專(zhuān)利名稱(chēng)：含有由抗骨膜素的外顯子-17編碼的肽的抗體的癌癥治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有針對(duì)骨膜素(periostin)的外顯子_17所編碼的肽區(qū)域的抗體的 癌癥治療用藥物組合物。更詳細(xì)的是，含有識(shí)別在以癌組織為代表的組織重建的間質(zhì)中特 異表達(dá)的，具有抗細(xì)胞粘附作用的骨膜素的剪切變體(splice variant)的抗骨膜素抗體的 癌癥治療用藥物組合物，或者使用前述抗骨膜素抗體的癌的診斷方法和診斷劑。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，隨著癌癥治療法的進(jìn)步，癌癥的治愈率穩(wěn)步提高。尤其是，對(duì)于通過(guò)外科 手術(shù)、放射療法或者化學(xué)療法消除原發(fā)癌的成功率的提高對(duì)其進(jìn)步做出了貢獻(xiàn)。但是，從世 界上來(lái)看，癌癥導(dǎo)致的死亡數(shù)由于人口的高齡化加劇等原因，必然逐漸增加，依然是死因的 首位。其原因直接的或間接地與以下因素相關(guān)即使完全除去原發(fā)癌，但隨著癌癥轉(zhuǎn)移而 死亡的情況也不少，通過(guò)外科的手術(shù)、放射療法或者化學(xué)療法對(duì)于完全阻止癌癥轉(zhuǎn)移而言 還是存在限制，依然由于癌癥導(dǎo)致的死亡原因中直接或間接地與癌癥的遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移有關(guān)。 癌癥轉(zhuǎn)移由以下過(guò)程構(gòu)成，即從原發(fā)病灶中游離的癌細(xì)胞向血管或淋巴管內(nèi)的浸潤(rùn)、癌細(xì) 胞向轉(zhuǎn)移內(nèi)臟器官的選擇性移動(dòng)，癌細(xì)胞從血管向轉(zhuǎn)移內(nèi)臟器官的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移前由微小環(huán) 境支持的癌細(xì)胞的增殖、伴隨血管新生的直徑達(dá)到數(shù)毫米以上的腫瘤的增殖等(非專(zhuān)利文 獻(xiàn)1、非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。在這些復(fù)雜的轉(zhuǎn)移成立過(guò)程中，癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力的亢進(jìn)而造成的浸 潤(rùn) 轉(zhuǎn)移是極為重要的階段(非專(zhuān)利文獻(xiàn)3)。迄今為止，據(jù)報(bào)道，高轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞其自身產(chǎn) 生自我分泌型運(yùn)動(dòng)因子，使固有運(yùn)動(dòng)亢進(jìn)(非專(zhuān)利文獻(xiàn)4)。盡管一直期待針對(duì)惡性因子的 抑制物質(zhì)作為轉(zhuǎn)移抑制劑，但迄今為止并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其特異的抑制劑。骨膜素是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的一種，由分子量約為9萬(wàn)的多肽構(gòu)成。各多肽鏈中 含有信號(hào)序列，富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，4個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)域，C末端結(jié)構(gòu)域。骨膜素最初被稱(chēng)為成骨細(xì)胞特異性因子-2(0SF_2)，作為在小鼠成骨細(xì)胞株 MC3T3-E1細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因被分離鑒定(專(zhuān)利文獻(xiàn)1、非專(zhuān)利文獻(xiàn)5)、后來(lái)被稱(chēng)為現(xiàn) 在的名稱(chēng)即骨膜素，據(jù)報(bào)道在成骨細(xì)胞中有粘附促進(jìn)活性(非專(zhuān)利文獻(xiàn)6)。在初期的研究中，人們認(rèn)為骨膜素是在骨組織中特異性表達(dá)的細(xì)胞外基質(zhì)。但是， 現(xiàn)在已清楚了其不僅在骨組織，而且還在心衰竭(非專(zhuān)利文獻(xiàn)7、非專(zhuān)利文獻(xiàn)8)、動(dòng)脈瘤 (非專(zhuān)利文獻(xiàn)9)、高轉(zhuǎn)移性癌(非專(zhuān)利文獻(xiàn)10、非專(zhuān)利文獻(xiàn)11、非專(zhuān)利文獻(xiàn)12)、子癇前癥 (非專(zhuān)利文獻(xiàn)13)等發(fā)病中以極高水平表達(dá)，而且在正常組織中雖微但也表達(dá)。而且，也已 清楚了一些骨膜素剪切變體在成骨細(xì)胞中表達(dá)(非專(zhuān)利文獻(xiàn)5、非專(zhuān)利文獻(xiàn)6、非專(zhuān)利文獻(xiàn) 14、專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。對(duì)于骨膜素的作用，就細(xì)胞粘附作用而言，報(bào)道了由811個(gè)氨基酸構(gòu)成的骨膜素 剪切變體(相當(dāng)于

圖1中PN-2)(非專(zhuān)利文獻(xiàn)6)和由782個(gè)氨基酸構(gòu)成的骨膜素剪切變體 (非專(zhuān)利文獻(xiàn)15)具有細(xì)胞粘附作用。與之相對(duì)，據(jù)報(bào)道，心成纖維細(xì)胞不粘附在包被了由 838個(gè)氨基酸構(gòu)成的骨膜素剪切變體(相當(dāng)于圖1中PN-1)的平板上，即不具有細(xì)胞粘附活性，與正常的大鼠相比，在心衰竭模型大鼠中由838個(gè)氨基酸構(gòu)成的骨膜素剪切變體(相 當(dāng)于圖1中PN-1)的基因表達(dá)顯著增加，此外該骨膜素剪切變體是引起心臟擴(kuò)張的惡化因 子，而且若抑制該蛋白質(zhì)的表達(dá)則存活率顯著上升(非專(zhuān)利文獻(xiàn)7)。此外，還報(bào)道了，通過(guò) 使用針對(duì)由838個(gè)氨基酸構(gòu)成的骨膜素剪切變體(相當(dāng)于圖1中PN-1)的反義核苷酸抑制 該骨膜素剪切變體的表達(dá)的心衰竭的預(yù)防劑或治療劑(專(zhuān)利文獻(xiàn)3)。此外，本發(fā)明人，對(duì) 關(guān)于由811個(gè)氨基酸構(gòu)成的骨膜素剪切變體(相當(dāng)于圖1中PN-2)細(xì)胞粘附，通過(guò)發(fā)現(xiàn)由 838個(gè)氨基酸構(gòu)成的骨膜素剪切變體(相當(dāng)于圖1中PN-1)具有細(xì)胞的剝離活性，以其外顯 子17序列作為抗原的抗體抑制其剝離活性，而且在急性心肌梗塞模型動(dòng)物中心臟功能有 改善，就心衰竭的預(yù)防劑或治療劑進(jìn)行了報(bào)道(特愿2005-380009)。就癌而言，在各種論文 中報(bào)道了骨膜素在高轉(zhuǎn)移性癌中的高表達(dá)(非專(zhuān)利文獻(xiàn)16 (胰腺癌)、非專(zhuān)利文獻(xiàn)17 ( 口 腔癌)、非專(zhuān)利文獻(xiàn)18 (胰腺癌)、非專(zhuān)利文獻(xiàn)19 (乳癌)、非專(zhuān)利文獻(xiàn)20 (頭頸部癌)、非專(zhuān) 利文獻(xiàn)21 (結(jié)腸癌)、非專(zhuān)利文獻(xiàn)10(乳癌)、非專(zhuān)利文獻(xiàn)12(乳癌)、非專(zhuān)利文獻(xiàn)22(胸腺 癌)、非專(zhuān)利文獻(xiàn)23 (非小細(xì)胞性肺癌)、非專(zhuān)利文獻(xiàn)11 (頭頸部扁平上皮癌))。但是，在這 些文獻(xiàn)中，并沒(méi)有關(guān)注于骨膜素的剪切變體，盡管有通過(guò)RT-PCR法分析骨膜素的表達(dá)確認(rèn) 的報(bào)告(非專(zhuān)利文獻(xiàn)6、11、13、14、17、18、20、26、28、29)，但全都是在與外顯子-17區(qū)域不同 的部位制備引物，沒(méi)有特異性分析具有外顯子-17區(qū)域的變體。此外，還關(guān)注于關(guān)于轉(zhuǎn)錄因 子Twist在高轉(zhuǎn)移性癌中高表達(dá)的報(bào)道(非專(zhuān)利文獻(xiàn)24、非專(zhuān)利文獻(xiàn)25)，報(bào)道了在骨膜素 的啟動(dòng)子區(qū)域也有Twist (非專(zhuān)利文獻(xiàn)26)。此外，據(jù)報(bào)道，如果在致癌性且非轉(zhuǎn)移性的人胎 兒腎上皮細(xì)胞株293T細(xì)胞中導(dǎo)入骨膜素基因，浸潤(rùn)能力增強(qiáng)(非專(zhuān)利文獻(xiàn)27)。此外，還報(bào) 道了，在各種癌細(xì)胞中，大鼠骨膜素的小鼠同源物的表達(dá)降低，通過(guò)將該骨膜素的基因?qū)?膀胱癌細(xì)胞抑制了膀胱癌細(xì)胞的浸潤(rùn)，和通過(guò)在小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞中導(dǎo)入該骨膜 素基因抑制了向肺的轉(zhuǎn)移(非專(zhuān)利文獻(xiàn)28)。這提示出骨膜素基因的表達(dá)不僅與心衰竭的病狀相關(guān)，還與癌癥病狀相關(guān)，但各 剪切變體在癌癥病狀的進(jìn)行中的功能還不清楚。此外，據(jù)報(bào)道，作為針對(duì)骨膜素的抗體，有抑制由于骨膜素的過(guò)表達(dá)而導(dǎo)致的增 大的間充質(zhì)細(xì)胞的游走的抗骨膜素抗體(非專(zhuān)利文獻(xiàn)29)，該抗體是以小鼠或大鼠的骨膜 素蛋白質(zhì)的N末端123 141的氨基酸序列(KLREEIEGKGSYTYFAPSN)作為抗原的多克隆 抗體。此外，還報(bào)道了抑制由于骨膜素導(dǎo)致的結(jié)腸直腸癌中的增殖和細(xì)胞分化的抗骨膜 素抗體(非專(zhuān)利文獻(xiàn)30)，該論文中完全沒(méi)有記載關(guān)于骨膜素變體的內(nèi)容，作為抗原使用 的純化的蛋白質(zhì)是哪種變體不清楚，是識(shí)別哪個(gè)部位的抗體也不清楚。專(zhuān)利文獻(xiàn)1 特開(kāi) 平5-268982號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)2 國(guó)際公開(kāi)W02005/019471號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)3 再公開(kāi)專(zhuān) 利 W002/020055 號(hào)公報(bào)非專(zhuān)利文獻(xiàn) 1 =Folkman J. Se 分鐘.Cancer Biol，3，65-71 (1992) 非專(zhuān)利文獻(xiàn) 2 :Hanahan D. et al. Cell，86，353-364 (1996)非專(zhuān)利文獻(xiàn) 3 :Liotta LA. et al. Cell,64,327-336(1991)非專(zhuān)利文獻(xiàn) 4 :Liotta LA. et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 83,3302-3306(1986)非專(zhuān)利文獻(xiàn) 5 :Takeshita S. et al.，Biochem J (1993) 294，271-8 非專(zhuān)利文獻(xiàn) 6 =Horiuchi K. et al.，J. Bone 分鐘 er. Res. (1999) 14，1239-49 非專(zhuān)利文 獻(xiàn) 7 :Katsuragi N. et al.，Circulation (2004) 110，1806-13 非專(zhuān)利文獻(xiàn) 8 :Wang D. et al.，Hypertension (2003) 42，88-95 非專(zhuān)利文獻(xiàn) 9 =Peters DG. et al.，Stroke (2001) 32， 1036-42 非專(zhuān)利文獻(xiàn) 10 :Shao R. et al.，Mol Cell Biol. (2004) 24，3992-4003 非專(zhuān)利文獻(xiàn) 11 :Gonzalez HE. et al. , Arch Otolaryngol HeadNeck Surg. (2003) 129，754-9 非 專(zhuān)利文獻(xiàn) 12 =Sasaki H. et al.，Breast Cancer ResTreat. (2003) 77，245—52 非專(zhuān)利 文獻(xiàn) 13:Sasaki H. et al.，Am J Obstet Gynecol. (2002) 186，103-8 非專(zhuān)利文獻(xiàn) 14 Litvin J. et al.，J Cell Biochem. (2004)92，1044-61 非專(zhuān)利文獻(xiàn) 15 =Gillan L. et al. , Cancer Res. (2002) 62，5358-64 非專(zhuān)利文獻(xiàn) 16 :Erkan Μ. et al. Gastroenterology, 132(4)，1447-64(2007)非專(zhuān)利文獻(xiàn) 17 :Siriwardena BS. et al. Br J Cancer, 95 (10), 1396-403(2006)非專(zhuān)利文獻(xiàn) 18 =Baril P. et al. Oncogene，26 (14)，2082-94 (2007)非 專(zhuān)利文獻(xiàn) 19 :Grigoriadis A. et al. Breast Cancer Res, 8 (5), R56 (2006)非專(zhuān)利文 獻(xiàn) 20 =Kudo Y. et al. Cancer Res, 66 (14), 6928-35 (2006)非專(zhuān)利文獻(xiàn) 21 :Bao S. et al. Cancer Cell. 5 (4)，329—39 (2004)非專(zhuān)禾Ij 文獻(xiàn) 22 :Sasaki H. et al. Cancer Lett., 72(1)，37-42 (2001)非專(zhuān)利文獻(xiàn) 23 :Sasaki H. et al. Cancer, 92 (4), 843-8 (2001)非專(zhuān) 利文獻(xiàn) 24:Thiery JP. et al. Nat Med. 10 (8)，777-8 (2004)非專(zhuān)利文獻(xiàn) 25:Yang J, et al. Cell. 117(7)，927-39 (2004)非專(zhuān)利文獻(xiàn) 26 =Oshima A, et al. J Cell Biochem, 86 (4), 792-804 (2002)非專(zhuān)利文獻(xiàn) 27 :Yan W. et al. J. Biol. Chem.，281 (28)，19700-8 (2006)非專(zhuān) 利文獻(xiàn) 28 :Kim CJ, et al. Int J Cancer，117 (1)，51-8 (2005)非專(zhuān)利文獻(xiàn) 29 =Lindner V. et al. , Arterioscler Thromb VascBiol. (2005) 25，77-83 非專(zhuān)利文獻(xiàn) 30 :Tai IT. et al.， Carcinogenesis(2005)26，908-1
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問(wèn)題本發(fā)明的目的在于提供可以改善生活質(zhì)量和長(zhǎng)期生命預(yù)后的，且與已有機(jī)理不同 的新的癌癥治療劑。此外，本發(fā)明的目的還在于提供癌癥診斷方法和診斷劑。用于解決問(wèn) 題的方法本發(fā)明人弄清楚了不具有細(xì)胞粘附活性的骨膜素剪切變體(PN-I)具有抗細(xì)胞 粘附活性，即剝離粘附的細(xì)胞的活性，此外，另一方面，確認(rèn)了具有細(xì)胞粘附活性的骨膜素 (PN-2)不具有抗細(xì)胞粘附活性，即不剝離粘附的細(xì)胞。而且，也已經(jīng)公開(kāi)了，關(guān)注具有抗細(xì) 胞粘附活性的骨膜素剪切變體(PN-I)和不顯示抗細(xì)胞粘附活性的骨膜素(PN-2)這兩者的 結(jié)構(gòu)和在細(xì)胞粘附中活性的差異，通過(guò)抑制在具有抗細(xì)胞粘附活性的骨膜素剪切變體中特 異存在的區(qū)域，即外顯子-17區(qū)域，可以預(yù)防或治療與具有抗細(xì)胞粘附活性的骨膜素相關(guān) 聯(lián)的疾病(特愿2005-380009)。這里，本發(fā)明人認(rèn)為PN-I蛋白質(zhì)所具有的細(xì)胞的剝離作用即使細(xì)胞游離的作用 與在先前描述的癌轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，癌細(xì)胞從原發(fā)病灶游離相關(guān)，使癌轉(zhuǎn)移被促進(jìn)，并試圖了 解PN-I蛋白質(zhì)與癌癥病狀之間的關(guān)系。骨膜素剪切變體形成的C-末端結(jié)構(gòu)域由外顯子(外顯子)15至23構(gòu)成，在大鼠中 存在下述⑴至⑷。⑴全都有的(稱(chēng)為PN-I ；表示為SEQ ID NO :1，由838個(gè)氨基酸構(gòu) 成；其cDNA序列示為SEQ ID NO :6)、(2)缺失了外顯子-17 (稱(chēng)為PN-2 ；示為SEQ ID NO :5， 由811個(gè)氨基酸構(gòu)成；PN-I中缺失了 SEQ ID NO :3所示的27個(gè)氨基酸(外顯子-17) ；cDNA 序列示為SEQ ID NO 7)、(3)缺失了外顯子-21 (稱(chēng)為PN—3 ；由810個(gè)氨基酸構(gòu)成)、(4)缺失了外顯子-17和外顯子-21 (稱(chēng)為PN-4 ；由783個(gè)氨基酸構(gòu)成)此外，大鼠以外，在小鼠和 人中也發(fā)現(xiàn)了 PN-I 和 PN-2 QjnIlPN-I =SEQ ID NO :8 (氨基酸序列)、SEQ ID N0:9(cDNA 序 列)；小鼠PN-2:SEQ ID NO 10 (氨基酸序列)、SEQ ID NO 11 (cDNA序列)；人PN-I SEQ ID NO :12(cDNA 序列)；人 PN-2:SEQ ID NO 13 (氨基酸序列)、SEQ ID NO 14 (cDNA 序列))。而且，對(duì)癌癥病狀中表達(dá)亢進(jìn)的骨膜素剪切變體進(jìn)行研究，結(jié)果清楚了，具有抑制 細(xì)胞的粘附和使粘附細(xì)胞剝離的功能的PN-I在小鼠黑色素瘤(惡性黑色素瘤)B16-F10細(xì) 胞、或小鼠4T1乳癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移模型小鼠的腫瘤組織中，與正常組織相比，表達(dá)極高，發(fā)現(xiàn) PN-I在癌癥病狀時(shí)表達(dá)極高(后述實(shí)施例12、實(shí)施例13)。此外，在人的多種癌組織(食道癌、肺癌、胸腺癌、胰腺癌、甲狀腺癌、胃癌、小腸 癌、結(jié)腸(大腸)癌、直腸癌、肝癌、膀胱癌、腎癌、乳癌、乳管癌、乳腺癌、子宮癌、子宮頸癌、 卵巢癌、睪丸癌、淋巴瘤、腎上腺癌、前列腺癌、骨肉瘤、惡性黑色素瘤、滑膜瘤、白血病)中 也確認(rèn)了具有外顯子-17區(qū)域的變體的表達(dá)。(后述實(shí)施例16)。因此，本發(fā)明人認(rèn)為，具有抑制細(xì)胞粘附的功能的PN-I和具有使細(xì)胞粘附的功能 的PN-2中，作為二者結(jié)構(gòu)上不同的部位的只存在于PN-I的外顯子-17部位是與細(xì)胞粘附 的抑制相關(guān)的區(qū)域，認(rèn)為通過(guò)抑制該外顯子-17部位，可以抑制這種PN-I的細(xì)胞粘附抑制 功能，而且可以抑制癌癥轉(zhuǎn)移。作為PN-I所具有的外顯子-17部位的抑制物質(zhì)，研究了特 異性識(shí)別由該部位編碼的氨基酸序列構(gòu)成的肽部分的抗體的制備。為了制備抗體，作為免疫原使用的物質(zhì)必須是親水性的，此外，在使用蛋白質(zhì)這樣 的大多肽的一部分制備抗體時(shí)，作為免疫原使用的部分需要出現(xiàn)在該蛋白質(zhì)的表面，構(gòu)成 表位部分。因此，為了探討將外顯子-17肽鏈用作抗原的可能性，最初使用在生物信息學(xué) 領(lǐng)域中廣泛使用的accelrys公司的軟件Mac Vector 7. 2進(jìn)行表位檢索。其結(jié)果是，從 “親水性(Hydrophilicity) ”、“向表面露出的容易性(SurfaceProbability) ”和“抗原性 (Antigenicity)，，來(lái)看，外顯子-17 區(qū)域的 TTKIITKLVEPKIKVIQGSLQPIIKTE (SEQ ID NO 3) 基本上是疏水性區(qū)域，這提示在蛋白質(zhì)分子的表面出現(xiàn)的可能性非常低，因此認(rèn)為其不具 有抗原性，無(wú)法制備抗體，預(yù)計(jì)實(shí)際上難以制備抗體。但是，合成構(gòu)成由外顯子-17區(qū)域編碼的肽的由27個(gè)氨基酸構(gòu)成的肽，使兔免疫， 從獲得的血清中純化IgG級(jí)分，制備抗外顯子-17肽的多克隆抗體，令人驚奇的是，盡管預(yù) 測(cè)為疏水性，沒(méi)有抗原性，卻可以制備針對(duì)由特異性存在于PN-I的外顯子-17編碼的肽區(qū) 域的抗體(以下，稱(chēng)為抗外顯子-17多克隆抗體)(后述實(shí)施例1)。接著，如果在涂布了 PN-I蛋白質(zhì)的平板上加入小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞或小 鼠4T1乳癌細(xì)胞，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的粘附，由此清楚了大鼠PN-I蛋白質(zhì)具有不使細(xì)胞粘附的 作用(即非細(xì)胞粘附作用)(后述實(shí)施例2)。此外，若在培養(yǎng)至80%融合時(shí)的小鼠黑色素 瘤B16-F10細(xì)胞、或小鼠4T1乳癌細(xì)胞中添加PN-I蛋白質(zhì)，則觀察到幾乎100%的細(xì)胞脫離 (即，抗細(xì)胞粘附活性)(后述實(shí)施例3)。向該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中施用抗外顯子-17多克隆抗體， 其結(jié)果是，通過(guò)PN-I蛋白質(zhì)抑制了細(xì)胞的脫離，由此清楚了該抗外顯子-17多克隆抗體是 具有中和PN-I蛋白質(zhì)的活性的抗體(后述實(shí)施例4)。此外，在小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì) 胞、或小鼠4T1細(xì)胞中添加抗外顯子-17多克隆抗體，結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖抑制，由此清楚了 該抗外顯子-17多克隆抗體兼有抑制小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞或小鼠4T1乳癌細(xì)胞的增 殖的效果。(后述實(shí)施例5)接著，在腳踝注射小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞或小鼠4T1乳癌細(xì)胞，發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的模型小鼠中一周一次連續(xù)施用抗外顯子-17多克隆抗體，結(jié)果，在模型 制作后的3-5周間，顯著抑制了原發(fā)病灶的增殖和由原發(fā)病灶向肺的轉(zhuǎn)移率·轉(zhuǎn)移集落數(shù) (后述實(shí)施例14、實(shí)施例15)。而且，在小鼠4T1乳癌細(xì)胞中，顯著抑制了從原發(fā)病灶的乳 癌細(xì)胞的骨浸潤(rùn)和癌癥骨浸潤(rùn)導(dǎo)致的骨破壞(后述實(shí)施例15)。由此清楚了，抗外顯子-17 多克隆抗體是具有抑制在癌癥病狀進(jìn)行的同時(shí)發(fā)生的原發(fā)病灶的增殖的活性、抑制骨浸潤(rùn) 的活性和抑制癌癥骨浸潤(rùn)導(dǎo)致的骨破壞的活性以及抑制由原發(fā)病灶向肺的轉(zhuǎn)移的活性的 抗體。由此表明，針對(duì)PN-I的中和抗體作為抑制PN-I所具有的粘附抑制作用，抑制惡性黑 色素瘤或乳癌細(xì)胞的增殖和肺轉(zhuǎn)移以及抑制乳癌細(xì)胞的骨浸潤(rùn)、骨破壞的新型治療藥是有 用的。根據(jù)上述認(rèn)識(shí)，清楚了在癌癥病狀中，PN-I具有引起原發(fā)病灶增殖和從原發(fā)病灶的 轉(zhuǎn)移的功能，發(fā)現(xiàn)通過(guò)針對(duì)特異存在于PN-I上的外顯子-17編碼的肽區(qū)域的抗體，可以抑 制這些癌癥病狀的進(jìn)行。此外，本發(fā)明人還制備了針對(duì)人骨膜素外顯子-17肽鏈的單克隆抗體(以下，稱(chēng)為 抗外顯子-17單克隆抗體)(后述實(shí)施例6)。而且，在使用小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞肺轉(zhuǎn) 移模型小鼠的實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)施用抗外顯子-17單克隆抗體，顯示出癌增殖抑制和由原發(fā)病 灶向肺的轉(zhuǎn)移率·轉(zhuǎn)移集落數(shù)的抑制作用(后述實(shí)施例14)。根據(jù)這些認(rèn)識(shí)，清楚了在多種癌組織中表達(dá)上升的具有外顯子-17區(qū)域的骨膜素 (PN-I)具有引起原發(fā)病灶的增殖和從原發(fā)病灶的轉(zhuǎn)移的功能，通過(guò)施用針對(duì)特異存在于 PN-I上的外顯子-17編碼的肽區(qū)域的抗體(抗外顯子-17多克隆抗體或者抗外顯子-17單 克隆抗體)，原發(fā)病灶的增殖和由原發(fā)病灶的轉(zhuǎn)移被抑制，可以抑制癌癥病狀的進(jìn)行，從而 完成了本發(fā)明。也就是說(shuō)，本發(fā)明提供含有針對(duì)骨膜素的抗體、尤其是針對(duì)由外顯子-17編碼的 肽區(qū)域的抗體的癌癥治療用藥物組合物。即，本發(fā)明可以列舉以下內(nèi)容。(1)含有針對(duì)由選自于SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 和SEQ ID NO :21中的任意一個(gè)氨基酸序列構(gòu)成的肽的抗體的癌癥治療用藥物組合物。(2) 上述(1)所述的癌癥治療用藥物組合物，前述抗體是與由SEQID NO 26的氨基酸序列構(gòu)成 的部位特異性結(jié)合的抗體。(3)上述(1)或者(2)所述的癌癥治療用藥物組合物，前述抗體 是特異性識(shí)別由SEQ ID NO 34的氨基酸序列構(gòu)成的部位的抗體。(4)上述(1) (3)任 一項(xiàng)所述的癌癥治療用藥物組合物，所述癌癥治療是抑制癌癥轉(zhuǎn)移。(5)上述(1) (3)任 一項(xiàng)所述的癌癥治療用藥物組合物，所述癌癥治療是抑制癌癥原發(fā)病灶的增殖。(6)上述 (1) (3)任一項(xiàng)所述的癌癥治療用藥物組合物，所述癌癥治療是抑制癌癥骨浸潤(rùn)和由于 癌癥骨浸潤(rùn)導(dǎo)致的骨破壞。(7)前述(1) (6)任一項(xiàng)所述的癌癥治療用藥物組合物，前述 癌是食道癌、肺癌、胸腺癌、胰腺癌、甲狀腺癌、胃癌、小腸癌、結(jié)腸(大腸)癌、直腸癌、肝癌、 膀胱癌、腎癌、乳癌、乳管癌、乳腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巢癌、睪丸癌、淋巴瘤、腎上腺癌、 前列腺癌、骨肉瘤、惡性黑色素瘤、滑膜瘤、白血病。(8)上述(1) (6)任一項(xiàng)所述的癌癥 治療用藥物組合物，前述癌是惡性黑色素瘤或者乳癌。(9)癌癥診斷方法，其包括使用針對(duì) 由選自于SEQ ID NO :3、SEQID NO :4和SEQ ID NO 21中的任意一個(gè)氨基酸序列構(gòu)成的肽 的抗體，測(cè)定生物體試樣中的具有由外顯子-17編碼的肽區(qū)域的骨膜素量的工序。(10)癌 癥診斷劑，其含有針對(duì)由選自于SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4和SEQ ID NO 21中的任意一 個(gè)氨基酸序列構(gòu)成的肽的抗體。(11)癌癥診斷方法，其包括通過(guò)由SEQ ID N0:35的核苷酸和SEQ ID NO :36的核苷酸構(gòu)成的PCR引物，測(cè)定生物體試樣中的具有由外顯子-17編碼的 肽區(qū)域的骨膜素量的工序。(12)癌癥診斷劑，其包括由SEQ ID NO :35的核苷酸和SEQ ID NO 36的核苷酸構(gòu)成的PCR引物。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明 圖1是表示小鼠的骨膜素的剪切變體的模式圖。圖2A是表示測(cè)定大鼠PN-I蛋白 質(zhì)對(duì)小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞的非細(xì)胞粘附作用的結(jié)果的圖(實(shí)施例2)。圖2B是表示 測(cè)定大鼠PN-I蛋白質(zhì)對(duì)小鼠4T1乳癌細(xì)胞的非細(xì)胞粘附作用的結(jié)果的圖(實(shí)施例2)。圖 3A是表示測(cè)定大鼠PN-I蛋白質(zhì)對(duì)小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞的抗細(xì)胞粘附作用的結(jié)果的 圖(實(shí)施例3)。圖3B是表示測(cè)定大鼠PN-I蛋白質(zhì)的小鼠4T1乳癌細(xì)胞的抗細(xì)胞粘附作用 的結(jié)果的圖(實(shí)施例3)。圖4A是表示對(duì)小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞就抗大鼠外顯子-17 多克隆抗體具有的大鼠PN-I蛋白質(zhì)的活性抑制進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果的圖(實(shí)施例4)。圖4B是 表示對(duì)小鼠4T1乳癌細(xì)胞就抗大鼠外顯子-17多克隆抗體具有的大鼠PN-I蛋白質(zhì)的活性 抑制進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果的圖(實(shí)施例4)。圖5A是表示就抗大鼠外顯子-17多克隆抗體對(duì)小 鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果的圖(實(shí)施例5)。圖5B是表示 就抗大鼠外顯子-17多克隆抗體對(duì)小鼠4T1乳癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果的圖 (實(shí)施例5)。圖6A是表示在接種了小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞的原發(fā)病灶和正常組織中 具有由外顯子-17編碼的肽區(qū)域的骨膜素的表達(dá)的圖(實(shí)施例12)。圖6B是表示接種了小 鼠4T1乳癌細(xì)胞的原發(fā)病灶和正常組織中具有由外顯子-17編碼的肽區(qū)域的骨膜素的表達(dá) 的圖(實(shí)施例13)。圖7是表示采用小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移模型小鼠對(duì)抗人外 顯子-17單克隆抗體(No. 1和No. 3)的效果進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果的圖(實(shí)施例14)。圖8是表 示使用小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移模型小鼠對(duì)抗大鼠外顯子-17多克隆抗體的效果 進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果的圖(實(shí)施例14 原發(fā)病灶的增加率、肺轉(zhuǎn)移率、轉(zhuǎn)移集落數(shù))。圖9是表 示使用小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移模型小鼠對(duì)抗人外顯子-17單克隆抗體(No. 3) 的效果進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果的圖(實(shí)施例14 原發(fā)病灶的增加率、肺轉(zhuǎn)移率、轉(zhuǎn)移集落數(shù))。圖 10是表示采用小鼠4T1乳癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移模型小鼠對(duì)抗大鼠外顯子-17多克隆抗體的效果進(jìn) 行測(cè)定的結(jié)果的圖(實(shí)施例15:體重變化)。圖11是表示采用小鼠4T1乳癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移模 型小鼠對(duì)抗大鼠外顯子-17多克隆抗體的效果進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果的圖(實(shí)施例15 原發(fā)病灶 中腫瘤體積的變化)。圖12是表示采用小鼠4T1乳癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移模型小鼠對(duì)抗大鼠外顯 子-17多克隆抗體的效果進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果的圖(實(shí)施例15 骨浸潤(rùn)導(dǎo)致的骨破壞中骨面積 比較)。圖13是表示采用小鼠4T1乳癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移模型小鼠對(duì)抗大鼠外顯子-17多克隆 抗體的效果進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果的圖(實(shí)施例15 骨浸潤(rùn)導(dǎo)致的骨破壞中破骨細(xì)胞數(shù)的比較)。 圖14是表示采用小鼠4T1乳癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移模型小鼠對(duì)抗大鼠外顯子-17多克隆抗體的效 果進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果的圖(實(shí)施例15:小鼠4T1乳癌細(xì)胞接種后、3周內(nèi)的轉(zhuǎn)移集落數(shù))。圖 15是表示在從ATCC和ECACC購(gòu)買(mǎi)的人癌細(xì)胞株中確認(rèn)了具有外顯子_17區(qū)域的變體的表 達(dá)的圖。圖16是表示在從Ambion公司購(gòu)買(mǎi)的人癌細(xì)胞株總RNA中確認(rèn)了具有外顯子-17 區(qū)域的變體的表達(dá)的圖。圖17是表示在從Ambion公司購(gòu)買(mǎi)的人癌組織來(lái)源的總RNA中確 認(rèn)了具有外顯子-17區(qū)域的變體的表達(dá)的圖。圖18是表示在從Biochain公司購(gòu)買(mǎi)的人 癌組織來(lái)源的總RNA中確認(rèn)了具有外顯子-17區(qū)域的變體的表達(dá)的圖。圖19是表示在從CL0NTECH公司和COSMO BIO公司購(gòu)買(mǎi)的人正常組織來(lái)源的總RNA中確認(rèn)了具有外顯子_17 區(qū)域的變體的表達(dá)的圖。
用于實(shí)施發(fā)明的最佳實(shí)施方式1.癌癥治療用藥物組合物本發(fā)明為癌癥治療用藥物組合物，其含有具有抗細(xì)胞粘 附作用的識(shí)別骨膜素的剪切變體(PN-1蛋白質(zhì))的抗骨膜素抗體。本發(fā)明的藥物組合物可用于治療或者診斷癌癥。本發(fā)明的對(duì)象癌癥，盡管不限 于此，但可以列舉惡性黑色素瘤、乳癌、大腸癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、胃癌、皮膚癌、子宮癌、 卵巢癌、直腸癌、結(jié)腸癌、卵管癌、食道癌、小腸癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、前列腺 癌、膀胱癌、腎癌、胸腺癌、胰腺癌、肝癌、乳管癌、乳腺癌、子宮頸癌、卵巢癌、睪丸癌、淋巴 瘤、骨肉瘤、滑膜瘤和白血病，尤其可以應(yīng)用于惡性黑色素瘤、乳癌、大腸癌或者肺癌等這樣 的轉(zhuǎn)移性高的癌癥。本發(fā)明的藥物組合物具有抑制癌癥原發(fā)病灶的增殖的效果、抑制癌細(xì)胞的骨浸 潤(rùn)、由于癌細(xì)胞的骨浸潤(rùn)導(dǎo)致的骨破壞、和抑制癌癥轉(zhuǎn)移的效果。因此，通過(guò)抑制癌癥原發(fā) 病灶增殖、抑制癌細(xì)胞的骨浸潤(rùn)、癌細(xì)胞的骨浸潤(rùn)導(dǎo)致的骨破壞、或者抑制癌癥轉(zhuǎn)移，可以 進(jìn)行癌癥治療。本發(fā)明的藥物組合物可以使用通常制劑化時(shí)可以使用的載體或賦形劑，其它添加 劑來(lái)制備。本發(fā)明的藥物組合物的有效成分的抗體，優(yōu)選與公知的藥理學(xué)上可容許的載體， 賦形劑，稀釋劑等混合后再作為藥物、尤其是抗體藥物，通過(guò)藥物的一般使用的給藥方法， 例如靜脈內(nèi)給藥、皮下注射、皮內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、或者口服給藥等實(shí)施方式 給藥。本發(fā)明的藥物組合物可以通過(guò)例如將有效成分與生理學(xué)上可允許的載體，香味 劑，賦形劑，穩(wěn)定劑，稀釋劑，乳濁劑，溶液劑，懸浮液，糖漿劑等適當(dāng)混合來(lái)制備，可以作為 錠劑，粉劑，顆粒劑，溶液劑等來(lái)使用。作為可以在錠劑等中混合的添加劑，可以使用例如明 膠等結(jié)合劑，玉米淀粉等潤(rùn)滑劑等，而且也可以用糖衣或醫(yī)溶性或腸溶性物質(zhì)的膜進(jìn)行包 膜。膠囊劑的情況下，前述組合物中還可以再含有液狀載體。作為注射用的無(wú)菌組合物，可 以使用常規(guī)處方來(lái)制備。作為注射用的水性液，可以列舉含有葡萄糖等的等滲溶液等，還可 以與聚乙二醇等適當(dāng)?shù)娜芙廨o助劑等合用。而且還可以配合緩沖劑，穩(wěn)定劑，保存劑，抗氧 化劑，去痛劑等。在口服給藥中，在消化道內(nèi)有效成分容易受到分解時(shí)，還可以作為在消化 道內(nèi)難以受到分解的制劑，例如在脂質(zhì)體中包容活性成分的微膠囊劑進(jìn)行口服給藥。而且， 也可以是使有效成分從直腸，鼻腔內(nèi)，舌下，肺等消化管以外的粘膜被吸收的給藥方法。此 時(shí)，可以以栓劑，滴鼻劑，舌下劑，經(jīng)肺劑等形態(tài)給藥。本發(fā)明的藥物組合物的給藥量，在可以在治療中使用時(shí)，對(duì)于治療有效的給藥量 可以被確定，給藥量根據(jù)給藥對(duì)象的年齡，體重，癥狀的程度和給藥途徑等而不同，根據(jù)各 個(gè)情況來(lái)決定。通常，通過(guò)口服給藥時(shí)，成人每日的給藥量約為0. I-IOOOmg,可以分成1-數(shù) 次給藥。在持續(xù)靜脈給藥中，可以在0. 01 μ g/kg/分鐘-1. 0 μ g/kg/分鐘的范圍內(nèi)給藥，理 想的是在0. 025 μ g/kg/分鐘-0. 1 μ g/kg/分鐘的范圍內(nèi)給藥。2.抗體本發(fā)明中使用的抗 體是針對(duì)特異存在于PN-I蛋白質(zhì)中的區(qū)域的抗體。
本說(shuō)明書(shū)中，作為PN-I蛋白質(zhì)，可以列舉由SEQ ID NO :1 (大鼠骨膜素PN_1、838 個(gè)氨基酸)、SEQ ID N0:2(人骨膜素PN-1、836個(gè)氨基酸N末端的信號(hào)序列比大鼠骨膜素 少2個(gè)氨基酸)、或者SEQ IDN0:8(小鼠骨膜素PN-1)的氨基酸序列構(gòu)成的骨膜素。作為特異存在于PN-I蛋白質(zhì)中的區(qū)域，可以列舉外顯子-17的剪切部位，還可以 列舉由外顯子-17編碼的肽區(qū)域。具體可以列舉，如具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列 的骨膜素的SEQ ID NO 3所示的肽部分(SEQ ID NO 1的第672 698位氨基酸)、具有 SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的骨膜素的SEQ ID NO :4所示的肽部分(SEQ ID NO :2的 第670 696位氨基酸)、或者具有SEQ ID NO :8所示的氨基酸序列的骨膜素的SEQ ID NO 21所示的肽部分(SEQ ID NO 8的第672 698位氨基酸)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，針對(duì)由外顯子-17編碼的肽的抗體，可以列舉與由 外顯子-17編碼的肽的氨基酸序列中N末端起第-1位的酪氨酸到第9位的纈氨酸的氨基 酸序列(SEQ ID NO 26)構(gòu)成的肽特異性結(jié)合的抗體。此外，還優(yōu)選能夠特異性識(shí)別由外顯 子-17編碼的肽的氨基酸序列中N末端的第1位的蘇氨酸到第6位的蘇氨酸的氨基酸序列 (SEQ ID NO 34)構(gòu)成的肽的抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明中使用的抗體是以上述的由外顯子-17編碼的肽區(qū)域 作為抗原制備的單克隆抗體和多克隆抗體。這里，所謂“單克隆抗體”是與前述抗原有反應(yīng) 性的任意的單克隆抗體，“單克隆抗體”還包括通過(guò)對(duì)小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、豚鼠或者兔等哺乳 動(dòng)物免疫前述抗原獲得的天然型抗體，可以使用基因重組技術(shù)制造的嵌合單克隆抗體(嵌 合抗體)和人源化單克隆抗體(人化抗體；CDR移植抗體)，以及可以使用產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn) 基因動(dòng)物等制造的人單克隆抗體(人抗體)。此外，本發(fā)明中可以使用的抗體還包括具有 IgGdgGl, IgG2，IgG3，IgG4)、IgM、IgA、IgD或者IgE等中的任意一種同種型的單克隆抗 體。優(yōu)選是IgG(IgGl，IgG2，IgG3，IgG4)或者IgM。3.抗體的制備本發(fā)明中使用的抗體可 以以化學(xué)合成的由在形成特異于癌癥病狀中等的癌細(xì)胞的剪切變體的C-末端結(jié)構(gòu)域的外 顯子-17區(qū)域編碼的氨基酸序列構(gòu)成的肽作為抗原進(jìn)行制備，涉及的肽可以通過(guò)骨膜素蛋 白質(zhì)的酶消化或基因工程方法等獲得，無(wú)論什么來(lái)源都可以。在使用上述肽作為抗原時(shí)，其自身也可以作為抗原使用，但為了提高抗原性，有使 上述肽吸附于聚乙烯吡咯烷酮，乳劑，聚甲基丙烯酸甲酯等巨大分子物質(zhì)再進(jìn)行免疫的方 法、與KLH(Keyhole LimpetHemocyanin 鑰孔血藍(lán)蛋白)或BSA(牛血清白蛋白)等載體蛋 白結(jié)合再使用的方法等，可以使用任意一種方法。一般優(yōu)選采用肽與載體蛋白結(jié)合再使用 的方法，結(jié)合方法可以使用公知的方法(例如，續(xù)醫(yī)藥品的開(kāi)發(fā)，14卷，廣川書(shū)店，1991)。為 了肽通過(guò)與載體蛋白結(jié)合保持方向性，采用在肽的C末端或N末端上導(dǎo)入半胱氨酸基，通過(guò) 半胱氨酸基使之與載體蛋白結(jié)合的方法。如果是適于此目的的結(jié)合方法，可以使用本領(lǐng)域 中一般使用的交聯(lián)劑。使用琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(以 下簡(jiǎn)稱(chēng)為“SMCC”)或3-馬來(lái)酰亞胺苯甲酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)等。單克隆抗體通 過(guò)培養(yǎng)用Kohler和Milstein的細(xì)胞融合法(G. Kohler等人Nature (1975) 256，495-7)制備 的雜交瘤，使之分泌，從其培養(yǎng)液中分離進(jìn)行制備。即，用具有由外顯子-17編碼的氨基酸 序列的肽等免疫哺乳動(dòng)物后，獲得該動(dòng)物的抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合的雜交瘤。產(chǎn) 生與外顯子-17結(jié)合的抗體的雜交瘤的檢索，通過(guò)例如對(duì)于雜交瘤上清使用固定了抗原的 微板通過(guò)酶免疫測(cè)定法(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“ELISA”)進(jìn)行。作為免疫中使用的動(dòng)物，沒(méi)有特別的限定，可以使用各種哺乳動(dòng)物，例如小鼠，大鼠，豚鼠，兔，綿羊，山羊，貓，狗等。在單克隆抗體 的制備中，在上述免疫動(dòng)物中，根據(jù)容易吸收等理由，一般可以使用Balb/c小鼠，也可以使 用其它系統(tǒng)的小鼠。此時(shí)，免疫中使用的抗原的濃度，以可形成按受足夠量的抗原刺激的淋 巴細(xì)胞的程度進(jìn)行選擇，優(yōu)選用生理鹽水等將I-IOOyg的抗原稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛茸鳛楦?氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑等懸浮液，通過(guò)在動(dòng)物的腹腔內(nèi)注射或皮下注射等實(shí)施方式 給藥。給藥按每2-4周1-數(shù)次進(jìn)行。最終免疫通常通過(guò)靜脈注射或皮下注射等施用添加了 1-100 μ g的抗原的生理食鹽溶液來(lái)進(jìn)行。最終免疫的數(shù)日后從用于細(xì)胞融合的被免疫的動(dòng) 物中取出抗原產(chǎn)生細(xì)胞，例如淋巴細(xì)胞，優(yōu)選脾臟細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞。以下對(duì)于使用脾臟細(xì) 胞作為抗體產(chǎn)生細(xì)胞的情況進(jìn)行說(shuō)明，但脾臟細(xì)胞以外的抗體產(chǎn)生細(xì)胞也同樣可提供給細(xì) 胞融合。細(xì)胞融合，在最終免疫3-4天后，在融合促進(jìn)劑的存在下使從無(wú)菌取出的脾臟制備 的脾臟細(xì)胞和適當(dāng)?shù)墓撬枇黾?xì)胞發(fā)生細(xì)胞融合。融合中使用的骨髓瘤細(xì)胞可以是從哺乳動(dòng) 物中獲得的，一般合適的是來(lái)自于與免疫中使用的動(dòng)物同種的動(dòng)物，可以適當(dāng)使用已知的 各種細(xì)胞株，例如小鼠中，SP2/0-Agl4 (SP2) [Nature, 276，269 (1978) ]、NS_l_Ag4/l (NS-I)、 P3-X63Ag8U. 1 (P3U1) [Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81，1-7(1978)從 ATCC 獲得，ATCC 號(hào) CRL-1597]、P3-NSl-l-Ag4-l、P3_X63Ag8 (P3)、F0、X63Ag8. 653 (X63. 653)、210. RCY3. Agl. 2. 3、S194/5XX0. BUI、SK0-007、GM15006TG-A12 等，大鼠中可適當(dāng)使用 Y3. Agl. 2. 3 等。 作為優(yōu)選的融合促進(jìn)劑，除了例如平均分子量為1000-6000的聚乙二醇(PEG)之外還可以 使用仙臺(tái)病毒。融合時(shí)的脾臟細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的混合比率一般優(yōu)選在10 1-2 1。
從融合的細(xì)胞分離雜交瘤，可以通過(guò)下述實(shí)施方式進(jìn)行在未融合的骨髓瘤細(xì)胞 無(wú)法生存的選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)未融合的脾臟細(xì)胞、未融合的骨髓瘤細(xì)胞和融合的細(xì)胞的混 合物直至未融合的細(xì)胞死亡的適當(dāng)?shù)臅r(shí)間(約1周)。選擇培養(yǎng)基可以使用例如HAT培養(yǎng) 基(含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺啶的培養(yǎng)基)。在該選擇培養(yǎng)基中，由于未融合的骨髓 瘤細(xì)胞死亡且未融合的脾臟細(xì)胞是非腫瘤性細(xì)胞，在一定時(shí)間后(約一周后)死亡，因此 通過(guò)選擇可以生長(zhǎng)的細(xì)胞可以獲得雜交瘤。產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤，通過(guò)常規(guī)的有限稀釋 法，進(jìn)行作為目的的抗體的產(chǎn)生株的檢索和單一克隆化。通過(guò)使這樣獲得的產(chǎn)生單克隆抗 體的雜交瘤可以在適于生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而且可以在超低溫冷庫(kù)或液氮等中容易地長(zhǎng) 期保存。通過(guò)使這樣獲得的雜交瘤在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中或哺乳動(dòng)物的腹腔中增殖可以使之產(chǎn)生 抗體，產(chǎn)生的抗體可以從培養(yǎng)上清或該哺乳動(dòng)物的腹水或血清中純化。作為本發(fā)明的雜交 瘤，可以使用例如2006年18年11月1日保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專(zhuān)利生 物保藏中心，保藏號(hào)為FERM BP-10718的雜交瘤?？贵w的純化可以使用離心分離，透析，硫 酸銨等進(jìn)行的鹽析，DEAE株等進(jìn)行的離子交換色譜，凝膠過(guò)濾，親合層析等一般的分離，純 化方法進(jìn)行。就這樣獲得的單克隆抗體的同種型或亞類(lèi)的確定可以按如下實(shí)施方式進(jìn)行。 首先，作為鑒定法，可以列舉奧克特洛尼(Ouchterlony)法，ELISA法或RIA法。奧克特洛 尼法簡(jiǎn)便，但單克隆抗體濃度低時(shí)需要濃縮操作。另一方面，使用ELISA法或RIA法時(shí)，使 培養(yǎng)上清直接與抗原吸附固相反應(yīng)，再通過(guò)使用對(duì)應(yīng)各種免疫球蛋白同種型、亞類(lèi)的抗體 作為第二抗體，可以鑒定單克隆抗體的同種型、亞類(lèi)。而且，作為更為簡(jiǎn)便的方法，還可以使 用市售的鑒定用試劑盒(例如，小鼠分型試劑盒；Bio-Rad公司社制)等。進(jìn)而，可以通過(guò) Folin-Lowry法和根據(jù)在280nm處的吸光度[1.4(0D280)=免疫球蛋白lmg/ml]計(jì)算的方 法進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量。這樣獲得的本發(fā)明的單克隆抗體，特異性識(shí)別由SEQ ID NO=U SEQID NO :2或者SEQ ID NO :8所示的氨基酸序列構(gòu)成的骨膜素(PN-1蛋白質(zhì))、由SEQ ID NO: 3,SEQ ID NO :4或者SEQ ID NO :21所示的氨基酸序列構(gòu)成的外顯子-17編碼的肽。優(yōu)選， 本發(fā)明的單克隆抗體可以特異性識(shí)別并結(jié)合由氨基酸序列YTTKIITKVV(SEQ IDNO 26)構(gòu) 成的肽，即由人骨膜素外顯子-17肽鏈的氨基酸序列(SEQ IDNO 4)中N末端的第-1位的 酪氨酸至第9位的纈氨酸的氨基酸序列構(gòu)成的肽，和由人骨膜素PN-I的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)中N末端的第669位的酪氨酸至第679位的纈氨酸的氨基酸序列構(gòu)成的肽。艮口， 可以特異性識(shí)別人骨膜素外顯子-17肽鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO 4)中N末端的蘇氨酸 至第9位的纈氨酸的氨基酸序列部位(TTKIITKVV ;SEQ ID NO 22)或其一部分。更優(yōu)選的 是，本發(fā)明的單克隆抗體可以特異性識(shí)別結(jié)合人骨膜素外顯子-17肽鏈(SEQ ID NO 4)的 N末端第-1位的酪氨酸至第9位的纈氨酸的氨基酸序列(YTTKIITKVV ；SEQ IDNO 26)構(gòu)成 的肽中，從N末端起第1位和第8-10位的氨基酸被丙氨酸取代的肽。即，可以特異性識(shí)別 人骨膜素外顯子-17肽鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO 4)或大鼠骨膜素外顯子_17肽鏈的氨 基酸序列(SEQ IDNO 3)的至少?gòu)腘末端起第1位的蘇氨酸至第6位的蘇氨酸的氨基酸序 列部位(SEQ ID NO 34)或其一部分。而且，本發(fā)明中使用的單克隆抗體具有阻礙或抑制 PN-I蛋白質(zhì)的癌細(xì)胞的粘附抑制作用和粘附細(xì)胞剝離作用，即具有中和PN-I蛋白質(zhì)的癌 細(xì)胞的粘附抑制作用和粘附細(xì)胞剝離作用的活性。而且，還具有癌癥原發(fā)病灶的增殖抑制 活性、癌細(xì)胞的骨浸潤(rùn)抑制活性、癌細(xì)胞的骨浸潤(rùn)導(dǎo)致的骨破壞的抑制活性、和癌細(xì)胞的轉(zhuǎn) 移抑制活性。 使用多克隆抗體作為抗體時(shí)，多克隆抗體可以通過(guò)通常進(jìn)行的方法，例如“日本生 物化學(xué)會(huì)編，新生化學(xué)實(shí)驗(yàn)講座12，東京化學(xué)同人，1992”中記載的方法獲得。作為免疫動(dòng) 物，沒(méi)有特別的限定，可以列舉馬，山羊，羊，兔，豚鼠，小鼠，家禽等。使用兔子作為免疫動(dòng)物 時(shí)，用生理鹽水等將抗原稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛?，形成弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑或氫氧?鋁佐劑等的懸浮液，注射10-1000 μ g/次/只，在2-4周后進(jìn)行1-3次追加免疫注射，獲得 抗血清。注射優(yōu)選在多處皮下進(jìn)行。由抗血清制備多克隆抗體，可以通過(guò)與上述單克隆抗 體的純化相同的方法進(jìn)行。這樣獲得的本發(fā)明的多克隆抗體，特異性識(shí)別由SEQ ID NO=U SEQ ID NO 2或者SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列構(gòu)成的骨膜素(PN-1蛋白質(zhì))、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4或者SEQ ID NO :21所示的氨基酸序列構(gòu)成的外顯子-17編碼的肽。優(yōu) 選地，本發(fā)明的多克隆抗體可以特異性識(shí)別并結(jié)合由氨基酸序列YTTKIITKVV (SEQ ID NO 26)構(gòu)成的肽，即人骨膜素外顯子-17肽鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO 4)中N末端的第-1 位的酪氨酸至第9位的纈氨酸的氨基酸序列構(gòu)成的肽，和人骨膜素PN-I的氨基酸序列(SEQ IDNO 2)中從N末端起的第669位的酪氨酸至第679位的纈氨酸的氨基酸序列構(gòu)成的肽。 即，可以特異性識(shí)別人骨膜素外顯子-17肽鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO 4)中N末端的蘇 氨酸至第9位的纈氨酸的氨基酸序列部位(TTKIITKVV ；SEQ ID NO 22)或其一部分。更優(yōu) 選地，本發(fā)明中使用的多克隆抗體可以識(shí)別并結(jié)合由人骨膜素外顯子-17肽鏈(SEQ ID NO 4)的N末端起第-1位的酪氨酸至第9位的纈氨酸的氨基酸序列(YTTKIITKVV SEQ ID NO 26)構(gòu)成的肽中從N末端起第1位和第8-10位的氨基酸被丙氨酸取代的肽。S卩，可以特異 性識(shí)別人骨膜素外顯子-17肽鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO 4)或大鼠骨膜素外顯子_17肽 鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO 3)的至少N末端起第1位的蘇氨酸至第6位的蘇氨酸的氨基 酸序列部位(SEQ ID NO 34)或其一部分。而且，本發(fā)明中使用的多克隆抗體具有抑制或阻礙PN-I蛋白質(zhì)的癌細(xì)胞的粘附抑制作用和粘附細(xì)胞剝離作用，即具有中和PN-I蛋白質(zhì)的 癌細(xì)胞的粘附抑制作用和粘附細(xì)胞剝離作用的活性。而且，還具有癌癥原發(fā)病灶的增殖抑 制活性、癌細(xì)胞的骨浸潤(rùn)抑制活性、癌細(xì)胞的骨浸潤(rùn)導(dǎo)致的骨破壞的抑制活性、和癌細(xì)胞的 轉(zhuǎn)移抑制活性。4.人源化抗體的制備免疫球蛋白G(以下單獨(dú)稱(chēng)為“IgG”)由分子量為約 23000的輕多肽鏈(以下稱(chēng)為“輕鏈”)，分子量約為50000的重多肽鏈(以下稱(chēng)為“重鏈”) 兩條鏈構(gòu)成。重鏈，輕鏈均由約110個(gè)殘基構(gòu)成，具有氨基酸序列保守的區(qū)域重復(fù)的結(jié)構(gòu)， 它們構(gòu)成IgG的三維結(jié)構(gòu)的基本單位(以下稱(chēng)為“結(jié)構(gòu)域”)。重鏈和輕鏈各由連續(xù)的4個(gè) 區(qū)域以及2個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。在重鏈、輕鏈中，氨基末端的結(jié)構(gòu)域與其它結(jié)構(gòu)域相比，各抗體 分子間的氨基酸序列的變異大，該結(jié)構(gòu)域稱(chēng)為可變結(jié)構(gòu)域(variabledomain 以下稱(chēng)為“V 結(jié)構(gòu)域”)。IgG的氨基末端上，重鏈、輕鏈的V區(qū)域互補(bǔ)性會(huì)合形成可變區(qū)域。與之相對(duì)， 其余的結(jié)構(gòu)域整體形成恒定區(qū)域。恒定區(qū)域具有各動(dòng)物種類(lèi)中的特征序列，例如由于小鼠 IgG的恒定區(qū)域與人IgG的恒定區(qū)域不同，小鼠IgG被人的免疫系統(tǒng)識(shí)別為異物，其結(jié)果是， 引起人抗小鼠抗體(Human Anti Mouse Antibody 以下稱(chēng)為“HAMA”。)應(yīng)答(Schroff Rff 等人CancerRes. (1985) 45，879_85)。因此，小鼠抗體無(wú)法對(duì)人反復(fù)給藥。為了對(duì)人施用這 種抗體，需要修飾抗體分子使得其保持抗體的特異性而不引起HAMA應(yīng)答。根據(jù)X射線(xiàn)晶體 結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果，一般而言，這種結(jié)構(gòu)域形成由3至5條β鏈構(gòu)成的逆平行β片合在一起 形成兩層重疊的長(zhǎng)圓筒狀結(jié)構(gòu)。在可變區(qū)域中，重鏈，輕鏈的V結(jié)構(gòu)域各集合有各3個(gè)環(huán)， 形成抗原結(jié)合部位。各環(huán)稱(chēng)為互補(bǔ)性決定區(qū)域(complementaritydeter分鐘ing region 以下，稱(chēng)之為“CDR”。)，氨基酸序列的差異最為顯著?？勺儏^(qū)域的CDR以外的部分一般具有 保持⑶R結(jié)構(gòu)的作用，稱(chēng)為構(gòu)架(framework)。Kabatt等人收集了多個(gè)重鏈，輕鏈的可變區(qū) 域的一級(jí)序列，基于序列的保守性，將這些一級(jí)序列分類(lèi)為CDR和構(gòu)架，并制成表(Kabatt 等人 SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST，第 5 版，NIH 出版，No. 91-3242，Ε· A.)。而 且，各構(gòu)架被分類(lèi)為氨基酸序列具有共同的特征的多個(gè)亞類(lèi)。進(jìn)而，發(fā)現(xiàn)人和小鼠之間存在 對(duì)應(yīng)的構(gòu)架。根據(jù)關(guān)于這種I gG結(jié)構(gòu)特征的研究，提議了以下的人源化抗體的制備法。在 研究初期的階段，提議了小鼠來(lái)源的抗體的可變區(qū)域與人來(lái)源的恒定區(qū)域接合的嵌合抗體 (Morrison SL. et al ProcNatl Acad Sci USA. (1984) 81，6851-5)。但是，這種嵌合抗體 依然存在的問(wèn)題是，由于含有多個(gè)非人氨基酸殘基，因此尤其在長(zhǎng)期給藥時(shí)會(huì)誘導(dǎo)HAMA應(yīng) 答(Begent et al.，Br. J. Cancer, (1990)62,487)。 作為使存在對(duì)人表達(dá)HAMA應(yīng)答的可能性的非人哺乳動(dòng)物來(lái)源的氨基酸殘基變得 更少的方法，提議了僅向人來(lái)源的抗體中整合⑶R部分的方法(Peter T et al. Nature, (1986)321,522-5)，但是一般而言，只移植CDR不足以保持對(duì)于抗原的免疫球蛋白活性。另 一方面，Chothia等人在1987年使用X射線(xiàn)結(jié)晶結(jié)構(gòu)分析數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)(a)OTR氨基酸序列中 存在直接與抗原結(jié)合的部位和維持CDR自身結(jié)構(gòu)的部位，CDR所取得的三維結(jié)構(gòu)被分類(lèi)為 多種典型的模式(典型結(jié)構(gòu))，(b)典型結(jié)構(gòu)的類(lèi)型，由CDR和構(gòu)架部分的特定位置的氨基 酸種類(lèi)決定(Chothia C等人，J. Mol. Biol. (1987) 196，901-17)。基于這種認(rèn)識(shí)，提示使用 CDR移植法時(shí)，除了 CDR序列之外還需要在人抗體上移植一部分構(gòu)架的氨基酸殘基(特表 平4-502408號(hào))。一般，要移植的具有CDR的非人哺乳動(dòng)物來(lái)源的抗體被定義為“供體”， 移植CDR側(cè)的人抗體被定義為“受體”，在實(shí)施CDR移植法時(shí)應(yīng)當(dāng)考慮的方面在于盡可能保 持CDR結(jié)構(gòu)，保持免疫球蛋白分子的活性。為了達(dá)到這個(gè)目的，需要留意兩點(diǎn)(a)受體應(yīng)當(dāng)選擇屬于任意亞群的生物，以及(b)應(yīng)當(dāng)從供體的構(gòu)架中選擇任意氨基酸殘基。Wl=Queen等人建議了供體的構(gòu)架的氨基酸殘基當(dāng)符合以下標(biāo)準(zhǔn)的至少一種時(shí)， 其與CDR序列一起移植到受體中的設(shè)計(jì)的方法(特表平4-502408號(hào))可以預(yù)料(a)受體 的構(gòu)架區(qū)域中的氨基酸在其位置上稀有，供體對(duì)應(yīng)的氨基酸在受體的前述位置上普通(b) 該氨基酸為很接近于CDR的一個(gè)氨基酸(c)該氨基酸在三維免疫球蛋白模型中CDR的約 3人以?xún)?nèi)具有側(cè)鏈原子，而且可以與抗原或人源化抗體的CDR相互作用。編碼本發(fā)明的抗外顯子-17單克隆抗體的重鏈或輕鏈的DNA可以通過(guò)下述實(shí)施 方式獲得從產(chǎn)生上述抗外顯子-17單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞中制備mRNA，用逆轉(zhuǎn)錄酶將 該mRNA轉(zhuǎn)換為cDNA，再分別分離編碼該抗體的重鏈或輕鏈的DNA。5.人抗體的制備本發(fā) 明中使用的所謂“人抗體”或“人免疫球蛋白，，是指含有構(gòu)成免疫球蛋白的H鏈的可變區(qū)域 (VH)和H鏈的恒定區(qū)域(CH)以及L鏈的可變區(qū)域(VL)和L鏈的恒定區(qū)域(CL)的所有區(qū) 域均來(lái)源于編碼人免疫球蛋白的基因的免疫球蛋白。換言之，是指H鏈來(lái)源于人免疫球蛋 白重鏈基因，輕鏈來(lái)源于人免疫球蛋白輕鏈基因的抗體。人抗體，可以按照常規(guī)方法，例如， 對(duì)通過(guò)向小鼠等人以外的哺乳動(dòng)物的基因座中整合至少人免疫球蛋白基因制備的轉(zhuǎn)基因 動(dòng)物，用抗原進(jìn)行免疫接種，與前述的單克隆抗體的制備方法同樣進(jìn)行制造。例如，可以按 照已經(jīng)報(bào)道的文獻(xiàn)(Mendez MJ 等人，Nature Genetics (1997) 15，146-56，Green LL 等人， Nature Genetics (1997) 7，13-21，表平 4-504365 號(hào)公報(bào)；國(guó)際公開(kāi) W094/25585 號(hào)公報(bào)；日 經(jīng)科學(xué)，6 月號(hào)，第 40-50 頁(yè)，1995 年；Nils Lonberg 等人，Nature (1994) 368，856-9 和特表 平6-500233號(hào)公報(bào))中記載的方法制備產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠。本發(fā)明中使用的抗體不限于抗體分子整體，只要是抑制具有抗細(xì)胞粘附活性的骨 膜素的該活件的物質(zhì)即可，也可以是抗體的片段或衍牛物。6.抗體片段作為抗體片段，可以 列舉，例如Fab、F(ab‘ )2、Fv、單鏈抗體(scFv)、二硫化物穩(wěn)定化抗體(dsFv)、含有⑶R的 月太等。本發(fā)明的抗體片段中的Fab、F(ab' )2等，可以通過(guò)以下實(shí)施方式進(jìn)行制備用木 瓜蛋白酶、胃蛋白酶等蛋白質(zhì)分解酶處理針對(duì)由PN-I的外顯子-17編碼的肽的抗體而獲 得，而且，構(gòu)建編碼所獲抗體片段的基因，將其導(dǎo)入于表達(dá)載體后，使之在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞 中表達(dá)。本發(fā)明使用的抗體片段中的scFv可以使用適當(dāng)?shù)碾倪B接子連接針對(duì)由PN-I的外 顯子-17編碼的肽的抗體的H鏈V區(qū)域和L鏈V區(qū)域進(jìn)行制備。而且，可以通過(guò)構(gòu)建編碼 上述抗體的H鏈或H鏈V區(qū)域的基因，和編碼L鏈或L鏈V區(qū)域的基因的所有序列或編碼 所希望的氨基酸序列的DNA部分，將其導(dǎo)入于表達(dá)載體后，使之在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá) 進(jìn)行制備。本發(fā)明的抗體片段中的dsFv是將針對(duì)由PN-I的外顯子-17編碼的肽的抗體的H 鏈V區(qū)域和L鏈V區(qū)域的各1個(gè)氨基酸殘基被半胱氨酸殘基取代的多肽通過(guò)在該半胱氨酸 殘基之間通過(guò)二硫鍵結(jié)合的抗體片段，取代為半胱氨酸殘基的氨基酸殘基可以通過(guò)抗體的 立體結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)進(jìn)行選擇?？梢酝ㄟ^(guò)構(gòu)建編碼該抗體的基因的全序列或編碼所希望的氨基酸 序列的DNA部分，將其導(dǎo)入表達(dá)載體后，使之在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)來(lái)制備。本發(fā)明的抗體片段中含有CDR的肽由抑制骨膜素的抗細(xì)胞粘附活性的抗體的H鏈 或L鏈的⑶R區(qū)域中至少含有一個(gè)以上的⑶R區(qū)域而構(gòu)成。而且，也可以通過(guò)適當(dāng)?shù)碾倪B接子等方法使多個(gè)CDR區(qū)域結(jié)合。含有該CDR的肽可以通過(guò)構(gòu)建編碼其的基因的全序列 或編碼所希望的氨基酸序列的DNA部分，將其導(dǎo)入表達(dá)載體后，使之在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中 表達(dá)來(lái)制備。而且，還可以通過(guò)Fmoc法或tBoc法等化學(xué)合成來(lái)制備。7.診斷劑本發(fā)明還 提供了通過(guò)用標(biāo)記物標(biāo)識(shí)上述抗體制備的癌癥診斷劑。其中，作為標(biāo)記，可以使用酶，放射 性同位素，熒光色素等。作為其中使用的酶，如果是滿(mǎn)足周轉(zhuǎn)數(shù)(turn over number)大且 即使與酶結(jié)合也穩(wěn)定，可以特異性與底物反應(yīng)使之發(fā)色等條件，則沒(méi)有特別的限制，可以使 用通常可以在酶免疫測(cè)試(EIA)中使用的酶。作為優(yōu)選的酶的例子，可以使用過(guò)氧化物酶， β -半乳糖苷酶，堿性磷酸酶，葡糖氧化酶，膽堿酯酶，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，蘋(píng)果酸脫氫 酶等。而且，還可以使用酶抑制物質(zhì)或輔酶等。這些酶與抗體的結(jié)合可以通過(guò)采用馬來(lái)酰亞胺混合物等交聯(lián)劑的公知方法進(jìn)行。 作為底物，可以采用與使用的酶所對(duì)應(yīng)的公知物質(zhì)。例如，使用過(guò)氧化物酶作為酶時(shí)，可以 使用3，3' ,5,5'-四甲基苯胺，且在使用堿性磷酸酶作為酶時(shí)，可以使用對(duì)硝基苯酚等。 作為標(biāo)記物使用的放射線(xiàn)同位素，可以使用1251和3Η等通常在放射性免疫檢測(cè)(RIA)中 使用的放射線(xiàn)同位素。作為熒光色素，可以使用異硫氰酸熒光素(FITC)和四甲基若丹明 異硫氰酸鹽(TRITC)等通?？梢栽跓晒饪贵w法中使用的熒光色素。而且，本診斷劑可以特 異性染色癌組織間質(zhì)，可以作為免疫組織學(xué)的染色使用。而且，標(biāo)識(shí)放射性同位素時(shí)，通過(guò) 體內(nèi)施用，還可以用于使癌癥病狀時(shí)的病變部位圖像化。8.診斷方法本發(fā)明還是一種通 過(guò)使用本發(fā)明的抗體測(cè)定生物體試樣，例如從人或動(dòng)物的血液中制備的血清中具有由外顯 子-17編碼的肽區(qū)域的骨膜素量的癌癥診斷方法。本發(fā)明中，通過(guò)所謂三明治ELISA法 (Enzyme-linked immunosorbent assay 酶聯(lián)免疫測(cè)定法)可以檢測(cè)具有由外顯子-17編 碼的肽區(qū)域的骨膜素。在使用本發(fā)明的診斷試劑盒時(shí)，首先使試樣與固定了抗一級(jí)抗體的 平板相接觸，使二者結(jié)合，使經(jīng)標(biāo)記物標(biāo)識(shí)的二級(jí)抗體與該結(jié)合體結(jié)合，通過(guò)測(cè)定這三者的 結(jié)合體中標(biāo)記物的信號(hào)強(qiáng)度，可以檢測(cè)或定量具有由外顯子-17編碼的肽區(qū)域的骨膜素。 尤其是具有由外顯子-17編碼的肽區(qū)域的骨膜素由于在癌等病狀時(shí)高表達(dá)，且是與原發(fā)病 灶的增殖和癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)的剪切變體，因此通過(guò)監(jiān)控其產(chǎn)生，可以診斷癌癥等中的病狀。這樣，通過(guò)標(biāo)識(shí)本發(fā)明的抗體，其可以作為二級(jí)抗體使用。本發(fā)明還是一種通過(guò)使用特異于外顯子-17區(qū)域的引物(有義鏈5' -TAAAATTAT MCCAAAGTTGTGGAACC-3 ‘ (SEQ ID NO :35)和反義鏈5, -AGTGTGGGTCCTTCAGTTTTGAT-3 ‘( SEQ ID NO :36))，測(cè)定生物體試樣、如從人或動(dòng)物的組織中制備的RNA中的具有外顯子-17 區(qū)域的骨膜素量的癌癥診斷方法。本方法中，可以通過(guò)采用所謂RT-PCR或SYBR(注冊(cè)商 標(biāo))Green I的PCR來(lái)檢測(cè)和定量具有外顯子-17區(qū)域的骨膜素的有無(wú)。尤其是，由于具有 外顯子-17區(qū)域的骨膜素在癌癥病狀時(shí)高表達(dá)，是與原發(fā)病灶的增殖和癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)的剪 切變體，因此通過(guò)監(jiān)控其產(chǎn)生，可以診斷癌癥等中的病狀。以下，采用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)而具體的說(shuō)明?！磳?shí)施例〉「制造例11通過(guò)減 除法進(jìn)行的骨膜素的檢索1-1心衰竭病狀模型大鼠的制備和左心室試樣的提取從6周齡時(shí) 開(kāi)始用含有8%的食鹽的高含鹽食品飼養(yǎng)雄性Dahl食鹽感受性大鼠(Dahl-S)(清水實(shí)驗(yàn)材 料)，心臟肥大期(11周)和心衰竭期(14周)時(shí)各摘取三只的左心室。l-2mRNA的制備使用ISOGEN(Nippon gene公司)按照說(shuō)明書(shū)中記載的方法從約 500mg上述左心室中制備總RNA。接著，用Fast Track 2· 0試劑盒(Invitrogen公司)從混合了心臟肥大期，心衰竭期的各3只量的總RNA約400 μ g中，按照說(shuō)明書(shū)記載的方法純 化mRNA，分別回收了約3 μ g的mRNA。l-3cDNA 減除 cDNA 減除，用 PCR-Select cDNA 減除試劑盒(Clontech 公司)， 按照說(shuō)明書(shū)記載的方法進(jìn)行。即，由上述1-2獲得的mRNA各2μ g合成cDNA，用限制性 酶Rsal消化。然后，以從14周齡合成的cDNA作為檢測(cè)cDNA，以從11周齡合成的cDNA 作為驅(qū)動(dòng)cDNA (driver cDNA)，將試劑盒附帶的兩種接頭(adapter)分別連接到檢測(cè) cDNA(testercDNA)上后，進(jìn)行減除雜交。然后，用與接頭互補(bǔ)的引物進(jìn)行PCR，特異性擴(kuò)增 表達(dá)量存在差異的cDNA片段，獲得了擴(kuò)增產(chǎn)物1。而且，以從11周齡合成的cDNA作為檢測(cè)cDNA，以從14周齡合成的cDNA作為驅(qū)動(dòng) cDNA，進(jìn)行同樣的減除，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物稱(chēng)為擴(kuò)增產(chǎn)物2。1-4點(diǎn)印篩選A.點(diǎn)印跡的制備將擴(kuò)增產(chǎn)物ITA克隆到PCR II載體(Invitrogen 公司)中，選擇導(dǎo)入了插入片段的克隆。擴(kuò)增各克隆的插入片段的PCR反應(yīng)后，對(duì)各IyL 進(jìn)行熱處理后，在兩張尼龍膜過(guò)濾膜(Boehringer公司)上點(diǎn)印跡，用UV交聯(lián)劑(Stragene 公司)固定。B. cDNA探針的制備用限制性酶Rsal和Eael，Smal消化擴(kuò)增產(chǎn)物1，除去adapter， 用DIG HighPrime DNA標(biāo)簽/檢測(cè)試劑盒II (Boehringer公司)，按照說(shuō)明書(shū)記載的方法用 DIG-dUTP進(jìn)行隨機(jī)引物標(biāo)識(shí)，制備cDNA探針1。以同樣實(shí)施方式從擴(kuò)增產(chǎn)物2制備cDNA 探針2。C.篩選進(jìn)行cDNA探針1與一張從上述A制備的點(diǎn)印跡膜的雜交，cDNA探針2與另 一張的雜交。具體而言，使用Boehringer公司的DIGHighPrimeDNA標(biāo)簽/檢測(cè)試劑盒II， 按照說(shuō)明書(shū)記載的方法，在DIGEasy Hyb.液中42°C下雜交一晚。在2X SSC，0. 1 % SDS中 于室溫下五分鐘內(nèi)清洗兩次，于0. 1XSSC，0. SDS中于68°C下15分鐘內(nèi)清洗兩次后，在 試劑盒附加的阻斷緩沖液中與堿性磷酸酶標(biāo)識(shí)抗DIG抗體反應(yīng)后，添力CSPD ready-to use 使之進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，使X射線(xiàn)膜曝光。選擇cDNA探針1中的信號(hào)比cDNA探針2中的信號(hào) 強(qiáng)的克隆作為陽(yáng)性克隆，進(jìn)行堿基序列的測(cè)定。1-5堿基序列的測(cè)定使用THERMO Sequenase II染料終止子循環(huán)測(cè)序試劑盒 (Amersham Pharmacia)，用 373A 型自動(dòng) DNA 序列讀取裝置(PE AppliedBiosystems 公司) 分析來(lái)測(cè)定堿基序列。將獲得的基因序列與GenBank的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行查詢(xún)的結(jié)果是，判明了 其中1個(gè)克隆(SF014)是與小鼠骨膜素(GenBank登錄號(hào)No. D13664)具有86%同源性的基 因?！钢圃炖?1大鼠骨膜素cDNA的克隆大鼠骨膜素cDNA的分離，使用基于SF014的 堿基序列設(shè)計(jì)的引物(1)5' -GTTCATTGAAGGTGGCGATGGTC-3‘ (SEQ ID NO 15) > (2)5' -G AGATAAAATCCCTGCATGGTCCT-3‘ (SEQ ID NO 16)，對(duì)由插入于 λ gtll 載體中的大鼠主動(dòng)脈 cDNA文庫(kù)(Clontech公司)制備的約4000個(gè)克隆的10個(gè)噬菌體亞庫(kù)(subpool)(計(jì)約4 萬(wàn)個(gè)克隆)，進(jìn)行PCR篩選，獲得了 3個(gè)陽(yáng)性亞庫(kù)。對(duì)于通過(guò)上述PCR對(duì)其中的1個(gè)亞庫(kù)進(jìn) 行擴(kuò)增獲得的片段，用AlkPhos Direct (Amersham Pharmacia公司)，采用經(jīng)堿性磷酸酶 標(biāo)識(shí)的探針通過(guò)雜交進(jìn)行篩選，獲得了 1個(gè)陽(yáng)性克隆大鼠骨膜素#1。將該插入片段整合于 pBluescriptll (Stragene公司)的EcoRI位點(diǎn)，按照制造例1-5的方法測(cè)定全堿基序列。獲得的克隆的長(zhǎng)度為約3kb，相當(dāng)于小鼠的骨膜素(GenBank登錄號(hào)D13664)的第292位至3'端，這提示其缺失了 5'末端。于是，使用SMART RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒(Clontech公司)，按照說(shuō)明書(shū)中記載的 方法，以大鼠主動(dòng)脈cDNA為模板，使用上述引物(2) 5 ‘ -GAGATAAAATCCCTGCATGGTCCT-3 ‘( SEQ ID NO 16)和基于大鼠骨膜素#1的堿基序列設(shè)計(jì)的引物(3)5' -CACGGTCGATGACATGGAC AACACC-3‘ (SEQ IDN0:17)進(jìn)行 5' -RACE 反應(yīng)。將獲得的 PCR產(chǎn)物 TA克隆到 Invitrogen 公司的PCR II載體中，命名為大鼠骨膜素5' RACE#1。按照制造例1_5的方法測(cè)定堿基序 列。其結(jié)果是，大鼠骨膜素5' RACE#1是比最初獲得的大鼠骨膜素#1在5'方向上長(zhǎng) 約300bp的克隆，5'末端比小鼠骨膜素(GenBank登錄號(hào)D13664)的5'-末端長(zhǎng)15bp的 克隆。再使用基于大鼠骨膜素5' RACE#1的堿基序列設(shè)計(jì)的引物(4)5' -ACGGAGCTCAGGGC TGAAGATG-3 ‘ (SEQ IDNO 18)和上述引物(3) 5 ‘ -CACGGTCGATGACATGGACAACACC-3 ‘ (SEQ IDNO :17)，通過(guò)PCR篩選由上述大鼠主動(dòng)脈cDNA文庫(kù)制備的約4萬(wàn)個(gè)克隆的10個(gè)噬菌體 亞庫(kù)(subpool)(計(jì)約40萬(wàn)個(gè)克隆)，獲得了 2個(gè)陽(yáng)性的亞庫(kù)。通過(guò)上述PCR對(duì)其中1個(gè)亞 庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增，以獲得的片段作為探針，通過(guò)雜交進(jìn)行篩選，獲得1個(gè)陽(yáng)性克隆，命名為大鼠 骨膜素#2。將插入片段整合到pBluescriptll (Stragene公司)的EcoRI位點(diǎn)，按照制造例 1-5的方法測(cè)定堿基序列。獲得的克隆長(zhǎng)度為約2.6kb，5'末端與5' -RACE中獲得的克隆相同，而3'末端 相當(dāng)于至小鼠骨膜素(GenBank登錄號(hào)D13664)的第2410位的克隆。而且，先前獲得的大 鼠骨膜素5' RACE#1的堿基序列和大鼠骨膜素#2的相當(dāng)區(qū)域的堿基序列完全一樣。由大 鼠骨膜素#1和大鼠骨膜素#2完成大鼠骨膜素cDNA的全長(zhǎng)。該全長(zhǎng)cDNA的堿基序列和由 該堿基序列翻譯的氨基酸序列示于SEQ ID NO :6和1?！钢圃炖?lMyC-HiS-大鼠骨膜素融合蛋白質(zhì)表達(dá)載體的構(gòu)建制備在由制造例2獲 得的大鼠骨膜素基因的編碼區(qū)域翻譯的蛋白質(zhì)的羧基末端上具有Myc表位和6個(gè)組氨酸標(biāo) 記，具有CMV啟動(dòng)子的表達(dá)載體。首先，用限制性酶EcoRI和EcoRV消化pTracer_CMV2載體(Invitrogen公司)獲 得的載體片段上，用連接試劑盒(寶酒造(株))連接通過(guò)用限制性酶EcoRI和HindIII消 化制造例2中獲得的大鼠骨膜素5' RACE#1獲得的約500bp的片段和用限制性酶HindIII 和Hpal消化制造例2中獲得的大鼠骨膜素#1獲得的約2780bp的片段，將獲得的質(zhì)粒命名 為pTracer-CMV2/大鼠骨膜素。用限制性酶EcoRI和Smal消化這樣制備的pTracer_CMV2/ 大鼠骨膜素，獲得了含有大鼠骨膜素基因的編碼區(qū)域的約2330bp的片段，以基于制造例2 獲得的大鼠骨膜素#1作為模板，基于其序列設(shè)計(jì)的引物(5) 5 ‘ -GACCCGGGAAGAACGCATCATC -3' (SEQ ID NO :19)和設(shè)計(jì)為在緊挨著大鼠骨膜素的終止密碼子插入BstEII位點(diǎn)的引物 (6) 5 ‘ -TGGGTGACCCTGAGAACGGCCTTCTCTTGATC-3 ‘ (SEQ ID NO 20)，進(jìn)行 PCR，純化后，用 限制性酶Smal和BstEII消化后獲得約270bp的片段。將上述兩個(gè)片段用連接試劑盒(寶 酒造(株))連接到用限制性酶EcoRI和BstEII消化表達(dá)載體構(gòu)建用質(zhì)粒pCDNA4/MyC-His/ C型(Irwitrogen公司)獲得的載體片段上，將獲得的質(zhì)粒命名為pCDNA4/MyC-His/大鼠骨 膜素。用制造例中記載的方法確認(rèn)插入部分的全堿基序列?！钢圃炖?1桿狀病毒用表達(dá)載體的構(gòu)建用限制性酶SacI和Pmel消化制造例3中 獲得的質(zhì)粒pcDNA4/Myc-His/大鼠骨膜素，切出肽片段大鼠PN-1/Myc-His。用連接試劑盒(寶酒造(株))將其連接到用限制性酶SacI和KpnI (平切)消化pFastBacHTc (Invitrogen 公司)獲得的載體片段上，將獲得的表達(dá)載體命名為PFastBac/大鼠骨膜素-1/Myc-His。 用制造例1-5中記載的方法確認(rèn)插入部分的堿基序列?！钢圃炖?1重組桿狀病毒的制備和培養(yǎng)用制造例5獲得的pFastBac/大鼠骨膜 素-Ι/Myc-His轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10BAC細(xì)胞，制備重組桿狀病毒。對(duì)于獲得的桿狀病毒，通 過(guò)電泳和PCR確認(rèn)目的片段插入。在無(wú)血清培養(yǎng)基(2000mL Sf-900IISFM(Invitrogen公司制)添加慶大霉素使其 終濃度為50 μ g/mL)中，于28°C培養(yǎng)經(jīng)上述重組桿狀病毒以MOI = 0. 1感染的昆蟲(chóng)Sf9細(xì) 胞(2 X IO6細(xì)胞/ml) 4-5天后，回收培養(yǎng)上清?！钢圃炖?1大鼠骨膜素蛋白質(zhì)的純化將2000mL制造例5中獲得的培養(yǎng)上清提供 給經(jīng)平衡化緩沖液(50mM醋酸鈉緩沖液pH6. 00. IM氯化鈉)平衡化的SP瓊脂糖FastFlow IOmL bed上，獲得的通過(guò)級(jí)分作為SP瓊脂糖通過(guò)級(jí)分。用平衡化緩沖液清洗至280nm處的吸光度達(dá)到0附近(約IOOmL)，作為SP瓊脂糖 洗脫級(jí)分。用IOOmL洗脫緩沖液(50mM磷酸二氫鈉(pH8. 0)，0. 5M氯化鈉，5mM咪唑)洗脫，作 為SP瓊脂糖洗脫級(jí)分。然后，將IOOmLSP瓊脂糖洗脫級(jí)分提供給經(jīng)50mM磷酸鈉緩沖液，pH8. 0,0. 5M氯化 鈉和5mM咪唑平衡化的Ni-NTA瓊脂糖5mL bed上，獲得的通過(guò)級(jí)分作為Ni-NTA瓊脂糖通 過(guò)級(jí)分。用約50mL清洗緩沖液(50mL磷酸二氫鈉pH8. 0,0. 5M氯化鈉，5mM咪唑)清洗，作 為M-NTA瓊脂糖清洗級(jí)分。洗脫緩沖液為如下((l)50mM磷酸二氫鈉，0. 5M氯化鈉，20mM咪唑，之后的咪唑量 為(2) 30mM, (3) 40mM, (4) 50mM, (5) 60mM)，分別用約25mL洗脫，形成Ni-NTA瓊脂糖洗脫級(jí) 分(1)_(6)。將經(jīng)蛋白印跡法確認(rèn)含有目的蛋白的級(jí)分濃縮到ImL以下。然后，將上述濃縮試樣提供給經(jīng)脫氣的PBS㈠(137mM NaCl, 8. ImMNa2HPO4, 2. 68mM KCl，1. 47mM KH2PO4)平衡化的凝膠過(guò)濾柱(S印hacryl S-200HR Φ 1 ImmX 95cm ；容量 90bed)，用PBS(-)洗脫，通過(guò)冷凍干燥，獲得了大鼠骨膜素純化蛋白質(zhì)?！磳?shí)施例1>大鼠 外顯子-17肽鏈的合成和多克降抗體的制備若使PN-I基因在ιΗ常的SD大鼠的心臟中高表 達(dá)，則引起心臟擴(kuò)張，并且，如果在Dahl心衰竭模型大鼠的心臟中施用大鼠骨膜素的反義 寡核苷酸，則存活率得以改善，除此之外，與已報(bào)道的PN-2不同，已經(jīng)清楚大鼠PN-I蛋白 質(zhì)中沒(méi)有細(xì)胞粘附作用，根據(jù)各個(gè)序列的比較，大鼠PN-I蛋白質(zhì)中特異的結(jié)構(gòu)鑒定為是外 顯子-17序列(參照?qǐng)D1)。以80%以上的純度化學(xué)合成在由該外顯子-17編碼的氨基酸 序列的N末端上添加了 Cys殘基的肽10mg。使所述肽與6mg作為載體蛋白質(zhì)的KLH結(jié)合， 再免疫兔(Kbl:JW)。免疫方法，在最初免疫時(shí)使用FCA(弗氏完全佐劑)，兩次免疫之后使 用FIA(弗氏不完全佐劑)。而且，以給藥部位在背部皮下20處，給藥時(shí)間為0，2，4，6周， 給藥量為在最初免疫時(shí)800 μ g肽/只，2次免疫之后為400 μ g肽/只的實(shí)施方式進(jìn)行免 疫。用ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)，給藥第7周時(shí)收集全血清。然后，使用合成肽制備親合層析 柱，只回收對(duì)外顯子-17肽特異性反應(yīng)的抗體。以后，將針對(duì)由大鼠骨膜素的外顯子-17編碼的肽的多克隆抗體稱(chēng)為抗大鼠外顯子-17多克隆抗體。〈實(shí)施例2>體外研究大鼠PN-I 蛋白質(zhì)的非細(xì)胞粘附活件的有無(wú)在細(xì)胞培養(yǎng)用96孔多孔板上分別添加10mg/ml纖連蛋白、 100 μ g/ml BSAUOmg/ml PN-I蛋白質(zhì)，于4°C包被一晚。在除去了蛋白質(zhì)液的孔中以IO4個(gè) /孔加入懸浮于01^] (10%854，？(/5]\0的小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞(ATCC號(hào)CRL_6475) 或小鼠4T1乳癌細(xì)胞(ATCC號(hào)CRL-2539)，于37°C用培養(yǎng)箱培養(yǎng)3小時(shí)。細(xì)胞的粘附量 測(cè)定，在除去培養(yǎng)上清后，用2. 5%戊二醛固定30分鐘，用0. 02%結(jié)晶紫染色后，用讀板儀 (BI0-RAD、680型微讀板儀)測(cè)定OD 550nm的吸光度。作為背景，使用經(jīng)染色的無(wú)處理的 孔，比較根據(jù)其吸光度值進(jìn)行了補(bǔ)正的值。數(shù)據(jù)的分析通過(guò)Fisher的PLSD檢測(cè)進(jìn)行(圖 2A、B)。其結(jié)果是，陽(yáng)性對(duì)照纖連蛋白中細(xì)胞粘附，陰性對(duì)照BSA中細(xì)胞不粘附。在添加了 大鼠PN-I蛋白質(zhì)的組中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的粘附，由此清楚了大鼠PN-I蛋白質(zhì)中具有不使細(xì) 胞粘附的作用，即具有非細(xì)胞粘附作用。< 實(shí)施例3>在體外研究大鼠PN-I蛋白質(zhì)的抗細(xì)胞 粘附活件的有無(wú)在細(xì)胞培養(yǎng)用96孔多孔板上以IO4個(gè)/孔添加懸浮于DMEM(10% BSA,PC/ SM)的小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞或小鼠4T1乳癌細(xì)胞，于37°C用培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。除去培 養(yǎng)上清后，添加 10 μ g/ml 纖連蛋白(SIGMA)、100 μ g/ml BSA(SIGMA)、PN_1 蛋白質(zhì)，于 37°C 用培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 3小時(shí)。細(xì)胞的粘附量測(cè)定，在除去培養(yǎng)上清后，用2. 5%戊二醛固定30 分鐘，用0. 02%結(jié)晶紫染色后，用讀板儀(BI0-RAD、680型微讀板儀)測(cè)定OD 550nm的吸 光度。作為背景，使用經(jīng)染色的無(wú)處理的孔，比較根據(jù)其吸光度值進(jìn)行了補(bǔ)正的值。數(shù)據(jù)的 分析通過(guò)Fisher的PLSD檢測(cè)進(jìn)行(圖3A、B)。用實(shí)體顯微鏡LEICA MZ16附帶的Nikon C00LPIX4500拍攝細(xì)胞。其結(jié)果是，在施用了對(duì)照纖連蛋白和BSA的組和未添加組中粘附的 細(xì)胞沒(méi)有發(fā)生剝離，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)抗細(xì)胞粘附作用，在添加了大鼠PN-I蛋白質(zhì)的組中發(fā)現(xiàn)了細(xì) 胞的剝離，由此清楚了大鼠PN-I蛋白質(zhì)具有粘附細(xì)胞的剝離作用，即抗細(xì)胞粘附作用。 施例4>在體外研究抗大鼠外顯子-17多克隆抗體的中和活性與實(shí)施例3 —樣，在細(xì)胞培養(yǎng) 用96孔多孔板中按IO4個(gè)/孔添加懸浮于DMEM(10% BSA，PC/SM)的小鼠黑色素瘤B16-F10 細(xì)胞或小鼠4T1乳癌細(xì)胞，于37°C用培養(yǎng)箱培養(yǎng)一夜。除去培養(yǎng)上清后，將培養(yǎng)液更換為添 加了 10 μ g/ml的環(huán)己酰亞胺(cycloheximide)的添加有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，于37°C 培養(yǎng)1小時(shí)。然后，用預(yù)先加熱到37°C的DMEM培養(yǎng)基(無(wú)血清)清洗細(xì)胞2遍，將終濃度 10 μ g/ml的大鼠骨膜素蛋白質(zhì)和抗大鼠外顯子-17多克隆抗體添加到DMEM培養(yǎng)基(無(wú)血 清)中至終濃度100 μ g/ml。只使用大鼠骨膜素蛋白質(zhì)作為陽(yáng)性對(duì)照，使用BSA作為陰性對(duì) 照。于37°C培養(yǎng)1小時(shí)后的顯微鏡觀察中，只添加了大鼠骨膜素蛋白質(zhì)的的組細(xì)胞幾乎完 全剝離，因此用PBS(-)清洗2次后，用10%中性緩沖福爾馬林液固定細(xì)胞30分鐘。然后， 用PBS(-)清洗3次后，用結(jié)晶紫將細(xì)胞染色30分鐘。然后，用550nm的讀板儀(BI0-RAD， 680型微讀板儀)測(cè)定細(xì)胞的染色度(圖4A、B)。其結(jié)果是，判明了抗大鼠外顯子-17多克 隆抗體是具有抑制PN-I蛋白質(zhì)導(dǎo)致的粘附細(xì)胞的剝離，也就是抑制PN-I蛋白質(zhì)的抗細(xì)胞 粘附作用，即中和大鼠PN-I蛋白質(zhì)的抗細(xì)胞粘附作用的活性的抗體。< 實(shí)施例5>在體外 研究抗大鼠外顯子-17多克降抗體對(duì)細(xì)胞增殖的影響與實(shí)施例3 —樣，在細(xì)胞培養(yǎng)用96孔 多孔板中按IO4個(gè)/孔添加懸浮于DMEM(無(wú)血清，PC/SM)的小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞，于 37°C用培養(yǎng)箱培養(yǎng)一夜。除去培養(yǎng)上清后，加入將抗大鼠外顯子-17多克隆抗體和兔IgG 抗體分別按至100mg/ml、10 μ g/ml、1 μ g/ml的終濃度添加了的DMEM(無(wú)血清，PC/SM)培養(yǎng) 基，再培養(yǎng)一晚。次日，將所有孔中的培養(yǎng)基更換為DMEM(10%BSA，PC/SM)，用Cell Titer96AQueous0ne Solution Cell Proliferation Assay kit (Promega),對(duì) 100 μ 1 的培養(yǎng)基 各添加20 μ 1細(xì)胞滴定液，于37°C培養(yǎng)1小時(shí)。然后，用490nm的讀板儀(BI0_RAD、680型 微讀板儀)測(cè)定細(xì)胞的染色度(圖5A)。同樣，向小鼠4T1乳癌細(xì)胞中分別按至200 μ g/ml、 100 μ g/ml,50 μ g/ml的終濃度添加抗大鼠外顯子-17多克隆抗體和兔IgG抗體，進(jìn)行測(cè)定 (圓5B)。其結(jié)果判明了，抗大鼠外顯子-17多克隆抗體是具有在高濃度下抑制細(xì)胞增殖的 活性的抗體?！磳?shí)施例6>針對(duì)人骨膜素的外顯子-17肽鏈的單克降抗體的制作(1)抗原的 制作通過(guò)Fmoc法化學(xué)合成了純度在90%以上的在由人骨膜素外顯子-17編碼的氨基酸序 列(SEQ ID NO 4)的N末端上添加了 Cys殘基的肽(抗原肽；SEQ ID N0:25)，從而獲得抗 原肽10mg。使5mg作為載體蛋白的KLH(CALBI0CHEM社制)與5mg該抗原肽結(jié)合，獲得了 抗原溶液。即，將KLH溶解于PBS (0. 01M)中調(diào)到3. 3mg/mL,滴下0. 2524mg/mL的MBS溶液 (GE Healthcare Science公司制)，于室溫下攪拌60分鐘使之反應(yīng)。用二氯甲烷除去游離 的MBS，獲得了 KLH-MB。將5mg該KLH-MB與5mg溶解于0. OlM磷酸鈉緩沖液(pH7. 2)的抗 原肽混合，于4°C攪拌12小時(shí)使之反應(yīng)，獲得抗原溶液。(2)免瘡在3只六周齡的BALB/c 雄性小鼠的兩足上皮下注射含有⑴中獲得的KLH結(jié)合抗原肽IOOyg的50μ1抗原溶液 和50 μ IFCA(弗氏完全佐劑)的混合乳濁液全量。然后以?xún)芍荛g隔在兩足給藥即時(shí)制備的 上述抗原溶液和FIA(弗氏不完全佐劑)的混合乳濁液。然后，通過(guò)頸椎脫臼使這些小鼠致 死，無(wú)菌采集足部淋巴結(jié)。在供給給RPMI培養(yǎng)基(K0HJINBI0株式會(huì)社制)的同時(shí)，破碎上 述淋巴結(jié)，通過(guò)直徑為約10 μ m的篩，獲得了懸浮于RPMI培養(yǎng)基的狀態(tài)的淋巴結(jié)細(xì)胞。將 其以IOOOrpm離心分離10分鐘，獲得作為沉淀級(jí)分的淋巴結(jié)細(xì)胞。在該沉淀級(jí)分中，加入 Iml在0. 84%的氯化銨溶液中加入了 20mM的HEPES緩沖液(pH7. 4)的溶液使之溶血，除去 紅血球后，以IOOOrpm離心分離5分鐘。用RPMI培養(yǎng)基清洗獲得的沉淀級(jí)分(細(xì)胞級(jí)分) 數(shù)次，用于細(xì)胞融合。(3)骨髓瘤細(xì)胞的制備用含有20%的胎牛血清(FCS)的RPMI培養(yǎng)基 在10% C02、37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)具有8-氮鳥(niǎo)嘌呤抗性且免疫球蛋白非分泌型小鼠骨髓瘤細(xì) 胞株P(guān)3X63Ag8U. 1 (P3U1株)，收集處于對(duì)數(shù)增殖期的細(xì)胞，以IOOOrpm離心分離5分鐘，只 獲得作為沉淀級(jí)分的細(xì)胞，使之懸浮于RPMI培養(yǎng)基中。(4)細(xì)胞的融合混合(2)中獲得的含 有108-3X IO8個(gè)免疫化淋巴結(jié)細(xì)胞的RPMI培養(yǎng)基和(3)中獲得的含有IO8個(gè)骨髓瘤細(xì)胞的 RPMI培養(yǎng)基后，以IOOOrpm離心分離10分鐘。輕輕地除去上清獲得作為沉淀級(jí)分的細(xì)胞， 向其中加入Im 1的25% (w/v)的聚乙二醇1500(PEG1500，Boehringer公司制)后，再緩慢 加入RPMI培養(yǎng)基使總量達(dá)到10ml。在其中加入IOml含有20% FCS的RPMI培養(yǎng)基，少許 靜置后，以IOOOrpm離心分離5分鐘，在獲得的沉淀級(jí)分(細(xì)胞級(jí)分)中添加含有20%FCS 的RPMI使細(xì)胞濃度調(diào)整到IO6個(gè)/ml，將此細(xì)胞懸浮液以200 μ 1/孔分注于corning公司 制的96孔培養(yǎng)板上。于5% CO2、37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)后，添加HAT溶液(Invitrogen 公司制)后，再培養(yǎng)2周。(5)用ELISA法篩詵講行培養(yǎng)上清與抗原肽反應(yīng)的陽(yáng)件孔的蹄 選。使用2mg(l)中獲得的抗原肽上結(jié)合了作為載體蛋白的卵清蛋白(OVA)的綴合物， 作為測(cè)試用的抗原溶液。將96孔微量滴定板(FalCOn353912)的各孔用1 μ g/ml上述綴合物于4°C靜置一 夜進(jìn)行包被。清洗該板后，在各孔滴下50μ1的(4)的培養(yǎng)上清(含有單克隆抗體)，在 37°C的培養(yǎng)箱內(nèi)放置2小時(shí)后，用PBS(-)(磷酸緩沖液)清洗。在其中添加堿性磷酸酶結(jié)合綿羊抗小鼠IgG抗體(Zymed公司制)，在37°C培養(yǎng)箱內(nèi)放置1小時(shí)，用PBS(-)清洗后， 加入發(fā)色底物劑(ALP)使之發(fā)色20分鐘，用讀板儀(BI0-RAD，680型微讀板儀)測(cè)定各孔 的0D490nm的吸光度(抗體效價(jià))，確認(rèn)與抗原肽的反應(yīng)性，測(cè)定培養(yǎng)上清與抗原肽反應(yīng)的 陽(yáng)性孔。(6)抗體產(chǎn)牛細(xì)胞的篩詵從經(jīng)(5)的ELISA法確認(rèn)了與抗原肽的反應(yīng)性的陽(yáng)性孔 內(nèi)的細(xì)胞中，通過(guò)有限稀釋法進(jìn)行抗體產(chǎn)生細(xì)胞株的篩選。即，將陽(yáng)性孔內(nèi)的細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板的各孔中，于5%C02、37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2周。對(duì)于各孔的培養(yǎng)上清，與(5)的方 法相同，用ELISA法確認(rèn)與抗原肽的反應(yīng)性，對(duì)于陽(yáng)性孔，再通過(guò)有限稀釋法進(jìn)行篩選，獲 得了與抗原肽的反應(yīng)性高且細(xì)胞集落生長(zhǎng)良好的30個(gè)細(xì)胞。將這些細(xì)胞轉(zhuǎn)移到24孔培養(yǎng) 板上，于5%C02、37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2周。對(duì)于培養(yǎng)上清，與(5)的方法相同，再用ELISA法 確認(rèn)與抗原肽的反應(yīng)性(抗體效價(jià))。0D490nm的吸光度變高的10個(gè)孔中的細(xì)胞，即10個(gè) 雜交瘤細(xì)胞株被判斷為作為抗體產(chǎn)生細(xì)胞有用，并選擇了這些細(xì)胞。表1雜交瘤細(xì)胞株
這樣獲得的抗體產(chǎn)生細(xì)胞由于總是產(chǎn)生本發(fā)明抗體_抗人外顯子-17單克隆抗體，因此 培養(yǎng)該抗體產(chǎn)生細(xì)胞的培養(yǎng)液的上清液可以直接作為本發(fā)明的抗體溶液使用。并且，產(chǎn) 生上述的抗人外顯子-17單克隆抗體的抗體產(chǎn)生細(xì)胞株(雜交瘤)No. 1 (SBM337)以FERM BP-10718于平成18年11月1日保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專(zhuān)利生物保藏 中心。(7)與人骨膜素蛋白質(zhì)(PN-I)的結(jié)合性的確認(rèn)通過(guò)點(diǎn)印跡法確認(rèn)了由10個(gè)(6)中 獲得的抗體產(chǎn)生細(xì)胞產(chǎn)生的抗體和人骨膜素蛋白質(zhì)(PN-I)的結(jié)合性。即，將各5μ1實(shí) 施例8中合成的蛋白質(zhì)OOyg/ml)點(diǎn)樣到Hybond-ECL硝化纖維素膜上(GEHealthcare Bio-Science 公司制)上，用 TBS 溶液(IOmMTris-HCl (ρΗ8· 0)，150mM NaCl)清洗 1 次。添 加阻斷緩沖液(Block Ace，雪印乳業(yè)株式會(huì)社制)，于室溫下振蕩1小時(shí)。在膜上加入(6) 中獲得的單克隆抗體(一級(jí)抗體)的1 μ g/ml濃度的溶液，振蕩3小時(shí)后，進(jìn)行4次用TBS 溶液振蕩清洗10分鐘的步驟。在膜上加入HRP標(biāo)識(shí)抗小鼠IgG抗體(Promega公司制)(二 級(jí)抗體)的0. 4mg/ml濃度溶液，于室溫下振蕩1小時(shí)后，進(jìn)行4次用TBS溶液振蕩清洗10 分鐘的步驟。加入檢測(cè)用試劑(ECL plus蛋白印跡檢測(cè)系統(tǒng)，GE HealthcareBio-Science 公司制)使之反應(yīng)1小時(shí)，通過(guò)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。其結(jié)果是，(6)中克隆的所有10個(gè)抗體 產(chǎn)生細(xì)胞均與人骨膜素PN-I結(jié)合。(8)單克降抗體的大量制備和純化在BALB/c小鼠腹腔 內(nèi)給藥0.5ml的姥鮫烷[2，6，10，14-四甲基十五烷(和光純藥制)]，飼養(yǎng)2_3周。首先， 回收維持在對(duì)數(shù)增殖期的單克隆抗體產(chǎn)生雜交瘤No. 1和No. 3，在除去培養(yǎng)上清的沉淀級(jí)分的細(xì)胞中添加不含F(xiàn)CS的RPMI培養(yǎng)基，制備細(xì)胞數(shù)至1 X IO7個(gè)/ml的細(xì)胞液。將該細(xì) 胞液注入于已經(jīng)給藥了姥鯨烷的BALB/c小鼠的腹腔中，3周后左右用注射器從腹部回收漏 出的腹水。用孔徑為0.22μπιΦ濾膜過(guò)濾收集的腹水，用蛋白質(zhì)G-瓊脂糖柱(Millipore， 11511324)，通過(guò)親合層析過(guò)濾，按照常規(guī)方法純化濾液，制備兩種抗人外顯子-17單克隆 抗體。< 實(shí)施例7>抗人外顯子-17單克降抗體的人骨膜素外顯子-17肽鏈中的識(shí)別部位分 近對(duì)于獲得的兩種單克隆抗體(No. 1和No. 3)進(jìn)行人骨膜素外顯子-17肽鏈中識(shí)別位點(diǎn)的 分析(表位的鑒定)。即，在纖維素膜上，制成了，在由從人骨膜素外顯子-17肽鏈(SEQ ID NO 4；1位的蘇氨酸至27位的谷氨酸)的N末端起的第-9位的苯丙氨酸到從C末端起的 第9位的異亮氨酸的共計(jì)45個(gè)氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列中，下述36種由10個(gè)氨基酸構(gòu)成 的肽的膜結(jié)合型肽陣列(SIGMA-ALDRICH JAPAN株式會(huì)社custom Spots service)。
[化 1]1 FKEIPVTVYT2 KEIPVTVYTT3 EIPVTVYTTK4 IPVTVYTTKI5 PVTVYTTKII6 VTVYTTKIIT7 TVYTTKIITK8 VYTTKIITKV9 YTTKIITKWlO TTKIITKWEl 1 TKIITKVVEP12 KIITKVVEPK13 IITKVVEPKI14 ITKVVEPKIK15 TKVVEPKIKV16 KVVEPKIKVI17 VVEPKIKVIE18 VEPKIKVIEG19 EPKIKVIEGS20 PKIKVIEGSL21 KIKVIEGSLQ22 IKVIEGSLQP23 KVIEGSLQPI24 VIEGSLQPII25 IEGSLQPIIK26 EGSLQPIIKT27 GSLQPIIKTE28 SLQPIIKTEG29 LQPIIKTEGP30 QPIIKTEGPT31 PIIKTEGPTL32 IIKTEGPTLT33 IKTEGPTLTK34 KTEGPTLTKV35 TEGPTLTKVK36 EGPTLTKVKI將該膜放置于少量的甲醇中5分鐘后，用TBS溶液清洗3次。添 加阻斷緩沖液(酪蛋白，SPOTs附帶的)，室溫下攪拌2小時(shí)。在膜上添加實(shí)施例實(shí)施例6 (8) 中獲得的單克隆抗體(一級(jí)抗體)的濃度為1 μ g/ml的溶液，振蕩3小時(shí)后，用TBS溶液中 進(jìn)行3次10分鐘的振蕩清洗。在膜上添加HRP標(biāo)識(shí)抗小鼠IgG抗體(Promega公司制)(二 級(jí)抗體)的濃度為0. 4 μ g/ml的溶液，溫育2小時(shí)后，用TBS溶液中進(jìn)行3次5分鐘的振蕩 清洗。添加檢測(cè)用試劑(SuperSignal WestPico, Pierce公司制)使之反應(yīng)1分鐘，通過(guò) 化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。其結(jié)果是，單克隆抗體No. 1和No. 3只與由氨基酸序列YTTKIITKVV(SEQ IDNO 26)構(gòu)成的合成肽No. 9，即人骨膜素外顯子-17肽鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO 4) 中的末端起的第-1位的酪氨酸至第9位的纈氨酸，人骨膜素PN-I O氨基酸序列(SEQ ID NO 2)中的N末端起的第669位的酪氨酸至第679位的纈氨酸的氨基酸序列構(gòu)成的肽反 應(yīng)并結(jié)合。< 實(shí)施例8>抗大鼠外顯子-17多克降抗體的人骨膜素外顯子-17肽鏈中識(shí)別 部位分析對(duì)于實(shí)施例1制備的多克隆抗體，與實(shí)施例7同樣，進(jìn)行人骨膜素外顯子-17肽 鏈中的識(shí)別位點(diǎn)分析(表位的鑒定)。其結(jié)果清楚了，與實(shí)施例7的單克隆抗體一樣，該多 克隆抗體只與合成肽No. 9反應(yīng)，與單克隆抗體特異性識(shí)別相同的部位因此，提示即使以大 鼠骨膜素外顯子-17作為抗原制備多克隆抗體，以人骨膜素外顯子-17肽作為抗原制備多 克隆抗體也可以得到具有相同特異性的抗體?！磳?shí)施例9>與大鼠骨膜素蛋白質(zhì)(PN-I)的 結(jié)合件的確認(rèn)通過(guò)點(diǎn)印跡法確認(rèn)了所獲得的2種單克隆抗體(No. 1和No. 3)與大鼠骨膜 素蛋白質(zhì)(PN-I)的結(jié)合性。即，將各5μ1制造例6中獲得的純化蛋白質(zhì)(30yg/ml)點(diǎn) 樣到Hybond-ECL硝化纖維素膜上(GEHealthcare Bio-Science公司制)上，用TBS溶液 (IOmMTris-HCl (ρΗ8. 0)，150mM NaCl)清洗1次。添加封閉緩沖液(Block Ace，雪印乳業(yè)株 式會(huì)社制)，于室溫下振蕩1小時(shí)。在膜上加入單克隆抗體(一級(jí)抗體)的濃度為1 μ g/ml 的溶液，振蕩3小時(shí)后，用TBS溶液進(jìn)行4次10分鐘的振蕩清洗。在膜上加入HRP標(biāo)識(shí)抗 小鼠IgG抗體(Promega公司制)(二級(jí)抗體)的0. 4 μ g/ml濃度溶液，于室溫下振蕩1小時(shí)后，進(jìn)行4次用TBS溶液振蕩清洗10分鐘的步驟。加入檢測(cè)用試劑(ECL plus蛋白印跡 檢測(cè)系統(tǒng)，GE Healthcare Bio-Science公司制)使之反應(yīng)1小時(shí)，通過(guò)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。 其結(jié)果確認(rèn)了，獲得的兩種單克隆抗體均與大鼠骨膜素PN-I結(jié)合?！磳?shí)施例10>杭人外顯 子-17單克降抗體的表位分析根據(jù)實(shí)施例7的結(jié)果，清楚了抗人外顯子-17的單克隆抗體 的表位部分識(shí)別人骨膜素外顯子-17肽鏈(SEQ ID NO :4)的N末端的蘇氨酸至第9位的 纈氨酸的氨基酸序列(TTKIITKVV ；SEQ ID NO :22)，而且在實(shí)施例9結(jié)果中，還確認(rèn)了抗人 外顯子-17的單克隆抗體也與大鼠骨膜素蛋白質(zhì)(PN-I)結(jié)合。由此提示，抗人外顯子-17 單克隆抗體的表位部分識(shí)別人骨膜素外顯子-17肽鏈(SEQ ID NO 4)的N末端的蘇氨酸至 第9位的纈氨酸的氨基酸序列(TTKIITKVV ；SEQ ID NO 22)中在人與大鼠種間氨基酸不同 的部分，即人骨膜素外顯子-17肽鏈(SEQ IDNO 4)或大鼠骨膜素外顯子_17肽鏈(SEQ ID NO 3)的N末端的蘇氨酸至第7位的賴(lài)氨酸的氨基酸序列的全部或其部分。因此，為了更 詳細(xì)地分析表位部分，用丙氨酸掃描(alanine scanning)的方法進(jìn)行分析。以80%以上的純度合成了人骨膜素外顯子-17肽鏈(SEQ ID NO 4)的N末端起 的第-1位的酪氨酸至第9位的纈氨酸的氨基酸序列(YTTKIITKVV ;SEQ ID NO 26)中，一部 分氨基酸被替換成丙氨酸的下述10種肽。[化 2]#1 YTTKIITKVV#2 ATTKIITKAA#3 AATKIITKAA#4 AAAKIITKAA#5 AAAAIITKAA#6 AAAAAITKAA#7 ATTKIITAAA#8 ATTKIIAAAA#9 ATTKIAAAAA#10 ATTKAAAAAA用50 μ 1 PBS㈠使Img的合成肽溶解，將各1. 5 μ 1點(diǎn)樣到Hybond-ECL硝化纖 維素膜上(GE Healthcare Bio-Science公司制)上，用TBS溶液清洗1次。添加阻斷緩沖 液(Block Ace，雪印乳業(yè)株式會(huì)社制)，于室溫下振蕩1小時(shí)。在膜上加入實(shí)施例9 (8)中 獲得的單克隆抗體(一級(jí)抗體)的1 μ g/ml濃度的溶液，振蕩3小時(shí)后，用TBS溶液進(jìn)行4 次10分鐘的振蕩清洗。在膜上加入HRP標(biāo)識(shí)抗小鼠IgG抗體(Promega公司制)(二級(jí)抗 體)的0. 4 μ g/ml濃度溶液，于室溫下振蕩1小時(shí)后，用TBS溶液對(duì)膜進(jìn)行4次10分鐘的 振蕩清洗。加入檢測(cè)用試劑(SuperSignal West Pico, Pierce公司制)使之反應(yīng)1分鐘， 通過(guò)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。其結(jié)果是，該單克隆抗體與上述合成肽#7 (由人骨膜素外顯子-17肽鏈(SEQ ID NO 4)的N末端起的第-1位的酪氨酸至第9位的纈氨酸的氨基酸序列(YTTKIITKVV ；SEQ ID NO 26)構(gòu)成的肽中，N末端起第1位和第8-10位的氨基酸被替換成丙氨酸的肽)強(qiáng)烈 反應(yīng)，與#1(由人骨膜素外顯子-17肽鏈(SEQ ID NO 4)的N末端起的第-1位的酪氨酸至 第9位的纈氨酸的氨基酸序列(YTTKIITKVV ；SEQ ID NO 26)構(gòu)成的肽)和#2 (由人骨膜素 外顯子-17肽鏈(SEQ ID NO 4)的N末端起的第-1位的酪氨酸至第9位的纈氨酸的氨基 酸序列(YTTKIITKVV ；SEQ ID NO 26)構(gòu)成的肽中，N末端起的第1位和第9_10位的氨基酸 被替換成丙氨酸的肽)弱反應(yīng)，與#3 (由人骨膜素外顯子-17肽鏈(SEQ ID NO 4)的N末 端起的第-1位的酪氨酸至第9位的纈氨酸的氨基酸序列(YTTKIITKVV ；SEQ ID NO 26)構(gòu) 成的肽中，N末端起的第1-2位和第9-10位的氨基酸被替換成丙氨酸的肽)和#8(由人骨 膜素外顯子-17肽鏈(SEQ ID NO 4)的N末端起的第-1位的酪氨酸至第9位的纈氨酸的 氨基酸序列(YTTKIITKVV ；SEQ ID NO 26)構(gòu)成的肽中，N末端起的第1位和第7_10位的氨 基酸被替換成丙氨酸的肽)反應(yīng)更弱。< 實(shí)施例11>抗大鼠外顯子-17多克降抗體的人骨 膜素外顯子-17肽鏈中識(shí)別位點(diǎn)分析對(duì)于實(shí)施例1制備的多克隆抗體，與實(shí)施例10同樣，進(jìn)行人骨膜素外顯子-17肽鏈中的識(shí)別位點(diǎn)分析(表位的鑒定)。其結(jié)果清楚了，與實(shí)施例 10的單克隆抗體一樣，該多克隆抗體與合成肽No. #7強(qiáng)反應(yīng)，和#1和#2弱反應(yīng)，與#3和#8 反應(yīng)更弱，與單克隆抗體特異性識(shí)別相同的部位。因此，提示即使以大鼠骨膜素外顯子-17 肽作為抗原制備多克隆抗體，以人骨膜素外顯子-17肽作為抗原制備單克隆抗體也可以得 至IlJI有相同特異件的杭體?！磳?shí)施徹丨12>#用小鼠黑盧,素瘤B16-F10細(xì)胞J市轉(zhuǎn)移1草型小鼠的 ■謝十Φ·挪夕卜肝-17··獻(xiàn)汰小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞 注射后第二周采集小鼠原發(fā)病灶，添加均質(zhì)化的組織，RIPA緩沖液(RIPA裂解緩沖液IOX ； Upstate)、180mM Na3V04、蛋白酶抑制劑混合物(Nacalai Tesque)、200mM NaF，冰上靜置 15 分鐘。然后，15000rpm，于4°C離心20分鐘，采集其上清。提取的蛋白質(zhì)用DC蛋白質(zhì)測(cè)試 試劑(BIO-RAD)測(cè)定其濃度。然后，與2X試樣緩沖液(Laemmli試樣緩沖液(BIO-RAD)、 5% 2-巰基乙醇)混合，于98°C、加熱處理5分鐘。用Multi gelll分鐘i7. 5 (第一化學(xué))， 按IOmA將制備的蛋白質(zhì)的試樣電泳180分鐘后，于30V、4°C，轉(zhuǎn)移到ImmobiIon-P轉(zhuǎn)移膜 (MILLIP0RE) 一夜。然后，將膜浸入含5%脫脂乳的PBS-T中1小時(shí)，或者浸入Blocking one P (Nacalai Tesque)中20分鐘，室溫下振蕩進(jìn)行阻斷。然后，添加一級(jí)抗體(抗人外顯子-17 單克隆抗體(No. 3)、稀釋至1 500、對(duì)照為抗雞α-微管蛋白單克隆IgG抗體(Sigma)、稀 釋至1 5000)，于4°C反應(yīng)一夜后，用PBS-T進(jìn)行5分X3次的清洗。然后，添加二級(jí)抗體 (抗小鼠IgG HRP (PR0MEGA)、稀釋至1 10000)，室溫下反應(yīng)1小時(shí)。用PBS-T進(jìn)行10分X 1 次、30分X 2次清洗后，用ECL-Plus (Amersiam Biosciences)，通過(guò)化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行條帶檢 測(cè)。結(jié)果清楚了，在正常下肢中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)具有由外顯子-17編碼的肽區(qū)域的骨膜素的表達(dá)， 而在腫瘤組織中表達(dá)增強(qiáng)(圖6A)。<實(shí)施例13>用小鼠4T1乳癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移樽型小鼠的原 發(fā)病灶的具有由外顯子-17編碼的肽R域的骨膜素的表汰小鼠4T1乳癌細(xì)胞注射后第1周 時(shí)采集小鼠原發(fā)病灶，添加均質(zhì)化的組織，RIPA緩沖液(RIPA裂解緩沖液IOX ；Upstate)、 180mMNa3V04、蛋白酶抑制劑混合物(Nacalai Tesque)、200mM NaF，冰上靜置15分鐘。然后， 15000rpm，于4°C離心20分鐘，采集其上清。提取的蛋白質(zhì)用DC蛋白質(zhì)測(cè)試試劑(BIO-RAD) 測(cè)定其濃度。然后，與2X試樣緩沖液(Laemmli試樣緩沖液(BIO-RAD) ,5% 2-巰基乙醇) 混合，于98°C、加熱處理5分鐘。用Multi gelll分鐘i7.5(第一化學(xué))，按IOmA將制備 的蛋白質(zhì)的試樣電泳180分鐘后，于30V、4°C，用Immobilon-P轉(zhuǎn)移膜(MILLIP0RE)轉(zhuǎn)移一 夜。然后，將膜浸入含5%脫脂乳的PBS-T中1小時(shí)，或者浸入Blocking one P(Nacalai Tesque)中20分鐘，室溫下振蕩進(jìn)行阻斷。然后，添加一級(jí)抗體(抗人外顯子_17單克隆 抗體(No.3)、稀釋至1 500、對(duì)照為抗雞α-微管蛋白單克隆IgG抗體(Sigma)、稀釋至 1 5000)，于4°C反應(yīng)一夜后，用PBS-T進(jìn)行5分X3次的清洗。然后，添加二級(jí)抗體(抗 小鼠IgG HRP (PR0MEGA)、稀釋至1 10000)，室溫下反應(yīng)1小時(shí)。用PBS-T進(jìn)行10分X 1 次、30分X 2次清洗后，用ECL-Plus (Amersiam Biosciences)，通過(guò)化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行條帶檢 測(cè)。結(jié)果清楚了，在正常下肢中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)骨膜素的表達(dá)，而在腫瘤組織中表達(dá)增強(qiáng)(圖6B)。 <實(shí)施例14>使用小鼠黑餼素瘤B16-F10細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移模型小鼠的抗大鼠外顯子-17多克隆 抗體和抗人外顯子-17單克降抗體的效果用37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞， 用PBS清洗后，用胰蛋白酶/EDTA使細(xì)胞浮游，再回收。然后，進(jìn)行1500rpm離心3分鐘，回收 的細(xì)胞按最終5 X IO5個(gè)/只計(jì)算，懸浮于100μ1的PBS中。制備的細(xì)胞，用29G Myjector 帶注射針的胰島素用注射器(TERMO)注入到小鼠C57BL/6N雄性8周齡的足底部。首先，為了研究最初在實(shí)施例6中獲得的2種單克隆抗體(No. 1和No. 3)的效果，在接種細(xì)胞的同 時(shí)用29G Myjector帶注射針的胰島素用注射器從小鼠頸靜脈處按2 μ g/只施用抗體。采 用正常兔IgG(R&D Systems)作為對(duì)照。用游標(biāo)卡尺測(cè)量施用細(xì)胞和抗體后1周間的下肢 腫大部位的直徑，對(duì)原發(fā)病灶的增加率進(jìn)行了評(píng)價(jià)。其結(jié)果是，對(duì)照組中為74. 5士6. 3% (η =11)、抗體(No. 1)組中為 17. 8士4. 4% (η = 10)，抗體(No. 3)組中為 19. 5士9. 9% (η = 10)，表明兩抗體具有同等程度的癌增殖抑制活性(圖7)。接著，在接種小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞后，在這段時(shí)期之后開(kāi)始施用抗體，研究 是否以更接近臨床的形式具有效果。在使用抗大鼠外顯子-17多克隆抗體(0. 75mg/ml)的 實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行細(xì)胞注射1周后，以及在使用抗人外顯子-17單克隆抗體(No. 3) (2. 14mg/ml) 的實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)行細(xì)胞注射3天后和7天后，用29G Myjector帶注射針的胰島素用注射器從 小鼠頸靜脈以20yg/只施用抗體。采用正常兔IgG(R&DSyStemS)作為對(duì)照。進(jìn)行細(xì)胞注 射后，每周用游標(biāo)卡尺測(cè)量下肢腫大部分的直徑，評(píng)價(jià)原發(fā)病灶的增加率。為了防止由于原 發(fā)病灶的過(guò)增殖，癌直接浸潤(rùn)到腹膜下而小鼠死亡，在細(xì)胞注射后第二周時(shí)切除原發(fā)病灶 的下肢。在細(xì)胞注射后第5周是進(jìn)行解剖，計(jì)算是否由原發(fā)病灶轉(zhuǎn)移到肺以及向肺轉(zhuǎn)移的 集落數(shù)。原發(fā)病灶的增加率，用百分率表示以注射小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞前腳的直徑 作為100時(shí)的增加百分比，通過(guò)t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。此外，由原發(fā)病灶向肺的轉(zhuǎn)移率通過(guò) X2檢驗(yàn)、向肺的轉(zhuǎn)移集落數(shù)用Marm-Whitney檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。在抗大鼠外顯子-17多克隆抗體施用實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞注射后第2周的原發(fā)病灶的增 加率(與注射細(xì)胞前的腳的直徑比較)，在對(duì)照組中為198. 1 士 10. 428% (η = 10)、在中和 抗體組中為163. 2士21. 015% (η = 11)(圖8)。另一方面，由原發(fā)病灶向肺的轉(zhuǎn)移率，對(duì)照 組為57. (η = 7)，而中和抗體組中為0% (η = 6)，轉(zhuǎn)移顯著得到了抑制(圖8)。對(duì)照 組的由原發(fā)病灶向肺的轉(zhuǎn)移集落數(shù)為1. 143士0. 553個(gè)(圖8)。然后，在抗人外顯子-17單克隆抗體(No. 3)施用實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞注射后第1周的原 發(fā)病灶的增加率(與注射細(xì)胞前的腳的直徑比較)，對(duì)照組為77. 6士9. 484% (η = 12)， 而中和抗體組為48. 9士7. 060% (η = 11)，增殖被顯著抑制(P < 0. 05)(圖9)。而且，由 原發(fā)病灶向肺的轉(zhuǎn)移率，對(duì)照組為75% (η = 12)，而中和抗體組(η = 10)中呈現(xiàn)出40% 的轉(zhuǎn)移率的減少傾向(P = 0. 0964)(圖9)。由原發(fā)病灶向肺的轉(zhuǎn)移集落數(shù)，對(duì)照組中為 9. 41 士4. 38個(gè)，而中和抗體組中為0. 7士0. 335個(gè)，轉(zhuǎn)移集落數(shù)被顯著抑制了(P < 0. 05) (圖9)。根據(jù)以上的結(jié)果，確認(rèn)了抗大鼠外顯子-17多克隆抗體具有抑制黑色素瘤細(xì)胞向 肺的轉(zhuǎn)移的效果。此外，還清楚了抗人外顯子-17單克隆抗體(No. 3)具有原發(fā)病灶的增 殖抑制效果。< 實(shí)施例15>使用了小鼠4Τ1乳癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移樽型小鼠的抗大鼠外顯子-17 多克隆抗體的效果用含有10%牛血清白蛋白(FBSMBio west)、青霉素-鏈霉素混合溶 液(Nacalai Tesque)的RPMI1640 (Gibco)，將小鼠4T1乳癌細(xì)胞接種在IOcm組織培養(yǎng)皿 (Greiner)中，用37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)。然后，除去培養(yǎng)上清，用PBS清洗后，用胰蛋白 酶/EDTA使之浮游?；厥占?xì)胞，于1500rpm離心3分鐘后，傳代1.5X105個(gè)細(xì)胞，用37°C 培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時(shí)后，將處于對(duì)數(shù)增殖期的細(xì)胞按最終達(dá)到1 X IO6個(gè)/只計(jì)算，懸浮于 100 μ 1的PBS中。用29G Myjector帶注射針的胰島素用注射器(TERMO)將制備的細(xì)胞注 入到小鼠BALB/c雌性8周齡的足底部。并且，從小鼠頸靜脈用29G Myjector帶注射針的 胰島素用注射器以20 μ g/只施用抗體。在采用抗大鼠外顯子-17多克隆抗體(lmg/ml)的實(shí)驗(yàn)中，在細(xì)胞注射的同時(shí)施用抗體，并且在進(jìn)行細(xì)胞注射1周后和2周后施用抗體。使用 正常兔IgG(R&D Systems)作為對(duì)照。進(jìn)行細(xì)胞注射后，每周進(jìn)行體重測(cè)定并用游標(biāo)卡尺測(cè) 量下肢腫大部位的直徑，評(píng)價(jià)原發(fā)病灶的體積。評(píng)價(jià)方法按Dethlefsen LA. et al. J. Natl. Cancer Inst. ,40,389(1968)中記載的方法，用(腳掌的長(zhǎng)度)X (腳掌的寬的平方)+2 求出。細(xì)胞注射后第3周進(jìn)行解剖，進(jìn)行體重測(cè)定，計(jì)算是否由原發(fā)病灶向肺的轉(zhuǎn)移以及向 肺轉(zhuǎn)移的集落數(shù)。分別通過(guò)t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果，在體重變化方面，細(xì)胞注射后直 至第2周，兩組間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著差異，3周后，對(duì)照組為17. 50士0. 703g(n = 6)、中和抗體 組為21.24士0.5178(11 = 6)，原發(fā)病灶的增殖被顯著抑制了(P < 0. 05)(圖10)。而且， 細(xì)胞注射后第1周的原發(fā)病灶的腫瘤體積，對(duì)照組中為301. 3士 11. 49mm3(η = 10)、中和抗 體組中為235. 9 士 7. 842mm3 (η = 10)，原發(fā)病灶的增殖被顯著抑制了(P < 0. 05)，而且，細(xì) 胞注射后第2周的原發(fā)病灶的腫瘤體積，對(duì)照組中為842. 4士34. 7Imm3(η = 10)、中和抗體 組中為613. 9士45. 17mm3 (η = 10)，原發(fā)病灶的增殖被顯著抑制了(P < 0. 05)(圖11)，細(xì) 胞注射后直至第3周，對(duì)照組的腳由于壞死而脫落，而中和抗體組中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)脫落。此外， 由原發(fā)病灶向乳癌細(xì)胞的骨浸潤(rùn)導(dǎo)致的骨破壞的評(píng)價(jià)，在對(duì)下肢距骨進(jìn)行HE染色、TRAP染 色后，測(cè)定骨面積和破骨細(xì)胞數(shù)。由于向骨的直接浸潤(rùn)導(dǎo)致的殘留骨面積，在對(duì)照組中為 326656 士 53628. 7 (η = 5)，與之相對(duì)，中和抗體組中為 545756. 8 士65928. 8 (η = 5)，發(fā)現(xiàn)顯 著的骨殘留(ρ <0.05)(圖12)。此外，破骨細(xì)胞數(shù)還與殘留骨面積逆相關(guān)，對(duì)照組中為 49士9. 576個(gè)(η = 5)，與之相對(duì)，中和抗體組中為20士5. 167個(gè)(η = 5)，顯著的減少了(ρ < 0. 05)(圖13)。另一方面，由原發(fā)病灶向肺的轉(zhuǎn)移率，盡管無(wú)論在哪一組中都發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn) 移，但轉(zhuǎn)移集落數(shù)在對(duì)照組中為89士28. 9個(gè)，與之相對(duì)，中和抗體組中為30. 5士6. 30個(gè)， 顯著抑制了轉(zhuǎn)移集落數(shù)(P < 0. 05)(圖14)。根據(jù)以上的結(jié)果，清楚了抗大鼠外顯子-17 多克隆抗體抑制乳癌細(xì)胞的原發(fā)病灶的增殖，同時(shí)具有對(duì)向肺轉(zhuǎn)移的抑制效果。< 實(shí)施例 16>人癌細(xì)朐,和IH常組織中具有外顯子-17 R域的骨膜素的表達(dá)的研究首先制備特異于 外顯子-17 區(qū)域的引物(有義鏈5' -TAAAATTATAACCAAAGTTGTGGAACC-3 ‘ (SEQ ID NO: 35)、反義鏈5 ‘ -AGTGTGGGTCCTTCAGTTTTGAT-3 ‘ (SEQ ID NO 36))。然后，從 ATCC (美 國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，American Type CultureCollection)和ECACC(歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物 保藏中心，EuropeanCollection of Cell Cultures)購(gòu)買(mǎi)下述1) 6)的人癌細(xì)胞株， 按照這些該細(xì)胞株的說(shuō)明書(shū)中記載的方法培養(yǎng)后，用ISOGEN(Nippon gene公司)，按照說(shuō) 明書(shū)中記載的方法提取總 RNA l)Breast Ductal Carcinoma(乳管癌、MDA_MB_435s)Cat. No. HTB-129、2)Breast Adenocarcinoma(乳腺腺癌、MDA-MB—231)Cat. No. HTB—26、3)Breast Adenocarcinoma (乳腺腺癌、MCF-7) Cat. No. HTB_22、4) Lung Carcinoma (月市癌、A—549) Cat. No. CCL-185、5)Melanoma(黑色素瘤、SK-MEL-5)Cat. No. HTB-70、6)Breast carcinoma(乳 癌、Hs 578T) Cat. No. EC86082104o從Ambion公司購(gòu)買(mǎi)下述1) 11)的人癌細(xì)胞株來(lái)源 RNA 1) Leukemia(白!&_、KG-1) Cat. No. AM7830>2)Prostate Adenocarcinoma( fr^lJ 腺腺癌、PC-3) Cat. No. AM7834.3) Osteogenic Sarcoma(骨肉瘤、SaOS-2) Cat. No. AM7840、 4) Bladder Carcinoma (膀腕癌、T—24) Cat. No. AM7844、5) Breast Adenocarcinoma (乳腺腺 癌、MCF-7)Cat.No.AM7846、6)Liver Carcinoma(肝癌、HepG2) Cat. No. AM7848,7) Cervical Adenocarcinoma(子宮頸部腺癌、HeLa_S3) Cat. No. AM7852、8)Breast Carcinoma(乳癌、 T-470) Cat. No. AM7874、9) Breast Carcinoma (乳癌、MDA-MB-453) Cat. No. AM7876、10)Breast Carcinoma(乳癌、DU-4475) Cat. No. AM7878U1)Breast Adenocarcinoma(乳腺腺 癌、MDA-MB-361)Cat. No.AM7872)。從Ambion公司購(gòu)買(mǎi)下述1) 16)的人癌組織來(lái)源 的總 RNA l)Lung Adenocarcinoma(月市腺癌)Cat. No. AM7225、2)Pancreas :Acinar cell carcinoma(胰腺腺泡細(xì)胞癌)Cat. No. AM7229、3)Colon =Adenocarcinoma(結(jié)腸腺癌) Cat. No. AM7237、4) Liver =Hepatocellular CA(肝細(xì)胞癌)Cat. No. AM7245、5)Bladder transitional cell cancer ( If E # ^ ) Cat. No. AM7249>6) Kidney =Renal cell carcinoma(腎細(xì)胞癌)Cat. No. AM7253、7)胃未知(胃癌)Cat. No. AM7265、8)Breast Ductal carcinoma(乳管癌)Cat. No. AM7221、9)子宮手術(shù)(子宮癌)Cat. No. AM7233、 10) Thyroid =Hurthle cell neoplasm(甲狀腺許特爾細(xì)胞癌)Cat. No. AM7241、11) Ovary : Papillary cystadenocarcinoma(卵巢乳頭狀囊腺癌)Cat. No. AM7257U2)Testis =Germ cell tumor (睪丸生殖細(xì)胞瘤)Cat. No. AM7261、13)淋巴瘤Large B-cell lymphoma(大 B 細(xì)胞淋巴瘤)Cat. No. AM7269、14)子宮頸Cervical cancer (子宮頸癌)Cat. No. AM7277、 15) Prostate =Acinar adenocarcinoma ( ff 歹I」l/| 泡 癌)Cat. No. AM7289U6) E 節(jié) follicular Lymphoma(濾胞性淋巴瘤)Cat. No. AM7291)。從 Biochain 公司購(gòu)買(mǎi)下 述1) 11)的人癌組織來(lái)源的總RNA l)Adrenal =Pheochromocytoma(腎上腺嗜鉻細(xì) 胞瘤)Cat. No. R1235004-10、2) Bone Osteosarcoma (骨肉瘤)Cat. No. R1235023_10、3) Breast LobuIar carcinoma(乳小葉癌)Cat. No. R1235086_50、4)Esophagus Squamous cell carcinoma(食道魚(yú)舞狀細(xì)胞癌)Cat. No. R1235106-50>5)Lung Adenocarcinoma(月市腺 癌)Cat. No. R1235152-50.6) Ovary =Adenocarcinoma (卵巢腺癌)Cat. No. R1235183—10、 7) Rectum Adenocarcinoma (直腸腺癌)Cat. No. R1235206_50、8)皮膚皮膚黑色素 瘤(惡性黑色素瘤)Cat.No.R1235218A-10、9)小腸惡性間皮瘤(小腸間皮瘤)Cat. No. R1235226-10U0)軟組織Synoviosarcoma(滑膜瘤)Cat. No. Rl235257-KK 11)胸腺 Thymoma(胸腺瘤)Cat. No. R1235264-10。從CLONTECH購(gòu)買(mǎi)的以下人正常組織來(lái)源的總 RNA :l)Adrenal Gland (腎上腺、Cat. No. 636528)、2) Bladder (膀胱、Cat. No. 636542)、3) 外周白細(xì)胞(白細(xì)胞、Cat. No. 636580)、4) Colon (結(jié)腸、Cat. No. 636553) ,5) Kidney (腎臟、 Cat. No. 636529)、6) Liver (肝臟、Cat. No. 636531)、7) Lung(肺、Cat. No. 636524) ,8)Mammary Gland (乳腺、Cat. No. 636576)、9) Pancreas (胰腺、Cat. No. 636577)、10) Prostate (前列 腺、Cat. No. 636550)、11) Small Intestin (小腸、Cat. No. 636539)、12) Testis (睪丸、Cat. No. 636533)、13) Thymus (胸腺、Cat. No. 636549)、14) Thyroid (甲狀腺、Cat. No. 636536)、 15) Uterus (子宮、Cat. No. 636551))。從 COSMO BIO 購(gòu)買(mǎi)的以下1) Esophagus (食道、 Cat. No. CB-R1234106-50) ,2) Rectum(直腸、Cat. No. CB-R1234206-50)、3) Skin (皮膚、Cat. No. CB-R1234218-50) ,4)Uterus Cervix (子宮頸部、Cat. No. CB-R1234275-50) ,5) Lymph Node(淋巴節(jié)、Cat. No. CB-R1234161-10) ,6) Ovary (卵巢、Cat. No. CB-R1234183-50)、7) Stomach(胃、Cat. No. CB-R1234248-50))用 Superscript II 第一鏈(first strand)系統(tǒng) (Invitrogen (社))，對(duì)這些總RNA,于42°C 50分鐘、70°C 10分鐘，制作cDNA。然后，進(jìn)行采 用SEQ ID NO :35，36的引物和KOD plus TaqDNA聚合酶(東洋紡(株))的PCR法(熱變性 940C 30秒、退火56°C 30秒、延伸反應(yīng)68°C 30秒X40個(gè)循環(huán))后，進(jìn)行采用3%瓊脂糖凝 膠的電泳，對(duì)具有外顯子-17區(qū)域的骨膜素的表達(dá)進(jìn)行了研究。其結(jié)果是，確認(rèn)了在研究的 所有的癌癥種類(lèi)(食道癌、肺癌、胸腺癌、胰腺癌、甲狀腺癌、胃癌、小腸癌、結(jié)腸(大腸)癌、直腸癌、肝癌、膀胱癌、腎癌、乳癌、乳管癌、乳腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巢癌、睪丸癌、淋巴 瘤、腎上腺癌、前列腺癌、骨肉瘤、惡性黑色素瘤(黑色素瘤)、滑膜瘤、白血病)中表達(dá)(圖 15、圖16、圖17、圖18)。另一方面，對(duì)與之相對(duì)應(yīng)的正常組織中的表達(dá)進(jìn)行研究，其結(jié)果是， 盡管在乳腺中發(fā)現(xiàn)少量表達(dá)，但與癌組織相比，其表達(dá)非常弱。此外，在其它正常組織中也 幾乎沒(méi)有發(fā)現(xiàn)表達(dá)(圖19)。根據(jù)以上結(jié)果，表明具有外顯子-17區(qū)域的骨膜素在癌組織中 特異表達(dá)，通過(guò)測(cè)定其表達(dá)量，可以進(jìn)行癌癥診斷。這表示針對(duì)由骨膜素的外顯子-17所編 碼的肽的抗體可以不僅以黑色素瘤或乳癌癥還可以上述癌作為靶點(diǎn)。工業(yè)上利用的可能性
通過(guò)使用針對(duì)由骨膜素的外顯子-17所編碼的肽區(qū)域的抗體，可以進(jìn)行癌癥治 療，具體是進(jìn)行原發(fā)病灶的增殖抑制和轉(zhuǎn)移抑制。而且，通過(guò)使用前述抗體或者特異于外 顯子-17區(qū)域的引物測(cè)定患者試樣中的該骨膜素量，可以了解癌癥的有無(wú)和病狀的進(jìn)行程 度。
權(quán)利要求
癌癥治療用藥物組合物，其含有針對(duì)由選自SEQ ID NO3、SEQ ID NO4和SEQ ID NO21中的任意一個(gè)氨基酸序列構(gòu)成的肽的抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的癌癥治療用藥物組合物，所述抗體是與由SEQID N0:26的 氨基酸序列構(gòu)成的部位特異性結(jié)合的抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的癌癥治療用藥物組合物，所述抗體是特異性識(shí)別由SEQ ID NO 34的氨基酸序列構(gòu)成的部位的抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的癌癥治療用藥物組合物，所述癌癥治療是抑制癌 癥轉(zhuǎn)移。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的癌癥治療用藥物組合物，所述癌癥治療是抑制癌 癥原發(fā)病灶的增殖。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的癌癥治療用藥物組合物，所述癌癥治療是抑制癌 癥骨浸潤(rùn)和/或由于癌癥骨浸潤(rùn)導(dǎo)致的骨破壞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 6任一項(xiàng)所述的癌癥治療用藥物組合物，前述癌是食道癌、肺癌、 胸腺癌、胰腺癌、甲狀腺癌、胃癌、小腸癌、結(jié)腸(大腸)癌、直腸癌、肝癌、膀胱癌、腎癌、乳 癌、乳管癌、乳腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巢癌、睪丸癌、淋巴瘤、腎上腺癌、前列腺癌、骨肉 瘤、惡性黑色素瘤、滑膜瘤、或者白血病。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 6任一項(xiàng)所述的癌癥治療用藥物組合物，前述癌是惡性黑色素瘤 或者乳癌。
9.癌癥診斷方法，其包括使用針對(duì)由選自SEQID N0:3、SEQ IDN0:4和SEQ ID NO 21 中的任意一個(gè)氨基酸序列構(gòu)成的肽的抗體，測(cè)定生物體試樣中具有由外顯子-17編碼的肽 區(qū)域的骨膜素量的工序。
10.癌癥診斷劑，其含有針對(duì)由選自SEQID N0:3、SEQ ID NO :4和SEQ ID N0:21中的 任意一個(gè)氨基酸序列構(gòu)成的肽的抗體。
11.癌癥診斷方法，其包括通過(guò)由SEQID NO :35的核苷酸和SEQID NO :36的核苷酸構(gòu) 成的PCR引物，測(cè)定生物體試樣中具有由外顯子-17編碼的肽區(qū)域的骨膜素量的工序。
12.癌癥診斷劑，其包括由SEQID NO :35的核苷酸和SEQ ID NO :36的核苷酸構(gòu)成的 PCR引物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種針對(duì)具有抗細(xì)胞粘附活性的骨膜素的抗體，尤其是具有中和抗細(xì)胞粘附作用的能力的抗骨膜素抗體，以及使用該抗體的骨膜素相關(guān)疾病的預(yù)防或治療藥。而且，還提供了使用該抗體的試樣中的該多肽的檢測(cè)和定量方法，以及通過(guò)用該方法測(cè)定骨膜素量從而診斷骨膜素相關(guān)疾病的方法。
文檔編號(hào)A61K39/395GK101888855SQ20088002100
公開(kāi)日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2008年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月27日
發(fā)明者森下龍一, 葛城鳴門(mén), 谷山義明 申請(qǐng)人:阿斯比奧制藥株式會(huì)社;國(guó)立大學(xué)法人大阪大學(xué)