗-CD40L抗體(如5C8抗體)的至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)、一個(gè)或多個(gè)⑶R(如，1、2、3、4、5、或6個(gè)OTR)、或一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)(VH或VL)。⑶40L(⑶154、gp39)是一種跨膜蛋白，表達(dá)在活化的⑶4+T細(xì)胞、巨細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、天然殺傷(NK)細(xì)胞和活化的血小板。CD40L對(duì)于T-細(xì)胞依賴性B-細(xì)胞應(yīng)答是重要的。⑶40L的一種顯著功能即同種型轉(zhuǎn)換由其中⑶40L是天生缺乏的高免疫球蛋白M(IgM)綜合征證實(shí)。⑶40L-⑶40的相互作用(在抗原-呈遞細(xì)胞諸如樹(shù)突狀細(xì)胞上)對(duì)于引發(fā)T-細(xì)胞和T-細(xì)胞-依賴性體液免疫應(yīng)答是必需的。因此，基于上述信息和對(duì)動(dòng)物的研究，以抗-⑶40L單克隆抗體(mAb)破壞⑶40-⑶40L相互作用已被認(rèn)為是對(duì)人類自身免疫疾病的可能治療策略?？蓮钠溲苌景l(fā)明結(jié)合多肽的示例性抗-CD40L抗體包括美國(guó)專利第5，474，771號(hào)中公開(kāi)的小鼠抗體5C8，其以引用的方式并入本文，以及其人源化版本，如，實(shí)施例中公開(kāi)的IgGlHu5C8抗體。其它抗-CD40L抗體是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)如，美國(guó)專利第5，961，974號(hào)和國(guó)際公布第WO96/23071號(hào))。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明抗-CD40L結(jié)合多肽包含選自SEQIDNO:1(EAG2066)、SEQIDNO:7(EAG2146)、SEQIDNO:9(EAG2147)、SEQIDNO:13(ASK043)、SEQIDNO:15(ASK048)、SEQIDNO:17(ASK052)和SEQIDNO:19(ASK053)組成的組的重鏈序列。在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽結(jié)合于可用于治療神經(jīng)疾病或病癥的分子。例如，結(jié)合多肽可結(jié)合神經(jīng)細(xì)胞(如，神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或)上存在的抗原。在某些實(shí)施方案中，與抗原相關(guān)的神經(jīng)病癥可為前述自身免疫或炎性病癥。本文所用的術(shù)語(yǔ)“神經(jīng)疾病或病癥”包括受治療者的疾病或病癥，其中神經(jīng)系統(tǒng)退化(如，神經(jīng)退化病癥，以及其中神經(jīng)系統(tǒng)不能適當(dāng)?shù)匕l(fā)展或不能在損傷如脊索損傷后再生的病癥。本發(fā)明方法和組合物可診斷、預(yù)防或治療的神經(jīng)病癥的實(shí)例包括但不限于，多發(fā)性硬化、亨廷頓氏病、阿爾茨海默病、帕金森病、神經(jīng)痛、創(chuàng)傷性腦損傷、格-巴二氏綜合征和慢性炎性脫鞘性多神經(jīng)病(CIDP)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽與抗-LINGO抗體(如，Li33抗體)結(jié)合于相同表位。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽包含來(lái)自抗-LINGO抗體(如Li33抗體)的至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)、一個(gè)或多個(gè)CDR或一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)(VH或VL)。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-LINGO結(jié)合多肽包含選自SEQIDNO21(EAG2148)、SEQIDNO:22(ASK050)和SEQIDNO:23(ASK051)的重鏈序列。(b)抗原結(jié)合片段在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽的結(jié)合位點(diǎn)可包含抗原結(jié)合片段。術(shù)語(yǔ)“抗原-結(jié)合片段”是指免疫球蛋白、抗體或抗體變體結(jié)合抗原或與完整抗體(即，與其所衍生自的完整抗體)競(jìng)爭(zhēng)抗原結(jié)合(即，特異性結(jié)合)的多肽片段。例如，所述抗原結(jié)合片段可衍生自前述任何抗體或抗體變體?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的重組或生物化學(xué)方法產(chǎn)生抗原結(jié)合片段。示例性抗原-結(jié)合片段包括Fv、Fab、Fab，和(Fab，)2。在示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含可操作地連接(如，化學(xué)結(jié)合或遺傳融合的(如，直接融合或經(jīng)由多肽接頭融合))于遺傳融合的Fc區(qū)(S卩，scFc區(qū))的C-末端和/或N-末端的至少一個(gè)抗原結(jié)合片段。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含經(jīng)由鉸鏈結(jié)構(gòu)域或其部分(如，IgGl鉸鏈或其部分，如，人類IgGl鉸鏈)可操作地連接于至少一個(gè)遺傳融合的Fc區(qū)的N-末端(或C-末端)的抗原結(jié)合片段(如，F(xiàn)ab)。示例性鉸鏈結(jié)構(gòu)域部分包含序列DKTHTCPPCPAPELLGG。(c)單鏈結(jié)合分子在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子可包含來(lái)自單鏈結(jié)合分子(如，單鏈可變區(qū)或scFv)的結(jié)合位點(diǎn)。所述為產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專利第4，694，778號(hào)；Bird,Science242:423-442(1988)；Huston^A,Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-5883(1988)；和Ward等人，Nature334:544-554(1989))可適于產(chǎn)生單鏈結(jié)合分子。通過(guò)經(jīng)由氨基酸橋連接Fv區(qū)的重和輕鏈片段形成單鏈抗體，造成單鏈抗體。還可使用在大腸桿菌中組裝功能Fv片段的技術(shù)(Skerra等人，Science242:1038-1041(1988))。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含一個(gè)或多個(gè)包含單鏈可變區(qū)序列(scFv)或由單鏈可變區(qū)序列(scFv)組成的結(jié)合位點(diǎn)或區(qū)。單鏈可變區(qū)序列包含具有一個(gè)或多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的單個(gè)多肽，如，由柔性接頭連接于Vh結(jié)構(gòu)域的\結(jié)構(gòu)域。VL和/或VH結(jié)構(gòu)域可衍生自前述任何抗體或抗體變體?？梢訴H-接頭-VL方向或VL-接頭-VH方向構(gòu)建ScFv分子。連接形成抗原結(jié)合位點(diǎn)的VL和VH結(jié)構(gòu)域的柔性接頭優(yōu)選地包含從約10至約50個(gè)氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽接頭是gly-ser多肽接頭。一種示例性gly/ser多肽接頭是式(Gly4Ser)n，其中η是正整數(shù)(如，1、2、3、4、5或6)。其它多肽接頭是本領(lǐng)域已知的。具有單鏈可變區(qū)序列的抗體(如單鏈Fv抗體)和制備所述單鏈抗體的方法是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)如，Ho等人1989.Gene7751；Bird等人1988Science242423；Pantoliano等人1991.Biochemistry30:10117;Milenic等人1991.CancerResearch51:6363；Takkinen等人1991.ProteinEngineering4837)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽采用的scFv分子是穩(wěn)定化的scFv分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，穩(wěn)定化的scFv分子可包含介于VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域之間的scFv接頭，其中Vh和\結(jié)構(gòu)域由Vh中的氨基酸與\結(jié)構(gòu)域中的氨基酸之間的二硫鍵連接。在其它實(shí)施方案中，穩(wěn)定化的scFv分子可包含具有優(yōu)化的長(zhǎng)度或組成的scFv接頭。在其他的實(shí)施方案中，穩(wěn)定化的scFv分子可包含具有至少一個(gè)穩(wěn)定氨基酸取代的VH或VL結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，穩(wěn)定化的scFv分子可具有至少兩個(gè)上述穩(wěn)定特征。穩(wěn)定化的scFv分子具有改進(jìn)的蛋白穩(wěn)定性或?qū)ζ淇刹僮鞯剡B接的結(jié)合多肽賦予改進(jìn)的蛋白穩(wěn)定性。與常規(guī)結(jié)合多肽相比，本發(fā)明優(yōu)選的scFv接頭改進(jìn)本發(fā)明結(jié)合多肽的熱穩(wěn)定性至少約2°C或；TC?？稍诶绫景l(fā)明的scFv分子之間進(jìn)行比較。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，穩(wěn)定化的scFv分子包含(Gly4Ser)4ScFv接頭和連接Vh氨基酸44和\氨基酸100的二硫鍵。本發(fā)明結(jié)合多肽中可采用的其它示例性穩(wěn)定化的scFv分子描述于2006年12月8日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第60/873，996號(hào)或2007年3月19日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)第11/725，970號(hào)，其各自以引用的方式全文并入本文。在某些示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含可操作地連接(如，化學(xué)結(jié)合或遺傳融合的(如，直接融合或經(jīng)由多肽接頭融合)于遺傳融合的Fc區(qū)(即，scFc區(qū))的C-末端和/或N-末端的至少一個(gè)scFv分子。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含經(jīng)由鉸鏈結(jié)構(gòu)域或其部分(如，IgGl鉸鏈或其部分，如，人類IgGl鉸鏈)可操作地連接于至少一個(gè)遺傳融合的Fc區(qū)的N-末端(或C-末端)的至少一個(gè)scFv分子(如，一個(gè)或多個(gè)穩(wěn)定化的scFv分子)。示例性鉸鏈結(jié)構(gòu)域部分包含序列DKTHTCPPCPAPELLGG。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含通過(guò)成串地融合兩個(gè)或多個(gè)scFv分子形成的四價(jià)結(jié)合位點(diǎn)或區(qū)。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，組合scFv分子以使第一scFv分子在其N(xiāo)-末端(如，經(jīng)由多肽接頭(如，gly/ser多肽接頭))可操作地連接于具有相同或不同結(jié)合特異性的至少一個(gè)另外scFv分子。scFv分子的串聯(lián)隊(duì)列可操作地連接于至少一個(gè)遺傳融合的Fc區(qū)(S卩，scFc區(qū))的N-末端和/或C-末端以形成本發(fā)明結(jié)合多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含通過(guò)可操作地連接scFv分子(如經(jīng)由多肽接頭)于抗原結(jié)合片段(如，F(xiàn)ab片段)形成的四價(jià)結(jié)合位點(diǎn)或區(qū)。所述四價(jià)結(jié)合位點(diǎn)或區(qū)可操作地連接于至少一個(gè)遺傳融合的Fc區(qū)(即，scFc區(qū))的N-末端和/或C-末端以形成本發(fā)明結(jié)合多肽。(d)修飾的抗體在其它方面，本發(fā)明結(jié)合多肽可包含衍生自抗體的修飾形式的抗原結(jié)合位點(diǎn)或其部分。示例性這種形式包括，如，微型抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、納米抗體、駱駝抗體、Dab、四價(jià)抗體、內(nèi)雙鏈抗體(intradiabodies)(如，Jendreyko等人2003.J.Biol.Chem.27847813)、融合蛋白(如，抗體細(xì)胞因子融合蛋白、融合于至少部分的Fc受體的蛋白)、和雙特異性抗體。其它修飾的抗體描述于例如美國(guó)專利第4，745，055號(hào)；EP256，654；Faulkner等人，Nature298:286(1982)；EP120,694；EP125,023；Morrison,J.Immun.123793(1979)；Kohler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:2197(1980)；Raso等人，CancerRes.412073(1981)；Morrison等人，Ann.Rev.Immunol.2239(1984)；Morrison,Science2291202(1985)；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851(1984)；EP255,694；EP266,663;和WO88/03559。再分類的免疫球蛋白鏈也是已知的。參見(jiàn)例如，美國(guó)專利第4，444，878號(hào)；WO88/03565；和EP68，763以及其中引用的參考文獻(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽包含是微型抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)或區(qū)或從其衍生的抗原結(jié)合位點(diǎn)。微型抗體是兩條多肽鏈組成的二聚的分子，每條多肽鏈包含經(jīng)由多肽接頭融合于CH3結(jié)構(gòu)域或其部分的scFv分子。可通過(guò)使用本領(lǐng)域所述的方法連接scFv成分和多肽接頭-CH3成分而制備微型抗體(參見(jiàn)如，美國(guó)專利第5，837，821號(hào)或WO94/09817A1)。這些成分可從分開(kāi)的質(zhì)粒作為限制性片段分離，隨后連接并再克隆到合適的載體(如，表達(dá)載體)中。適當(dāng)?shù)慕M裝(如，組裝編碼單體微型抗體多肽鏈的可讀框(ORF))可通過(guò)限制性消化和DNA序列分析證實(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含可操作地連接于至少一個(gè)遺傳融合的Fc區(qū)(即，scFc區(qū))的微型抗體的scFv成分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽包含四價(jià)微型抗體作為結(jié)合位點(diǎn)或區(qū)。四價(jià)微型抗體可以與微型抗體相同的方式構(gòu)建，除了兩個(gè)scFv分子使用多肽接頭連接。隨后連接的scFv-scFv構(gòu)建體可操作地連接于遺傳融合的Fc區(qū)(即，scFc區(qū))以形成本發(fā)明結(jié)合多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽包含是雙鏈抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)或區(qū)或從其衍生的抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙鏈抗體是二聚的四價(jià)分子，各具有與scFv分子相似的多肽，但通常具有短的(如，少于10并優(yōu)選地1-5)氨基酸殘基接頭，連接兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，以使同一多肽鏈上的\和Vh結(jié)構(gòu)域不能相互作用。相反地，一條多肽鏈的\和Vh結(jié)構(gòu)域與第二多肽鏈上的Vh和\結(jié)構(gòu)域(分別地)相互作用(參見(jiàn)例如，WO02/02781)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含可操作地連接于至少一個(gè)遺傳融合的Fc區(qū)(即，scFc區(qū))的N-末端和/或C-末端的雙鏈抗體。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合分子包含連接于scFc的單個(gè)結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子(如單個(gè)結(jié)構(gòu)域抗體)。示例性單個(gè)結(jié)構(gòu)域分子包括抗體的分離的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)(即，重鏈可變結(jié)構(gòu)域，無(wú)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域)，和抗體的分離的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)(即，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，無(wú)重鏈可變結(jié)構(gòu)域)。本發(fā)明結(jié)合分子采用的示例性單個(gè)結(jié)構(gòu)域抗體包括，例如，駱駝抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(約118至136氨基酸殘基)，如Hamers-Casterman等人，Nature363446-448(1993)和Dumoulin，等人，ProteinScience11500-515(2002)所述的。其它示例性單個(gè)結(jié)構(gòu)域抗體包括單個(gè)VH或VL結(jié)構(gòu)域，也稱為Dabs(DomantisLtd.，Cambridge,UK)。其他的單個(gè)結(jié)構(gòu)域抗體包括鯊魚(yú)抗體(如，鯊魚(yú)Ig-NAR)。鯊魚(yú)Ig-NAR包含一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(V-NAR)和五個(gè)C-樣恒定結(jié)構(gòu)域(C-NAR)的同二聚體，其中多樣性集中在長(zhǎng)度從5至23殘基的延伸CDR3區(qū)。在駱駝科動(dòng)物物種(如，美洲駝)，稱為VHH的重鏈可變區(qū)形成完整抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。駱駝抗體VHH可變區(qū)與衍生自常規(guī)抗體的可變區(qū)(VH)的主要區(qū)別包括(a)與VHH中相應(yīng)區(qū)相比，VH的輕鏈接觸表面中疏水氨基酸更多，(b)VHH中CDR3更長(zhǎng)，和(C)VHH中頻繁出現(xiàn)CDRl和CDR3之間的二硫鍵。制備單個(gè)結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子的方法描述于美國(guó)專利第6.005,079和6，765，087號(hào)，兩者以引用的方式并入本文。示例性包含VHH結(jié)構(gòu)域的單個(gè)結(jié)構(gòu)域抗體包括Nanobodies(AblynxNV，Ghent，Belgium)。(e)非免疫球蛋白的結(jié)合分子在一些其它實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽包含一個(gè)或多個(gè)衍生自非免疫球蛋白的結(jié)合分子的結(jié)合位點(diǎn)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“非免疫球蛋白的結(jié)合分子”是其結(jié)合位點(diǎn)包含衍生自免疫球蛋白以外的多肽但可被工程化(如，誘變)以賦予期望的結(jié)合特異性的部分(如，支架或構(gòu)架)的結(jié)合分子。包含不是衍生自抗體分子的結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合分子的其它實(shí)例包括受體結(jié)合位點(diǎn)和配體結(jié)合位點(diǎn)，在以下詳細(xì)討論。非免疫球蛋白的結(jié)合分子可包含衍生自不是免疫球蛋白的免疫球蛋白超家族成員(如T-細(xì)胞受體或細(xì)胞粘附蛋白(如，CTLA-4、N-CAM、端蛋白))的結(jié)合位點(diǎn)部分。這種結(jié)合分子包含保持免疫球蛋白折疊的構(gòu)象并能夠特異性結(jié)合IGFl-R表位(印titope)的結(jié)合位點(diǎn)部分。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的非免疫球蛋白的結(jié)合分子還包含具有不是基于免疫球蛋白折疊的蛋白拓?fù)?如諸如錨蛋白重復(fù)蛋白或纖連蛋白)但能夠特異性結(jié)合靶(如IGF-IR表位)的結(jié)合位點(diǎn)。非免疫球蛋白的結(jié)合分子可通過(guò)從具有人工變化的結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合分子文庫(kù)選擇或分離靶結(jié)合變體而鑒定。變化的文庫(kù)可使用完全隨機(jī)方法(如，易錯(cuò)PCR、外顯子改組或定向進(jìn)化)產(chǎn)生或由領(lǐng)域公認(rèn)的設(shè)計(jì)策略輔助。例如，當(dāng)結(jié)合位點(diǎn)與其同族靶分子相互作用時(shí)通常牽涉的氨基酸位置可通過(guò)在編碼結(jié)合位點(diǎn)的核酸的相應(yīng)位置插入簡(jiǎn)并密碼子、三核苷酸、隨機(jī)肽、或完整環(huán)而隨機(jī)化(參見(jiàn)如，美國(guó)專利公布第20040132028號(hào))。通過(guò)研究復(fù)合體與靶分子結(jié)合位點(diǎn)的晶體結(jié)構(gòu)，可鑒定氨基酸位置的定位。隨機(jī)化的候選位置包括環(huán)、平表面、螺旋和結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合腔。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合位點(diǎn)中可能候選用于變化的氨基酸可通過(guò)與折疊的免疫球蛋白的同源性來(lái)鑒定。例如，纖連蛋白的CDR樣環(huán)中的殘基可隨機(jī)化以產(chǎn)生纖連蛋白結(jié)合分子文庫(kù)(參見(jiàn)如，Koide等人，J.Mol.Biol.,2841141-1151(1998))?？呻S機(jī)化的結(jié)合位點(diǎn)的其它部分包括平表面。隨機(jī)化后，隨后可對(duì)變化的文庫(kù)進(jìn)行選擇或篩選步驟以獲得具有期望的結(jié)合特征的結(jié)合分子，如特異性結(jié)合前述IGF-IR表位。例如，選擇可通過(guò)領(lǐng)域公認(rèn)的方法諸如噬菌體展示、酵母展示或核糖體展示來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子包含來(lái)自纖連蛋白結(jié)合分子的結(jié)合位點(diǎn)。纖連蛋白結(jié)合分子(如，包含纖連蛋白I、II或III型結(jié)構(gòu)域的分子)展示⑶R樣環(huán)，其不同于免疫球蛋白，不依賴于鏈內(nèi)二硫鍵。制備纖連蛋白結(jié)合多肽的方法描述于例如，WO01/64942和美國(guó)專利第6，673，901,6,703，199,7,078，490和7，119，171號(hào)，其以引用的方式并入本文。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，纖連蛋白結(jié)合多肽如AdNectin(AdnexusTherpaeutics,ffaltham,ΜΑ)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子包含來(lái)自親和體親和體(Abeam,Cambridge,ΜΑ)的結(jié)合位點(diǎn)。親和體親和體衍生自葡萄球菌蛋白A(SPA)的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(參見(jiàn)如，Nord等人，Nat.Biotechnol.,15:772_777(1997))。通過(guò)誘變衍生自SPA結(jié)構(gòu)域(如，結(jié)構(gòu)域B)的SPA-相關(guān)蛋白(如，蛋白Z)并選擇對(duì)IGF-IR表位具有結(jié)合親和性的突變的SPA-相關(guān)多肽，可合成本發(fā)明采用的親和體親和體結(jié)合位點(diǎn)。制備親和體親和體結(jié)合位點(diǎn)的其它方法描述于美國(guó)專利第6，740，734和6，602，977號(hào)以及W000/63243，其以引用的方式并入本文。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子包含來(lái)自抗運(yùn)載蛋白(PierisAG,Friesing,Germany)的結(jié)合位點(diǎn)。抗運(yùn)載蛋白(也稱為脂籠蛋白)是多樣β-筒蛋白家族的成員，功能是在其筒/環(huán)區(qū)結(jié)合靶分子。脂籠蛋白結(jié)合位點(diǎn)可被工程化以結(jié)合IGF-IR表位，通過(guò)將連接筒鏈的環(huán)序列隨機(jī)化(參見(jiàn)如，Schlehuber等人，DrugDiscov.Today,1023-33(2005)；Beste等人，PNAS，96:1898_1903(1999)。本發(fā)明結(jié)合分子采用的抗運(yùn)載蛋白結(jié)合位點(diǎn)可從脂籠蛋白家族的多肽開(kāi)始獲得，將脂籠蛋白家族的多肽在對(duì)應(yīng)于包含大菜粉蝶(Pierisbrassica)的后膽色素-結(jié)合蛋白(BBP)的氨基酸位置28至45、58至69、86至99以及114至129的線性多肽序列的序列位置的四個(gè)區(qū)段突變。制備抗運(yùn)載蛋白結(jié)合位點(diǎn)的其它方法描述于W099/16873和WO05/019254，其各以引用的方式并入本文。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子包含來(lái)自富含半胱氨酸的多肽的結(jié)合位點(diǎn)。本發(fā)明實(shí)踐中采用的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域通常不形成α-螺旋、β片層或β-筒結(jié)構(gòu)。通常，二硫鍵促進(jìn)結(jié)構(gòu)域折疊成為三維結(jié)構(gòu)。通常，富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域具有至少兩個(gè)二硫鍵，更通常至少三個(gè)二硫鍵。一種示例性富含半胱氨酸的多肽是A結(jié)構(gòu)域蛋白。A-結(jié)構(gòu)域(有時(shí)稱為"補(bǔ)體型重復(fù)")包含約30-50或30-65氨基酸。在一些實(shí)施方案中，該結(jié)構(gòu)域包含約35-45氨基酸，在一些情況包含約40氨基酸。在30-50氨基酸中，有約6半胱氨酸殘基。六個(gè)半胱氨酸中，二硫鍵通常見(jiàn)于以下半胱氨酸之間C1和C3、C2和C5、C4和C6。A結(jié)構(gòu)域構(gòu)成配體結(jié)合部分。結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基被二硫鍵連接以形成緊湊的、穩(wěn)定的功能獨(dú)立部分。這些重復(fù)的簇形成配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，不同的簇集可賦予配體結(jié)合的特異性。含有A-結(jié)構(gòu)域的示例性蛋白包括，如，補(bǔ)體成分(如，C6、C7、C8、C9和因子I)、絲氨酸蛋白酶(如，腸肽酶、matriptase和corin)、跨膜蛋白(如，ST7、LRP3、LRP5和LRP6)和內(nèi)吞受體(如，選蛋白相關(guān)受體、LDL受體、VLDLR、LRPl、LRP2和ApoER2)。制備期望的結(jié)合特異性的結(jié)構(gòu)域蛋白的方法公開(kāi)于，例如W002/088171和WO04/044011，其各以引用的方式并入本文。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子包含來(lái)自重復(fù)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。重復(fù)蛋白是包含堆疊在一起形成連續(xù)結(jié)構(gòu)域的小(如，約20至約40氨基酸殘基)結(jié)構(gòu)單元的連續(xù)拷貝或重復(fù)的蛋白。通過(guò)調(diào)整蛋白中重復(fù)的數(shù)目，重復(fù)蛋白可被修飾以適合特定靶結(jié)合位點(diǎn)。示例性重復(fù)蛋白包括設(shè)計(jì)的錨蛋白重復(fù)蛋白(即，DARPins，MolecularPartners,Zurich,Switzerland)(參見(jiàn)如，Binz等人，Nat.Biotechnol.，22:575_582(2004))或富含亮氨酸的重復(fù)蛋白(即，LRRP)(參見(jiàn)如，Pancer等人，Nature，430174-180(2004))。所有目前確定的錨蛋白重復(fù)單元三級(jí)結(jié)構(gòu)共有特征是包含發(fā)夾，隨后是兩個(gè)逆平行的α-螺旋，并結(jié)束于連接重復(fù)單元與下一個(gè)重復(fù)單元的環(huán)。錨蛋白重復(fù)單元建立的結(jié)構(gòu)域通過(guò)堆疊重復(fù)單元為延伸和彎曲的結(jié)構(gòu)而形成。來(lái)自海洋八目鰻和其它無(wú)顎綱魚(yú)類的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的部分的LRRP結(jié)合位點(diǎn)類似抗體，因?yàn)樗鼈兺ㄟ^(guò)在淋巴細(xì)胞成熟期間重組一套富含亮氨酸的重復(fù)基因而形成。制備DARpin或LRRP結(jié)合位點(diǎn)的方法描述于WO02/20565和WO06/083275，其各以引用的方式并入本文。本發(fā)明結(jié)合分子可采用的其它非免疫球蛋白結(jié)合位點(diǎn)包括衍生自Src同源性結(jié)構(gòu)域(如SH2或SH3結(jié)構(gòu)域)、PDZ結(jié)構(gòu)域、β-內(nèi)酰胺酶、高親和性蛋白酶抑制劑、或小二硫化物結(jié)合蛋白支架諸如蝎毒素的結(jié)合位點(diǎn)。制備衍生自這些分子的結(jié)合位點(diǎn)的方法已公開(kāi)于本領(lǐng)域，參見(jiàn)如，Silverman等人，Nat.Biotechnol.，23(12)1493-4(2005)；Panni等人，J.Biol.Chem.，277:21666_21674(2002)，Schneider等人，Nat.Biotechnol.，17170-175(1999)；Legendre等人，ProteinSci.，111506-1518(2002)；Stoop等人，Nat.Biotechnol.,211063-1068(2003)；和Vita等人，PNAS，92:6404_6408(1995)。其他結(jié)合位點(diǎn)可衍生自選自由以下組成的組的結(jié)合結(jié)構(gòu)域EGF-樣結(jié)構(gòu)域、Kringle-結(jié)構(gòu)域、PAN結(jié)構(gòu)域、Gla結(jié)構(gòu)域、SRCR結(jié)構(gòu)域、Kunitz/牛胰蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域、Kazal-型絲氨酸蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域、三葉草(P型)結(jié)構(gòu)域、血管假性血友病因子C型結(jié)構(gòu)域、過(guò)敏毒素-樣結(jié)構(gòu)域、CUB結(jié)構(gòu)域、甲狀腺球蛋白I型重復(fù)蛋白、LDL-受體A類結(jié)構(gòu)域、Sushi結(jié)構(gòu)域、Link結(jié)構(gòu)域、血小板反應(yīng)蛋白I型結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白_樣結(jié)構(gòu)域、C-型凝集素結(jié)構(gòu)域、MAM結(jié)構(gòu)域、血管假性血友病因子A型結(jié)構(gòu)域、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素B結(jié)構(gòu)域、WAP-型四個(gè)二硫化物核結(jié)構(gòu)域、F5/8C型結(jié)構(gòu)域、血液結(jié)合素結(jié)構(gòu)域、層粘連蛋白-型EGF-樣結(jié)構(gòu)域、C2結(jié)構(gòu)域、CTLA-4結(jié)構(gòu)域、和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它這種結(jié)構(gòu)域，以及其衍生物和/或變體。其它非免疫球蛋白結(jié)合多肽包括Avimers(Avidia，Inc.，MountainView,CA_參見(jiàn)國(guó)際PCT公布第W006/055689號(hào)和美國(guó)專利公布第2006/0234299號(hào))、Telobodies(BiotechStudio，Cambridge,MA)、Evibodies(Evogenix，Sydney,Australia-參見(jiàn)美國(guó)專利第7，166，697號(hào))、禾口Microbodies(NascacellTechnologies,Munich,Germany)。ii.受體和配體的結(jié)合部分在其它方面，本發(fā)明結(jié)合多肽包含受體的配體結(jié)合位點(diǎn)和/或配體的受體結(jié)合部分，其可操作地連接于至少一個(gè)遺傳融合的Fc區(qū)。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合多肽是受體的配體結(jié)合部分和/或配體的受體結(jié)合部分與遺傳融合的Fc區(qū)(即，scFc區(qū))的融合體。配體結(jié)合受體的任何跨膜區(qū)或脂質(zhì)或磷脂錨識(shí)別序列優(yōu)選地在融合前被失活或缺失。編碼配體或配體結(jié)合伴侶的DNA在編碼期望的0RF區(qū)段的DNA的5’和3’端或附近被限制性酶裂解。隨后所得的DNA片段易于插入(如，符合讀框連接)到編碼遺傳融合的Fc區(qū)的DNA?？筛鶕?jù)經(jīng)驗(yàn)選擇進(jìn)行融合的確切位點(diǎn)以優(yōu)化可溶融合蛋白的分泌或結(jié)合特征。隨后編碼融合蛋白的DNA亞克隆到合適的表達(dá)載體，然后可轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞來(lái)表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽組合配體或受體的結(jié)合位點(diǎn)(如受體的胞外結(jié)構(gòu)域(ECD))與至少一個(gè)遺傳融合的Fc區(qū)(即，scFc區(qū))。在一個(gè)實(shí)施方案中，配體或受體結(jié)構(gòu)域的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)⒖刹僮鞯剡B接(如經(jīng)由多肽接頭融合)于遺傳融合的Fc區(qū)的C-末端。N-末端融合也是可能的。在示例性實(shí)施方案中，可在遺傳融合的Fc區(qū)的C-末端、或剛好在遺傳融合的Fc區(qū)的鉸鏈結(jié)構(gòu)域的N-末端進(jìn)行融合。在某些實(shí)施方案中，受體的配體結(jié)合部分的結(jié)合位點(diǎn)或結(jié)構(gòu)域可衍生自前述抗體或抗體變體結(jié)合的受體。在其它實(shí)施方案中，受體的配體結(jié)合部分衍生自選自免疫球蛋白(Ig)超家族的受體(如，可溶T-細(xì)胞受體，如，mTCR(MedigeneAG,Munich,Germany)、前述TNF受體超家族的受體(如，免疫粘附素的可溶TNFa受體，如，Enbrel0^6讓，1^肚8011，町))、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞-衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(⑶NF)受體家族的受體(如，GFRa3)、G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)超家族的受體、酪氨酸激酶(TK)受體超家族的受體、配體-門(mén)控(LG)超家族的受體、趨化因子受體超家族的受體、IL-1/Toll樣受體(TLR)超家族和細(xì)胞因子受體超家族組成的組的受體。在其它實(shí)施方案中，配體的受體結(jié)合部分的結(jié)合位點(diǎn)或結(jié)構(gòu)域可衍生自前述抗體或抗體變體結(jié)合的配體。例如，配體可結(jié)合選自免疫球蛋白(Ig)超家族的受體、TNF受體超家族的受體、G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)超家族的受體、酪氨酸激酶(TK)受體超家族的受體、配體-門(mén)控(LG)超家族的受體、趨化因子受體超家族的受體、IL-1/Toll樣受體(TLR)超家族和細(xì)胞因子受體超家族組成的組的受體。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，配體的受體-結(jié)合部分的結(jié)合位點(diǎn)衍生自屬于前述TNF配體超家族的配體(如，CD40L)。在其它示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽可包含衍生自一種或多種以下蛋白的一個(gè)或多個(gè)配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域1.細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體細(xì)胞因子對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖、分化和功能活化具有多效性作用。各種細(xì)胞因子或其受體結(jié)合部分均可以用于本發(fā)明融合蛋白中。示例性細(xì)胞因子包括白介素(如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13和IL-18)，集落刺激因子(CSF)(例如，粒細(xì)胞CSF(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞CSF(GM-CSF)，和單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞CSF(M-CSF))，腫瘤壞死因子(TNF)α和β，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4(CTLA-4)，及干擾素如干擾素_α、β或γ(美國(guó)專利第4，925，793和4，929，554號(hào))。細(xì)胞因子受體典型地由配體特異的α鏈和共同的β鏈組成。示例性細(xì)胞因子受體包括GM-CSF、IL-3(美國(guó)專利第5，639，605號(hào))、IL_4(美國(guó)專利第5，599，905號(hào))、IL_5(美國(guó)專利第5，453，491號(hào))、ILlO受體、IFNy(EP0240975)的受體，和TNF受體家族(如，TNFα(如，TNFR-I(EP417，563)、TNFR-2(ΕΡ417,014)淋巴毒素β受體)。2.粘附蛋白粘附分子是允許細(xì)胞彼此相互作用的膜結(jié)合蛋白。各種粘附蛋白，包括白細(xì)胞歸巢受體和細(xì)胞粘附分子，或其受體結(jié)合部分，均可以摻入本發(fā)明融合蛋白中。白細(xì)胞歸巢受體在炎癥期間表達(dá)在白細(xì)胞表面上，包括介導(dǎo)與細(xì)胞外基質(zhì)成分結(jié)合的β-1整聯(lián)蛋白(如VLA-1、2、3、4、5和6)、和與血管內(nèi)皮上的細(xì)胞粘附分子(CAM)結(jié)合的β2-整聯(lián)蛋白(例如，LFA-I、LPAM-I、CR3和CR4)。示例性CAM包括ICAM-1、ICAM-2、VCAM-I和MAdCAM-I。其它CAM包括選擇蛋白家族的那些，包括E-選擇蛋白、L-選擇蛋白和P-選擇蛋白。3.趨化因子趨化因子-刺激白細(xì)胞向感染位點(diǎn)遷移的趨化蛋白-也可以摻入本發(fā)明融合蛋白中。示例性趨化因子包括巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP-1-α和MIP-1-β)、嗜中性粒細(xì)胞趨化因子和RANTES(受活化調(diào)節(jié)的、正常由T細(xì)胞表達(dá)分泌的)。4.生長(zhǎng)因子和生長(zhǎng)因子受體生長(zhǎng)因子或其受體(或其受體結(jié)合部分或配體結(jié)合部分)可以摻入本發(fā)明融合蛋白中。示例性生長(zhǎng)因子包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和其同種型(美國(guó)專利第5，194，596號(hào))；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)，包括aFGF和bFGF；心房鈉尿肽(ANF)；肝生長(zhǎng)因子(HGF；美國(guó)專利第5，227，155和6，099，541號(hào))、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子例如骨衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子配體(如，⑶NF、neuturin、artemin和pers印hin)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3、_4、_5、或-6(NT-3、NT_4、NT_5或NT-6)、或神經(jīng)生長(zhǎng)因子例如NGF-β血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)(美國(guó)專利第4，889，919、4，545，075、5，910，574和5，877，016號(hào))；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)例如TGF-α和TGF-β(W090/14359)，骨誘導(dǎo)因子包括骨形成蛋白(BMP)；胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和-IKIGF-I和IGF-II；美國(guó)專利第6，403，764和6，506，874號(hào))；促紅細(xì)胞生成素(EPO)；血小板生成素(TPO)；干細(xì)胞因子(SCF)，血小板生成素(TPO,c-Mpl配體)，和Wnt多肽(美國(guó)專利第6，159，462號(hào))?？梢杂米鞅景l(fā)明靶向受體結(jié)構(gòu)域的示例性生長(zhǎng)因子受體包括EGF受體；VEGF受體(如，F(xiàn)ltl或Flkl/KDR)、PDGF受體(W090/14425)；HGF受體(美國(guó)專利第5，648，273和5，686，292號(hào))，和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)受體包括結(jié)合NGF、BNDF和NT-3的低親和受體(LNGFR)，也稱作p75NTK或p75，以及作為受體酪氨酸激酶trk家族成員的高親和受體(如trkA、trkB(EP455，460)、trkc(EP522,530))。5.激素用作本發(fā)明融合蛋白中靶向劑的示例性生長(zhǎng)激素包括腎素、人生長(zhǎng)激素(HGH；美國(guó)專利第5，834，598號(hào))、N-甲硫氨?；松L(zhǎng)激素；牛生長(zhǎng)激素；生長(zhǎng)激素釋放因子；甲狀旁腺激素(PTH)；甲狀腺刺激激素(TSH)；甲狀腺素；胰島素原和胰島素(美國(guó)專利第5，157，021和6，576，605號(hào))；濾泡刺激激素(FSH)、降鈣素、黃體生成素(LH)、瘦蛋白、胰高血糖素；鈴蟾肽(bombesin)；促生長(zhǎng)素；Mullerian抑制物；松弛素和松弛素原；促性腺激素相關(guān)肽；催乳素；胎盤(pán)催乳激素；OB蛋白；或mullerian抑制物。6.凝血因子在本發(fā)明融合蛋白中用作靶向劑的示例性血液凝結(jié)因子包括凝血因子(例如因子V、VII、VIII、IX、X、XI、XII和XIII、vonWillebrand因子)；組織因子(美國(guó)專利第5，346，991、5，349，991、5，726，147和6，596，84號(hào))；凝血酶和凝血酶原；纖維蛋白和纖維蛋白原；纖溶酶和纖溶酶原；纖溶酶原激活物，例如尿激酶或人類尿或組織型纖溶酶原激活物(t-PA)。在一種示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽是包含可溶LTβR受體和scFc區(qū)的融合蛋白或免疫粘附素。例如，結(jié)合多肽可包含SEQIDN0:37(ASK057)的重鏈序列。在另一示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽是包含干擾素(如，干擾素)和scFc區(qū)的融合蛋白或免疫粘附素。例如，結(jié)合多肽可包含SEQIDNO:39(EAG2149)的重鏈序列。在另一示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽是包含可溶LTiiR受體和scFc區(qū)的融合蛋白或免疫粘附素。例如，結(jié)合多肽可包含SEQIDN0:41(EAG2190)或SEQIDNO:43(EAG2191)的重鏈序列。III.多特異性結(jié)合多肽在某些特定方面，本發(fā)明的結(jié)合多肽是多特異性的，即，具有結(jié)合于第一分子或分子表位的至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合于第二分子或第一分子的第二表位的至少一個(gè)第二結(jié)合位點(diǎn)。本發(fā)明的多特異性結(jié)合分子可包含至少兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，其中至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)衍生自來(lái)自前述結(jié)合分子的結(jié)合位點(diǎn)或包含來(lái)自前述結(jié)合分子的結(jié)合位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明多特異性結(jié)合分子的至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是抗體的抗原結(jié)合區(qū)或其抗原結(jié)合片段(如前述抗體或抗原結(jié)合片段)。(a)雙特異性分子在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽是雙特異性的。雙特異性結(jié)合多肽可以與例如相同靶分子上的或不同靶分子上的兩個(gè)不同靶位點(diǎn)結(jié)合。例如，在本發(fā)明結(jié)合多肽的情況下，其雙特異性變體可以與例如相同抗原或兩個(gè)不同抗原上的兩個(gè)不同表位結(jié)合。雙特異結(jié)合多肽可以用于例如診斷和治療應(yīng)用。例如，它們可以用固定酶以在免疫測(cè)定中使用。它們還可以，例如通過(guò)與腫瘤相關(guān)分子和可檢測(cè)標(biāo)記(例如緊密地結(jié)合放射性核素的螯合齊U)結(jié)合，用于診斷和治療癌癥。雙特異性結(jié)合多肽還可以，例如通過(guò)使細(xì)胞毒性指向特異靶標(biāo)(例如通過(guò)與病原體或腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞毒性觸發(fā)分子，例如T細(xì)胞受體或FcY受體結(jié)合)，用于人類治療。雙特異性結(jié)合多肽還可以用作例如纖維蛋白溶解劑或疫苗佐劑。雙特異性結(jié)合多肽的例子包括具有至少兩個(gè)針對(duì)不同腫瘤細(xì)胞抗原的臂的雙特異性結(jié)合多肽；具有至少一個(gè)針對(duì)腫瘤細(xì)胞抗原的臂和至少一個(gè)針對(duì)細(xì)胞毒性觸發(fā)分子的臂的雙特異性改變的結(jié)合蛋白(諸如抗-Fe.^.11/抗-0)15、抗-185.sup.HER2/Fe.y.RIII(CD16)、抗CD3/抗惡性B細(xì)胞(IDlO)、抗CD3/抗pl85.sup.HER2、抗CD3/抗p97、抗⑶3/抗腎細(xì)胞癌、抗⑶3/抗OVCAR-3、抗⑶3/L-D1(抗結(jié)腸癌)、抗⑶3/抗刺激黑素細(xì)胞的激素類似物、抗EGF受體/抗⑶3、抗⑶3/抗CAMA1、抗⑶3/抗⑶19、抗⑶3/MoV18、抗神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(NCAM)/抗⑶3、抗葉酸結(jié)合蛋白(FBP)/抗⑶3、抗泛癌相關(guān)抗J^(anti-pancarcinomaassociatedantigen)(AMOC-31)/JfiCD3)；^h^^ift與腫瘤抗原結(jié)合的臂和至少一個(gè)與毒素結(jié)合的臂的雙特異性結(jié)合多肽(例如，抗皂草素/抗Id-Ι、抗⑶22/抗皂草素、抗⑶7/抗皂草素、抗⑶38/抗皂草素、抗CEA/抗蓖麻毒素A鏈、抗-干擾素a.(IFN-.α.)/抗雜交瘤獨(dú)特型、抗CEA/抗長(zhǎng)春花生物堿)；用于轉(zhuǎn)化酶激活的前藥的雙特異性結(jié)合多肽(例如，抗CD30/抗堿性磷酸酶(該酶催化絲裂霉素磷酸酯前藥轉(zhuǎn)化成絲裂霉素醇))；可以用作纖維蛋白溶解劑的雙特異性結(jié)合多肽(例如，抗纖維蛋白/抗組織纖溶酶原激活物(tPA)、抗纖維蛋白/抗尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA))；使免疫復(fù)合物定向于細(xì)胞表面受體的雙特異性結(jié)合多肽(例如抗低密度脂蛋白(LDL)/抗-Fc受體(如Fe.γ.RI、Fe.γ.RII或Fe.γ.RIII))；用于治療感染性疾病的雙特異性結(jié)合多肽(例如，抗CD3/抗單純皰疹病毒(HSV)、抗T細(xì)胞受體CD3復(fù)合物/抗流感病毒、抗-Fe.Y.R/抗-HIV)；用于體外或體內(nèi)檢測(cè)腫瘤的雙特異性結(jié)合多肽例如抗-CEA/抗-E0TUBE、抗-CEA/抗-DPTA、抗-pl85HER2/抗-半抗原)；作為疫苗佐劑的雙特異性結(jié)合多肽(見(jiàn)Fanger等人，同上引文)；和作為診斷工具的雙特異性結(jié)合多肽(例如抗兔IgG/抗鐵蛋白、抗辣根過(guò)氧化物酶(HRP)/抗激素、抗促生長(zhǎng)素抑制素/抗P物質(zhì)、抗-HRP/抗-FITC、抗-CEA/抗-.半乳糖苷酶(見(jiàn)Nofan等人，同上引文))。三特異性多肽的例子包括抗CD3/抗CD4/抗CD37、抗CD3/抗CD5/抗CD37和抗CD3/抗CD8/抗CD37。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明雙特異性結(jié)合多肽具有結(jié)合于CRIPTO-I的一條臂。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性結(jié)合多肽具有結(jié)合于ΙΤβR的一條臂。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性結(jié)合多肽具有結(jié)合于TRAIL-R2的一條臂。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明雙特異性結(jié)合多肽具有結(jié)合于LTβR的一條臂和結(jié)合于TRAIL-R2的一條臂。本發(fā)明多特異性結(jié)合多肽可以對(duì)每種特異性而言是單價(jià)的，或者可以對(duì)每種特異性而言是多價(jià)的。例如，本發(fā)明結(jié)合多肽可以包含一個(gè)與第一靶分子反應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)與第二靶分子反應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)，或者其可以包含兩個(gè)與第一靶分子反應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)和兩個(gè)與第二靶分子反應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)。本發(fā)明結(jié)合多肽可具有至少兩個(gè)來(lái)自配體或受體的兩個(gè)或多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特異性。它們可組裝為異二聚體、異三聚體或異四聚體，基本如公開(kāi)于WO89/02922(1989年4月6日公開(kāi))、ΕΡ314,317(1989年5月3日公開(kāi))、和1992年5月2日授權(quán)的美國(guó)專利第5，116，964號(hào)的。實(shí)例包括CD4-IgG/TNF受體-IgG和CD4_IgG/L_選擇蛋白_IgG。最后提到的分子聯(lián)合淋巴細(xì)胞歸巢受體(LHR、L-選擇蛋白)的淋巴結(jié)結(jié)合功能和CD4的HIV結(jié)合功能，可能應(yīng)用于預(yù)防或治療HIV感染、相關(guān)病癥，或作為診斷劑。(b)含有scFv的多特異性結(jié)合分子在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多特異性結(jié)合分子是包含至少一個(gè)scFv分子例如前述的scFv分子的多特異性結(jié)合分子。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的多特異性結(jié)合分子包含兩個(gè)scFv分子，如雙特異性scFv(Bis-scFv)。在某些實(shí)施方案中，scFv分子是常規(guī)scFv分子。在其它實(shí)施方案中，scFv分子是前述的穩(wěn)定化的scFv分子。在某些實(shí)施方案中，多特異性結(jié)合分子可通過(guò)連接scFv分子(如，穩(wěn)定化的scFv分子)與包含scFc分子的結(jié)合分子支架而產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，起始分子選自前述結(jié)合分子，scFv分子和起始結(jié)合分子具有不同結(jié)合位點(diǎn)。例如，本發(fā)明結(jié)合分子可包含連接于第二scFv分子或非scFv結(jié)合分子、具有第一結(jié)合特異性的scFv分子，該第二scFv分子或非scFv結(jié)合分子賦予第二結(jié)合特異性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子是天然存在抗體，已融合了穩(wěn)定化的scFv分子。當(dāng)穩(wěn)定化的scFv連接于母體結(jié)合分子時(shí)，穩(wěn)定化的scFv分子的鍵合優(yōu)選地改進(jìn)結(jié)合分子的熱穩(wěn)定性至少約2°c或;rc。在一個(gè)實(shí)施方案中，與常規(guī)結(jié)合分子相比，含有scFv的本發(fā)明結(jié)合分子具有rc的改進(jìn)的熱穩(wěn)定性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，與常規(guī)結(jié)合分子相比，本發(fā)明結(jié)合分子具有2°C的改進(jìn)的熱穩(wěn)定性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，與常規(guī)結(jié)合分子相比，本發(fā)明結(jié)合分子具有4、5、6°C的改進(jìn)的熱穩(wěn)定性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明多特異性結(jié)合分子包含至少一個(gè)scFv(如2、3或4scFv,如，穩(wěn)定化的scFv)。關(guān)于scFv分子的進(jìn)一步細(xì)節(jié)可見(jiàn)于USSN11/725,970，以引用的方式并入本文。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子是多特異性多價(jià)結(jié)合分子，具有帶有第一結(jié)合特異性的至少一個(gè)scFv片段和帶有第二結(jié)合特異性的至少一個(gè)scFv。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一個(gè)scFv分子是穩(wěn)定化的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子是scFv四價(jià)結(jié)合分子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一個(gè)scFv分子是穩(wěn)定化的。(c)多特異性結(jié)合分子片段在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽可包含來(lái)自多特異性結(jié)合分子片段的結(jié)合位點(diǎn)。多特異性結(jié)合分子片段包括雙特異性Fab2或多特異性(如三特異性)Fab3分子。例如，多特異性結(jié)合分子片段可包含具有不同特異性的Fab或scFv分子的化學(xué)結(jié)合的多聚體(如二聚體、三聚體或四聚體)。(d)串聯(lián)可變結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明多特異性結(jié)合分子可包含含有串聯(lián)抗原結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合分子。例如，可變結(jié)構(gòu)域可包含被工程化以包含直接融合或成串連接的至少兩個(gè)(如，兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或更多)可變重結(jié)構(gòu)域(VH結(jié)構(gòu)域)的抗體重鏈和被工程化以包含直接融合或成串連接的至少兩個(gè)(如，兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或更多)可變輕結(jié)構(gòu)域(VL結(jié)構(gòu)域)的抗體輕鏈。VH結(jié)構(gòu)域與相應(yīng)VL結(jié)構(gòu)域相互作用以形成一串抗原結(jié)合位點(diǎn)，其中至少兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合不同表位。串聯(lián)可變結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子可包含兩個(gè)或多個(gè)重或輕鏈并具有更高級(jí)的價(jià)(如，二價(jià)或四價(jià))。制備串聯(lián)可變結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子的方法是本領(lǐng)域已知的，參見(jiàn)如TO2007/024715。(e)雙重特異性結(jié)合分子在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明多特異性結(jié)合分子可包含具有雙重結(jié)合特異性的單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。例如，本發(fā)明的雙重特異性結(jié)合分子可包含與兩個(gè)表位交叉反應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)。產(chǎn)生雙重特異性結(jié)合分子的領(lǐng)域公認(rèn)的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，雙重特異性結(jié)合分子可通過(guò)篩選結(jié)合第一表位兩者的結(jié)合分子并反篩選(counterscreening)分離的結(jié)合分子結(jié)合第二表位的能力而分離。(f)多特異性融合蛋白在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明多特異性結(jié)合分子是多特異性融合蛋白。本文所用的術(shù)語(yǔ)"多特異性融合蛋白"指定具有至少兩個(gè)結(jié)合特異性且還包含scFc的融合蛋白(如上定義的)。多特異性融合蛋白可組裝為如，異二聚體、異三聚體或異四聚體，基本如公開(kāi)于W89/02922(1989年4月6日公開(kāi))、EP314，317(1989年5月3日公開(kāi))和1992年5月2日授權(quán)的美國(guó)專利第5，116，964號(hào)。優(yōu)選的多特異性融合蛋白是雙特異性的。在某些實(shí)施方案中，多特異性融合蛋白的至少結(jié)合特異性包含scFv，如，穩(wěn)定化的scFv。本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)重組DNA技術(shù)可開(kāi)發(fā)多種其它多價(jià)抗體構(gòu)建體，例如描述于PCT國(guó)際申請(qǐng)第PCT/US86/02269號(hào)；歐洲專利申請(qǐng)第184，187號(hào)；歐洲專利申請(qǐng)第171，496號(hào)；歐洲專利申請(qǐng)第173，494號(hào)；PCT國(guó)際公布第W086/01533號(hào)；美國(guó)專利第4,816,567號(hào)；歐洲專利申請(qǐng)第125,023號(hào)；Better等人(1988)Science2401041-1043；Liu等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:3439_3443；Liu等人(1987)J.Immunol.139:3521-3526;Sun等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:214-218;Nishimura等人(1987)CancerRes.47:999_1005；Wood等人(1985)Nature314446-449；Shaw等人(1988)J.Natl.CancerInst.801553-1559)；Morrison(1985)Science2291202-1207；Oi等人(1986)BioTechniques4:214；美國(guó)專利第5，225，539號(hào)Jones等人(1986)Nature321:552_525；Verhoeyan等人(1988)Science2391534；Beidler等人(1988)J.Immunol.1414053-4060；以及Winter和Milstein,Nature,349,第293-99頁(yè)(1991))。優(yōu)選地非人類的抗體通過(guò)連接非人類的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與人類恒定結(jié)構(gòu)域而被“人源化”(如〇&1^117等人，美國(guó)專利第4，816，567號(hào)；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81，第6851-55頁(yè)(1984))?？捎糜谥苽涠鄡r(jià)抗體構(gòu)建體的其它方法描述在以下出版物Ghetie，Maria-Ana等人(2001)Blood971392-1398；Wolff,EdithA等人(1993)CancerResearch53:2560-2565；Ghetie,Maria-Ana等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94:7509_7514；Kim,J.C.等人(2002)Int.J.Cancer97(4):542_547;Todorovska，Aneta等人(2001)JournalofImmunologicalMethods24847~66；ColomaM.J.等人(1997)NatureBiotechnology15:159-163；Zuo,Zhuang等人(2000)ProteinEngineering(增刊.)13(5):361_367；SantosA.D.,等人(1999)ClinicalCancerResearch5:3118s_3123s；Presta,LeonardG.(2002)CurrentPharmaceuticalBiotechnology3237-256；vanSpriel,Annemiek等人，(2000)ReviewlmmunologyToday21(8)391-397。IV.制備結(jié)合多肽選擇了為了并入scFc支架的結(jié)合位點(diǎn)后，許多方法可用于產(chǎn)生本發(fā)明結(jié)合分子。連接衍生自抗體或其它分子的期望的靶結(jié)合位點(diǎn)于scFc支架的方法是本領(lǐng)域已知的。應(yīng)理解的是，因?yàn)槊艽a子的簡(jiǎn)并性，多種核酸序列將編碼結(jié)合多肽的氨基酸序列。通過(guò)從頭固相DNA合成或通過(guò)PCR誘變此前制備的編碼靶多肽的多核苷酸，可產(chǎn)生期望的多核苷酸。寡核苷酸-介導(dǎo)的誘變是一種制備取代、符合讀框的插入或改變(如，改變的密碼子)以引入編碼氨基酸取代的密碼子(如，引入到Fc變體部分)的方法。例如，通過(guò)將編碼期望的突變的寡核苷酸與單鏈DNA模板雜交而改變起始多肽DNA。雜交后，DNA聚合酶用于合成并入寡核苷酸引物的模板的全長(zhǎng)第二互補(bǔ)鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，遺傳工程如，基于引物的PCR誘變，足以并入本文定義的改變以產(chǎn)生編碼本發(fā)明結(jié)合多肽的多核苷酸。編碼結(jié)合多肽的多核苷酸序列隨后可插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體并轉(zhuǎn)染到本來(lái)不產(chǎn)生所述蛋白的原核或真核宿主細(xì)胞諸如大腸桿菌細(xì)胞、猿COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CH0)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞以重組表達(dá)。為了本發(fā)明的目的，可采用多種表達(dá)載體系統(tǒng)。這些表達(dá)載體通常在宿主生物體中作為游離基因或作為宿主染色體DNA的整合部分可復(fù)制。表達(dá)載體可包括表達(dá)控制序列，包括但不限于啟動(dòng)子(如，天然伴隨的或異源啟動(dòng)子)、增強(qiáng)子、信號(hào)序列、剪接信號(hào)、增強(qiáng)子元件、和轉(zhuǎn)錄終止序列。優(yōu)選地，表達(dá)控制序列是能夠轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染真核宿主細(xì)胞的載體中的真核啟動(dòng)子系統(tǒng)。表達(dá)載體還可利用衍生自動(dòng)物病毒諸如牛乳頭狀瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、桿狀病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒(RSV、MMTV或M0MLV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)或SV40病毒的DNA元件。其它載體涉及使用具有內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)的多順?lè)醋酉到y(tǒng)。通常，表達(dá)載體包含選擇標(biāo)記(如，氨芐西林抗性、潮霉素抗性、四環(huán)素抗性或新霉素抗性)以允許檢測(cè)以期望的DNA序列轉(zhuǎn)化的那些細(xì)胞(參見(jiàn)如，Itakura等人，美國(guó)專利第4，704，362號(hào))。已將DNA整合進(jìn)其染色體的細(xì)胞可通過(guò)引入一個(gè)或多個(gè)允許選擇轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞的標(biāo)記而選擇。標(biāo)記可提供對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷宿主的原養(yǎng)型、殺生物劑抗性(如，抗生素)或?qū)χ亟饘僦T如銅的抗性。選擇標(biāo)記基因可直接連接于待表達(dá)的DNA序列，或可通過(guò)共轉(zhuǎn)化引入同一細(xì)胞。一種優(yōu)選的表達(dá)載體是NE0SPLA(美國(guó)專利第6，159，730號(hào))。該載體含有巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子/增強(qiáng)子、小鼠0球蛋白主啟動(dòng)子、SV40復(fù)制原點(diǎn)、牛生長(zhǎng)激素多腺苷酸化序列、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶外顯子1和2、二氫葉酸還原酶基因和前導(dǎo)序列。已發(fā)現(xiàn)，在該載體中引入可變和恒定區(qū)基因，轉(zhuǎn)染CH0細(xì)胞，然后在含有G418的培養(yǎng)基中進(jìn)行挑選和氨甲蝶呤擴(kuò)增會(huì)造成抗體的高水平表達(dá)。美國(guó)專利第5，736，137和5，658，570號(hào)中也有關(guān)于載體系統(tǒng)的教導(dǎo)，這兩篇專利均以參考的方式全文并入本文。該系統(tǒng)提供高水平表達(dá)，如，>30pg/細(xì)胞/天。其它示例性載體系統(tǒng)描述于如，美國(guó)專利第6，413，777號(hào)。當(dāng)本發(fā)明結(jié)合多肽包含抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，任選地連接于遺傳融合的Fc區(qū)(即，scFc區(qū))的編碼另外的輕和重鏈可變區(qū)的多核苷酸，可插入到相同或不同表達(dá)載體。編碼免疫球蛋白鏈的DNA區(qū)段可操作地連接于表達(dá)載體中的控制序列，這確保免疫球蛋白多肽的表達(dá)。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽可以用多順?lè)醋訕?gòu)建體來(lái)表達(dá)。在這些表達(dá)系統(tǒng)中，多個(gè)目的基因產(chǎn)物，比如多聚結(jié)合蛋白的多個(gè)結(jié)合多肽可以由單個(gè)多順?lè)醋訕?gòu)建體產(chǎn)生。這些系統(tǒng)有利地利用了一個(gè)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)來(lái)提供在真核宿主細(xì)胞內(nèi)相對(duì)高水平表達(dá)本發(fā)明多肽。適用的IRES序列在美國(guó)專利第6，193，980號(hào)中公開(kāi)，該專利同樣引入本文。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠意識(shí)到，可以利用這類表達(dá)系統(tǒng)來(lái)高效地產(chǎn)生本申請(qǐng)公開(kāi)的各種多肽。更一般地，在制備編碼結(jié)合多肽的載體或DNA序列之后，可以將表達(dá)載體導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞。即可以轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的多種技術(shù)導(dǎo)入宿主細(xì)胞。這些技術(shù)包括但不限于，轉(zhuǎn)染(包括電泳和電穿孔)、原生質(zhì)體融合、磷酸鈣沉淀、與包被DNA進(jìn)行的細(xì)胞融合、顯微注射以及用完整病毒進(jìn)行感染。參見(jiàn)，Ridgway,A.A.G.“MammalianExpressionVectors(哺乳動(dòng)物表達(dá)載體)〃第24.2章，第470-472頁(yè)Vectors(載體),Rodriguez禾口Denhardt,編輯.(Butterworths,Boston,Mass.1988)。最優(yōu)選地，質(zhì)粒借助電穿孔導(dǎo)入宿主。將轉(zhuǎn)化細(xì)胞在適合產(chǎn)生輕鏈和重鏈的條件下生長(zhǎng)，測(cè)定重鏈和/或輕鏈蛋白合成。示例性測(cè)定技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附檢定法(ELISA)、放射免疫分析(RIA)或熒光激活的細(xì)胞分選法(FACS)、免疫組織化學(xué)法及類似測(cè)定技術(shù)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”廣義上用來(lái)指DNA導(dǎo)入受體宿主細(xì)胞，其改變基因型從而造成了受體細(xì)胞的變化。依此類推，“宿主細(xì)胞”是指轉(zhuǎn)化了利用重組DNA技術(shù)構(gòu)建的編碼至少一種異源基因的載體的細(xì)胞。在描述從重組宿主中分離結(jié)合多肽的過(guò)程時(shí)，術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞"和"細(xì)胞培養(yǎng)物"可以交換使用來(lái)指示結(jié)合多肽的來(lái)源，除非另外清楚地說(shuō)明。換句話說(shuō)，從“細(xì)胞”中回收多肽可能意味著從離心沉淀的完整細(xì)胞，或從含有培養(yǎng)基和懸浮細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物中回收。用于蛋白表達(dá)的宿主細(xì)胞系最優(yōu)選是來(lái)源于哺乳動(dòng)物的；本領(lǐng)域技術(shù)人員有能力優(yōu)先確定最適合期望的基因產(chǎn)物在其中表達(dá)的具體宿主細(xì)胞系。示例性宿主細(xì)胞系包括，但不限于DG44和DUXB11(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系，DHFR-)、HELA(人類宮頸癌細(xì)胞)、CVI(猴腎細(xì)胞系)、COS(帶有SV40T抗原的CVI衍生物)、R1610(中國(guó)倉(cāng)鼠成纖維細(xì)胞)、BALBC/3T3(小鼠成纖維細(xì)胞)、HAK(倉(cāng)鼠腎細(xì)胞系)、SP2/0(小鼠骨髓瘤)、P3.X63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-lclBPT(牛內(nèi)皮細(xì)胞)、RAJI(人類淋巴細(xì)胞)和293(人類腎細(xì)胞)。尤其優(yōu)選CH0細(xì)胞。宿主細(xì)胞系通?？梢缘米陨虡I(yè)服務(wù)機(jī)構(gòu)、美國(guó)組織培養(yǎng)物保藏中心或公開(kāi)文獻(xiàn)。編碼本發(fā)明多肽的基因也可以在非哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，比如細(xì)菌或酵母或植物細(xì)胞。就此而言，應(yīng)該意識(shí)到各種單細(xì)胞非哺乳動(dòng)物微生物比如細(xì)菌也可以被轉(zhuǎn)化；即那些能夠在培養(yǎng)基中或發(fā)酵生長(zhǎng)的。易于被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌，包括腸桿菌科的成員，比如大腸桿菌或沙門(mén)氏菌菌株；芽孢桿菌科，比如枯草芽孢桿菌；肺炎球菌；鏈球菌和流感嗜血桿菌。還應(yīng)該意識(shí)到，在細(xì)菌中進(jìn)行表達(dá)時(shí)，多肽通常成為內(nèi)涵體的一部分。多肽必須被分離、純化，然后組裝成功能性分子。除了原核生物，還可使用真核微生物。釀酒酵母或普通面包酵母是最常用的真核微生物，而多種其它株系通常也可用。對(duì)于在酵母中表達(dá)，通常使用質(zhì)粒YRp7，例如(Stinchcomb等人，(1979)，Nature,282:39;Kingsman等人，(1979)，Gene，7141；Tschemper等人，(1980)，Gene，10157)。該質(zhì)粒已包含TRP1基因，其為缺少在色氨酸中生長(zhǎng)的能力的酵母突變株例如ATCCNo.44076或PEP4-1提供選擇標(biāo)記(Jones,(1977)，GenetiCS，85:12)。作為酵母宿主細(xì)胞基因組特征，trpl損傷的存在隨后提供有效環(huán)境來(lái)通過(guò)在不存在色氨酸時(shí)生長(zhǎng)檢測(cè)轉(zhuǎn)化。也可采用其它酵母宿主如畢赤酵母。期望酵母表達(dá)載體具有表達(dá)控制序列(如，啟動(dòng)子)、復(fù)制起點(diǎn)、終止序列和類似序列。典型啟動(dòng)子包括3_磷酸甘油酯激酶和其它糖解酶。誘導(dǎo)型酵母啟動(dòng)子包括，除了其它以外，來(lái)自乙醇脫氫酶、異細(xì)胞色素C以及負(fù)責(zé)甲醇、麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動(dòng)子。替代地，可以將編碼多肽的核苷酸序列摻入轉(zhuǎn)基因中用于導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基因組和隨后在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的奶中表達(dá)(見(jiàn)例如，Deboer等人，US5,741,957,Rosen,US5，304，489和Meade等人，US5，849，992)。適宜的轉(zhuǎn)基因包括可操作地與來(lái)自乳腺特異基因如酪蛋白或0乳球蛋白的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子連接的結(jié)合多肽的編碼序列。體外生長(zhǎng)允許放大規(guī)模以獲得大量期望的多肽。組織培養(yǎng)條件下培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并包括均一的懸浮培養(yǎng)，如在氣升式反應(yīng)器或連續(xù)攪拌反應(yīng)器中，或固定或捕獲的細(xì)胞培養(yǎng)，如在空心纖維、微囊中、在瓊脂糖微珠或陶瓷芯上。如果需要和/或期望，多肽溶液可通過(guò)常規(guī)層析方法純化，例如凝膠過(guò)濾、離子交換層析、DEAE-纖維素上的層析或(免疫_(dá))親合層析，如，在優(yōu)先生物合成合成的鉸鏈區(qū)多肽之后或在本文所述的HIC層析步驟之前或之后。親和性標(biāo)簽序列(如His(6)標(biāo)簽)可任選地附加或包括在多肽序列中以便于下游純化。在其中本發(fā)明的結(jié)合多肽形成多聚的蛋白或多聚體(如，二聚的結(jié)合多肽)的情況，多聚的蛋白可使用單個(gè)載體或兩個(gè)載體表達(dá)。當(dāng)結(jié)合多肽在不同表達(dá)載體上克隆時(shí)，共轉(zhuǎn)染載體以獲得表達(dá)和組裝完整全蛋白。表達(dá)后，全蛋白、其二聚體、單獨(dú)多肽(如結(jié)合多肽)、或其它形式可以根據(jù)本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法，包括硫酸銨沉淀、親和柱層析、HPLC純化、凝膠電泳及類似方法純化(一般見(jiàn)Scopes，ProteinPurification(蛋白純化)(Springer-Verlag,N.Y.，(1982))。對(duì)于制藥應(yīng)用，至少約90至95%均質(zhì)性的大致純的蛋白是優(yōu)選的，98至99%或更高均質(zhì)性最優(yōu)選。V.純化結(jié)合分子在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及從包含遺傳融合的Fc區(qū)的單鏈(S卩，單體)scFc結(jié)合分子純化表達(dá)為包含遺傳融合的Fc區(qū)(即，scFc區(qū))的雙鏈(即，二聚的)scFc結(jié)合分子的本發(fā)明結(jié)合分子的方法。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供從單鏈scFc結(jié)合分子純化雙鏈scFc結(jié)合分子的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含單鏈scFc蛋白和雙鏈scFc蛋白兩者的群體可通過(guò)大小排阻層析純化。例如，單鏈scFc結(jié)合分子可從聚集體和雙鏈scFc分子分離，如，使用Superdex200凝膠過(guò)濾柱。如通過(guò)還原和非還原SDS-PAGE可分析凝膠過(guò)濾級(jí)分，并組合合適的級(jí)分以獲得單鏈Fc和雙鏈Fc群體的均一的池。這些池可進(jìn)一步表征以確定分子的均質(zhì)性和分子質(zhì)量，如，通過(guò)連線光散射分析的分析性SEC(TSK-GelG3000SWa柱)。本發(fā)明還涉及包含遺傳融合的Fc結(jié)構(gòu)域的雙鏈scFc結(jié)合分子(即，二聚的scFc結(jié)合分子)的純化群體以及包含遺傳融合的Fc結(jié)構(gòu)域的單鏈scFc結(jié)合分子(即，單體scFc結(jié)合分子)的純化群體。VI.標(biāo)記或結(jié)合功能性部分本發(fā)明結(jié)合多肽可以以非結(jié)合形式來(lái)使用，或者可結(jié)合多種功能性部分中的至少一種，從而例如便于檢測(cè)靶或者給患者成像或治療。本發(fā)明多肽可以在純化之前或之后，或進(jìn)行純化時(shí)被標(biāo)記或結(jié)合。具體地，本發(fā)明多肽可結(jié)合(如，經(jīng)由工程化的半胱氨酸殘基)于功能性部分。功能性部分優(yōu)選地附著于結(jié)合多肽的結(jié)合位點(diǎn)以外的部分(如，多肽接頭或遺傳融合的Fc區(qū)(S卩，scFc區(qū))的Fc部分)。示例性功能性部分包括親和性部分和效應(yīng)子部分。示例性效應(yīng)子部分包括細(xì)胞毒素(比如放射性同位素、細(xì)胞毒性藥物或毒素)、治療劑、細(xì)胞抑制劑、生物毒素、前藥、肽、蛋白、酶、病毒、脂質(zhì)、生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑、藥劑、免疫活性配體(例如淋巴因子或其它抗體，其中所得分子既能結(jié)合贅生性細(xì)胞，又結(jié)合效應(yīng)細(xì)胞，比如T細(xì)胞)、PEG或用于成像的可檢測(cè)部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽可以結(jié)合到能降低腫瘤血管形成的分子。在其它實(shí)施方案中，公開(kāi)的組合物可包含偶聯(lián)了藥物或前藥的本發(fā)明多肽。本發(fā)明的其他實(shí)施方案包括結(jié)合了特異性生物毒素(比如蓖麻毒蛋白、白樹(shù)毒蛋白(gelonin)、假單胞菌外毒素或白喉毒素)或其細(xì)胞毒性片段的本發(fā)明多肽的用途。選擇使用結(jié)合或未結(jié)合多肽取決于癌癥的類型和發(fā)展階段、所用的輔助治療(例如化療或外部放療)以及患者的狀態(tài)。應(yīng)當(dāng)意識(shí)到，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本文的教導(dǎo)可以容易地作出這類選擇。應(yīng)當(dāng)意識(shí)到，在以前的研究中，標(biāo)記了同位素的抗腫瘤抗體已被成功地用于在動(dòng)物模型中，在一些情形在人類中破壞實(shí)體瘤的細(xì)胞以及淋巴瘤/白血病細(xì)胞。示例性放射性同位素包括’、125〗、131〗、123〗、111〗!!、1。5!^、15、!!!、67^!、6^、166^、177!^、186!^和188Re。放射性核素通過(guò)產(chǎn)生電離輻射，引起核DNA多處鏈斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞死亡而作用。用于產(chǎn)生治療結(jié)合物的同位素典型地產(chǎn)生具有短路徑長(zhǎng)度的高能a或卩粒子。這些放射性核素殺傷其鄰近的細(xì)胞，例如該結(jié)合物所附著的或已經(jīng)進(jìn)入的贅生性細(xì)胞。它們對(duì)非被定位的細(xì)胞很少或無(wú)作用。放射性核素基本上是無(wú)免疫原性的。在與本發(fā)明相關(guān)的放射標(biāo)記結(jié)合物的使用方面，本發(fā)明結(jié)合多肽可以直接標(biāo)記(比如通過(guò)電離)或利用螯合劑來(lái)間接標(biāo)記。本文所用的短語(yǔ)“間接標(biāo)記”和“間接標(biāo)記方法”均意味著螯合劑共價(jià)地連接結(jié)合多肽，而至少一種放射性核素與該螯合劑相關(guān)聯(lián)。這些螯合劑通常是指雙功能螯合劑，因?yàn)樗鼈兗饶芙Y(jié)合多膚，又能結(jié)合放射性同位素。特別優(yōu)選的螯合劑包括1-異硫氰酸芐基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(〃MX-DTPA")和環(huán)己基二乙三胺五乙酸(〃CHX-DTPA")衍生物。其它螯合劑包括P-D0TA和EDTA衍生物。特別優(yōu)選的用于間接標(biāo)記的放射性核素包括mIn和9°Y。本文所用的短語(yǔ)“間接標(biāo)記”和“間接標(biāo)記方法”均意味著放射性核素直接共價(jià)地連到多肽上(通常借助氨基酸殘基)。更具體的說(shuō)，這些連接技術(shù)包括隨機(jī)標(biāo)記和定點(diǎn)標(biāo)記。在后一種情況中，標(biāo)記定點(diǎn)到多肽上的特定位點(diǎn)，比如僅存在于結(jié)合物Fc部分的N-連接的糖殘基。此外，各種直接標(biāo)記技術(shù)和實(shí)驗(yàn)方案是適用于本發(fā)明的。例如，锝_99m標(biāo)記的多肽可以通過(guò)配體交換過(guò)程來(lái)制備，即通過(guò)用錫離子溶液還原锝酸鹽(Pertechnate)(Tc04_)，將被還原的锝鰲合到S印hadex柱上，將多肽上樣到該柱子上；或者通過(guò)批量標(biāo)記技術(shù)，例如將锝酸鹽、還原劑(比如SnCl2)、緩沖液(比如鄰苯二甲酸鈉鉀溶液)，以及抗體一起孵育。在任何情況中，用于直接標(biāo)記抗體的優(yōu)選放射性核素是本領(lǐng)域公知的，特別優(yōu)選用于直接標(biāo)記的放射性核素是通過(guò)酪氨酸殘基共價(jià)連接的mI。根據(jù)本發(fā)明的多肽可以用例如放射性碘化鈉或碘化鉀和化學(xué)氧化劑(比如次氯酸鈉、氯胺T或類似物)，或者酶學(xué)氧化劑(例如，乳過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶和葡萄糖)來(lái)進(jìn)行衍生。但是，為了本發(fā)明的目的，特別優(yōu)選的是間接標(biāo)記方法。關(guān)于螯合劑和螯合劑結(jié)合物的專利是本領(lǐng)域已知的。例如，Gansow的美國(guó)專利第4，831，175號(hào)涉及多重取代的二乙三胺五乙酸螯合物，和含有該螯合物的蛋白結(jié)合體，以及它們的制備方法。Gansow的美國(guó)專利第5，099，069,5,246，692,5,286，850,5,434，287和5，124，471號(hào)還涉及到多重取代的DTPA螯合物。這些專利均全文引入本文。其它適用的金屬螯合劑的例子是乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙三胺五乙酸(DPTA)、1，4，8，11-四氮雜十四烷、1，4，8，11-四氮雜十四烷-1，4，8，11-四乙酸、1-氧代-4，7，12，15-四氮雜十七烷-4，7，12，15-四乙酸及類似物。環(huán)己基-DTPA或CHX-DTPA是特別優(yōu)選的，在下文有大量的例子。還有其它一些適用的螯合劑，包括有待發(fā)現(xiàn)的，可很容易地被技術(shù)人員識(shí)別，顯然在本發(fā)明的范圍內(nèi)。優(yōu)選共同待決申請(qǐng)序列號(hào)08/475，813,08/475,815和08/478，967中用于協(xié)助螯合的相容螯合劑，包括特異性雙官能螯合劑來(lái)提供對(duì)三價(jià)金屬的高親和性，顯示升高的腫瘤對(duì)非腫瘤比率，骨吸收下降以及更高的放射性核素在體內(nèi)目標(biāo)部位(即B細(xì)胞淋巴瘤腫瘤位點(diǎn))的累積。但是，可具備或可以不具備所有這些特點(diǎn)的其他雙官能螯合劑也是本領(lǐng)域已知的，并且有益于腫瘤治療。還應(yīng)當(dāng)意識(shí)到，與本文的教導(dǎo)一致的，為了診斷和治療目的，結(jié)合多肽可以結(jié)合不同的放射性標(biāo)記。為了這個(gè)目的，前面提到的共同待決申請(qǐng)(以參考的方式全文引入本文)公開(kāi)了放射性標(biāo)記的治療結(jié)合物，其用于在施用治療抗體前進(jìn)行腫瘤診斷“成像”?！癐n2B8”結(jié)合物包含鼠單克隆抗體2B8，該抗體對(duì)人類CD20抗原具有特異性，借助雙官能螯合劑連接于mIn，其中所述螯合劑是包含1:1混合的1-異硫氰酸芐基-3-甲基-DTPA和1-甲基-3-異硫氰酸芐基-DTPA的MX-DTPA(二乙三胺五乙酸)。111In是特別優(yōu)選的診斷放射性核素，因?yàn)樵诩s1到IOmCi可以安全地施用而沒(méi)有可檢測(cè)到的毒性；成像數(shù)據(jù)通?？梢灶A(yù)測(cè)后續(xù)的9°Y標(biāo)記的抗體分布。多數(shù)成像研究使用5mCilllIn標(biāo)記的抗體，因?yàn)檫@個(gè)劑量既安全又比更低劑量具有增加的成像效率，最佳成像出現(xiàn)在施用抗體后的3到6天。參見(jiàn)，例如Murray,J.Nuc.Med.263328(1985)和Carraguillo等人，J.Nuc.Med.2667(1985)。如上文所述，有許多放射性核素可以用于本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定各種情況下，哪種放射性核素是最合適的。例如，131I是公知用于靶向免疫治療的放射性核素。然而，131I的臨床應(yīng)用可能受到幾個(gè)因素的限制，包括物理半衰期為8天；碘化抗體在血液和腫瘤部位的脫鹵作用；以及發(fā)射特性(例如，Y成分高)，這對(duì)腫瘤局部劑量蓄積可能是次優(yōu)的。隨著更佳螯合劑的出現(xiàn)，在蛋白上連接金屬螯合基團(tuán)的機(jī)會(huì)提高了利用其它放射性核素諸如111In和9°Y的機(jī)會(huì)。9°Υ提供了幾個(gè)用于放射免疫治療應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)9°Υ的半衰期是64小時(shí)長(zhǎng)，足夠抗體在腫瘤部位的積累；并且與例如131I不同，9°Υ是純的高能β射線源，在衰變過(guò)程中無(wú)伴隨的Y輻射；于100到1，000細(xì)胞直徑的組織范圍內(nèi)。另外，最低貫穿輻射量使得可以門(mén)診施用9°Υ_標(biāo)記的抗體。此外，細(xì)胞殺傷不要求標(biāo)記抗體內(nèi)在化，電離輻射的局部發(fā)射對(duì)沒(méi)有靶分子的臨近腫瘤細(xì)胞是致死的。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到，這些非放射活性的結(jié)合物也可以根據(jù)選擇的要結(jié)合的試劑利用多種技術(shù)來(lái)組裝。例如，通過(guò)例如將多肽與生物素的活化酯(比如生物素N-羥基琥珀酰胺酯)進(jìn)行反應(yīng)來(lái)制備生物素的結(jié)合物。類似的，帶有熒光標(biāo)記的結(jié)合物可以在有偶聯(lián)劑(例如前面列舉的)的情況下制備，或者通過(guò)與異硫氰酸酯，優(yōu)選異硫氰酸熒光素進(jìn)行反應(yīng)來(lái)制備。本發(fā)明多肽與細(xì)胞抑制劑/細(xì)胞毒性物質(zhì)以及金屬鰲合劑的結(jié)合物可以通過(guò)類似的方式制備。許多效應(yīng)子分子缺少可以連接結(jié)合多肽的適當(dāng)?shù)墓倌芑鶊F(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方案中，效應(yīng)子分子例如藥物或前藥通過(guò)連接分子連到結(jié)合多肽上。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述連接分子含有能夠在特定位點(diǎn)激活細(xì)胞毒性的化學(xué)鍵。合適的化學(xué)鍵是本領(lǐng)域公知的，包括二硫鍵、酸敏感性鍵、光敏感性鍵、肽酶敏感性鍵、在巰基和馬來(lái)酰亞胺之間形成的硫醚鍵，以及酯酶敏感性健。最優(yōu)選地，所述連接分子包含二硫鍵或硫醚鍵。與本發(fā)明一致的，所述連接分子優(yōu)選包含活性化學(xué)基團(tuán)。特別優(yōu)選的活性化學(xué)基團(tuán)是N-琥珀酰亞胺酯和N-琥珀酰亞胺酯。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述活性化學(xué)基團(tuán)可以借助硫醇基之間的二硫鍵共價(jià)結(jié)合到效應(yīng)子上。在一個(gè)實(shí)施方案中，效應(yīng)物分子被修飾以便含有硫醇基。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員明白，硫醇基含有與氫原子結(jié)合的硫原子，通常在本領(lǐng)域又稱為巰基，可以用“一SH"或〃RSH"表示。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以用連接分子將效應(yīng)子分子與本發(fā)明結(jié)合多肽連接起來(lái)。本發(fā)明的連接分子可以是可切割的或不可切割的。在一個(gè)實(shí)施方案中，可切割連接分子是氧化還原可切割的連接分子，以使該連接分子在較低氧還電勢(shì)的環(huán)境中是可切割的，這種環(huán)境比如細(xì)胞質(zhì)和游離巰基的分子濃度較高的其它區(qū)域。因?yàn)檠踹€電勢(shì)的改變而可被切割的連接分子的例子包括那些含有二硫鍵的。切割刺激可以在本發(fā)明結(jié)合蛋白被吸收到胞內(nèi)時(shí)提供，在這里細(xì)胞質(zhì)的較低氧還電勢(shì)促使連接分子被切割。在另一個(gè)實(shí)施方案中，PH降低引發(fā)美登木素生物堿釋放到靶細(xì)胞內(nèi)。在許多生理和病理過(guò)程中涉及到PH的下降，比如內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)、腫瘤生長(zhǎng)、發(fā)炎和心肌局部缺血。PH由生理值7.4下降到內(nèi)體中的5-6或者溶酶體中的4-5?？梢杂脕?lái)靶向癌細(xì)胞的溶酶體或內(nèi)體的酸敏感性連接分子的例子包括帶有比如見(jiàn)于乙縮醛、縮酮、原酸酯、腙、三苯甲基、順aconityl或硫代氨甲酰的酸敏感性鍵的那些(參見(jiàn)例如，Willner等人，(1993)，Bioconj.Chem.，4:521_7；美國(guó)專利第4，569，789、4，631，190,5,306，809和5，665，358號(hào))。其它示例性酸敏感性連接分子包含二肽序列Phe-Lys和Val-Lys(King等人，(2002)，J.Med.Chem.，45:4336_43)。切割刺激可以由攝取到胞內(nèi)并運(yùn)輸?shù)降蚉H的內(nèi)體區(qū)室(例如溶酶體)來(lái)提供。其它示例性酸切割連接分子是含有兩個(gè)或多個(gè)供兩個(gè)或多個(gè)美登木素生物堿附著的酸切割鍵的分子(King等人，(1999)，Bioconj.Chem.，10:279_88；W098/19705)。可切割的連接分子可以是對(duì)生物供應(yīng)的與特定靶細(xì)胞相關(guān)的切割試劑(例如，溶酶體或腫瘤相關(guān)酶)敏感?？梢悦复偾懈畹倪B接分子的例子包括，但不限于肽和酯。示例性可酶切連接分子包括對(duì)腫瘤相關(guān)蛋白酶，比如組織蛋白酶B或血纖蛋白溶酶敏感的那些(Dubowchik等人，(1999),Pharm.Ther.,8367-123；Dubowchik等人，(1998),Bioorg.Med.Chem.Lett.，8:3341_52；deGroot等人，(2000)，J.Med.Chem.，43:3093_102；deGroot等人，(1999)m42:5277-83)。組織蛋白酶B可切割的位點(diǎn)包括二肽序列纈氨酸-瓜氨酸和苯丙氨酸-賴氨酸(Doronina等人，(2003),Nat.Biotech.,21(7):778_84)；Dubowchik等人，(2002)，Bioconjug.Chem.，13:855_69)。其它示例性酶切位點(diǎn)包括由4到16個(gè)氨基酸的寡肽序列形成的那些(例如，Sue-0-Ala-Leu-Ala-Leu)，該位點(diǎn)可以被trouse蛋白酶，比如甲拌磷寡肽酶(TOP)識(shí)別，該酶優(yōu)先由嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其它粒細(xì)胞釋放。在進(jìn)一步實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽與下式連接分子反應(yīng)X-Y-Z其中X是附著分子；Y是間隔子分子；且Z是效應(yīng)子附著部分。術(shù)語(yǔ)“附著分子”包括使得連接分子能共價(jià)附著到本發(fā)明結(jié)合多肽的分子。所述附著分子可以包含，例如1-60個(gè)碳、氧、氮、硫原子的共價(jià)鏈，任選以氫原子和其它使得結(jié)合分子能行使其預(yù)期功能的取代基取代。附著分子可以包含肽、酯、烷基、烯基、炔基、芳基、醚、硫醚等官能基團(tuán)。優(yōu)選的，選擇附著分子以使它能與包含至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的多肽上的活性官能基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，形成本發(fā)明的結(jié)合分子。附著部分的例子包括，例如氨基、羧基和硫醇附著分子。氨基附著分子包括與結(jié)合多肽上的氨基反應(yīng)，從而形成修飾的多肽的分子。氨基附著分子是本領(lǐng)域已知的。氨基附著分子的例子包括，活化脲(例如，與結(jié)合分子上的氨基發(fā)生反應(yīng)形成包含脲基團(tuán)的連接分子)、醛(例如，能與結(jié)合分子上的氨基發(fā)生反應(yīng))，以及活化異硫氰酸酯(其能與結(jié)合多肽上的氨基發(fā)生反應(yīng)形成包含脲基團(tuán)的連接分子)。氨基附著分子的例子包括，但不限于N-琥珀酰亞胺基、N-磺基琥珀酰亞胺基、N-對(duì)酞內(nèi)酰胺基(phthahmidyl)、N-磺基對(duì)酞內(nèi)酰胺基、2-硝基苯基、4-硝基苯基、2，4-二硝基苯基、3-磺?；?4-硝基苯基或3-羧基-4-硝基苯基分子。羧基附著分子包括能與結(jié)合多肽上的羧基基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，從而形成修飾的本發(fā)明結(jié)合多肽的分子。羧基附著分子是本領(lǐng)域已知的。羧基附著分子的例子包括但不限于活化的酯中間體和活化的羰基中間體，它們能與結(jié)合多肽上的COOH基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，形成包含酯、硫酯或酰胺基團(tuán)的連接分子。硫醇附著分子包括能與多肽上的硫醇基發(fā)生反應(yīng)，從而形成本發(fā)明結(jié)合分子的分子。硫醇附著分子是本領(lǐng)域已知的。硫醇附著分子的例子包括但不限于活化的?；?能與結(jié)合分子上的巰基發(fā)生反應(yīng)形成包含硫酯的連接分子)、活化的烷基(能與結(jié)合分子上的巰基發(fā)生反應(yīng)形成包含硫酯分子的連接分子)、Michael受體，比如馬來(lái)酰亞胺或丙烯酸基團(tuán)(能與結(jié)合分子上的巰基發(fā)生反應(yīng)形成Michael型加成產(chǎn)物)、經(jīng)由氧化還原反應(yīng)與巰基發(fā)生反應(yīng)的基團(tuán)、活化的二硫化物基團(tuán)(能與結(jié)合分子上的巰基基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)形成，例如包含二硫化物分子的連接分子)。其它硫醇附著分子包括丙烯酰胺、α-碘乙酰胺以及環(huán)丙烷-ι，ι-二羰基化合物。此外，硫醇附著分子可能含有這樣的部分，其能將結(jié)合分子上的硫醇修飾形成另外的活性物質(zhì)，連接分子可結(jié)合其上形成本發(fā)明的結(jié)合分子。間隔子分子Y是含有一或多個(gè)氨基酸殘基的共價(jià)鍵或共價(jià)原子鏈。它還可能包含0-60個(gè)碳、氧、硫或氮原子，任選被氫或其它使得結(jié)合分子能行使其預(yù)期功能的取代基所取代。在一個(gè)實(shí)施方案中，Y包含烷基、烯基、炔基、酯、醚、羰基或酰胺分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合多肽上的硫醇基被轉(zhuǎn)化為活性基團(tuán)，比如活性羰基基團(tuán)，比如酮或醛。然后所述附著分子與酮或醛反應(yīng)形成修飾的結(jié)合多肽。羰基活性附著分子的例子包括，但不限于胼、酰胼、0-取代的羥胺、α-β-不飽和酮，以及H2C=CH-C0-NH-NH2。修飾可用于形成修飾的結(jié)合多肽的硫醇分子的附著分子和方法的其它實(shí)例描述在Pratt，M.L.等人JAmChemSoc.2003May21；125(20):6149_59；和Saxon，Ε.Science.2000Mar17；287(5460):2007_10。連接分子可以是能與效應(yīng)子分子或其衍生物發(fā)生反應(yīng)，形成本發(fā)明結(jié)合分子的分子。例如，效應(yīng)子分子可以借助二硫鍵連接到分子的其它部分。在這種情況中，選擇連接分子以使它能與合適的效應(yīng)子部分衍生物發(fā)生反應(yīng)，從而使得該效應(yīng)子部分附著到本發(fā)明結(jié)合多肽上。優(yōu)選用于本發(fā)明的細(xì)胞毒性效應(yīng)子分子是細(xì)胞毒性藥物，特別是用于癌癥療法的那些。如本文所用，“細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒性劑”指任何對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖有害并可作用以減少、抑制或破壞細(xì)胞或惡性腫瘤的劑。示例性的細(xì)胞毒素包括但不限于，放射性核素、生物毒素、酶活性毒素、細(xì)胞抑制劑或細(xì)胞毒性治療劑、前藥、免疫活性配體和生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑(比如細(xì)胞因子)。任何阻滯或減慢免疫反應(yīng)性細(xì)胞或惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞毒素均在本發(fā)明范圍內(nèi)。示例性細(xì)胞毒素通常包括，細(xì)胞抑制劑、烷化劑、抗代謝物、抗增殖劑、微管蛋白結(jié)合劑、激素和激素拮抗劑、和類似的細(xì)胞毒素。與本發(fā)明相容的示例性細(xì)胞抑制劑包括烷化物質(zhì)，比如雙氯乙基甲胺(mechiorethamine)、三亞乙基磷酰胺、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、白消安、美法侖或三亞胺醌，還有亞硝基脲化合物，比如卡莫司汀、洛莫司汀或司莫司汀。用于結(jié)合的示例性分子是美登木素生物堿。美登木素生物堿最初分離自屬于美登木屬的東非灌木，但后來(lái)發(fā)現(xiàn)它也是土壤細(xì)菌如珍貴束絲放線菌(Actinosyrmemapretiosum)的代謝物(參見(jiàn)如，美國(guó)專利第3，896，111號(hào))。本領(lǐng)域已知美登木素生物堿包括美登素(maytansine)、美登木醇(maytansinol)、美登木醇的C_3酯以及其它美登木醇類似物和衍生物(參見(jiàn)如，美國(guó)專利第5，208，020和6，441，163號(hào))。美登木醇的C-3酯可以是天然存在的或合成衍生的。并且，天然存在的和合成的C-3美登木醇酯可以歸類為簡(jiǎn)單羧酸的C-3酯，或與N-甲基-L-丙氨酸衍生物的C-3酯，后者比前者細(xì)胞毒性更強(qiáng)。合成的美登木素生物堿類似物是本領(lǐng)域已知的，在例如Kupchan等人，J.Med.Chem.，21，31-37(1978)中有描述。制備美登醇及其類似物和衍生物的方法描述在例如美國(guó)專利第4，151，042號(hào)。適合作為結(jié)合物的美登木素生物堿可以用本領(lǐng)域已知的方法從天然來(lái)源分離，合成制備，或者半合成制備。此外，可以通過(guò)任何合適的方式對(duì)美登木素生物堿進(jìn)行修飾，只要最后的結(jié)合分子保留了足夠的細(xì)胞毒性。特別優(yōu)選的包含連接分子、含有活性化學(xué)基團(tuán)的美登木素生物堿是美登木醇的C-3酯和它們的類似物，其中連接分子含有二硫鍵，附著分子包含N-琥珀酰亞胺或N-磺基琥珀酰亞胺酯。美登木素生物堿上的許多位點(diǎn)可以作為例如通過(guò)效應(yīng)子附著分子化學(xué)連接連接分子的位置。例如，帶有羥基的C-3位點(diǎn)、羥甲基修飾的C-14位點(diǎn)、羥基修飾的C-15位點(diǎn)以及帶有羥基基團(tuán)的C-20位點(diǎn)都很有用。連接分子最優(yōu)選與美登木醇的C-3位點(diǎn)連接。最優(yōu)選的，與發(fā)明所述組合物一起使用的美登木素生物堿是N.sup.2'-去乙酰-N.sup.2'-(-3-巰基-1-氧代丙基)-美登木素(DMl)或N.sup.2'-去乙酰-N.sup.2'-(4-巰基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登木素(DM4)。帶有其它化學(xué)鍵的連接分子也可以用于本發(fā)明的情況，其它美登木素生物堿也可以?？梢砸胨鲞B接分子的其它化學(xué)鍵的特定例子包括以上描述的那些，比如酸敏感性鍵、硫醚鍵、光敏感性鍵、肽酶敏感性鍵和酯酶敏感性鍵。制備帶有連接分子和/或效應(yīng)子附著分子的美登木素生物堿的方法描述在例如美國(guó)專利第5，208，020,5,416，064和6，333，410號(hào)。。美登木素生物堿的連接分子(和/或效應(yīng)子附著分子)通常，并且優(yōu)選是更大的肽分子的一部分，所述肽分子是用來(lái)將結(jié)合多肽與美登木素生物堿連在一起的。任何合適的肽分子都可以用于本發(fā)明，只要該連接分子分別保留美登木素生物堿和抗體的細(xì)胞毒性和靶向特點(diǎn)。連接分子通過(guò)化學(xué)鍵(如上所述)將美登木素生物堿連到結(jié)合多肽上，以使美登木素生物堿和結(jié)合多肽彼此化學(xué)偶聯(lián)(例如，共價(jià)結(jié)合)。希望連接分子通過(guò)二硫鍵或硫醚鍵將美登木素生物堿化學(xué)偶聯(lián)到結(jié)合多肽上。最優(yōu)選的，結(jié)合多肽借助二硫鍵化學(xué)偶聯(lián)到美登木素生物堿。其它優(yōu)選的細(xì)胞毒試劑種類包括，例如蒽環(huán)族藥物、長(zhǎng)春花藥物、絲裂霉素、博萊霉素、細(xì)胞毒性核苷、蝶啶族藥物、diynenes以及鬼白毒素。這些種類中特別有用的成員包括，例如阿霉素、洋紅霉素(carminomycin)、柔紅霉素(道諾霉素)、多柔比星(doxorubicin)、氨基喋呤(aminopterin)、氨甲蝶呤、甲氨蝶呤(methopterin)、普卡霉素(mithramycin)、鏈黑菌素(str印tonigrin)、二氯甲氨蝶呤、絲裂霉素C、放線菌素D、泊非霉素(porfiromycin)、5_氟尿嘧啶、氟尿苷、喃氟啶(ftorafur)、6_巰基嘌呤、阿糖胞Ρ(cytarabine)、P可ft胞U密(cytosinearabinoside)，鬼[H毒素(podophyllotoxin)或鬼白毒素衍生物，比如依托泊苷(etoposide)或磷酸依托泊苷，美法侖(melphalan)，長(zhǎng)春花堿(vinblastine),長(zhǎng)春新堿(vincristine),異長(zhǎng)春堿(Ieurosidine),長(zhǎng)春地辛(vindesine)，環(huán)氧長(zhǎng)春堿(leurosine)及類似物。與本文的教導(dǎo)相容的其他細(xì)胞毒素包括紫杉醇、紫杉烷(taxane)，松胞菌素B(cytochalasinB)，短桿菌肽D(gramicidinD)、溴化乙錠、吐根堿(emetine)，鬼臼噻吩甙(tenoposide)，秋水仙堿(colchicin)、二羥基炭疽菌素、二酮(dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、普魯卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(Iidocaine)、心得安(propranolol)和嘌呤霉素(Puromycin)以及它們的類似物或同系物。激素和激素拮抗劑，比如皮質(zhì)類固醇激素，例如潑尼松(Prednisone)；孕激素，例如羥基孕酮或甲羥孕酮(medroprogesterone)；雌激素，例如己烯雌酚(diethylstilbestrol)；抗雌激素，例如他莫昔芬；雄激素，例如睪酮，以及芳香酶抑制劑，例如氨魯米特(aminogluthetimide)也與本文的教導(dǎo)相容。正如前面提到的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)所需化合物進(jìn)行修飾，以使得該化合物的反應(yīng)更方便制備發(fā)明所述結(jié)合物。其它示例性細(xì)胞毒素包含烯二炔族抗腫瘤抗生素的成員或衍生物，包括calicheamicin、esperamicin或dynemicin。這些毒素非常強(qiáng)力，通過(guò)切割核DNA起作用，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。與能被體內(nèi)切割產(chǎn)生許多無(wú)活性但是有免疫原性的多肽片段的蛋白毒素不同，象calicheamicin、esperamicin和其它烯二炔類毒素是基本沒(méi)有免疫原性的小分子。這些非肽毒素是通過(guò)以前用于標(biāo)記單克隆抗體和其它分子的技術(shù)化學(xué)連接到二聚體或四聚體上的。這類連接技術(shù)包括經(jīng)由存在于本發(fā)明結(jié)合多肽Fc部分上的N-連接的糖殘基發(fā)生的位點(diǎn)特異性連接。這種定點(diǎn)連接技術(shù)的益處是減少了連接對(duì)構(gòu)建體的結(jié)合特性的可能影響。應(yīng)當(dāng)意識(shí)到，除了其它細(xì)胞毒素，多肽也可以與生物毒素相關(guān)聯(lián)，所述生物毒素比如蓖麻毒蛋白(ricin)亞基A、相思豆毒素(abrin)、白喉毒素、肉毒毒素(botulinum)、藍(lán)藻毒素(cyanginosin)、石房蛤毒素(saxitoxin)、志賀毒素(shigatoxin)、破傷風(fēng)、河豚毒素(tetrodotoxin)、單端孢霉毒素(trichothecene)、致震顫真菌毒素(verrucofogen)或毒性酶。優(yōu)選的，利用允許直接表達(dá)抗體-毒素構(gòu)建體的遺傳工程技術(shù)來(lái)制備這些構(gòu)建體。其它能與本發(fā)明多肽相關(guān)聯(lián)的生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑包含細(xì)胞因子，比如淋巴因子和干擾素。參考本說(shuō)明書(shū)公開(kāi)內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能很容易地利用常規(guī)技術(shù)制成這類構(gòu)建體。另一類可以與所公開(kāi)多肽聯(lián)合使用的相容生物毒素是放射增敏藥物，其可能能被有效地定向到腫瘤或免疫反應(yīng)性細(xì)胞。這類藥物增加了對(duì)電離輻射的敏感性，從而提高放療的效力。被腫瘤細(xì)胞內(nèi)在化的結(jié)合多肽結(jié)合物會(huì)將放射增敏劑遞送到細(xì)胞核附近，那里的放射增敏作用最強(qiáng)。未結(jié)合的連接有放射增敏劑的本發(fā)明多肽會(huì)很快從血液中清除，使其余的放射增敏劑局限于目標(biāo)腫瘤中，而在正常組織中只有最低的攝取。從血液中迅速清除后，以三種方式之一進(jìn)行輔助放療1)特異針對(duì)腫瘤的體外照射，2)直接植入腫瘤的放射性或3)用相同的靶向抗體進(jìn)行系統(tǒng)放射免疫療法。這個(gè)方法的一個(gè)很有吸引力的變化是將治療放射性同位素附著到放射增敏的免疫結(jié)合物上，從而給患者提供了施用單種藥物的方便。在一個(gè)實(shí)施方案中，可結(jié)合增強(qiáng)多肽穩(wěn)定性或效力的分子。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，PEG可結(jié)合于本發(fā)明多肽以增加其體內(nèi)半衰期。Leong，S.R.，等人2001.Cytokine16106；2002；Adv.inDrugDeliv.Rev.54531；或Weir等人2002.Biochem.Soc.Transactions30:512。如前面提到的，相容細(xì)胞毒素可以包含前藥。本文所用的術(shù)語(yǔ)“前藥”是指藥物活性物質(zhì)的前體或衍生物形式，與親本藥物相比，它們對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性低，能被酶促活化或轉(zhuǎn)化成活性更高的親本形式。與本發(fā)明相容的前藥包括但不限于，含磷酸酯的前藥、含硫代磷酸酯的前藥、含硫酸酯的前藥、含肽的前藥、含β-內(nèi)酰胺的前藥，含有任選地取代的苯氧基乙酰胺的前藥或含有任選地取代的苯乙酰胺的前藥、5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前藥，它們能被轉(zhuǎn)化為活性更高的細(xì)胞毒性游離型藥物。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性齊U，比如美登木素生物堿以前藥的形式施用，在二硫鍵被水解后釋放?？梢匝苌汕八幮问接糜诒景l(fā)明的細(xì)胞毒性藥物的進(jìn)一步例子包括上面描述過(guò)的那些化療劑。VI.本發(fā)明多肽的應(yīng)用方法本發(fā)明多肽可用于許多應(yīng)用，例如在篩選測(cè)定中以及用于診斷或治療目的。本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案提供診斷和/或治療需要這種治療的哺乳動(dòng)物受治療者的病癥，如，腫瘤病癥的藥盒和方法。優(yōu)選地，受治療者是人類。Α.篩選方法本發(fā)明結(jié)合分子還可用于篩選方法。當(dāng)作為雙特異性分子合成時(shí)，本發(fā)明結(jié)合分子有優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的雙特異性分子的多種益處，包括作為篩選測(cè)定中用的試劑。圖9描繪與使用常規(guī)雙特異性抗體相比，使用本發(fā)明scFc結(jié)合分子在篩選雙特異性抗體功能中的益處。使用scFc區(qū)阻止結(jié)合結(jié)構(gòu)域的不想要的異質(zhì)性。這種異質(zhì)性將造成設(shè)計(jì)以篩選雙特異性抗體獨(dú)特活性的復(fù)雜測(cè)定?！奥窂?”是異質(zhì)的結(jié)合蛋白組合的實(shí)例，當(dāng)以下三個(gè)基因在真核體系中共表達(dá)以形成雙特異性抗體時(shí)通常將發(fā)生(A)融合于FcN-末端的scF(ab)；⑶融合于FcCH3結(jié)構(gòu)域C-末端的F(ab)重鏈；和(C)包含CL和VL結(jié)構(gòu)域的輕鏈?！奥窂?”是如何融合兩個(gè)基因((A)和(B))到單個(gè)遺傳構(gòu)建體的實(shí)例，造成Fc部分被多肽接頭連接，scFc(D)。共表達(dá)(C)和(D)造成均一表達(dá)單個(gè)雙特異性mAb。因此，當(dāng)例如，使用本領(lǐng)域已知的方法篩選，如，雙特異性抗體結(jié)合于其一個(gè)或多個(gè)靶的能力時(shí)，本發(fā)明結(jié)合分子呈現(xiàn)益處。另一方面，本發(fā)明提供篩選活化靶蛋白或抑制靶蛋白的活化的多特異性結(jié)合蛋白(如雙特異性結(jié)合蛋白諸如雙特異性抗體)的方法。具體地，具有第一結(jié)合特異性的本發(fā)明結(jié)合多肽可與具有不同特異性的一種或多種多肽共表達(dá)或共價(jià)連接以形成多特異性結(jié)合蛋白。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽可作為單個(gè)遺傳構(gòu)建體表達(dá)，包含在其N(xiāo)-和C-末端具有不同特異性的結(jié)合位點(diǎn)(如，scFv或Fab)的遺傳融合的Fc區(qū)(即，scFc區(qū))?？稍跍y(cè)量針對(duì)一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)靶蛋白的相對(duì)活性的測(cè)定(如，基于細(xì)胞的測(cè)定)中篩選結(jié)合蛋白。大體上，這種篩選方案包括將本發(fā)明多特異性結(jié)合多肽與靶蛋白接觸以觀察結(jié)合、功能反應(yīng)的刺激或抑制。如果相對(duì)于相應(yīng)的單特異性結(jié)合多肽表現(xiàn)刺激或抑制，可選擇多特異性結(jié)合蛋白?？刹捎眠m于測(cè)量靶蛋白活性(如，生物化學(xué)或生物活性)的領(lǐng)域公認(rèn)的測(cè)定。例如，當(dāng)靶蛋白是激酶時(shí)，合適的測(cè)定可包括測(cè)量激酶底物磷酸化狀態(tài)的抑制或活化。在其它示例性實(shí)施方案中，當(dāng)靶蛋白是G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)時(shí)，合適的測(cè)定可測(cè)量胞外pH變化以確定多特異性結(jié)合多肽是活化還是抑制受體。當(dāng)靶蛋白是受體時(shí)，篩選測(cè)定可包括確定標(biāo)記的配體對(duì)在其表面上具有受體的細(xì)胞的相對(duì)結(jié)合?？扇?，通過(guò)放射活性標(biāo)記配體。測(cè)量與受體結(jié)合的標(biāo)記的配體的量，如，通過(guò)測(cè)量受體的放射活性。如果化合物結(jié)合于受體，如由結(jié)合于受體的標(biāo)記的配體減少確定的，則標(biāo)記的配體對(duì)受體的結(jié)合被抑制了。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，測(cè)定包括抑制LTiiR蛋白(如，LTa1β2蛋白)。因?yàn)長(zhǎng)TβR分子是三聚體，包含由三個(gè)裂縫分開(kāi)的三個(gè)不同亞基，期望封閉三個(gè)裂縫的多于一個(gè)以最佳地滅活LTβR活性。例如，期望獲得對(duì)LTβR的第一裂縫具有第一特異性和對(duì)LTβR的第二裂縫有第二特異性的多特異性結(jié)合多肽。因此，可在LTβR活性測(cè)定中篩選對(duì)LTβR具有多于一個(gè)結(jié)合特異性的多特異性結(jié)合蛋白，以確定相對(duì)于相應(yīng)單特異性抗體其是否表現(xiàn)改進(jìn)的活性。B.抗腫瘤治療本發(fā)明多肽將可用于多種不同應(yīng)用。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽應(yīng)可用于減少或消除攜帶結(jié)合多肽識(shí)別的表位的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽有效地減少循環(huán)中的可溶抗原濃度或消除循環(huán)中的可溶抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原的本發(fā)明結(jié)合多肽可以減小腫瘤體積、抑制腫瘤生長(zhǎng)和/或延長(zhǎng)攜帶腫瘤的動(dòng)物的存活時(shí)間。因此，本發(fā)明還涉及在人類或其它動(dòng)物治療腫瘤的方法，通過(guò)向這種人類或動(dòng)物施用有效無(wú)毒量的所述結(jié)合多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定修飾的結(jié)合多肽用于治療惡性腫瘤目的的有效無(wú)毒量。例如，結(jié)合多肽的治療有效量可以根據(jù)因素例如受治療者的疾病階段(例如I期對(duì)IV期腫瘤)、年齡、性別、醫(yī)學(xué)并發(fā)癥(例如，免疫抑制狀況或疾病)和體重，以及結(jié)合多肽在受治療者引發(fā)期望響應(yīng)的能力而變化?？梢哉{(diào)整劑量方案以提供最佳的治療響應(yīng)。例如，可以每日分幾次施用，或者可以隨著治療情況的緊急性而按比例減少劑量。然而，通常預(yù)料有效劑量在在約0.05至100毫克/千克體重/天的范圍，更優(yōu)選地從約0.5至10毫克/千克體重/天。一般地，本發(fā)明多肽可以用于預(yù)防性或治療性地處理任何包含如下抗原標(biāo)志的贅生物，所述抗原標(biāo)志允許修飾的抗體靶向癌細(xì)胞?？梢灾委煹氖纠园┌Y包括但不限于前列腺癌、胃癌如結(jié)腸癌、皮膚癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌和胰腺癌。更特別地，本發(fā)明結(jié)合多肽可以用于治療Kaposi肉瘤、CNS瘤形成(毛細(xì)血管性成血管細(xì)胞瘤、腦膜瘤和腦轉(zhuǎn)移癌)、黑素瘤、胃腸道的和腎的肉瘤、橫紋肌肉瘤、成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤(優(yōu)選地多形性成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤)、平滑肌肉瘤、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、卵巢的乳頭狀囊腺癌、Wilm氏腫瘤或小細(xì)胞肺癌?？梢岳斫?，鑒于本發(fā)明公開(kāi)，無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)即可以針對(duì)與前述各種瘤形成有關(guān)的腫瘤相關(guān)抗原，衍生出適當(dāng)?shù)陌薪Y(jié)合多肽。適于使用本公開(kāi)發(fā)明治療的示例性血液癌癥包括霍奇金和非霍奇金淋巴瘤以及白血病，包括ALL-L3(伯基特型白血病(Burkitt'stypeleukemia))、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)和單核細(xì)胞性白血病?？梢岳斫猓景l(fā)明的化合物和方法尤其可以有效地治療各種B細(xì)胞淋巴瘤，包括低級(jí)/濾泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、細(xì)胞淋巴瘤(FCC)、套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)、擴(kuò)散性大細(xì)胞淋巴瘤(DLCL)、小淋巴細(xì)胞(SL)型NHL、中級(jí)/濾泡性NHL、中級(jí)擴(kuò)散性NHL、高級(jí)成免疫細(xì)胞NHL、高級(jí)成淋巴細(xì)胞NHL、高級(jí)小無(wú)裂細(xì)胞性NHL、巨大腫塊(bulkydisease)NHL和Waldenstrom氏巨球蛋白血癥。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明了，這些淋巴瘤由于正在變化的分類系統(tǒng)而常常具有不同的名稱，而且，患有分類于不同名稱下的淋巴瘤的患者也可以得益于本發(fā)明的聯(lián)合治療方案。除了上述瘤形成病癥，可以理解本發(fā)明還可以有利地用于治療帶有相容的腫瘤相關(guān)抗原的其它惡性腫瘤。C.免疫疾病治療除了腫瘤病癥外，本發(fā)明多肽在治療自身免疫病或異常免疫應(yīng)答方面也尤其有效。在此方面，可以明了，本發(fā)明多肽可以用于控制、阻抑、調(diào)節(jié)或消除對(duì)外部抗原和自身抗原的不期望的免疫應(yīng)答。例如，一個(gè)實(shí)施方案中，抗原是自身抗原。另一實(shí)施方案中，抗原是變應(yīng)原。在其它實(shí)施方案中，抗原是同種抗原或異種抗原。本發(fā)明結(jié)合多肽在降低針對(duì)同種抗原和異種抗原的免疫應(yīng)答中的用途尤其可以用于移植中，例如以抑制移植受體對(duì)供體移植物例如組織或器官移植物或骨髓移植物的排斥。此外，抑制或消除骨髓移植物中的供體T細(xì)胞也可以用于抑制移植物抗宿主疾病。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽可以用于治療免疫病癥，包括但不限于，變應(yīng)性支氣管肺曲霉?。蛔儜?yīng)性鼻炎；自身免疫性溶血性貧血；棘皮癥；過(guò)敏性接觸性皮炎；Addison氏??；特應(yīng)性皮炎；斑禿；普禿；淀粉狀蛋白??；過(guò)敏性紫瘢；類過(guò)敏反應(yīng)；再生障礙性貧血；遺傳性血管性水腫；特發(fā)性血管性水腫；強(qiáng)直性脊柱炎(Ankylosingspondylitis)；顱(arteritis,cranial)；IeL^HIfitifeIfti^(arteritis,giantcell)；Takayasu氏動(dòng)脈炎；顳動(dòng)脈炎；哮喘；毛細(xì)血管擴(kuò)張-運(yùn)動(dòng)共濟(jì)失調(diào)癥(ataxia-telangiectasia)；自身免疫性卵巢炎；自身免疫性睪丸炎；自身免疫性多內(nèi)分泌衰竭；Behcet氏??；Berger氏??；Buerger氏??；支氣管炎；大皰性天皰瘡；慢性皮膚粘膜念珠菌病(candidiasis，chronicmucocutaneous)；CapIan氏綜合征；心肌梗塞后綜合征；心包切開(kāi)術(shù)后綜合征；心臟炎；口炎性腹瀉；Chagas氏??；Chediak-Higashi綜合征；Churg-Strauss病；cogan氏綜合征；冷凝集素病(coldagglutinindisease)；CREST綜合征；Crohn氏病；冷球蛋白血癥；隱源性致纖維化肺泡炎；皰疹樣皮炎；皮肌炎；糖尿??；Diamond-Blackfan綜合征；DiGeorge綜合征；盤(pán)狀紅斑狼瘡；嗜酸性筋膜炎；鞏膜外層炎；持久隆起性紅斑(Drythemaelevatumdiutinum)；邊緣性紅斑；多形紅斑；結(jié)節(jié)性紅斑(erythemanodosum)；家族性地中海熱(FamilialMediterraneanfever)；Felty氏綜合征；月市纖維化(fibrosispulmonary)；過(guò)敏樣腎小球性腎炎(glomerulonephritis,anaphylactoid)；自身免疫性腎小球腎炎；鏈球菌感染后腎小球腎炎；移植后腎小球腎炎；膜性腎小球病；Goodpasture氏綜合征；免疫介導(dǎo)的粒性白細(xì)胞減少癥；環(huán)狀肉芽腫；變應(yīng)性肉芽腫?。蝗庋磕[性肌炎；Grave氏??；橋本甲狀腺炎(Hashimoto，sThyroiditis)；新生兒溶血?。惶匕l(fā)性血色病(hemochromatosis,idiopathic)；Henoch-schoenlein紫瘢；慢性活動(dòng)性和慢性進(jìn)行性肝炎；組織細(xì)胞增生癥X(histiocytosisX)；嗜酸細(xì)胞增多綜合征(hypereosinophilicsyndrome)；特發(fā)性血小板減少性紫瘢(idiopathicthrombocytopenicpurpura)；Job氏綜合征；幼年型皮月JL炎(juveniledermatomyositis)；幼年型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(幼年型慢性關(guān)節(jié)炎)；Kawasaki氏病；角膜炎；干燥性角膜結(jié)膜炎(keratoconjunctivitissicca)；Landry-GuiIain-Barre-Strohl綜合征；瘤型麻風(fēng)(leprosy，lepromatous)；Loeffier氏綜合征；狼疫；Lyell氏綜合征；Lyme氏疏螺旋體病(Lymedisease)；淋巴瘤樣肉芽腫病(lymphomatoidgranulomatosis)；全身性肥大細(xì)胞增生癥(mastocytosis，systemic)；混合性結(jié)締組織病(mixedconnectivetissuedisease)；多發(fā)性單一神經(jīng)炎(Mononeuritismultiplex)；Muckle-Wells綜合征;粘膜皮膚淋巴結(jié)綜合征(mucocutaneouslymphnodesyndrome)；粘膜皮膚淋巴結(jié)綜合征；多中心性網(wǎng)狀組織細(xì)胞增生癥(multicentricreticulohistiocytosis)；多發(fā)性硬化；重癥肌無(wú)力；蕈樣肉芽腫??；全身性壞死性血管炎(necrotizingvasculitis,systemic)；腎病綜合征(nephroticsyndrome)；重疊綜合征(overlapsyndrome)；脂膜炎；陣發(fā)性寒冷性血紅蛋白尿癥(paroxysmalcoldhemoglobinuria)；陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(paroxysmalnocturnalhemoglobinuria)；類天;；天;；紅斑t生天(pemphiguserythematosus)；落葉性天皰疫(pemphigusfoliaceus)；尋常性天皰疫(pemphigusvulgaris)；詞合鳥(niǎo)者病(pigeonbreeder'sdisease)；過(guò)敏性月市炎(Pneumonitis,hypersensitivity)；結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎；風(fēng)濕性多肌痛；多肌炎；特發(fā)性多發(fā)性神經(jīng)炎(polyneuritis,idiopathic)；葡萄牙型家族性多發(fā)性神經(jīng)病(Portuguesefamilialpolyneuropathy)；先兆子癇/子癇；原發(fā)性膽汁性肝硬變；進(jìn)行性全身性硬化(硬皮病)；銀屑??；銀屑病性關(guān)節(jié)炎；肺泡蛋白沉著癥；肺纖維化、Raynaud氏現(xiàn)象/綜合征；Reidel氏甲狀腺炎；Reiter氏綜合征，復(fù)發(fā)性多軟骨炎(relapsingpolychrondritis)；風(fēng)濕熱；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；結(jié)節(jié)病；鞏膜炎；硬化性膽管炎；血清病(serumsickness)；Sezary綜合征；Sjogren氏綜合征；Stevens-Johnson綜合征；Still氏病；亞急性硬化性全腦炎；交感性眼炎；系統(tǒng)性紅斑狼瘡；移植排斥；潰瘍性結(jié)腸炎；未分化結(jié)締組織?。宦允n麻疹；冷激性蕁麻疹(urticaria，cold)；眼色素層炎；白瘢風(fēng)；Weber-Christian??；Wegener氏肉芽腫；和Wiskott-Aldrich綜合征。D.抗炎治療在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽可以用于治療因炎癥而引起的(至少部分地)或惡化的炎性病癥，例如血流增加、水腫、免疫細(xì)胞的活化(例如增生、細(xì)胞因子產(chǎn)生或增強(qiáng)的吞噬作用)。示例性炎性病癥包括其中炎癥或炎性因子(例如，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、一氧化氮(NO)、TNF、白介素、血漿蛋白、細(xì)胞防御系統(tǒng)、細(xì)胞因子、脂質(zhì)代謝物、蛋白酶、毒性自由基、線粒體、細(xì)胞凋亡、粘附分子等)被涉及或以異常量(例如，可以有利地改變例如有益于受治療者的量)存在于給定區(qū)域中的那些病癥。發(fā)炎過(guò)程是活組織對(duì)損傷的應(yīng)答。炎癥的原因可以是由于物理?yè)p傷、化學(xué)物質(zhì)、微生物、組織壞死、癌癥或其它因素。急性炎癥持續(xù)時(shí)間短，僅僅持續(xù)數(shù)天。然而，如果其持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，則可以稱作慢性炎癥。炎性病癥包括急性炎性病癥、慢性炎性病癥、和復(fù)發(fā)性炎性病癥。急性炎性病癥一般具有相對(duì)短的持續(xù)期，并且持續(xù)大約數(shù)分鐘至大約1到2天，但它們也可以持續(xù)幾周。急性炎性病癥的主要特征包括血流增加、體液和血漿蛋白滲出(水腫)以及白細(xì)胞如嗜中性粒細(xì)胞滲出。慢性炎性病癥一般有較長(zhǎng)的持續(xù)期，例如數(shù)周至數(shù)月至數(shù)年或甚至更長(zhǎng)，并且在組織學(xué)上其與淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的存在以及血管和結(jié)締組織的增生有關(guān)。復(fù)發(fā)性炎性病癥包括在一段時(shí)間后復(fù)發(fā)的或周期性發(fā)作的病癥。復(fù)發(fā)性炎性病癥的例子包括哮喘和多發(fā)性硬化。一些病癥可以落入一種或多種分類中。炎性病癥一般的特征在于發(fā)熱、潮紅、腫大、疼痛和喪失功能。炎性病癥的示例性原因包括但不限于微生物感染(例如細(xì)菌、病毒和真菌感染)、物理因素(例如，燒傷、輻射和創(chuàng)傷)、化學(xué)因素(例如，毒素和腐蝕性物質(zhì))、組織壞死和各種類型的免疫反應(yīng)。炎性病癥的例子包括但不限于骨關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，急性和慢性感染(細(xì)菌、病毒和真菌)；急性和慢性支氣管炎，鼻竇炎和其它呼吸感染，包括普通感冒；急性和慢性腸胃炎和結(jié)腸炎；急性和慢性膀胱炎和尿道炎；急性呼吸窘迫綜合征；囊性纖維化；急性和慢性皮炎；急性和慢性結(jié)膜炎；急性和慢性漿膜炎(心包炎、腹膜炎、滑膜炎、胸膜炎和腱炎)；尿毒癥性心包炎；急性和慢性膽囊炎；急性和慢性陰道炎；急性和慢性眼色素層炎；藥物反應(yīng)；和燒傷(熱的、化學(xué)的和電的)。E.神經(jīng)病癥在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽可用于治療神經(jīng)疾病或病癥。例如，如上所述，結(jié)合多肽可結(jié)合神經(jīng)細(xì)胞(如，神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)上存在的抗原。在某些實(shí)施方案中，與抗原相關(guān)的神經(jīng)病癥可為前述自身免疫或炎性病癥。本文所用的術(shù)語(yǔ)“神經(jīng)疾病或病癥”包括受治療者的疾病或病癥，其中神經(jīng)系統(tǒng)退化(如，神經(jīng)退化病癥，以及其中神經(jīng)系統(tǒng)不能適當(dāng)?shù)匕l(fā)展或不能再損傷如脊索損傷后再生的病癥。本發(fā)明方法和組合物可診斷、預(yù)防或治療的神經(jīng)病癥的實(shí)例包括但不限于，多發(fā)性硬化、亨廷頓氏病、阿爾茨海默病、帕金森病、神經(jīng)痛、創(chuàng)傷性腦損傷、格-巴二氏綜合征和慢性炎性脫鞘性多神經(jīng)病(CIDP)、腦血管疾病和腦炎。VIII.本發(fā)明多肽的施用方法制備并將本發(fā)明多肽施用受治療者的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知或容易確定的。本發(fā)明多肽的施用途徑可以是口服、腸胃外、經(jīng)吸入或局部。本文所用的術(shù)語(yǔ)腸胃外包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、直腸或陰道施用。通常優(yōu)選靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下和肌內(nèi)形式的腸胃外施用方式。雖然所有這些施用方式都明顯被認(rèn)為是本發(fā)明范圍內(nèi)的，但一種施用形式是用于注射，特別是靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)注射或點(diǎn)滴的溶液。一般來(lái)說(shuō)，適用于注射的藥物組合物可以包含緩沖液(例如，乙酸鹽、磷酸鹽或檸檬酸鹽緩沖液)、表面活性劑(例如，聚山梨酸酯)，任選穩(wěn)定劑(例如人類白蛋白)等。但是，在與本文教導(dǎo)相容的其它方法中，可以將多肽直接遞送到有害細(xì)胞群體的部位，從而提高患病組織與治療劑的接觸。用于腸胃外施用的制劑包括無(wú)菌水或非水溶液、懸浮液和乳液。非水溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油(比如橄欖油)以及可注射的有機(jī)酯(比如油酸乙酯)。水性載體包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水和緩沖的培養(yǎng)基。在本發(fā)明中，藥學(xué)可接受的載體包括但不限于0.01-0.1M，優(yōu)選0.05M磷酸緩沖液或0.8%鹽水。其它常見(jiàn)腸胃外載體包括磷酸鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、乳酸化的林格氏溶液，或者不揮發(fā)油。靜脈內(nèi)載體包括液體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑，比如基于林格氏右旋糖的那些，及類似物。還可以存在防腐劑和其它添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體，及類似物。更具體地說(shuō)，適用于注射用途的藥物組合物包括無(wú)菌水性溶液(當(dāng)是水溶性的時(shí))或分散體以及用于臨時(shí)制備無(wú)菌注射溶液或分散體的無(wú)菌粉末。在這些情況中，所述組合物必須是無(wú)菌的，應(yīng)該處于容易進(jìn)行注射器操作的流體。其應(yīng)當(dāng)在制造和儲(chǔ)存條件下是穩(wěn)定的，優(yōu)選抗微生物(比如細(xì)菌和真菌)污染作用地保存。載體可以是溶劑或分散體介質(zhì)，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇，及類似物)，和其合適混合物?？梢岳冒槐热缏蚜字?、在分散體的情況中維持所需顆粒大小，以及使用表面活性劑來(lái)保持合適的流動(dòng)性。預(yù)防微生物作用可以用各種抗細(xì)菌和抗真菌劑來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如對(duì)羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞及類似物。在許多情況中，優(yōu)選組合物中包括等滲劑，例如糖、多元醇(比如甘露醇、山梨醇)或氯化鈉。通過(guò)在組合物中包括延遲吸收的試劑(例如，單硬脂酸鋁和明膠)，可以將注射組合物的吸收延長(zhǎng)。在任何情況中，可將適當(dāng)溶劑中的所需量活性化合物(例如，結(jié)合多肽自身或聯(lián)合其它活性試劑)與所需的如本文所列的一或多種成分組合，隨后過(guò)濾除菌制得無(wú)菌注射液。通常將活性化合物引入含有基本分散體介質(zhì)和以上列舉的其它所需成分的無(wú)菌載體，制得分散體。對(duì)于制備無(wú)菌注射液的無(wú)菌粉末來(lái)說(shuō)，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，這些方法由先前無(wú)菌過(guò)濾溶液產(chǎn)生出活性成分和任何其它所需成分的粉末。用于注射的制劑根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法加工、裝入容器(比如安瓿、袋子、瓶子、針筒或小瓶)，在無(wú)菌條件下封口。進(jìn)一步，可以將制劑包裝，以藥盒的形式出售，象共同待決的U.S.S.N.09/259，337和U.S.S.N.09/259，338中描述的那些，這兩份申請(qǐng)以參考的方式引入本文。這類產(chǎn)品優(yōu)選帶有標(biāo)簽或包裝在內(nèi)的說(shuō)明書(shū)，表明相關(guān)組合物用于治療患有或易患自身免疫或腫瘤病癥的受治療者。對(duì)于上述病癥的治療，本發(fā)明組合物的有效劑量隨著許多不同因素而變化，所述因素包括施用方式、靶位點(diǎn)、患者的生理學(xué)狀況、患者是人類還是動(dòng)物、施用的其它藥物、和治療是預(yù)防性的還是治療性的。通常，患者是人類，但是也可以治療非人類哺乳動(dòng)物包括轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法滴定治療劑量以優(yōu)化安全性和效力。對(duì)于用本發(fā)明抗體進(jìn)行被動(dòng)免疫，劑量范圍可從宿主體重的大約0.0001至100mg/kg、更通常是0.01至5mg/kg(如，0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、lmg/kg、2mg/kg等)。例如，劑量可以是lmg/kg體重或10mg/kg體重或在Ι-lOmg/kg的范圍內(nèi)，優(yōu)選地至少lmg/kg。上述范圍中的中間劑量也意為在本發(fā)明范圍內(nèi)?？梢悦咳?、隔日、每周、或根據(jù)任何其它通過(guò)經(jīng)驗(yàn)性分析確定的方案，向受治療者施用此劑量。一個(gè)示例性療法需要長(zhǎng)期，例如至少6個(gè)月，多劑量施用。其它示例性治療方案需要每?jī)芍苁┯靡淮位蛎吭率┯靡淮位蛎?至6個(gè)月施用1次。示例性劑量方案包括連續(xù)每日l(shuí)-10mg/kg或15mg/kg、隔日30mg/kg或每周60mg/kg。在一些方法中，具有不同結(jié)合特異性的兩種或多種結(jié)合多肽同時(shí)施用，在此情況下各結(jié)合多肽的施用劑量落在所指明的范圍內(nèi)?？啥啻问┯帽景l(fā)明的多肽。單劑量之間的間隔可以是每周、每月或每年。通過(guò)測(cè)量患者中修飾結(jié)合多肽或抗原的血液水平所指示的，間隔也可以是不規(guī)則的。一些方法中，調(diào)整劑量以達(dá)到l-1000yg/ml的血漿修飾結(jié)合多肽濃度，而一些方法中調(diào)整以達(dá)到25-300μg/ml的血漿修飾結(jié)合多肽濃度。或者，可以以緩釋制劑的形式施用多肽，在此情況下需要較低的施用頻率。劑量和頻率隨著多肽在患者中的半衰期而變化。施用劑量和頻率可以根據(jù)治療是預(yù)防性的還是治療性的而變化。在預(yù)防性應(yīng)用中，含有本發(fā)明多肽或其混合物的組合物被施用給尚未處于疾病狀態(tài)的患者以便增強(qiáng)患者的抵抗力。該量被定義為“預(yù)防有效劑量”。在此應(yīng)用中，準(zhǔn)確的量同樣取決于患者的健康狀況和一般免疫狀況，但是通常為0.1至25mg/劑，尤其是0.5至2.5mg/劑?？梢砸韵鄬?duì)不頻繁的間隔長(zhǎng)期施用相對(duì)低的劑量。一些患者可以在其剩余生命期中持續(xù)接受治療。在治療性應(yīng)用中，有時(shí)需要以相對(duì)短的間隔施用相對(duì)高的劑量(例如，大約1至400mg/kg結(jié)合多肽/劑，對(duì)于放射免疫結(jié)合物更通常使用5至25mg劑量，對(duì)于細(xì)胞毒素_藥物修飾的結(jié)合多肽使用更高劑量)，直到減緩或終止疾病進(jìn)程，優(yōu)選地直到患者顯示部分或完全的疾病癥狀改善。之后，患者可以接受預(yù)防性方案。本發(fā)明多肽可任選地與其它對(duì)需要治療(例如，預(yù)防性或治療性)的病癥或狀況有效的劑一起聯(lián)合施用。9°Y標(biāo)記的修飾的本發(fā)明結(jié)合多肽的有效單次治療劑量(即治療有效量)范圍在約5到約75mCi，更優(yōu)選在約10到約40mCi。131I修飾的抗體的單次治療非骨髓清除有效劑量在約5到約70mCi，更優(yōu)選約5到約40mCi。131I標(biāo)記的抗體的單次治療清除有效劑量(即，可能需要自體骨髓移植)在約30到約600mCi，更優(yōu)選在約50到少于約500mCi。就嵌合抗體而言，由于其在循環(huán)系統(tǒng)的半衰期比鼠抗體長(zhǎng)，碘-131標(biāo)記的嵌合抗體的單次治療非骨髓清除有效劑量在約5到約40mCi，更優(yōu)選少于約30mCi。對(duì)于例如111In標(biāo)記，成像要求的標(biāo)準(zhǔn)通常少于5mCi。盡管可以如上文所述施用本發(fā)明的多肽，但必需強(qiáng)調(diào)的是，在其它實(shí)施方案中，可以將多肽施用于健康患者作為一線治療。在此實(shí)施方案中，可以向具有正?；蚱骄t骨髓儲(chǔ)備的患者和/或向沒(méi)有且現(xiàn)在沒(méi)有經(jīng)歷的患者，施用多肽。如本文中所用，本發(fā)明多肽與輔助療法的聯(lián)合或組合施用意味著相繼的(sequential)、同時(shí)的(simutaneous)、同延的(coextensive)、共存的(concurrent)、伴隨的(concomitant)、或同時(shí)期的(contemporaneous)施用或應(yīng)用所述療法和本發(fā)明公開(kāi)的結(jié)合多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員明了，可以安排聯(lián)合治療方案中各成分的施用或應(yīng)用時(shí)間以增強(qiáng)治療的整體效力。例如，可以按標(biāo)準(zhǔn)的熟知療程與本發(fā)明結(jié)合分子聯(lián)合施用化療劑或生物劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員(例如醫(yī)師)基于選定的輔助治療和本說(shuō)明的教導(dǎo)，無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛉菀椎罔b別有效的聯(lián)合治療方案。在此方面，可以理解，多肽和藥劑的聯(lián)合可以以任何順序并在向患者提供治療益處的任何時(shí)間框內(nèi)施用。即，藥劑和多肽可以以任何順序或同時(shí)施用。在選定的實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽向之前已經(jīng)進(jìn)行過(guò)化療的患者施用。在其它實(shí)施方案中，結(jié)合多肽和化療基本上同時(shí)或共存地施用。例如，可以給予正在經(jīng)歷化療療程的患者結(jié)合多肽。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在任何藥劑或治療的1年內(nèi)施用結(jié)合多肽。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，在任何藥劑或治療的10、8、6、4或2個(gè)月內(nèi)施用結(jié)合多肽。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，在任何藥劑或治療的4、3、2、或1周內(nèi)施用結(jié)合多肽。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，在選定的藥劑或治療的5、4、3、2或1天內(nèi)施用結(jié)合多肽。還可以理解，兩種藥劑或治療可以在大約數(shù)小時(shí)或數(shù)分鐘內(nèi)(即，基本上同時(shí)地)施用。還可以理解，本發(fā)明的多肽可以和任何能夠體內(nèi)消除、減少、抑制或控制瘤形成細(xì)胞生長(zhǎng)的任何藥劑組合或聯(lián)合使用(例如，以提供聯(lián)合治療方案)。與本發(fā)明相容的示例性化療劑包括烷化劑、長(zhǎng)春花生物堿(例如，長(zhǎng)春花新堿、長(zhǎng)春花堿)、甲基芐胼、氨甲蝶呤和強(qiáng)的松。四藥物聯(lián)合Μ0ΡΡ(雙氯乙基甲胺(氮芥)、長(zhǎng)春花新堿(oncovin)、甲基芐胼和強(qiáng)的松)可以非常有效地治療各種類型的淋巴瘤，并包含本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。在耐受MOPP的患者中，可以使用ABVD(例如，阿霉素、博來(lái)霉素、長(zhǎng)春花新堿和達(dá)卡巴嗪)、ChlVPP(苯丁酸氮芥、長(zhǎng)春花新堿、甲基芐胼和強(qiáng)的松)、CABS(洛莫司汀、阿霉素、博來(lái)霉素和鏈脲霉素)、MOPP加ABVD、MOPP加ABV(阿霉素、博來(lái)霉素和長(zhǎng)春花新堿)或BCVPP(卡莫司汀、環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春花新堿、甲基芐胼和強(qiáng)的松)聯(lián)合。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)給藥劑量和時(shí)間安排，可參見(jiàn)ArnoldS.Freedman禾口LeeM.Nadler,MalignantLymphomas(惡性淋巴瘤)，在Harrison'sPrinciplesofInternalMedicine1774-1788(KurtJ.Isselbacher等人編輯，第13版.1994)和V.Τ.DeVita等人，(1997)和其中引用的參考文獻(xiàn)。這些療法可以不經(jīng)變化或根據(jù)具體患者按照需要經(jīng)過(guò)變化后與本文所述一種或多種本發(fā)明多肽聯(lián)合使用。可用于本發(fā)明范疇的其它治療方案包括使用單獨(dú)烷化劑例如環(huán)磷酰胺或苯丁酸氮芥、或藥物聯(lián)合如CVP(環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春花新堿和強(qiáng)的松)、CH0P(CVP和阿霉素)、C-MOPP(環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春花新堿、強(qiáng)的松和甲基芐胼)、CAP-BOP(CHOP加甲基芐胼和博來(lái)霉素)、m-BAC0D(CHOP加氨甲蝶呤、博來(lái)霉素和甲酰四氫葉酸)、ProMACE-MOPP(強(qiáng)的松、氨甲蝶呤、阿霉素、環(huán)磷酰胺、依托泊苷和甲酰四氫葉酸加標(biāo)準(zhǔn)MoPP)、ProMACE-CytaBOM(強(qiáng)的松、阿霉素、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、阿糖胞苷、博來(lái)霉素、長(zhǎng)春花新堿、氨甲蝶呤和甲酰四氫葉酸)以及MACOP-B(氨甲蝶呤、阿霉素、環(huán)磷酞胺、長(zhǎng)春花新堿、固定劑量的強(qiáng)的松、博來(lái)霉素和甲酰四氫葉酸)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地確定用于這些方案之中每一個(gè)的標(biāo)準(zhǔn)劑量和時(shí)間安排。CHOP也已經(jīng)與博來(lái)霉素、氨甲蝶呤、甲基芐胼、氮芥、胞嘧啶阿拉伯糖苷和依托泊苷聯(lián)合。其它相容的化療劑包括但不限于2-氯脫氧腺苷(2-CDA)、2'-脫氧助間型霉素(Deoxycoformycin)禾口氟達(dá)拉濱。對(duì)于不能實(shí)現(xiàn)疾病緩解或復(fù)發(fā)的中級(jí)和高級(jí)NHL患者，使用拯救性治療(salvagetherapy)。拯救性治療使用藥物，例如胞嘧啶阿拉伯糖苷、卡鉬、順鉬、依托泊苷和異環(huán)磷酰胺(單獨(dú)地或聯(lián)合地給予)。在某些腫瘤病癥的復(fù)發(fā)或侵襲性形式中，常常使用以下方案IMVP-16(異環(huán)磷酰胺、氨甲蝶呤和依托泊苷)、MIME(甲基-gag、異環(huán)磷酰胺、氨甲蝶呤和依托泊苷)、DHAP(地塞米松、高劑量阿糖胞苷和順鉬)、ESHAP(依托泊苷、甲基強(qiáng)的松龍(methylpredisolone)、HD阿糖胞苷、順鉬)、CEPP(B)(環(huán)磷酰胺、依托泊苷、甲基芐胼、強(qiáng)的松和博來(lái)霉素)和CAMP(洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷和強(qiáng)的松)(每個(gè)均有熟知的給藥速率和時(shí)間安排)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合多肽可聯(lián)合生物制劑施用。術(shù)語(yǔ)“生物制劑”或“生物劑”是指將用作治療劑的從活的生物體和/或其產(chǎn)物制備的任何藥物活性劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可聯(lián)合包含scFc的結(jié)合分子使用的生物劑包括但不限于如，抗體、核酸分子，如，反義核酸分子、多肽或蛋白。這種生物制劑可聯(lián)合結(jié)合分子施用，通過(guò)如，在結(jié)合分子施用前、與結(jié)合分子同時(shí)、或結(jié)合分子施用后施用生物劑。可以與本發(fā)明多肽聯(lián)合使用的劑的量可以隨著受治療者而變化，或者可以根據(jù)本領(lǐng)域熟知的施用。見(jiàn)例如，BruceAChabner等人，AntineoplasticAgents(抗腫瘤齊Ll)，在Goodman&Gilrnan‘STHEPharmacologicalBasisofTheeapeutics(治療的藥理學(xué)基)1233-1287((JoelG.Hardman等人編輯，第9版.1996)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，施用這種劑的量與治療標(biāo)準(zhǔn)一致。如前文所述，可以將本發(fā)明多肽以藥物有效量施用用于體內(nèi)治療哺乳動(dòng)物病癥。在這方面，應(yīng)當(dāng)意識(shí)到本發(fā)明多肽可配制成便于活性劑的施用并提高其穩(wěn)定性的形式。優(yōu)選的，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包含藥學(xué)可接受的無(wú)毒、無(wú)菌載體，比如生理鹽水、無(wú)毒緩沖液、防腐劑及類似物。為了本申請(qǐng)的目的，結(jié)合或未結(jié)合治療劑的本發(fā)明多肽的藥學(xué)有效量應(yīng)該理解為這樣的用量，其足夠?qū)崿F(xiàn)與抗原的有效結(jié)合，并取得益處，例如減輕疾病或病癥的癥狀或者檢測(cè)物質(zhì)或細(xì)胞。在腫瘤細(xì)胞的情況中，優(yōu)選所述多肽能與贅生性或免疫反應(yīng)性細(xì)胞上的選定免疫反應(yīng)性抗原發(fā)生相互作用，并能引起這些細(xì)胞的死亡增加。當(dāng)然，可以將本發(fā)明的藥物組合物以單劑量或多劑量施用，從而提供藥學(xué)有效量的多肽。在本公開(kāi)的范圍內(nèi)，可以將本發(fā)明多肽按照前面提到的治療方法以足夠產(chǎn)生治療或預(yù)防效果的量施用于人類或其它動(dòng)物?？梢詫⒈景l(fā)明多肽以通過(guò)將多肽與常規(guī)藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑按照已知技術(shù)結(jié)合在一起制備的常規(guī)劑型給予這樣的人類或其它動(dòng)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到，藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑的形式和特點(diǎn)由將與之結(jié)合使用的活性成分的量、給藥途徑和其它公知變量確定。本領(lǐng)域技術(shù)人員還會(huì)意識(shí)到，包含一或多種本發(fā)明多肽的混合物可能證明特別有效。本發(fā)明進(jìn)一步通過(guò)以下實(shí)施例舉例說(shuō)明，這些實(shí)施例不應(yīng)理解為限制性的。在整個(gè)本申請(qǐng)中引用的所有參考文獻(xiàn)、專利和出版的專利申請(qǐng)的內(nèi)容均在此并入作為參考。實(shí)施例除非另外指明，否則實(shí)施例中使用以下材料和方法。一般材料和方法大體上，除非另外指明，實(shí)施本發(fā)明采用化學(xué)、生物物理學(xué)、分子生物學(xué)、重組DNA技術(shù)、免疫學(xué)(尤其是如，抗體技術(shù))和電泳標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)的常規(guī)技術(shù)。參見(jiàn)如，Sambrook,Fritsch禾口Maniatis,MolecularCloning(分子克隆)ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)；AntibodyEngineeringProtocols(MethodsinMolecularBiology)(抗體工程實(shí)驗(yàn)方案(分子生物學(xué)方法))，510，Paul,S.，HumanaPr(1996)；AntibodyEngineering:APracticalApproach(PracticalApproachSeries,169)(抗體工禾呈實(shí)用方法(實(shí)用方法系列，169))，McCafferty編輯，IrlPr(1996)；Antibodies:ALaboratoryManual(實(shí)驗(yàn)室抗體手冊(cè))，Harlow等人，C.S.H.L.Press,Pub.(1999)；禾口CurrentProtocolsinMolecularBiology(分子生物學(xué)最新實(shí)驗(yàn)方案)，Ausubel等人編輯，JohnWiley&Sons(1992)。實(shí)施例1.表達(dá)和純化scFc根據(jù)此前所述的方法，將包含遺傳融合的Fc區(qū)(即，單鏈(scFc)區(qū))的人類5C8IgGl抗體在DG44CHO細(xì)胞中表達(dá)。為了對(duì)重組表達(dá)的單鏈和雙鏈scFc蛋白進(jìn)行親和純化(參見(jiàn)圖1的圖解)，將CHO細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)基(IL)調(diào)整到pH7.0，將蛋白親和性地捕獲到預(yù)先在結(jié)合緩沖液(IOOmMNaPO4,pH7,150mMNaCl)中平衡的5mlHiTraprProteinAFF柱(GEHealthcare)。在結(jié)合緩沖液中洗滌柱，直到A280檢測(cè)值達(dá)到基線，在25mM甘氨酸pH2.8，IOOmM氯化鈉中洗脫結(jié)合的蛋白。通過(guò)加入0.1體積的IMTris緩沖液，pH8，立即中和級(jí)分。通過(guò)還原和非還原SDS-PAGE分析A280吸收級(jí)分中的蛋白，匯集并濃縮用于以大小排阻層析進(jìn)一步純化。在Superdex200凝膠過(guò)濾柱上、PBS，pH7中從聚集體和雙鏈(即，二聚的)scFc多肽分離單鏈(即，單體)scFc多肽。通過(guò)還原和非還原SDS-PAGE分析凝膠過(guò)濾級(jí)分，組合合適的級(jí)分以獲得單鏈和雙鏈scFc抗體群體的均一的池。通過(guò)帶有連線光散射分析的分析性SEC(TSK-GelG3000SWa柱)進(jìn)一步表征這些池以確定蛋白的均質(zhì)性和分子量。通過(guò)對(duì)非還原的去糖基化的Sc-和dc-Fc池的質(zhì)譜分析，進(jìn)行完整質(zhì)量測(cè)量和鏈間和鏈內(nèi)二硫鍵的繪圖。圖2A-D顯示分離單體(“sc”)和二聚(“dc”)的scFc蛋白的兩步驟純化方法結(jié)果。純化方法采用親和層析隨后是凝膠過(guò)濾層析。圖2A顯示從蛋白A親和柱在低pH洗脫的柱級(jí)分的吸收譜。圖2B顯示對(duì)包含二聚的(“dc”)和單體(“sc”)形式的scFc結(jié)合多肽的洗脫級(jí)分的相應(yīng)的SDSPAGE分析。單體和二聚的形式兩者基本上以單個(gè)峰從蛋白A柱洗脫。圖2C顯示Superdex200凝膠過(guò)濾柱洗脫物可將該混合物分為兩個(gè)不同峰。圖2D顯示對(duì)凝膠過(guò)濾洗脫物相應(yīng)的SDS-PAGE分析。峰分別代表純化的單體(“sc”)和二聚(“dc”)形式的人類5C8scFcIgGl抗體。圖3顯示二聚(“dc”)和單體(“sc”)形式的scFc結(jié)合多肽在非還原(組A)和還原(組B)條件下制備規(guī)模的SDS-PAGE。各圖中，泳道1和2分別包含各自二聚形式(“ds”;205kDa)和單體(“sc”;105kDa)形式。泳道3包含對(duì)照人類5C8IgGl抗體(5C8；150kDa)。實(shí)施例2.確定單體和二聚的scFc抗體的功能相互作用的測(cè)定(a)shCD40L結(jié)合測(cè)定為了檢測(cè)單體(“sc”)和二聚的(“dc”)SCFC抗體的直接抗原結(jié)合，將可溶的人類CD40L(CD154)以PBS，pH7中2μg/ml包被在NuncMaxiSorp96孔板上，在4°C過(guò)夜，每孔100μL。將IgG溶液搖出板，在室溫在含有10mMNaPi、0.362MNaCl,0.05%Tween-20、0.酪蛋白、5%FBS，pH7的封閉緩沖液(300μL每孔)中封閉孔2hr。倒空板，在封閉緩沖液中滴定生物素化的WT5c8hlgGl、SC或dcscFc，從1μg/ml開(kāi)始在板上進(jìn)行一系列13稀釋，每孔100μL。在室溫培養(yǎng)2hr后，在PBS，0.05%Tween-20中洗滌板四次。在封閉緩沖液中按110，000稀釋辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的鏈霉抗生物素蛋白，按每孔100μL加到板上，在室溫Ihr以檢測(cè)結(jié)合的生物素化的scFc。洗滌板，在底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB，100μL每孔)存在下允許顯色反應(yīng)進(jìn)行大約5min。每孔加入100μL0.5MH2SO4而終止反應(yīng)，在450nm讀取吸光度。圖6顯示ELISA結(jié)合測(cè)定的結(jié)果，比較單體(“SC”)SCFC抗體、二聚的(“dc”)SCFC抗體和常規(guī)IgGl抗體(Hu5C8)的抗原結(jié)合親和性。還進(jìn)行Biacore分析來(lái)確定由Biacore測(cè)量的5c8IgGl二價(jià)mAb、一價(jià)Fab和一價(jià)3xG4S-連接的半糖基化的scFc與抗原CD40L結(jié)合的親和性和解離速率(參見(jiàn)表2)。發(fā)現(xiàn)scFc對(duì)其靶抗原的親和性比mAb弱，但與Fab相當(dāng)。表2.Biacore分析<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>為了檢測(cè)對(duì)人類和大鼠FcRn的直接結(jié)合，將野生型(WT)5C8hIgGl、單體(“sc”)和二聚的(“dc”)scFc抗體以PBS，pH6中5μg/ml包被在NuncMaxiSorp96孔板上，在4°C過(guò)夜。將IgG溶液搖出板，在室溫在含有0.IM磷酸鈉、0.IM氯化鈉、0.05%Tween20和0.明膠，pH6的封閉緩沖液中封閉孔2hr。在PBSpH6中洗滌板，在封閉緩沖液中滴定生物素化的人類或大鼠FcRn-Fc從1μg/ml起始在板上進(jìn)行13系列稀釋。在室溫培養(yǎng)2hr后，在PBS，pH6中洗滌板，在封閉緩沖液中110，000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的鏈霉抗生物素蛋白，加到各孔，在室溫1.5hr以檢測(cè)結(jié)合的生物素化的FcRn-Fc。洗滌板，在底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)存在下允許顯色反應(yīng)進(jìn)行大約15min。加入0.5MH2SO4而猝滅反應(yīng)，在450nm讀取各板。圖7顯示FcRn結(jié)合測(cè)定的結(jié)果，比較二聚的和單體形式的scFc結(jié)合多肽與常規(guī)IgGl抗體(Hu5C8)的FcRn結(jié)合親和性。使用生物素化的形式的人類和大鼠FcRn-Fc構(gòu)建體兩者確定FcRn結(jié)合。該測(cè)定中，每個(gè)含有Fc的構(gòu)建體被包被在板上并檢測(cè)生物素化的大鼠或人類FcRn-Fc構(gòu)建體與鏈霉抗生物素蛋白HRP的結(jié)合。單體scFc對(duì)人類FcRn(不是大鼠FcRn)的結(jié)合的確定的C-值比Hu5C8或二聚的scFc抗體的低大約四倍。(c)FcγR結(jié)合測(cè)定以此前所述的基于細(xì)胞的搭橋測(cè)定(FerrantJL等人，InternationalImmunology，2004)測(cè)量WT5C8hlgGl抗體、單體(“sc”)和二聚的("dc”)scFc抗體對(duì)FcyRI(CD64)的結(jié)合。FcγRI(CD64)搭橋測(cè)定在96-孔MaxisorbELISA板(Nalge-Nunc，Rochester,NY,USA)上進(jìn)行，該板包被有10μg/ml的人類重組可溶CD40L(CD154)以捕獲測(cè)試抗體。將測(cè)試抗體滴定到各孔，從1μg/ml開(kāi)始，在板上進(jìn)行13系列稀釋。以激發(fā)波長(zhǎng)485nm/發(fā)射波長(zhǎng)530nm測(cè)量熒光標(biāo)記的⑶64+⑶32+U937細(xì)胞(ATCC)的抗體-依賴性結(jié)合。還以放大的發(fā)光近端均一測(cè)定(AmplifiedLuminescentProximityHomogeneousAssay)(Alphascreen；PerkinElmer)評(píng)價(jià)包含GGGGS(“l(fā)x_G4S，，)或(GGGS)3(“3x-G4S”)接頭的scFc抗體接合Fcγ受體的能力。供體珠的激光發(fā)射(680nm)產(chǎn)生單氧，氧接近受體珠時(shí)引發(fā)級(jí)聯(lián)事件，最終造成在520-620nm發(fā)射熒光。供體珠和受體珠分別飾以配體和受體蛋白，僅當(dāng)受體和配體變成功能性接合時(shí)，供體珠和受體珠才靠得足夠近。進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)式Ascreen測(cè)定，其中系列稀釋的測(cè)試抗體(WTIgGl或scFc)與人類FcγRIII-GST(CD16a，V158)和抗-GST受體珠在4°C在96-孔白板中培養(yǎng)過(guò)夜。鏈霉抗生物素蛋白供體珠和生物素化的野生型IgGl也在分開(kāi)的管中在4°C培養(yǎng)過(guò)夜，隨后次日加到測(cè)定板。在室溫伴隨輕微搖動(dòng)培養(yǎng)兩小時(shí)后，在Envision讀板器(PerkinElmer)對(duì)板讀數(shù)。與完全糖基化的WT人類IgGl相比，顯示半糖基化的3x-和lx-G4S連接的scFc對(duì)低親和性人類FcγRIII的高親和性變體(V158)分別具有低4-倍和57-倍的親和性(參見(jiàn)圖14A)。進(jìn)行Alphascreen測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)半糖基化的或完全糖基化的scFc多肽相對(duì)于野生型人類IgGl抗體(5c8)和工程化的無(wú)糖基化的人類IgGl變體(“Agly5c8scFc")的FcyR-結(jié)合活性，預(yù)料工程化的無(wú)糖基化的人類IgGl變體表現(xiàn)對(duì)Fcγ受體顯著減弱的結(jié)合。在該測(cè)定確定對(duì)人類和獼猴FcYRIIa(CD32a)、IIb(CD32b)和III(CD16a)的結(jié)合。半糖基化的以及完全糖基化的3xG4S連接的scFc變體兩者以與WTIgGl相當(dāng)?shù)谋碛^親和性結(jié)合受體，而lxG4S連接的scFc對(duì)FcγRIII的結(jié)合比WTIgGl測(cè)量值弱大約60-倍(參見(jiàn)圖14B)。(d)scFc抗體與人類CD40L的復(fù)合體的SEC-LS設(shè)定帶有連線光散射實(shí)驗(yàn)的非平衡的分析性凝膠過(guò)濾，以確定當(dāng)單鏈(“Sc”;即，單體)或雙鏈(“如”；8卩，二聚的)8沖(3抗體以及三聚配體004(^以不同摩爾比混合時(shí)形成的復(fù)合體的大小和化學(xué)計(jì)量。WT人類IgGl抗-人類⑶40LmAb(5C8)在這些研究中用作對(duì)照分子。各種scFc抗體與配體混合以獲得結(jié)合位點(diǎn)的近等摩爾比(11)以及三聚配體3-倍過(guò)量(13)的比例。混合蛋白，在PBS中形成終體積，并允許平衡彡4hr?？扇苄匀薈D40L的濃度在代表等摩爾結(jié)合位點(diǎn)的混合物中保持恒定在3μΜ,在代表3-倍過(guò)量配體結(jié)合位點(diǎn)的混合物中加到6μΜ。將復(fù)合體以40μ1體積、0.6ml/min注入到TSK-GELG4000SWXL柱(7.8mmx30cm，Tosoh)。用于這些研究的HPLC系統(tǒng)(Waters2690)裝備有連線UV光散射(PD2000DLS，PrecisionDetectors)和RI檢測(cè)器，以使易于確定復(fù)合體的分子量和化學(xué)計(jì)量。圖4A-B顯示表征單鏈(“sc”)或雙鏈(“dc”)scFc抗體結(jié)合于同三聚的shCD40L抗原的復(fù)合體。圖4A顯示從SEC-LS實(shí)驗(yàn)獲得的大小排阻層析的合成圖，進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)以確定各復(fù)合體的分子量。圖4B顯示⑴單鏈(“sc”)和(ii)雙鏈(“dc”)SCFC抗體分別結(jié)合于shCD40L后形成的預(yù)測(cè)復(fù)合體的圖解，以及這些復(fù)合體的理論分子量。圖5顯示在有單鏈(“SC”)SCFC抗體或常規(guī)人類IgGl抗-CD40LmAb(5C8)存在時(shí)形成的含有shCD40L的復(fù)合體的比較。各復(fù)合體確定的分子量標(biāo)在各峰上方。單鏈("sc”)scFc、5C8和shCD40L預(yù)測(cè)的分子量分別是101.5kDa、150kDa和51kDa。^MM3.H^^t^^M^a^lscFc多肽射曾強(qiáng)的表達(dá).用特異性多肽接頭可對(duì)單鏈_(即，單體)或雙鏈(即，二聚的)scFc構(gòu)建體的優(yōu)先表達(dá)進(jìn)行選擇。圖12顯示scFc構(gòu)建體在其scFc區(qū)的組成性Fc部分之間含有l(wèi)xG4S或3xG4S接頭時(shí)，經(jīng)蛋白-A親和純化后的特征。對(duì)lxG4S(圖12A)和3xG4S(圖12B)scFc的蛋白A池進(jìn)行制備級(jí)大小排阻層析，結(jié)果顯示，增加的接頭長(zhǎng)度與單體(“sc”)相比于二聚體(“dC”)SCFC的蛋白百分比明顯相關(guān)。由所示級(jí)分的SDS-PAGE分析洗脫物質(zhì)中包含的sc-和dc-scFc群體。對(duì)蛋白A親和純化的包含lxG4S或3xG4S接頭的scFc構(gòu)建體進(jìn)行分析性大小排阻層析，將圖譜重疊還顯示，lxG4S連接的scFc構(gòu)建體包含所需單體SCFC(“SC”)與可觀量的二聚scFc多肽(“dc”)的混合群體，而3xG4S接頭構(gòu)建體顯著地富集單體scFc群體(圖12Ci和ii)。Ix和3xG4S連接的scFc蛋白經(jīng)2-步純化后進(jìn)行分析性SEC-LS，分析顯示，兩種scFc蛋白都可制為均一制品，這些制品包含預(yù)計(jì)分子量(IOOkDa)的物質(zhì)。因此，當(dāng)scFc多肽中有經(jīng)lxG4S接頭遺傳融合的Fc部分時(shí)，其包含所需單鏈(“SC”)SCFC多肽與可觀量的雙鏈(“dc”)SCFC多肽的混合分子群體。相反，3x-G4S連接的scFc構(gòu)建體顯著地富集單鏈(“SC”)SCFC多肽群體。t施仿I丨4.確定scFc多At的藥代動(dòng)力學(xué)(PK)^flH在大鼠中確定WT人類IgGl(5C8)和含有Ix-和3x_G4S接頭的scFc構(gòu)建體的終末半衰期。各種構(gòu)建體在PBSpH7中以2.5mg/kg靜脈內(nèi)施用于三只動(dòng)物。在預(yù)確定的時(shí)間點(diǎn)收集血清樣品，冷凍儲(chǔ)存在-80°C用于分析。由ELISA確定各種構(gòu)建體的血清濃度隨時(shí)間變化的過(guò)程。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將重組、可溶的人類⑶40L(⑶154)以PBSpH7中5μg/ml包被到NuncMaxiSorp96-孔板上，在4°C過(guò)夜。以封閉緩沖液(IOmMPBSpH7中酪蛋白水解物，300μ1/孔，室溫(RT)2h)封閉板。在IOmMPBSpH7、0.362MNaCUO.05%Tween-20、0.1%酪蛋白、5%FBS中制備在各時(shí)間點(diǎn)獲得的血清樣品的系列稀釋，并在RT施加到相應(yīng)孔維持2hr。以PBS和0.05%Tween-20洗滌板4次，與辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的驢抗"人類IgG二抗(JacksonImmunoresearch709-035-149)孵育2hr后，在450nm檢測(cè)捕獲的IgG和scFc多肽。使用WinNonLin軟件包分析WT和scFc多肽血清濃度的時(shí)間依賴性變化。WT人類IgGl和3x-G4S連接的scFc多肽表現(xiàn)相似的β-相半衰期，分別是14天和12天。lx-G4S連接的scFc的半衰期是4.2天，顯著短于WTmAb的(參見(jiàn)圖13)。實(shí)施例5.制備半糖基化的scFc多肽示例性本發(fā)明scFc多肽是3xG4S_連接的半糖基化的5c8sCFC多肽，在其scFc區(qū)的兩個(gè)Fc部分之一具有單個(gè)聚糖。為了證實(shí)發(fā)生了半糖基化，在酶促除去半聚糖之前和之后，對(duì)scFc多肽進(jìn)行去卷積的質(zhì)譜測(cè)定(MS)。圖15顯示對(duì)蛋白以PNGaseF去糖基化之前和之后獲得的去卷積的質(zhì)譜。scFc多肽去糖基化(并還原)后的重鏈和輕鏈質(zhì)量經(jīng)確定分別是75，703Da和23，854Da。完整的去糖基化的分子因此應(yīng)具有99，557Da的質(zhì)量，這與計(jì)算的質(zhì)量IOOkDa很好地一致。因此，去糖基化的scFc多肽的分子量符合半糖基化的特征。實(shí)施例6.生物物理分析scFc多肽本發(fā)明scFc多肽優(yōu)選地具有與常規(guī)多肽相當(dāng)?shù)纳镂锢硖卣?如，熱穩(wěn)定性)。由差示掃描量熱法(DSC)比較5C8SCFC多肽的熱穩(wěn)定性和WThulgGlmAb和Fc的熱穩(wěn)定性。發(fā)現(xiàn)scFc的Fab和CH3結(jié)構(gòu)域的解鏈譜與IgGl的mAb和Fc片段的解鏈譜很好地一致(參見(jiàn)圖16)。尤其，半糖基化的scFc(ASK043)的CH2結(jié)構(gòu)域具有與無(wú)糖基化的IgGl相似的Tm(分別為61.9°C和61°C)，而完全糖基化的scFc(ASK048)比WTIgGlCH2結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性高。實(shí)施例7.具有改進(jìn)的溶解度的抗-LINGOscFc抗體LING0-1是CNS特異性膜結(jié)合糖蛋白，它與NgRl/p75和NgRl/TAJ(TROY)—起形成信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合體，該復(fù)合體結(jié)合髓磷脂抑制劑并介導(dǎo)軸突長(zhǎng)出。拮抗LING0-1結(jié)合的可溶LING0-1(LINGO-I-Fc)在脊束(spinaltract)損傷模型中可顯著促進(jìn)功能恢復(fù)。根據(jù)本發(fā)明方法合成多種抗-LINGOscFc抗體。示例性抗-LINGO抗體(EAG2148)的重鏈的氨基酸和核苷酸序列顯示在圖32、33和圖35-38。各抗體輕鏈的氨基酸和核苷酸序列顯示在圖34。圖39顯示分析抗-LingoscFc抗體分子的蛋白濃度依賴性溶解度特征，如由分析性SEC(A&B)和超速離心(C)確定。Li33是一種抗-LINGO人類IgGl抗體，容易聚集，因此產(chǎn)生其更可溶的人類IgG2形式。然而，甚至與更可溶的IgG2構(gòu)建體(B)比較，lxG4S連接的半糖基化的Li33scFc(A)顯示顯著更好的溶解度特征，因?yàn)椋S著蛋白濃度增力口，IgG2單體峰而不是scFc的曲線下面積減少。(C)通過(guò)用分析性超速離心測(cè)沉降速率，評(píng)價(jià)抗-LINGOLi33scFc在20mMTris、150mMNaCl,ρΗ8中在0.7mg/ml的均質(zhì)性。盡管Li33scFc制品在該濃度可檢出不超過(guò)的聚集材料，Li33IgG2mAb制品在PBS，pH7中濃度低至0.3mg/ml時(shí)包含4%-16%的聚集蛋白。實(shí)施例8.抗-⑶2scFc抗體CD2是腫瘤相關(guān)的泛T細(xì)胞抗原，見(jiàn)于T-細(xì)胞和天然殺傷(NK)細(xì)胞，與多種T-細(xì)胞相關(guān)病癥有關(guān)，所述病癥包括某些自身免疫病癥(如，移植物抗宿主病、銀屑病、腎移植)和T-細(xì)胞癌(如，非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’slymphoma))。示例性抗-⑶2scFc抗體可根據(jù)本發(fā)明方法合成。chCB6是人類CD2-特異性嵌合單克隆抗體(IgGl，κ)。根據(jù)本發(fā)明合成包含3xG4S、4xG4S、5xG4S或6XG4S接頭的完全糖基化的chCB6嵌合scFc抗體。示例性重鏈氨基酸和核苷酸序列顯示在圖40-47。實(shí)施例9.抗-LTβRscFc抗體淋巴毒素β受體(LTβR)是受體的腫瘤壞死因子(TNF)家族成員，已牽涉在細(xì)胞凋亡和癌癥中。示例性抗-LTβRscFc抗體可根據(jù)本發(fā)明方法合成。例如，BDA8的結(jié)合位點(diǎn)可融合于本發(fā)明的scFc區(qū)。BDA8抗體的示例性重鏈氨基酸和核苷酸序列顯示在圖64。實(shí)施例10.GFRa31scFc融合多肽GFRa3是神經(jīng)膠質(zhì)-衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(⑶NF)受體家族的成員。由于其生理作用，可溶神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可用于治療許多神經(jīng)退化疾病中發(fā)生的神經(jīng)細(xì)胞退化和失去分化功能。例如，保持配體結(jié)合(優(yōu)選地GDNF結(jié)合)和受體信號(hào)傳導(dǎo)功能(經(jīng)由Ret受體酪氨酸激酶)兩者的可溶⑶NFRα可用于賦予、恢復(fù)或增強(qiáng)⑶NFRa-配體(優(yōu)選地⑶NF)對(duì)神經(jīng)元或其它細(xì)胞的響應(yīng)性。根據(jù)本發(fā)明方法合成示例性GFRa3:ScFc融合蛋白(ASK057)。ASK057的氨基酸和核苷酸序列顯示在圖48和圖49。圖50顯示融合蛋白表達(dá)后的非還原SDS-PAGE和分析性SEC-LS。匯集從蛋白A柱洗脫的物質(zhì)(L)，上樣到Superdex200凝膠過(guò)濾柱以分離單體(sc)和二聚的(dc)SCFC群體(凝膠的泳道1)，隨后是泳道2中的分子量標(biāo)準(zhǔn)品(M)。經(jīng)SEC匯集的GFRa3:SCFC級(jí)分被括在兩個(gè)虛線之間。2-步純化后獲得的GFRa3:scFc經(jīng)SEC-LS分析表明是均一的制品，分子量是114.8kDa。GFRa3:ScFc結(jié)合于同二聚的neublastin的化學(xué)計(jì)量由溶液相Biacore實(shí)驗(yàn)確定為2GFRa3:scFcIneublastin二聚體。實(shí)施例ILIFN-β:scFc融合多肽干擾素i3-laUn，AVONEX)可用于治療多發(fā)性硬化。示例性IFN-β:scFc免疫粘附素(EAG2149)根據(jù)本發(fā)明方法合成。EAG2149分子包含lxG4S接頭并被修飾以便于半糖基化。ASK057的氨基酸和核苷酸序列顯示在圖51和圖52。實(shí)施例12.LTM=ScFc融合多肽示例性LTi3R:SCFC免疫粘附素(EAG2190和EAG2191)根據(jù)本發(fā)明方法合成。EAG2190分子包含3xG4S接頭，并被修飾以便于半糖基化。這些分子的氨基酸和核苷酸序列顯示在圖53-56。對(duì)純化的LTβR:scFc融合蛋白進(jìn)行4-12%梯度SDS-PAGE，揭示對(duì)應(yīng)于對(duì)DLI33scFc預(yù)料分子量75kD的單條帶。在PhenomonexBiosep-S-3000柱上在20mM磷酸鈉pH7.2、150mMNaCl(PBS)中以0.5mL/min進(jìn)行純化蛋白的分析性凝膠過(guò)濾。在280nM監(jiān)測(cè)洗脫液。隨后確定純化的LTβR:scFc的均質(zhì)性和對(duì)已知配體LTα1β2的結(jié)合活性。純化的LTβRscFc的還原和非還原的SDSPAGE顯示于圖57A。分析性大小排阻層析顯示純化LTβR:scFc的單個(gè)高均質(zhì)性峰(圖57B)。以PNGaseF去糖基化、以DTT還原并在室溫培養(yǎng)12h后，在LCZ質(zhì)譜儀上由質(zhì)譜測(cè)定分析LTBR:SCFC(參見(jiàn)圖58)。對(duì)還原和N-去糖基化的分子的質(zhì)譜測(cè)定顯示，73，844.5的理論分子量與實(shí)驗(yàn)值73，846一致。在表達(dá)的LTβR:scFc的前四個(gè)氨基酸觀察到N-末端蛋白水解不均質(zhì)性，且N-I和N-3部分兩者的第一殘基是焦谷氨酸。在質(zhì)譜測(cè)定中觀察到低水平的O-糖基化，反映在74726和74820的峰。圖59A描繪ELISA的結(jié)果，評(píng)價(jià)單體LTβR:scFc對(duì)LTα1β2的結(jié)合親和性。將ELISA板以PBS中5ug/mlLTα1β2包被，在4°C過(guò)夜。隨后以IOmMPBS，pH7.O中酪蛋白封閉板，隨后以IOmMPBS,pH7.0,0.1%Tween20(洗滌緩沖液)洗滌三次。將LTβRIgG或LTB3:scFc系列稀釋到IOmMPBS、362mMNaCl、0.055Tween_20、0.1%酪蛋白、5%FBSpH7.0(測(cè)定稀釋液)并孵育lh，隨后以洗滌緩沖液洗滌。向各孔加入在測(cè)定稀釋液中15000稀釋的驢抗-人類重鏈和輕鏈特異性HRP(JacksonLabs)結(jié)合的二抗，維持60min,隨后用PBS洗滌。幾分鐘后，使用四甲基聯(lián)苯胺和過(guò)氧化氫在IOOmM乙酸鈉pH4.0中將HRP顯色，加入IOOuLIN硫酸終止測(cè)定，在450nM讀取樣品吸光度。ELISA分析顯示，與LTi3R:IgG相比，LTβR:SCFC具有減少的結(jié)合親和性。這一結(jié)果反映單體LTβR:SCFC相對(duì)于二聚的LTi3R:IgG親和力的減少。此前顯示，二聚的LTi3RIgG(<0.IOnM)和單體LTβR(40nM)的Kd值差別超過(guò)400倍(Eldredge,Berkowitz等人2006)。還由FACS分析評(píng)價(jià)單體LTβR:scFc的結(jié)合親和性(圖59B)。根據(jù)Eldredge等人的方法對(duì)Π-23細(xì)胞進(jìn)行FACS(Eldredge，Berkowitz等人2006)。使用流式細(xì)胞術(shù)，根據(jù)此前所述的方法進(jìn)行FACS結(jié)合測(cè)定(Force，Walter等人1995)。簡(jiǎn)要地說(shuō)，在直接結(jié)合測(cè)定中，在帶有不同濃度的LTβRIgG或生物素化LTβRIgG(bLTβRIgG)的FACS緩沖液中，在經(jīng)豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯活化的11-23細(xì)胞(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)Manassas,VA)上檢測(cè)人類LTα1β2。細(xì)胞在冰上保溫l_2h，隨后以PBS洗滌并離心。加入合適的FACS緩沖液中的鏈霉抗生物素蛋白(steptavidin)藻紅蛋白或抗_hFc藻紅蛋白標(biāo)記的二抗(MolecularProbes,Eugene,OR)，并與細(xì)胞一起再保溫lh，再次洗滌。將11-23細(xì)胞上結(jié)合的LTiiRIgG的熒光染色，通過(guò)由FACS確定的平均通道熒光(meanchannelfluorescence)來(lái)定量。FACS和ELISA兩者都顯示，與LTβRIgG相比，LTβRscFc具有減少的結(jié)合親和性。這一結(jié)果是預(yù)計(jì)到的，因?yàn)閱误w蛋白缺少LTiiRIgG的親和力。此前顯示，二聚的LTβRIgG(<0.IOnM)和單體LTβR(40nM)的Kd值差別超過(guò)400倍(Eldredge,Berkowitz等人2006)。權(quán)利要求一種結(jié)合多肽，其包含(i)第一結(jié)合位點(diǎn)和(ii)單個(gè)連續(xù)遺傳序列中編碼的第一Fc區(qū)，其中a.所述Fc區(qū)包含至少兩個(gè)Fc部分，b.所述Fc區(qū)經(jīng)由置于所述Fc部分之間的多肽接頭序列融合；且c.所述Fc區(qū)賦予所述結(jié)合多肽至少一種效應(yīng)子功能。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合多肽，其中所述Fc區(qū)包含選自由FcRn結(jié)合部分、FcyR結(jié)合部分、補(bǔ)體結(jié)合部分、蛋白G結(jié)合部分和蛋白A結(jié)合部分組成的組的結(jié)構(gòu)域。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的結(jié)合多肽，其中所述Fc區(qū)是異聚的Fc區(qū)。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的結(jié)合多肽，其中所述異聚的Fc區(qū)是半糖基化的。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的結(jié)合多肽，其中所述Fc區(qū)是同聚的Fc區(qū)。6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的結(jié)合多肽，其中所述Fc區(qū)是完全糖基化的。7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的結(jié)合多肽，其中所述Fc區(qū)是無(wú)糖基化的。8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的結(jié)合多肽，其中所述Fc區(qū)是無(wú)巖藻糖基化的。9.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的結(jié)合多肽，其中所述Fc區(qū)是嵌合Fc區(qū)。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的結(jié)合多肽，其中所述Fc區(qū)包含多個(gè)來(lái)自IgG2分子的CH2結(jié)構(gòu)域和多個(gè)來(lái)自IgG4分子的CH3結(jié)構(gòu)域。11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的結(jié)合多肽，其中所述Fc區(qū)包含來(lái)自IgG2分子的CH2部分和來(lái)自IgG4分子的CH2部分。12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的結(jié)合多肽，其包含修飾的鉸鏈區(qū)。13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的結(jié)合多肽，其包含來(lái)自IgG4分子的中部鉸鏈區(qū)和來(lái)自IgGl分子的上部和下部鉸鏈區(qū)。14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的結(jié)合多肽，其中所述鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基取代。15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合多肽，其中所述Fc區(qū)包含兩個(gè)或多個(gè)Fc部分。16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合多肽，其中所述Fc區(qū)包含缺少選自由CH2結(jié)構(gòu)域、CH3結(jié)構(gòu)域和鉸鏈結(jié)構(gòu)域組成的組的部分的Fc結(jié)構(gòu)域。17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合多肽，其中所述Fc部分的至少一個(gè)包含至少一個(gè)氨基酸突變。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的結(jié)合多肽，其中所述Fc部分的兩個(gè)或多個(gè)包含氨基酸突變。19.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的結(jié)合多肽，其中所述突變?cè)趯?duì)應(yīng)于由根據(jù)EU編號(hào)索引234、236、239、241、246-252、254-256、275、277-288、294、296-298、301、303-307、309、310、312、313、315、328、332、334、338、342、343、350、355、359、360、361、374、376、378、381-385、387、389、413、415、418、422、426、428、430-432、434、435、438和441-446組成的組中所列的Fc氨基酸位置的一個(gè)或多個(gè)位置。20.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的結(jié)合多肽，其中所述突變位于CH2結(jié)構(gòu)域。21.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的結(jié)合多肽，其中所述突變位于CH3結(jié)構(gòu)域。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的結(jié)合多肽，其中所述CH3結(jié)構(gòu)域在對(duì)應(yīng)于選自由根據(jù)EU編號(hào)索引350、355、361、389、415、441、443和446b組成的組的Fc氨基酸位置的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置包含工程化的半胱氨酸或其含硫醇類似物。23.根據(jù)權(quán)利要求17所述的結(jié)合多肽，其在EU位置297具有減少的糖基化。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的結(jié)合多肽，其在EU位置297是無(wú)巖藻糖基化的。25.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合多肽，其中所述多肽接頭的長(zhǎng)度是約50至約500個(gè)氨基酸。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的結(jié)合多肽，其中所述多肽接頭的長(zhǎng)度是約50至約200個(gè)氨基酸。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的結(jié)合多肽，其中所述多肽接頭的長(zhǎng)度是約1至約50個(gè)氨基酸。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的結(jié)合多肽，其中所述多肽接頭的長(zhǎng)度是約10至約20個(gè)氨基酸。29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的結(jié)合多肽，其中所述多肽接頭包含鉸鏈區(qū)或其部分。30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的結(jié)合多肽，其中所述鉸鏈區(qū)是嵌合鉸鏈區(qū)。31.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合多肽，其中所述多肽接頭包含gly/ser肽。32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的結(jié)合多肽，其中所述gly/ser肽具有式(Gly4Ser)n，其中n是選自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10組成的組的正整數(shù)。33.根據(jù)權(quán)利要求31任一項(xiàng)所述的結(jié)合多肽，其中所述(Gly4Ser)n接頭是(Gly4Ser)3。34.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合多肽，其中所述第一結(jié)合位點(diǎn)遺傳融合于所述Fc區(qū)的N-末端。35.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合多肽，其中所述第一結(jié)合位點(diǎn)遺傳融合于所述Fc區(qū)的C-末端。36.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合多肽，其中所述第一結(jié)合位點(diǎn)貼在所述Fc區(qū)的Fc部分上。37.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合多肽，其中所述多肽接頭包含所述第一結(jié)合位點(diǎn)。38.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合多肽，其中所述結(jié)合位點(diǎn)并入所述Fc區(qū)的一個(gè)或多個(gè)Fc部分中。39.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合多肽，其還包含第二結(jié)合位點(diǎn)。40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的結(jié)合多肽，其中所述第二結(jié)合位點(diǎn)可操作地連接于所述Fc區(qū)的N-末端。41.根據(jù)權(quán)利要求39所述的結(jié)合多肽，其中所述第二結(jié)合位點(diǎn)可操作地連接于所述Fc區(qū)的C-末端。42.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合多肽，其包含至少三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的結(jié)合多肽，其包含至少四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。44.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合多肽，其中所述多肽接頭包含生物學(xué)相關(guān)的肽或其部分。45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的結(jié)合多肽，其中所述生物學(xué)相關(guān)的多肽是抗排斥或抗炎肽。46.根據(jù)權(quán)利要求44所述的結(jié)合多肽，其中所述生物學(xué)相關(guān)的多肽選自由細(xì)胞因子抑制肽、細(xì)胞粘附抑制肽、凝血酶抑制肽和血小板抑制肽組成的組。47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的結(jié)合多肽，其中所述細(xì)胞因子抑制肽是IL-I抑制肽。48.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合多肽，其中至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)選自由抗原結(jié)合位點(diǎn)、受體的配體結(jié)合部分和配體的受體結(jié)合部分組成的組。49.根據(jù)任何權(quán)利要求48所述的結(jié)合多肽，其中所述結(jié)合位點(diǎn)是衍生自抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)。50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的結(jié)合多肽，其中所述抗體選自由單克隆抗體、嵌合抗體、人類抗體和人源化抗體組成的組。51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的結(jié)合多肽，其中所述結(jié)合位點(diǎn)衍生自選自由scFv、Fab、微型抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、納米抗體、駱駝抗體和Dab組成的組的修飾的抗體。52.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合多肽，其中所述結(jié)合位點(diǎn)衍生自非免疫球蛋白的結(jié)合分子。53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的結(jié)合多肽，其中所述非免疫球蛋白的結(jié)合分子選自由adnectin、親和體親和體、DARPin和抗運(yùn)載蛋白組成的組。54.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的結(jié)合多肽，其中至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)包含來(lái)自選自由利妥昔單抗、達(dá)克珠單抗、加利昔單抗、CB6、Li33、5c8、CBEll、BDA8、14A2、B3F6、2B8、LymULym2、LL2、Her2、5E8、Bl、MBl、BH3、B4、B72.3、CC49和5E10組成的組的抗體的六個(gè)CDR、可變重鏈區(qū)和可變輕鏈區(qū)、或抗原結(jié)合位點(diǎn)。55.根據(jù)權(quán)利要求48所述的結(jié)合多肽，其中所述受體的配體結(jié)合部分衍生自選自由免疫球蛋白(Ig)超家族的受體、TNF受體超家族的受體、G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)超家族的受體、酪氨酸激酶(TK)受體超家族的受體、配體門(mén)控(LG)超家族的受體、趨化因子受體超家族的受體、IL-1/Toll樣受體(TLR)超家族、神經(jīng)膠質(zhì)衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(⑶NF)受體家族的受體、和細(xì)胞因子受體超家族組成的組的受體。56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的結(jié)合多肽，其中所述TNF受體超家族的受體是LTβR057.根據(jù)權(quán)利要求55所述的結(jié)合多肽，其中所述TNF受體超家族的受體結(jié)合TNFα。58.根據(jù)權(quán)利要求55所述的結(jié)合多肽，其中所述GDNF受體家族的受體是GFRa3。59.根據(jù)權(quán)利要求45所述的結(jié)合多肽，其中所述配體的受體結(jié)合部分衍生自抑制配體。60.根據(jù)權(quán)利要求48所述的結(jié)合多肽，其中所述配體的受體結(jié)合部分衍生自活化配體。61.根據(jù)權(quán)利要求59或60所述的結(jié)合多肽，其中所述配體結(jié)合選自由免疫球蛋白(Ig)超家族的受體、TNF受體超家族的受體、G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)超家族的受體、酪氨酸激酶(TK)受體超家族的受體、配體門(mén)控(LG)超家族的受體、趨化因子受體超家族的受體、IL-1/Toll樣受體(TLR)超家族和細(xì)胞因子受體超家族組成的組的受體。62.根據(jù)權(quán)利要求61所述的結(jié)合多肽，其中結(jié)合所述細(xì)胞因子受體超家族的受體的配體是β-干擾素。63.根據(jù)權(quán)利要求28所述的結(jié)合多肽，其中所述第一結(jié)合位點(diǎn)和第二結(jié)合位點(diǎn)具有不同的結(jié)合特異性。64.根據(jù)權(quán)利要求28所述的結(jié)合多肽，其中所述第一結(jié)合位點(diǎn)和第二結(jié)合位點(diǎn)具有相同的結(jié)合特異性。65.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合多肽，所述結(jié)合分子包含兩個(gè)或多個(gè)遺傳融合的Fc區(qū)。66.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合多肽，其結(jié)合于至少一個(gè)功能性部分。67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的結(jié)合多肽，其中所述功能性部分選自由封閉部分、可檢測(cè)部分、診斷部分和治療部分組成的組。68.根據(jù)權(quán)利要求67所述的多肽，其中所述封閉部分選自由半胱氨酸加合物、混合的二硫化物、聚乙二醇和聚乙二醇馬來(lái)酰亞胺組成的組。69.根據(jù)權(quán)利要求67所述的多肽，其中所述可檢測(cè)部分選自由熒光部分和同位素部分組成的組。70.根據(jù)權(quán)利要求67所述的多肽，其中所述診斷部分能夠揭示疾病或病癥的存在。71.根據(jù)權(quán)利要求67所述的多肽，其中所述治療部分選自由抗炎劑、抗癌劑、抗神經(jīng)變性劑和抗傳染劑組成的組。72.根據(jù)權(quán)利要求66任一項(xiàng)所述的結(jié)合多肽，其中所述功能性部分結(jié)合于所述多肽接頭。73.根據(jù)權(quán)利要求66任一項(xiàng)所述的結(jié)合多肽，其中所述功能性部分是經(jīng)由二硫鍵結(jié)合的。74.根據(jù)權(quán)利要求66任一項(xiàng)所述的結(jié)合多肽，其中所述功能性部分是經(jīng)由異雙官能接頭結(jié)合的。75.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合多肽，其還包含第二多肽并且是多聚的。76.根據(jù)權(quán)利要求75所述的結(jié)合多肽，其中所述第二多肽是包含(i)至少第二結(jié)合位點(diǎn)，和(ii)至少第二遺傳融合的Fc區(qū)的結(jié)合多肽，其中所述第二遺傳融合的Fc區(qū)包含至少兩個(gè)Fc部分并賦予所述結(jié)合多肽至少一種效應(yīng)子功能。77.根據(jù)權(quán)利要求76所述的多聚結(jié)合多肽，其是二聚的結(jié)合多肽。78.根據(jù)權(quán)利要求77所述的結(jié)合多肽，其中所述第一結(jié)合位點(diǎn)或第二結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合于免疫細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞上存在的抗原。79.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合多肽，其中至少一個(gè)Fc部分屬于IgG同種型。80.根據(jù)權(quán)利要求79所述的結(jié)合多肽，其中所述IgG同種型屬于IgGl亞類。81.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合多肽，其中至少一個(gè)Fc部分衍生自人類抗體。82.—種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1所述的多肽。83.一種核酸分子，其包含編碼權(quán)利要求1所述的多肽的核苷酸序列。84.根據(jù)權(quán)利要求83所述的核酸分子，其在表達(dá)載體中。85.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求84所述的表達(dá)載體。86.—種產(chǎn)生結(jié)合多肽的方法，其包括在培養(yǎng)物中培養(yǎng)權(quán)利要求85所述的宿主細(xì)胞以致產(chǎn)生所述結(jié)合多肽。87.一種治療或預(yù)防受治療者的疾病或病癥的方法，其包括施用權(quán)利要求86所述的藥物組合物。88.根據(jù)權(quán)利要求87所述的方法，其中所述疾病或病癥選自由神經(jīng)學(xué)病癥、炎性病癥、自身免疫病癥和腫瘤病癥組成的組。全文摘要除其它以外，本發(fā)明特征為包含含有遺傳融合的Fc部分的Fc區(qū)的多肽。此外，本發(fā)明提供例如通過(guò)向受治療者施用本發(fā)明結(jié)合多肽而治療或預(yù)防所述受治療者的疾病或病癥的方法。文檔編號(hào)A61P29/00GK101802197SQ200880024709公開(kāi)日2010年8月11日申請(qǐng)日期2008年5月14日優(yōu)先權(quán)日2007年5月14日發(fā)明者亞歷克西·A·盧戈夫斯科伊,埃倫·加伯,格雷厄姆·K·法林頓,阿姆納·西德-科瑟申請(qǐng)人:比奧根艾迪克Ma公司