專利名稱：：受體酪氨酸激酶抑制劑及其使用方法受體酪氨酸激酶抑制劑及其使用方法相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)涉及并要求以下申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)2008年3月24日遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)61/070，506,2007年12月28日遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)61/009，482和2007年6月5日遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/933，238。通過這種引用將前述每一申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容并入本申請(qǐng)中。關(guān)于聯(lián)邦資助的研究或開發(fā)的聲明本發(fā)明是按照國(guó)立衛(wèi)生研究院授予的約定R01-AR051448、R01-AR051886、和P50AR054086合約在政府的支持下作出的。政府在本發(fā)明中享有一定權(quán)利。
背景技術(shù)：
：干細(xì)胞因子(SCF)是通過結(jié)合并激活受體酪氨酸激酶Kit(亦稱SCF-受體)而介導(dǎo)其多樣的細(xì)胞應(yīng)答的細(xì)胞因子。Kit最初是作為貓科反向病毒中捕獲激活和截短形式的表面受體的致癌基因發(fā)現(xiàn)(Besmer等(1986)JVirol60:194-203.)。SCF由鼠steel(SI)基因座編碼，而Kit則由小鼠中的顯性白斑(W)基因座編碼(Copeland等(1990)Cell63175-183;Huang等(1990)Cell63225-233；Flanagan^PLeder(1990)Cell63:185-194.；Tan等(1990)Science247209-212；Bernstein等(1990)CibaFoundSymp148158-166；discussion166-172)。SCF作為非共價(jià)同型二聚體發(fā)揮作用，且通過交替RNA剪切以及通過蛋白水解加工產(chǎn)生的膜錨定形式和可溶形式的SCF均已有所記述(綜述于Ashman(1999)IntJBiochemCellBiol31:1037-1051)。Kit是受體酪氨酸激酶(RTK)III型家族的成員，該家族還包括PDGF-受體-a和0、CSF-1-受體(亦稱作M-CSF-受體或Fms)以及Flt3-受體(亦稱作Flk2)(綜述于Ullrich和Schlessinger(1990)Cell61203-212；Blume-Jensen等(2001)Nature411:355_365)。Kit由糖基化的胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(胞外域)構(gòu)成，該結(jié)構(gòu)域通過單一跨膜(TM)結(jié)構(gòu)域連接于胞質(zhì)區(qū)(綜述于Schlessinger(2000)Cell103:211_225)。Kit和其它III型RTK的成員的胞外域均含有五個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域，其中第二和第三膜遠(yuǎn)端結(jié)構(gòu)域表明在配體識(shí)別中起作用(綜述于Ullrich和Schlessinger(1990)Cell61:203_212)。細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域僅由多個(gè)Ig_樣重復(fù)序列組成的其它RTK包括VEGF-受體家族(7個(gè)Ig-樣結(jié)構(gòu)域)、CCK4-受體(7個(gè)Ig-樣結(jié)構(gòu)域)和FGF-受體(3個(gè)Ig-樣結(jié)構(gòu)域)的成員。Kit的胞質(zhì)區(qū)含有帶有大的激酶插入?yún)^(qū)的蛋白酪氨酸激酶(PTK)結(jié)構(gòu)域；這是III型RTK的另一個(gè)標(biāo)志。SCF與Kit的結(jié)合導(dǎo)致受體二聚化、分子間自磷酸化和PTK活化。有人提出，Kit的第四Ig樣結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)響應(yīng)于單價(jià)或者二價(jià)SCF結(jié)合的Kit二聚化(Lev等(1992b)JBiolChem26715970-15977；Blechman等(1995)Cell80:103-113)。然而，其它研究證明配體誘導(dǎo)的Kit二聚化是由SCF的二價(jià)結(jié)合驅(qū)動(dòng)的(Philo等(1996)JBiolChem271:6895_6902；Lemmon等(1997)JBiolChem272:6311-6317)。在SCF或Kit基因座發(fā)生突變的小鼠的特征已經(jīng)表明SCF和Kit是造血細(xì)胞、黑素細(xì)胞、生殖細(xì)胞和腸起搏細(xì)胞(intestinalpacemakercell)的發(fā)育所需要的(綜述于Ashman(1999)IntJBiochemCellBiol31:1037-1051)。在人體中，Kit的失能(lossoffunction)突變引起特征是前胸和腹部脫色的花斑(piebald)性狀、毛發(fā)的白色fareflock、耳聾和便秘(Fleischman等(1991)ProcNatlAcadSciUSA8810885-10889)。在不同類型的人類癌癥中發(fā)現(xiàn)了多種Kit的獲能(gain-of-function)突變。在其它癌癥中，在胃腸間質(zhì)瘤(GIST)、急性骨髓性白血病(AML)和肥大細(xì)胞白血病(MCL)中發(fā)現(xiàn)了活化的Kit突變。在膜近側(cè)Ig_樣結(jié)構(gòu)域(D5)(外顯子8和9)、近膜(juxtamembrane)(JM)結(jié)構(gòu)域(外顯子11)和酪氨酸激酶(PTK)結(jié)構(gòu)域(外顯子17)中鑒定出突變(參見Forbes等(2006)COSMIC2005.BRJ.CANCER，94:318_22.SomaticmutationdatabaseCatalogueofSomaticMutationsinCancerhttp://www.Sanger,ac.uk/genetics/CGP/cosmic/)。盡管有很好的證據(jù)表明在JM和PTK結(jié)構(gòu)域中的獲能突變通過解除自身抑制性約束而導(dǎo)致Kit的組成型活化(Mol等(2004)JBiolChem.27931655-31663)，但尚不理解在胞外域的D5中發(fā)生獲能突變的分子機(jī)制。仍需要更好地表征RTK(如Kit和PDGFR、以及SCF、PDGFa/日)和結(jié)合的Kit/SCF復(fù)合體的結(jié)構(gòu)。這樣的表征將導(dǎo)致廣泛識(shí)別可以被藥物、藥品或其它生物制劑作為靶標(biāo)的區(qū)域。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供結(jié)合人受體酪氨酸激酶，例如III型或V型受體酪氨酸激酶(如人Kit(亦稱SCF受體)或PDGFRa/^)，的胞外域(例如Ig樣結(jié)構(gòu)域或Ig樣結(jié)構(gòu)域之間的鉸鏈)的成分(moiety)，例如抗體或其抗原結(jié)合部分、小分子、肽類分子(p印tidecmolecule)、適體(aptamer)和adnectin。本發(fā)明的成分將受體酪氨酸激酶的胞外域鎖定在非活性狀態(tài)，從而抑制受體酪氨酸激酶的活性。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述成分將受體酪氨酸激酶的胞外域鎖定至單體狀態(tài)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述成分允許受體酪氨酸激酶的胞外域二聚化，但是影響兩個(gè)單體的Ig樣結(jié)構(gòu)域之間(例如III型受體酪氨酸激酶的D4-D4或D5-D5結(jié)構(gòu)域或者V型受體酪氨酸激酶的D7-D7結(jié)構(gòu)域)的定位、定向和/或距離，從而抑制受體酪氨酸激酶的活性。換言之，所述成分可以允許配體誘導(dǎo)的受體酪氨酸激酶胞外域的二聚化，但是影響兩個(gè)胞外域在細(xì)胞表面界面處的定位，或者改變或阻止受體酪氨酸激酶的構(gòu)象變化，從而抑制受體酪氨酸激酶的活性(例如抑制受體內(nèi)化和/或抑制受體的酪氨酸自磷酸化和/或抑制受體激活下游的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的能力)。本發(fā)明(至少部分地)基于單體形式和配體誘導(dǎo)的同型二聚體形式的受體酪氨酸激酶Kit的整個(gè)胞外域的晶體結(jié)構(gòu)的解碼。這些晶體結(jié)構(gòu)的解碼使得能夠識(shí)別本發(fā)明的成分可能靶向的表位，例如構(gòu)象表位(conformational印itope)。本發(fā)明也至少部分地基于如下發(fā)現(xiàn)不是在受體二聚化中起作用，而是相鄰受體之間的同型D4(以及同型D5)相互作用需要兩個(gè)受體的膜近側(cè)區(qū)以使得兩個(gè)受體的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域之間能夠發(fā)生相互作用從而引起酪氨酸激酶活化的距離和方向精確定位。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人受體酪氨酸激酶的胞外域(例如Ig樣結(jié)構(gòu)域或鉸鏈區(qū))的成分，其中所述成分將受體酪氨酸激酶的胞外域鎖定在非活性狀態(tài)，從而拮抗受體酪氨酸激酶的活性。在一種實(shí)施方式中，所述Ig樣結(jié)構(gòu)域可以負(fù)責(zé)或不負(fù)責(zé)配體與受體酪氨酸激酶的結(jié)合。在另一種實(shí)施方式中，所述成分可以阻斷或不阻斷受體酪氨酸激酶和受體酪氨酸激酶配體之間的相互作用。在又一實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分可以阻止或不阻止受體酪氨酸激酶的二聚化。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分可以不阻止配體誘導(dǎo)的受體二聚化，但阻止受體酪氨酸激酶活化所需要的膜近側(cè)區(qū)之間的同型或異型相互作用。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分阻止受體酪氨酸激酶的各原聚體的胞外域的膜近側(cè)區(qū)之間的同型或異型相互作用。例如，本發(fā)明的成分可以引起來自受體酪氨酸激酶的各原聚體的胞外域終點(diǎn)(最接近質(zhì)膜的胞外域的末端)被分隔大于約15人、約20A、約25人、約30人、約35入或約40入的距離。在優(yōu)選實(shí)施方式中，受體酪氨酸激酶是III型受體酪氨酸激酶，例如Kit、PDGFRa、PDGFR旦、CSF1R、Fms、Flt3或Flk2。在其他的實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分結(jié)合的Ig樣結(jié)構(gòu)域是III型受體酪氨酸激酶的D4結(jié)構(gòu)域。在一種特定實(shí)施方式中，所述成分結(jié)合D4相互作用位點(diǎn)的以下共有序列uyyyycAWG，其中L是亮氨酸，R是精氨酸，G是甘氨酸選自蘇氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、天門冬酰胺或賴氨酸；X2選自亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸；x3選自賴氨酸、組氨酸、天門冬酰胺和精氨酸；X4選自甘氨酸、纈氨酸、丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸；X5選自蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸；x6選自谷氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺；以及x7選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸、賴氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和蘇氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分結(jié)合的Ig樣結(jié)構(gòu)域是III型受體酪氨酸激酶的D5結(jié)構(gòu)域，例如人Kit的氨基酸殘基309-413或410-519。在一種特定實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分可以結(jié)合來自D5相互作用位點(diǎn)的保守氨基酸的共有序列。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分結(jié)合III型受體酪氨酸激酶D4或D5結(jié)構(gòu)域的突變體或者結(jié)合V型受體酪氨酸激酶D7結(jié)構(gòu)域的突變體。在一種特定實(shí)施方式中，所述成分結(jié)合人Kit的突變D5結(jié)構(gòu)域的點(diǎn)突變，其中所述突變選自Thr417、Tyr418、Asp419、Leu421、Arg420、Tyr503和Ala502。在一些實(shí)施方式中，III型受體酪氨酸激酶是人Kit，且本發(fā)明的成分結(jié)合選自以下表4中所示的那些氨基酸殘基的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，例如2個(gè)以上、3個(gè)以上、4個(gè)以上、5個(gè)以上、6個(gè)以上、7個(gè)以上、8個(gè)以上、9個(gè)以上、10個(gè)以上、11個(gè)以上、12個(gè)以上、13個(gè)以上、14個(gè)以上、15個(gè)以上、16個(gè)以上、17個(gè)以上或18個(gè)以上氨基酸殘基。例如，本發(fā)明的成分可以結(jié)合以下殘基中的一個(gè)或多個(gè)Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206、P206、F208、K127、A207、V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268、Y269、T295、L222、L222、L223、E306、V308、R224、V308、K310、K218、A219、S220、K218、A220、Y221、A339、D327、D398、E338、E368、E386、F312、F324、F340、F355、G311、G384、G387、G388、I371、K342、K358、L382、L379、N326、N367、N370、N410、P341、S369、T385、V325、V407、V409、Y373、Y350、Y408、T380、T390、R381、R353、T411、K412、E414、K471、F433、G470、L472、V497、F469、A431或G432。在特定實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分結(jié)合選自K218、S220、Y221、L222、F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、I371和Y373的Kit受體中的至少一個(gè)氨基酸殘基或者選自Y350、R353、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386和T390的Kit受體中的至少一個(gè)氨基酸殘基。本發(fā)明的成分可以結(jié)合形成表4中確認(rèn)的口袋或腔的所有殘基，或者它們可以結(jié)合形成口袋或腔的殘基的一部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分可以容易地靶向于其它III型RTK中對(duì)應(yīng)于上面所列舉的殘基的殘基，例如形成相似的口袋或腔的那些殘基或通過結(jié)構(gòu)比對(duì)或序列比對(duì)處于相同位置的那些殘基。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分結(jié)合人Kit的氨基酸殘基381Arg和386G1u。在又一實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分結(jié)合人Kit的氨基酸殘基418Tyr和/或505Asn。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分結(jié)合PDGFRa或PDGFR0受體。在類似的實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分結(jié)合人PDGFR0的氨基酸殘基385Arg和/或39°G1u，或者PDGFRa中的相應(yīng)殘基。在又一實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分結(jié)合III型RTK上的構(gòu)象表位。在特定實(shí)施方式中，所述構(gòu)象表位由來自III型RTK的D3、D4或D5結(jié)構(gòu)域或鉸鏈區(qū)的兩個(gè)或多個(gè)殘基組成，例如人Kit受體或PDGF受體。在進(jìn)一步的特定實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分可以結(jié)合由選自表4中所示的那些氨基酸殘基的兩個(gè)或多個(gè)殘基組成的人Kit受體中的構(gòu)象表位，例如2個(gè)以上、3個(gè)以上、4個(gè)以上、5個(gè)以上、6個(gè)以上、7個(gè)以上、8個(gè)以上、9個(gè)以上、10個(gè)以上、11個(gè)以上、12個(gè)以上、13個(gè)以上、14個(gè)以上、15個(gè)以上、16個(gè)以上、17個(gè)以上或18個(gè)以上氨基酸殘基。在一種特別實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分結(jié)合由選自Y125、H180、R181、K203、V204、R205、P206.V238、S239、S240、H263、G265、D266、F267、N268和Y269的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸組成的構(gòu)象表位。在相似的實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分可以結(jié)合由選自以下氨基酸組之一的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸組成的構(gòu)象表位P206、F208、V238和S239；K127、A207、F208和T295；L222、A339、F340、K342、E368、S369、N370、1371和Y373；L222、L223、E306、V308、F312、E338、F340和1371；R224、V308、K310、G311、F340、P341和D398；K218、A219、S220、N367、E368和S369；K218、A220、E368和S369；G384、T385、T411、K412、E414和K471；Y408、F433、G470、K471和L472；F324、V325、N326和N410；D327、N410、T411、K412和V497；G384、G387、V409和K471；L382、G387、V407和V409；Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206、F208、V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268和Y269；P206、F208、V238和S239；K218、S220、Y221、L222、F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、1371和Y373；G384、G387、G388、Y408、V409、T411、F433、F469、G470和K471；D327、T411、K412、E414、A43UG432和K471；Y350、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386和T390；Y350、R353和F355。如上所示，本發(fā)明的成分可以結(jié)合形成在表4中確認(rèn)的口袋或腔的所有氨基酸殘基，或者它們可以結(jié)合形成口袋或腔的殘基的一部分。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分結(jié)合構(gòu)象表位，其中構(gòu)象表位由選自表5中所列的肽的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成。在一種特定實(shí)施方式中，構(gòu)象表位由選自第一肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基和選自第二肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成，其中第一和第二肽選自表5中所列的肽的組。因而，本發(fā)明的成分可以結(jié)合其中第一和第二肽的組如下的構(gòu)象表位Ala219-Leu222和Thr304_Val308；Asp309_Gly311和Arg224_Gly226；Thr303-Glu306和Ala219_Leu222；Asn367_Asn370和Ser217_Tyr221；Ala339-Pro343和Asn396-Val399；Ala339-Pro343和Glu368-Arg372；Lys358-Tyr362和Val374_His378；Asp357-Glu360和Leu377_Thr380；Met351_Glu360和His378_Thr389；His378_Thr389和Val323-Asp332；Val409-Ile415和Ala493-Thr500；Val409-Ile415和Ala431-Thr437；Val409-Ile415和Phe469_Val473；Val409_Ile415和Val325_Asn330；Val409_Ile415和Arg381-Gly387；Gly466-Leu472和Gly384-Gly388；Val325_Glu329和Tyr494-Lys499；Thr411-Leu416和Val497_Ala502；Ile415_Leu421和Ala502-Ala507；Ala502-Ala507和Lys484-Thr488；及Ala502_Ala507和Gly445_Cys450。本發(fā)明的成分可以結(jié)合形成上述第一和第二肽組的所有氨基酸殘基，或者它們可以結(jié)合形成第一和第二肽組的殘基的一部分。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分結(jié)合作為VEGF受體家族成員的受體酪氨酸激酶(V型受體酪氨酸激酶)，例如VEGFR-I(Fltl)、VEGFR-2(Flkl)和VEGFR-3(Flt4)。在一些實(shí)施方式中，由本發(fā)明的成分結(jié)合的Ig樣結(jié)構(gòu)域可以是VEGF受體家族會(huì)員的D7結(jié)構(gòu)域。在一種特定實(shí)施方式中，所述成分結(jié)合VEGF受體家族成員的D7結(jié)構(gòu)域的以下共有序列=IX1RVX2X3EDX4G(SEQIDNO:1)，其中I是異亮氨酸，R是精氨酸，E是谷氨酸，D是天冬氨酸，G是甘氨酸A1選自谷氨酸、精氨酸和谷氨酰胺；X2選自精氨酸和蘇氨酸；X3選自谷氨酸和賴氨酸；以及X4選自谷氨酸和丙氨酸。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分是分離的抗體或其抗原結(jié)合部分。所述抗體或其抗原結(jié)合部分可以是人抗體、人源化抗體、雙特異性抗體或嵌合抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含選自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE恒定區(qū)的重鏈恒定區(qū)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述抗體重鏈恒定區(qū)是IgGl。另外，本發(fā)明的成分可以是抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分選自Fab片段、F(ab’)2片段、單鏈Fv片段、SMIP、親和體(affibody)、高親合性多聚體(Avimer)、納米體(nanobody)和單結(jié)構(gòu)域抗體。在特別的實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分以IxlO-7M或更低、更優(yōu)選5x10_8M或更低、更優(yōu)選1X10_8M或更低、更優(yōu)選5X10_9M或更低的Kd結(jié)合受體酪氨酸激酶的Ig樣結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合人Kit的氨基酸殘基309-413和/或410-519，從而將人Kit的胞外域鎖定在非活性狀態(tài)并拮抗人Kit的活性。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明包括產(chǎn)生本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分的雜交瘤。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分是小分子。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的小分子結(jié)合選自表4中所示的氨基酸殘基的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。例如，本發(fā)明的小分子可以結(jié)合以下殘基中的一個(gè)或多個(gè)Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206、P206、F208、K127、A207、V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268、Y269、T295、L222、L222、L223、E306、V308、R224、V308、K310、K218、A219、S220、K218、A220、Y221、A339、D327、D398、E338、E368、E386、F312、F324、F340、F355、G311、G384、G387、G388、I371、K342、K358、L382、L379、N326、N367、N370、N410、P341、S369、T385、V325、V407、V409、Y373、Y350、Y408、T380、T390、R381、R353、T411、K412、E414、K471、F433、G470、L472、V497、F469、A431或G432。在一種特定實(shí)施方式中，本發(fā)明的小分子結(jié)合選自K218、S220、Y221、L222、F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、1371和Y373的Kit受體中的至少一個(gè)氨基酸殘基。在相關(guān)的實(shí)施方式中，本發(fā)明的小分子結(jié)合選自Y350、R353、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386和T390的Kit受體中的至少一個(gè)氨基酸殘基。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的小分子可以容易地靶向其它III型RTK中相應(yīng)于以上所列的殘基的殘基，例如形成相似的口袋或腔的那些殘基或通過結(jié)構(gòu)比對(duì)或序列比對(duì)處于相同的位置的那些殘基。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分是肽類分子。在一些實(shí)施方式中，基于受體酪氨酸激酶的Ig樣結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)所述肽類分子。在一種特定實(shí)施方式中，基于Kit的D4結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)本發(fā)明的肽類分子。本發(fā)明的肽類分子可以包含保守的D4相互作用位點(diǎn)，例如，如上所述的D4共有序列(LXiRWWWG)，或者通過比對(duì)或比較III型受體酪氨酸激酶的D4結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生的其它序列。在另外的實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽類分子包含與人Kit的氨基酸殘基309-413至少80%相同的結(jié)構(gòu)，或者與人Kit的氨基酸殘基410-519至少80%相同的結(jié)構(gòu)。肽部分還可以基于Kit的D5結(jié)構(gòu)域進(jìn)行設(shè)計(jì)，且在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，可以包含通過比對(duì)或比較III型受體酪氨酸激酶的D5結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生的共有序列。在可選的實(shí)施方式中，基于突變D5結(jié)構(gòu)域的序列或共有序列設(shè)計(jì)肽類分子。本發(fā)明的肽成分可以是包含或由本文中確定的任何氨基酸序列(例如SEQIDNOs:1-89、92、93和105-157)組成的肽。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽類分子包含至少一個(gè)D-氨基酸殘基。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分是adnectin。另外，在一些實(shí)施方式中本發(fā)明的小分子和肽類分子結(jié)合目標(biāo)RTK中的構(gòu)象表位。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明的小分子和肽類分子結(jié)合目標(biāo)RTK中不是構(gòu)象表位的表位。在另一方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的成分的任一種和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。在另外的方面，本發(fā)明提供治療或預(yù)防對(duì)象的受體酪氨酸激酶相關(guān)疾病的方法。所述方法包括向?qū)ο笫┯糜行Я康谋景l(fā)明的成分(例如結(jié)合III型受體酪氨酸激酶的D4或D5結(jié)構(gòu)域或V型受體酪氨酸激酶的D7結(jié)構(gòu)域的成分)，從而治療或預(yù)防所述疾病。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述受體酪氨酸激酶相關(guān)疾病是癌癥，例如GIST、AML和SCLC。在另一方面，本發(fā)明提供治療或預(yù)防對(duì)象的受體酪氨酸激酶相關(guān)疾病的方法，通過向所述對(duì)象施用有效量的結(jié)合人III型受體酪氨酸激酶的D3-D4和/或D4-D5鉸鏈區(qū)的成分，從而治療或預(yù)防所述疾病。在特定實(shí)施方式中，所述受體酪氨酸激酶相關(guān)疾病是癌癥，例如GIST、AML和SCLC。在另一方面，本發(fā)明提供用于鑒定結(jié)合受體酪氨酸激酶的Ig樣結(jié)構(gòu)域并將所述受體酪氨酸激酶的胞外域鎖定至非活性狀態(tài)的成分的方法。該方法包括使受體酪氨酸激酶與候選成分接觸；同時(shí)或順序地使受體酪氨酸激酶與受體酪氨酸激酶的配體接觸；以及確定所述成分是否影響配體誘導(dǎo)的二聚體受體酪氨酸激酶的Ig樣結(jié)構(gòu)域之間的定位、定向和/或距離，從而鑒定結(jié)合受體酪氨酸激酶的Ig樣結(jié)構(gòu)域并將受體酪氨酸激酶的胞外域鎖定至非活性狀態(tài)的成分。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供用于鑒定將III型受體酪氨酸激酶的胞外域鎖定至非活性狀態(tài)的成分的方法。該方法包括使III型受體酪氨酸激酶與候選成分接觸；同時(shí)或順序地使受體酪氨酸激酶與受體酪氨酸激酶的配體接觸；以及確定所述成分是否影響配體誘導(dǎo)的二聚體受體酪氨酸激酶的D4-D4或D5-D5結(jié)構(gòu)域之間的定位、定向和/或距離，從而鑒定將III型受體酪氨酸激酶的胞外域鎖定至非活性狀態(tài)的成分。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將從以下詳細(xì)說明和權(quán)利要求中清晰可見。附圖簡(jiǎn)要說明本專利或申請(qǐng)文件含有至少一副以彩色制作的附圖。經(jīng)請(qǐng)求并支付必要的費(fèi)用，專利局將提供含彩色附圖的本專利或?qū)＠暾?qǐng)公開的副本。圖IA-E描繪Kit胞外域的晶體結(jié)構(gòu)。圖IA顯示Kit胞外域單體的帶狀柵圖(ribbondiagram)(左)禾口表面表現(xiàn)圖(surfacer印resentation)(右)。右圖顯示沿著左圖中所示視圖的縱軸旋轉(zhuǎn)90°后的視圖。Dl著藍(lán)色，D2綠色，D3黃色，D4橙色，D5粉紅色，N末端和C末端被標(biāo)記。Dl和D5中的二硫鍵以球-棍顯示，使硫原子著橙色。天門冬酰胺連接的糖以棍型顯示。圖IB-E提供D1-D2(B)、D2-D3(C)、D3-D4(D)和D4-D5(E)界面的詳圖。色彩編碼同圖1A。標(biāo)記了參與結(jié)構(gòu)域-結(jié)構(gòu)域相互作用的氨基酸，并且氫鍵繪成斷續(xù)的黃線。根據(jù)IgSF命名法指定二級(jí)結(jié)構(gòu)元件。圖2A-B描繪SCF-Kit胞外域22復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)。圖2A顯示SCF-Kit22復(fù)合體的帶狀柵圖。Dl至D5的色彩編碼與圖1相同，并且SCF著洋紅色。Kit和SCF的N和C末端被標(biāo)記。Dl和D5中的二硫鍵以球-棍顯示，硫原子著橙色。天門冬酰胺連接的糖以棍型表示。箭頭標(biāo)記SCF-Kit22復(fù)合體中的大空腔。圖2B顯示SCF-Kit胞外域22復(fù)合體的表面表現(xiàn)圖。該圖顯示頂視圖(頂部圖)、正視圖(中間左圖)、側(cè)視圖(中間右圖)和底視圖(下圖)。色彩編碼同圖2A。視圖表明SCF二聚體通過兩個(gè)對(duì)應(yīng)Kit胞外域的D1、D2和D3對(duì)稱地相互作用。此外，Kit胞外域通過兩個(gè)相鄰受體的D4(橙色)之間和D5(粉紅色)之間的側(cè)面接觸而形成類似性的(homophylic)相互作用。圖3A-E描繪Kit識(shí)別SCF。圖3A顯示SCF-Kit界面的視圖。SCF和Kit胞外域中包埋表面內(nèi)的氨基酸通過拉開兩個(gè)分子而呈現(xiàn)。該圖顯示KitDl-D2-D3(左)和SCF(右)的分子表面。酸性氨基酸以紅色顯示，堿性氨基酸以藍(lán)色顯示，極性氨基酸以橙色顯示，而疏水性氨基酸以黃色顯示。Kit上的SCF結(jié)合位點(diǎn)-I、位點(diǎn)-II和位點(diǎn)-III被圈出。圖3B描繪配體-受體界面中靜電勢(shì)的互補(bǔ)性。右圖顯示沿著左圖所示靜電表面的縱軸旋轉(zhuǎn)180°后的視圖。D1-D2-D3的靜電表面電勢(shì)疊合在分子表面上，具有著綠色的結(jié)合SCF的草圖的印記。右圖描繪著藍(lán)色(正的)和紅色(負(fù)的)的SCF結(jié)合Kit的靜電表面電勢(shì)。Kit以著青色的帶狀柵圖的形式顯示。圖3C-E顯示SCF-Kit界面的位點(diǎn)-I(C)、位點(diǎn)-II(D)和位點(diǎn)-III(E)的特寫視圖。SCF著綠色，而Kit著青色。相互作用的氨基酸被標(biāo)記，氫鍵繪成斷續(xù)的環(huán)線，而二級(jí)結(jié)構(gòu)元件標(biāo)記在帶和線上。圖4A-C描繪結(jié)合于Kit時(shí)SCF中的構(gòu)象變化。圖4A顯示兩個(gè)SCF原聚體之間的角度在Kit結(jié)合后改變。該視圖顯示游離SCF(綠色)和結(jié)合于Kit的SCF(洋紅)的草圖。一個(gè)SCF原聚體(左)的疊合揭示了第二原聚體(右)的大約5°的角運(yùn)動(dòng)，如測(cè)量螺旋αC所得。螺旋被標(biāo)記并顯示為圓柱。圖4Β描繪在結(jié)合Kit后SCF的N-末端的構(gòu)象變化。Kit的位點(diǎn)-III顯示為分子表面(灰色)，游離SCF的N-末端顯示為綠色，而結(jié)合于Kit的SCF的N-末端為洋紅色。Cys4’和Cys89’之間的二硫鍵顯示為黃色球體。關(guān)鍵氨基酸被標(biāo)記，并顯示為棍型。圖4C描繪在結(jié)合于Kit的位點(diǎn)-I后SCF的αC-β2環(huán)中的構(gòu)象變化。色彩編碼同圖4Β。圖5Α-Β描繪在結(jié)合SCF后KitD4和D5的重構(gòu)。圖5A顯示在SCF-Kit復(fù)合體中D4和D5的重構(gòu)。來自Kit單體的D3與結(jié)合于SCF的Kit的D3(兩者均著藍(lán)色)的疊合表明結(jié)合形式的D4(紅色)相對(duì)于游離形式的D4(綠色)的位置移動(dòng)了22°。兩種形式的D4(均為藍(lán)色)的疊合(右圖)表明SCF結(jié)合形式的D5(紅色)相對(duì)于游離形式的D5(綠色)的位置移動(dòng)了27°。兩個(gè)底部圖顯示單體(綠色)和同型二聚體(紅色)形式的D3-D4和D4-D5界面的鉸鏈區(qū)的近視圖。圖5B顯示SCF占據(jù)的Kit的D4和D5的表面表現(xiàn)圖(頂圖)，以與圖2同樣的方向觀察。黑色輪廓顯示通過SCF結(jié)合于配體結(jié)合區(qū)連接的Kit胞外域單體的D4和D5的位置。D4和D5的重構(gòu)導(dǎo)致兩個(gè)相鄰胞外域的C末端彼此距離從75人移動(dòng)到15人。下圖顯示來自SCF-Kit復(fù)合體的細(xì)胞膜(底視圖)的視圖。注意沿著X軸的90°旋轉(zhuǎn)。D1至D5的色彩編碼同圖1。圖6A-D描繪D4-D4和D5-D5界面的視圖。圖6A(頂部圖)顯示在1.1o水平處繪制的2Fo-Fc電子密度圖，顯示D4-D4界面的視圖。Kit原聚體的主鏈分別表示為粉紅色和黃色管。兩個(gè)相鄰胞外域的D4-D4界面的近視圖(底部圖)。在兩個(gè)鄰近的D4的Arg381和Glu386之間形成的鏈間氫鍵著色為黃色。關(guān)鍵氨基酸被標(biāo)記，并顯示為棍型。根據(jù)IgSF命名法標(biāo)記二級(jí)結(jié)構(gòu)元件。圖6B描繪III型和V型RTK家族成員之間的D4-D4二聚化基序的保守性。人Kit(AAC50969.1)的殘基370-398(SEQIDNO94)與以下序列比對(duì)小鼠(AAH75716.1)(SEQIDNO95)、雞(NP_989692.1)(SEQIDNO96)、爪蟾(AAH61947)(SEQIDNO97)、真螈(AAS91161.1)(SEQIDNO98)和斑馬魚(A型(SEQIDNO99)和B型(SEQIDNO100)(NP_571128,XP_691901)同系物。還顯示了來自人的CSF1R的氨基酸序列(P07333)(SEQIDNO:101)、小鼠的CSF1R的氨基酸序列(P09581)(SEQIDNO102)和虎河豚A型(SEQIDNO103)和B型(SEQIDNO104)(P79750,Q8UVR8)的CSF1R的氨基酸序列及來自人類的PDGFRa和PDGFR旦的序列(分別是SEQIDNO:105和107)(P16234，P09619)和小鼠的PDGFRa禾口PDGFR3的序列(分別是SEQIDN0:106和108)(NP_035188,P05622)。也呈現(xiàn)了人VEGFR1-3型的V型RTK的氨基酸序列(按照出現(xiàn)的順序分別為SEQIDNO109-111)(第七Ig樣結(jié)構(gòu)域)(P17948、P35968和P35916)。在序列比對(duì)的頂部標(biāo)記7Kit的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件。Arg381和Lys383、Leu382和Leu379、Glu386和Gly388的保守殘基分別著藍(lán)色、黃色、紅色和綠色。圖6C描繪了D5-D5界面的帶狀柵圖。兩個(gè)鄰近的Kit原聚體的A和G股參與形成D5-D5界面。通過兩個(gè)相鄰受體的Tyr418和Asn505之間的側(cè)面相互作用(很可能通過離子或水分子)保持D5-D5界面。圖6D描繪Kit的D4和D5的靜電勢(shì)表面。這些圖顯示D4-D4相互作用表面的正視圖(右)和沿著縱軸旋轉(zhuǎn)90°的視圖(左)。酸性補(bǔ)丁(acidicpatch)的位置和D4-D4界面被圈出，且相互作用殘基Arg381和Glu386被標(biāo)記。圖7A-C描繪參與癌癥和其它疾病的Kit胞外域突變以及Kit和其它RTK活化的機(jī)制。圖7A描繪負(fù)責(zé)花斑性狀的失能突變示于左圖。D1(藍(lán)色)、D2(綠色)和D3(黃色)的帶狀柵圖以及SCF的表面表現(xiàn)圖(灰色)。突變的氨基酸著紅色。負(fù)責(zé)GIST、SCLC和AML的獲能突變顯示于右圖。同型二聚體形式的D4和D5的表面表現(xiàn)圖著灰色。在GIST中加倍的Ala502和Tyr503以藍(lán)色顯示，靠近Asp419的缺失和插入突變(AML和NCLL)以綠色顯示。注意激活的Kit突變限于D5-D5界面。圖7B顯示Kit活化受到D4-D4界面中的點(diǎn)突變損害。瞬時(shí)表達(dá)野生型Kit(WT)、D4中的R381A或E386A點(diǎn)突變的HEK293細(xì)胞如所示的在37°C以lOng/mlSCF刺激六分鐘(上部左圖)。采用抗Kit抗體使未刺激的或SCF刺激的細(xì)胞的溶解產(chǎn)物進(jìn)行免疫沉淀(IP)，接下來進(jìn)行SDS-PAGE，并用抗Kit抗體或抗磷酸酪氨酸(P-Tyr)抗體進(jìn)行免疫印跡分析。根據(jù)抗p-Tyr免疫印跡(右上圖)進(jìn)行的Kit的酪氨酸自磷酸化的密度定量。用不同濃度的SCF處理穩(wěn)定表達(dá)野生型Kit(WT)或R381A突變體的3T3細(xì)胞。采用抗Kit抗體使來自未刺激或SCF刺激的細(xì)胞的溶解產(chǎn)物進(jìn)行免疫沉淀，接下來進(jìn)行SDS-PAGE，并用抗Kit抗體或抗p-Tyr抗體進(jìn)行免疫印跡分析(左下圖)。使用天然SCF進(jìn)行細(xì)胞結(jié)合125I-SCF的置換測(cè)定。表達(dá)WT(■)、R381A(▼)、R381A/E386A()或激酶陰性Kit(A)的3T3細(xì)胞在存在濃度增加的天然SCF的情況下用125I-SCF處理。SCF對(duì)WTKit的EC50(置換50%的結(jié)合到c_Kit的125I_SCF的配體濃度)(1.InM)與SCF對(duì)R381A(1.OnM)、R381A/E386A(0.8nM)或激酶陰性Kit突變體(1.4nM)的EC50相當(dāng)。圖7C示出由在相鄰細(xì)胞的細(xì)胞表面上表達(dá)的可溶性(左圖)或膜錨定(右圖)SCF分子驅(qū)動(dòng)的Kit及其他RTK活化的模型。SCF結(jié)合到D1-D2-D3配體結(jié)合模塊使得兩個(gè)結(jié)合的Kit胞外域單體的C-末端彼此相距在75人之內(nèi)。D3-D4和D4-D5鉸鏈的靈活性使得D4-D4和D5-D5側(cè)面相互作用成為可能，該相互作用使兩個(gè)相鄰胞外域的C-末端彼此相距在15A之內(nèi)。因此，Kit胞質(zhì)域的接近度和局部濃度增加導(dǎo)致在激酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)調(diào)節(jié)性酪氨酸殘基的自磷酸化，這引起PTK活化。(注意，PTK活化在該模型中未繪出。)在胞質(zhì)域中關(guān)鍵酪氨酸磷酸化之后，發(fā)生細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)分子的補(bǔ)體的募集和活化。該模型基于游離的SCF結(jié)構(gòu)、無配體Kit、SCF-Kit復(fù)合物和KitPTK結(jié)構(gòu)(PDB項(xiàng)1QZJUR01和1T45)。使用二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(綠色螺旋和黑色環(huán))對(duì)結(jié)構(gòu)還沒有被確定的區(qū)進(jìn)行建模。SCF以洋紅色著色，Kit胞外域?yàn)樗{(lán)色，而KitPTK為淺藍(lán)色。圖8描繪了基于Kit胞外域結(jié)構(gòu)進(jìn)行的III型RTK的基于結(jié)構(gòu)的序列比對(duì)，以及III型RTK家族的配體的基于結(jié)構(gòu)的比對(duì)。各行顯示單個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域的比對(duì)。基于IgSF折疊特征人工比對(duì)氨基酸序列，如由(Harpaz等(1994)JMolBiol238:528-539)并在如Jpred(Cuff等(1998)Bioinformatics14=892-893)計(jì)算的家族成員的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)協(xié)議內(nèi)所確定的。紅色標(biāo)記的氨基酸表示決定IgSF折疊的氨基酸。在所述序列上，B折疊通過箭頭標(biāo)記，而a-螺旋通過彈簧標(biāo)記，連同人Kit和人SCF的編號(hào)。在配體結(jié)合后顯示出溶劑可及性降低的配體結(jié)合位點(diǎn)的殘基通過星號(hào)標(biāo)注。位點(diǎn)-I著黑色，位點(diǎn)-II為紅色，而位點(diǎn)-III為綠色。同一色彩編碼被用于標(biāo)記SCF中的相互作用氨基酸殘基。負(fù)責(zé)D4-D4相互作用的D4EF環(huán)加青色框。用于比對(duì)的序列是Kit人(AAC50969)、Kit小鼠(AAH75716)、CSFR1人(P07333)、PDGFRa人(P16234)、PDGFR旦人(P09619)和Flt3人(P36888)。對(duì)于配體結(jié)構(gòu)比對(duì)，使用Lsqman(Kleywegt和Jones，1995)疊合SCF(IEXZ)、CSF(IHMC)、Flt3L(lETE)的PDB項(xiàng)，而使用ClustalW將SCF小鼠(NP_038626)的序列與人SCF進(jìn)行比對(duì)。所述圖按照出現(xiàn)的順序分別公開了SEQIDN0:112-147。圖9提供了22SCF-KH復(fù)合物的整體結(jié)構(gòu)的立體圖。22SCF-KH復(fù)合物的帶狀模型(ribbonmodel)以立體示意圖表示。所述視圖和色彩編碼與圖2A相同。圖10A-B描繪了在SCF-Kit復(fù)合物表面上的氨基酸保守性。圖10A顯示SCF-Kit晶體結(jié)構(gòu)復(fù)合物的以顏色編碼的保守模式。青色至栗色被用于標(biāo)記可變氨基酸至保守氨基酸。圖10B顯示通過將兩個(gè)分子彼此拉開而使SCF和Kit可視化。位點(diǎn)I、位點(diǎn)II和位點(diǎn)III以及D4-D4相互作用區(qū)(D4-D4界面)被圈出。圖11A-B描繪SCF-Kit界面的電子密度。圖11A顯示22SCF-KH復(fù)合物的位點(diǎn)II的局部圖，其中在Kit周圍繪出在2o水平的2Fo-Fc電子密度圖。除了標(biāo)記的側(cè)鏈外，Kit主鏈以黃色管畫出。圖11B描繪了SCF-Kit界面的電子密度，示出游離Kit的局部圖，其中畫出在Kit周圍的1.5o水平的實(shí)驗(yàn)圖。取向和色彩編碼同圖12A。圖12A-D描繪了來自游離的Kit和SCF結(jié)合的Kit的一對(duì)疊合的Ig樣結(jié)構(gòu)域的18視圖。來自游離的Kit和SCF結(jié)合的Kit的單個(gè)D1、D2、D3和D4被疊合。顯示的是Ig樣結(jié)構(gòu)域?qū)Φ?A)D1和D2、(B)D2和D3、(C)D3和D4以及(D)D4和D5的結(jié)構(gòu)，其中在各對(duì)中被疊合的Ig樣結(jié)構(gòu)域以藍(lán)色著色，而第二(不被疊合的)Ig樣結(jié)構(gòu)域?qū)τ谟坞x的胞外域以綠色著色而對(duì)于SCF結(jié)合的胞外域以紅色著色。這些圖表明，在SCF結(jié)合后五個(gè)單獨(dú)的Ig樣結(jié)構(gòu)域中的每一個(gè)的結(jié)構(gòu)實(shí)際上無變化發(fā)生，且D1-D2-D3起到配體結(jié)合單元的作用，所述配體結(jié)合單元保持用于SCF結(jié)合的姿態(tài)(poised)。相反，在SCF結(jié)合的Kit中，在D3-D4和D4-D5界面中發(fā)生大的重排。圖13A-B描繪SCF-Kit復(fù)合結(jié)構(gòu)的靜電表面電勢(shì)。圖13A具體顯示出SCF_Kit22復(fù)合物。圖13B描繪了SCF-Kit復(fù)合結(jié)構(gòu)的靜電表面電勢(shì)，具體地說是在SCF從SCF-Kit22復(fù)合物拉開之后Kit的靜電表面電勢(shì)的可視化。帶正電和負(fù)電的表面分別以藍(lán)色和紅色著色。SCF結(jié)合區(qū)和D4-D4界面被圈出。圖14描繪了通過抗KH-D5抗體抑制SCF誘導(dǎo)的Kit活化。表達(dá)Kit的3T3細(xì)胞與濃度增加的抗KitD5抗體(針對(duì)Kit的第五Ig樣結(jié)構(gòu)域)或作為對(duì)照與抗SCF抗體(針對(duì)SCF配體)或抗Kit胞外域抗體(針對(duì)完全的Kit胞外域)一起溫育。圖15描繪了使用重組KitD4抑制SCF誘導(dǎo)的Kit活化。表達(dá)Kit的3T3細(xì)胞與濃度增加的重組KH-D4在室溫下溫育10分鐘，接下來進(jìn)行10分鐘的SCF刺激。圖16A表明PDGF誘導(dǎo)的PDGFR活化受到D4中點(diǎn)突變的阻止。使表達(dá)WTPDGFR或D4突變體(R385A和E390A)的PDGFR-/-MEF血清饑餓過夜并用所示濃度的PDGFBB刺激5分鐘。用抗PDGFR抗體免疫沉淀細(xì)胞溶解產(chǎn)物，接下來進(jìn)行SDS-PAGE，并用抗磷酸酪氨酸抗體4G10進(jìn)行免疫印跡分析。剝?nèi)ツ?，用抗?biāo)記(flag)標(biāo)簽抗體(tagantibody)進(jìn)行再印跡分析，以確定總PDGFR水平。圖16B表明經(jīng)由PDGFR的信號(hào)傳導(dǎo)受到D4中點(diǎn)突變抑制。使表達(dá)WTPDGFR和D4突變體(R385A和E390A)的PDGFR-/-MEF血清饑餓過夜并在23°C用所示濃度的PDGFBB刺激5分鐘。使相同量的總細(xì)胞溶解產(chǎn)物(TCL)進(jìn)行SDS-PAGE并通過分別采用抗磷酸-MAPK、MAPK、磷酸-Akt和Akt的免疫印跡進(jìn)行分析。該實(shí)驗(yàn)表明，MAPK響應(yīng)和Akt活化都被D4中的點(diǎn)突變所阻止。圖16C表明抑制PDGFR活化的D4中的點(diǎn)突變不干擾PDGF誘導(dǎo)的PDGFR二聚化。表達(dá)WT或E390A突變體的PDGFR-/-MEF血清饑餓過夜，接下來與所示量的PDGF在DMEM/50mMHepes緩沖液(pH7.4)中在4°C溫育90分鐘。在除去非結(jié)合的配體之后，細(xì)胞與PBS中的0.5mM二琥珀酰亞胺基辛二酸酯(DSS)—起溫育30分鐘。采用抗PDGFR抗體使未刺激的或刺激的細(xì)胞的溶解產(chǎn)物發(fā)生免疫沉淀(IP)，接下來進(jìn)行SDS-PAGE分析，并采用抗標(biāo)記抗體(左圖)或抗pTyr抗體(右圖)進(jìn)行免疫印跡分析。圖17顯示D3-D4絞鏈區(qū)中的空腔。幾個(gè)空腔分散在胞外域單體結(jié)構(gòu)中的D3-D4界面上。參與界定所述空腔的氨基酸總結(jié)在表4(下文)中。在兩個(gè)Kit受體之間形成同型相互作用時(shí)，D3-D4絞鏈區(qū)被改變，從而導(dǎo)致形成由下列殘基產(chǎn)生的淺的空腔來自D3的K218、S220、Y221、L222和來自D4的F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、I371、Y373。圖17顯示了未被占據(jù)的單體(A)和SCF結(jié)合的二聚體(B)的D3-D4絞鏈區(qū)的帶狀柵圖以及D3-D4口袋的網(wǎng)格表示。圖18顯示D4-D5絞鏈區(qū)中的空腔。通過Kit單體的D4的AB環(huán)和EF環(huán)、D4-D5連接接頭和D5的DE環(huán)和TO環(huán)的一部分形成小的空腔。界定所述空腔的殘基總結(jié)在表4(下文)中。所述空腔的形狀和大小在Kit胞外域二聚結(jié)構(gòu)中被改變。由D4的EF環(huán)和G股、D4-D5接頭和D5的B股和DE環(huán)形成的主要空腔位于D4的EF環(huán)之下；一個(gè)對(duì)于D4同型界面的形成很關(guān)鍵的區(qū)域。注意，位置靠近空腔的D5的DE環(huán)可具有較高的靈活性，如由非結(jié)合的和占據(jù)的Kit結(jié)構(gòu)的較低質(zhì)量的電子密度所揭示的。圖18顯示了未被占據(jù)的單體(A)和SCF二聚體(B)的帶狀柵圖以及在D4-D5絞鏈區(qū)周圍的淺空腔的網(wǎng)格表示。圖19顯示了在介導(dǎo)D4同型相互作用的區(qū)域的空腔。由KitD4的⑶環(huán)和EF環(huán)形成的凹面位于D4同型界面的上方右側(cè)。來自D4的殘基Y350、R353、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386和T390為胞外域二聚結(jié)構(gòu)中的凹面提供了大約130A2的表面積。在D4同型界面中起重要作用的Glu386的側(cè)鏈伸向所述表面的中心。所述凹面的特征是由帶電殘基(Glu386和Lys358)圍繞的小的疏水補(bǔ)丁。在發(fā)生同型D4D4相互作用時(shí)，所述表面的尺寸和可及性被改變，使得變化發(fā)生在CD環(huán)的構(gòu)象中，其變得向著所述結(jié)構(gòu)域頂部向上折疊。在凹面的形成中涉及的殘基總結(jié)在表4(下文)中。在下面該圖中圖A顯示覆蓋在配體占據(jù)的KitD4(未示出)上的Kit的未被占據(jù)的D4結(jié)構(gòu)域(金色)的帶狀柵圖，在配體占據(jù)的(綠色)和未被占據(jù)的胞外域結(jié)構(gòu)(紅色)之間CD和EF環(huán)的構(gòu)象不同。用于D4D4相互作用的關(guān)鍵殘基以棍型形式示出。圖B和圖C示出了未被占據(jù)的Kit(圖19B)和SCF占據(jù)的Kit結(jié)構(gòu)(圖19C)的帶狀柵圖以及D4同型界面之上的淺空腔的網(wǎng)格表7J\o圖20顯示在配體結(jié)合D2和D3區(qū)的凹面。淺的凹面位于D2和D3的部分配體結(jié)合表面上。在小口袋中包括的殘基是來自D2的Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206和F208,以及來自D3的V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268和Y269?？诖ㄟ^被親水性殘基圍繞的小的疏水補(bǔ)丁產(chǎn)生。在未被占據(jù)的和SCF占據(jù)的Kit結(jié)構(gòu)之間沒有大的改變，總包埋面積為大約500A2。圖A和B顯示了未被占據(jù)的Kit(A)和SCF結(jié)合的Kit(B)的帶狀柵圖以及D2-D3口袋的網(wǎng)格表示。圖21描繪了基于結(jié)構(gòu)的序列分析和PDGF受體膜近側(cè)區(qū)的同源性建模。圖21A描繪了PDGFRa、PDGFR0和Kit的D4的氨基酸序列(按照出現(xiàn)的順序分別為SEQIDNO148-157)的比對(duì)。人Kit結(jié)構(gòu)的D4的IgSF折疊的關(guān)鍵殘基和Ig折疊的核心殘基的氨基酸相應(yīng)地用紅色和綠色著色。負(fù)責(zé)D4同型相互作用的兩個(gè)關(guān)鍵堿性和酸性殘基分別用藍(lán)色和紅色加框。相應(yīng)于在Ig樣結(jié)構(gòu)域上的保守二硫鍵形成半胱氨酸殘基的位置(B5和F5)通過星號(hào)標(biāo)注。3折疊通過Kit序列下的箭頭標(biāo)記。根據(jù)IgSF命名法標(biāo)記二級(jí)結(jié)構(gòu)元件。圖21B描繪了PDGFR的胞外域的膜近側(cè)區(qū)的模型。PDGFRA胞外域的膜近側(cè)區(qū)以白色著色，并顯示為具有透明分子表面的帶(D4著橙子，而D5著粉色；左圖)。兩個(gè)相鄰PDGFR日分子的D4-D4界面的放大視圖(右圖)表明在D4之間的相互作用通過從兩個(gè)相鄰的EF環(huán)伸出的殘基Arg385和Glu390介導(dǎo)。標(biāo)記關(guān)鍵氨基酸并以棍型顯示。圖22描繪了實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其表明PDGF誘導(dǎo)的PDGFR活化受到D4中的突變的影響。圖22A顯示出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其表明在表達(dá)PDGFR0的E390A、R385A、RE/AA和RKE/AAA突變體的細(xì)胞中PDGFR0的PDGF誘導(dǎo)的酪氨酸自磷酸化受到強(qiáng)烈影響。圖22B是顯示出野生型和突變體PDGFR0的置換曲線的圖。通過用Prism4進(jìn)行曲線擬合確定IC50值。圖22C描繪了免疫印跡分析結(jié)果，其表明R385A、E390A或RE/AA突變不影響PDGFR的固有酪氨酸激酶活性。圖23描繪了來自免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其表明在D4結(jié)構(gòu)域中突變的PDGF刺激的PDGFR0在細(xì)胞表面上以無活性二聚體的形式表達(dá)。采用抗PDGFR抗體免疫沉淀細(xì)胞溶解產(chǎn)物，且免疫沉淀物通過SDS-PAGE和分別用抗標(biāo)記抗體(左圖)和抗磷酸酪氨酸抗體(右圖)進(jìn)行免疫印跡進(jìn)行分析。圖24描繪了免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其表明PDGF誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答受到PDGFR3D4突變體中的突變的影響。圖25描繪了實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其表明PDGF刺激的肌動(dòng)蛋白環(huán)形成在表達(dá)PDGFRD4突變體的MEF中受到影響。盡管大約83%的表達(dá)WTPDGFR的MEF表現(xiàn)出圓形肌動(dòng)蛋白環(huán)形成，但是僅5%的PDGFRD4突變體細(xì)胞在用50ng/ml的PDGF刺激2分鐘之后顯示出相似的圓形肌動(dòng)蛋白環(huán)形成。而且，在2-5分鐘的PDGF刺激之后在表達(dá)WTPDGFR的MEF中達(dá)到高峰的瞬時(shí)圓形肌動(dòng)蛋白環(huán)形成在表達(dá)R385A、E390A或RE/AAPDGFR突變體的細(xì)胞中被微弱地檢測(cè)到。圖26描繪了實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其表明PDGFR內(nèi)化作用和泛素介導(dǎo)的PDGFR降解受到PDGFR的D4中的突變的影響。圖26A是表明結(jié)合于表達(dá)WTPDGFR的MEF的1251標(biāo)記PDGF的內(nèi)化動(dòng)力學(xué)比結(jié)合于表達(dá)E390A、R385A或RE/AAPDGFR的細(xì)胞的1251標(biāo)記PDGF的內(nèi)化動(dòng)力學(xué)快得多的曲線圖。圖26B表明R385A、E390A或RE/AAPDGFR突變體的降解動(dòng)力學(xué)被大大降低；并且盡管一半WTPDGFR在PDGF刺激的1.5小時(shí)內(nèi)被降解，但是PDGFRD4突變體的半衰期延長(zhǎng)至大約4至6小時(shí)。圖26C描繪了表明在相似條件條件下，相比于WTPDGFR,E390APDGFR的PDGF誘導(dǎo)的泛素化刺激也被大大降低的實(shí)驗(yàn)。圖27描繪了實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其表明D4界面的破壞阻斷了KIT中的致癌突變。野生型KIT的SCF刺激導(dǎo)致KIT活化的增強(qiáng)，這由KIT的酪氨酸自磷酸化增強(qiáng)所揭示。所述實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明KIT的致癌性D5-重復(fù)序列突變體被組成性地進(jìn)行酪氨酸自磷酸化。相比之下，D5-重復(fù)序列/E386A突變體阻斷通過致癌D5-重復(fù)序列突變介導(dǎo)的KIT的組成型酪氨酸自磷酸化。圖28描繪免疫印跡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，表明針對(duì)對(duì)應(yīng)于KIT-D4的同型相互作用基序的肽的抗體識(shí)別全長(zhǎng)KIT受體。具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供結(jié)合人受體酪氨酸激酶(例如III型或V型受體酪氨酸激酶，如人Kit(亦稱SCF受體)或PDGFRa或PDGFR^)的胞外域(例如Ig樣結(jié)構(gòu)域或Ig樣結(jié)構(gòu)域之間的鉸鏈)的成分，例如抗體或其抗原結(jié)合部分、小分子、肽類分子、適體和adnectin。本發(fā)明的成分鎖定受體酪氨酸激酶的胞外域在非活性狀態(tài)，從而抑制受體酪氨酸激酶的活性。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述成分將受體酪氨酸激酶的胞外域鎖定至單體的狀態(tài)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述成分允許受體酪氨酸激酶的胞外域二聚化，但是影響兩個(gè)單體的Ig樣結(jié)構(gòu)域(例如III型受體酪氨酸激酶的D4-D4或D5-D5結(jié)構(gòu)域或者V型受體酪氨酸激酶的D7-D7結(jié)構(gòu)域)之間的定位、定向和/或距離，從而抑制受體酪氨酸激酶的活性。換言之，所述成分可以允許受體酪氨酸激酶胞外域的配體誘導(dǎo)的二聚化，但是影響兩個(gè)胞外域在細(xì)胞表面界面處的定位，或者改變或阻止受體酪氨酸激酶中的構(gòu)象變化，從而抑制受體酪氨酸激酶的活性(例如抑制受體內(nèi)化和/或抑制受體的酪氨酸自磷酸化和/或抑制受體激活下游的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的能力)。本發(fā)明至少部分地基于單體形式以及配體誘導(dǎo)的同型二聚體形式的受體酪氨酸激酶整個(gè)胞外域的晶體結(jié)構(gòu)的解碼(deciphering)。這些晶體結(jié)構(gòu)的解碼允許確認(rèn)本發(fā)明的成分可能靶向的表位，例如構(gòu)象表位。如本文中所使用，術(shù)語“成分”意于包括任何結(jié)合受體酪氨酸激酶的胞外域(例如Ig樣結(jié)構(gòu)域)的成分，其中所述成分將受體酪氨酸激酶的胞外域鎖定在非活性狀態(tài)，例如單體狀態(tài)，從而拮抗受體酪氨酸激酶的活性。所述成分可以是分離的抗體或其抗原結(jié)合部分；小分子；肽類分子(例如基于受體酪氨酸激酶的Ig樣結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的肽類分子)；適體或adnectin。在一些方面，所述成分結(jié)合連接受體酪氨酸激酶的Ig樣結(jié)構(gòu)域的鉸鏈區(qū)(例如III型RTK的D3-D4或D4-D5鉸鏈區(qū))。在一些實(shí)施方式中，所述成分將結(jié)合人Kit受體的特定序列，例如人Kit的殘基309-413、殘基410-519,381Arg和386Glu或418Tyr和505Asn。殘基309-413包含D4結(jié)構(gòu)域，殘基410-519包含人Kit的D5結(jié)構(gòu)域，并在本文中表明對(duì)于Kit受體二聚化至關(guān)重要。殘基381Arg和386G1u是Kit的D4結(jié)構(gòu)域中的殘基，在本文中表明對(duì)于D4結(jié)構(gòu)域的非共價(jià)連接是重要的，因此，對(duì)于受體的二聚化是重要的。類似地，殘基418Tyr和5°5Asn是Kit的D5結(jié)構(gòu)域中的殘基，在本文中表明對(duì)于受體的二聚化是重要的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，特異性結(jié)合上述殘基的成分可以通過例如阻止兩個(gè)單體Kit分子的二聚化而拮抗受體的活性。在另外的實(shí)施方式中，所述成分結(jié)合人Kit中突變的氨基酸殘基，其中所述氨基酸殘基是417Thr、418Tyr、419ASp、421LeU、42°Arg、5°3Tyr或5°2Ala中的至少之一。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分結(jié)合Kit受體中的一或多個(gè)殘基，這些殘基構(gòu)成在表4(下文)中所述的小腔或口袋。例如，本發(fā)明的成分可以結(jié)合Kit受體的D3-D4鉸鏈區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)以下殘基來自D3結(jié)構(gòu)域的K218、S220、Y221、L222和來自D4結(jié)構(gòu)域的F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、I371、Y373。本發(fā)明的成分也可以結(jié)合一個(gè)或多個(gè)以下殘基，這些殘基構(gòu)成Kit受體的D4結(jié)構(gòu)域中的凹面Y350、R353、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386和T390。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分結(jié)合一個(gè)或多個(gè)以下殘基，這些殘基形成Kit受體的D2-D3鉸鏈區(qū)中的口袋來自D2結(jié)構(gòu)域的Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206和F208,以及來自D3結(jié)構(gòu)域的V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268和Y269。因此，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分可以結(jié)合連續(xù)的或不連續(xù)的氨基酸殘基，并起到阻止RTK的膜近側(cè)區(qū)以使酪氨酸激酶能夠活化的距離和定向進(jìn)行定位所需的運(yùn)動(dòng)分子楔(molecularwedge)的作用。本發(fā)明的成分也可以起到阻止同型或異型的D4或D5受體相互作用或使配體-受體相互作用位點(diǎn)不穩(wěn)定的作用。在一些優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的成分結(jié)合Kit受體上的一個(gè)或多個(gè)以下殘基Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206、P206、F208、K127、A207、V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268、Y269、T295、L222、L222、L223、E306、V308、R224、V308、K310、K218、A219、S220、K218、A220、Y221、A339、D327、D398、E338、E368、E386、F312、F324、F340、F355、G311、G384、G387、G388、1371、K342、K358、L382、L379、N326、N367、N370、N410、P341、S369、T385、V325、V407、V409、Y373、Y350、Y408、T380、T390、R381、R353、T411、K412、E414、K471、F433、G470、L472、V497、F469、A431或G432。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分可以容易地靶向于其它III型RTK中的相應(yīng)殘基，例如形成相似的口袋或空腔的那些殘基或通過結(jié)構(gòu)比對(duì)或序列比對(duì)處于相同位置的那些殘基。在一種特定實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分結(jié)合III型RTK上的構(gòu)象表位或非連續(xù)表位。構(gòu)象表位或非連續(xù)表位可以由來自III型RTK(例如人Kit受體或PDGF受體)的D3、D4和/或D5結(jié)構(gòu)域或者D4-D5或D3-D4鉸鏈區(qū)的兩個(gè)或多個(gè)殘基組成。例如，所述構(gòu)象表位或非連續(xù)表位可以由表4中所列的兩個(gè)或多個(gè)殘基組成。在一種具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分結(jié)合由2個(gè)或多個(gè)選自Y125、H180、R181、K203、V204、R205、P206、V238、S239、S240、H263、G265、D266、F267、N268和Y269的氨基酸組成的構(gòu)象表位。在相似的實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分可以結(jié)合由選自以下的氨基酸組之一的2個(gè)或多個(gè)氨基酸組成的構(gòu)象表位P206、F208、V238和S239；K127、A207、F208和T295；L222、A339、F340、K342、E368、S369、N370、I371和Y373；L222、L223、E306、V308、F312、E338、F340和1371；R224、V308、K310、G311、F340、P341和D398；K218、A219、S220、N367、E368和S369；K218、A220、E368和S369；G384、T385、T411、K412、E414和K471；Y408、F433、G470、K471和L472；F324、V325、N326和N410；D327、N410、T411、K412和V497；G384、G387、V409和K471；L382、G387、V407和V409；Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206、F208、V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268和Y269；P206、F208、V238和S239；K218、S220、Y221、L222、F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、I371和Y373；G384、G387、G388、Y408、V409、T411、F433、F469、G470和K471；D327、T411、K412、E414、A431、G432和K471；Y350、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386和T390；Y350、R353和F355。如以上所指出的，本發(fā)明的成分可以結(jié)合形成如表4中確定的口袋或空腔的所有氨基酸殘基，或者它們可以結(jié)合形成口袋或空腔的殘基的一部分。應(yīng)當(dāng)理解，在特定實(shí)施方式中，當(dāng)提到結(jié)合表位例如構(gòu)象表位的本發(fā)明的成分時(shí)，意圖是所述成分僅結(jié)合那些構(gòu)成該表位(例如表4中確定的口袋或空腔)的那些特定殘基，而不是在該受體的線性氨基酸序列中的其它殘基。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分結(jié)合構(gòu)象表位，其中所述表位由選自表5中所列的肽的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成。在一種具體實(shí)施方式中，構(gòu)象表位由選自第一肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基和選自第二肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成，其中第一和第二肽選自表5中所列的肽的組。因而，本發(fā)明的成分可以結(jié)合構(gòu)象表位，其中來自表5的所述第一和第二肽組如下Ala219-Leu222和Thr304_Val308；Asp309_Gly311和Arg224-Gly226；Thr303-Glu306和Ala219_Leu222；Asn367_Asn370和Ser217_Tyr221；Ala339-Pro343和Asn396_Val399；Ala339_Pro343和Glu368_Arg372；Lys358_Tyr362和Val374-His378；Asp357_Glu360和Leu377_Thr380；Met351_Glu360和His378_Thr389；His378-Thr389和Val323_Asp332；Val409-Ile415和Ala493-Thr500；Val409-Ile415和Ala431-Thr437；Val409-Ile415和Phe469_Val473；Val409-Ile415和Val325_Asn330；Val409-Ile415和Arg381-Gly387；Gly466-Leu472和Gly384-Gly388；Val325_Glu329和Tyr494-Lys499；Thr411-Leu416和Val497_Ala502；Ile415_Leu421和Ala502_Ala507；Ala502-Ala507和Lys484_Thr488；及Ala502_Ala507和Gly445_Cys450。本發(fā)明的成分可以結(jié)合形成前述第一和第二肽組的所有氨基酸殘基，或者它們可以結(jié)合形成第一和第二肽組的殘基的一部分。應(yīng)當(dāng)理解，在特定實(shí)施方式中，當(dāng)提到結(jié)合表位例如構(gòu)象表位的本發(fā)明的成分時(shí)，意圖是所述成分僅結(jié)合那些構(gòu)成該表位(例如表5中確定的特定肽)的那些特定殘基，而不是在該受體的線性氨基酸序列中的其它殘基。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分結(jié)合由2個(gè)或多個(gè)選自E33、P34、D72、E76、N77、K78、Q79、K158、D159、N250、S251、Q252、T253、K254、L255、N260、W262、H264、G265、E344、N352、R353、F355、T356、D357、Y362、S365、E366、N367、N370和G466的氨基酸組成的構(gòu)象表位或非連續(xù)表位。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分結(jié)合人PDGFR3的氨基酸殘基385Arg和39°G1u，或者PDGFRa中的相應(yīng)殘基。人PDGFR旦的殘基385Arg和39°Glu與Kit受體的殘基381Arg和386Glu類似，并介導(dǎo)PDGFR0的同型D4-D4相互作用。本發(fā)明的成分可以通過阻止III型RTK的膜近側(cè)區(qū)之間的關(guān)鍵同型相互作用(例如人PDGFR0的385Arg和390Glu之間形成的鹽橋)而發(fā)揮其對(duì)受體活化的抑制作用，所述相互作用對(duì)于胞質(zhì)域以對(duì)于酪氨酸激酶活化至關(guān)重要的距離和定向進(jìn)行定位是不可或缺的。本文中討論的實(shí)驗(yàn)證明同型D4-D4相互作用對(duì)于PDGFR0二聚化不是必要的，而PDGFR0二聚化對(duì)于受體活化是必要的然而并非足夠的。因此，本發(fā)明的成分可以允許PDGFR0二聚化而阻止活化?；诮Y(jié)構(gòu)的序列比對(duì)已經(jīng)表明在Kit、PDGFRa、PDGFR0和CSF1R中，EF環(huán)的大小以及包含重要氨基酸的D4-D4界面是保守的。因此，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分可以靶向于III型RTK的D4或D5結(jié)構(gòu)域的保守區(qū)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也會(huì)理解，本發(fā)明的成分可以結(jié)合糖殘基，所述糖殘基可以出現(xiàn)在RTK的糖基化形式上。本發(fā)明的成分也可以結(jié)合由氨基酸殘基和糖殘基兩者組成的表位。術(shù)語“受體酪氨酸激酶”和“RTK”在本文中可互換地使用以表示公知的使酪氨酸殘基磷酸化的膜受體的家族。很多受體酪氨酸激酶在發(fā)育或者細(xì)胞分裂中起到重要作用。受體酪氨酸激酶具有細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)催化結(jié)構(gòu)域。胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子或其它配體，并通常由一或多個(gè)可識(shí)別的結(jié)構(gòu)基序組成，包括富半胱氨酸區(qū)、纖連蛋白III樣結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域、EGF樣結(jié)構(gòu)域、鈣粘著蛋白樣結(jié)構(gòu)域、kringle樣結(jié)構(gòu)域、因子VIII樣結(jié)構(gòu)域、富甘氨酸區(qū)、富亮氨酸區(qū)、酸性區(qū)和盤狀(discoidin)結(jié)構(gòu)域。胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域的活化通過配體結(jié)合細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)，這引起受體二聚化。以這種方式活化的受體能夠自磷酸化催化結(jié)構(gòu)域外面的酪氨酸殘基，從而促進(jìn)活性受體構(gòu)象的穩(wěn)定。磷酸化殘基也作為隨后在細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)信號(hào)的蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)。RTK的實(shí)例包括但不限于Kit受體(亦稱干細(xì)胞因子受體或SCF受體)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)受體、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)受體、胰島素受體、胰島素樣生長(zhǎng)因子-l(IGF-l)受體、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)受體、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)受體、PDGF受體-a、PDGF受體、CSF-1受體(亦稱M-CSF受體或Fms)和Flt3_受體(亦稱Flk2)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，RTK是III型RTK。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，RTK是V型，即VEGF受體家族的成員。如本文中所使用，術(shù)語“受體酪氨酸激酶的III型家族”或“III型RTK”意于包括一般地在其胞外域中包含五個(gè)免疫球蛋白像結(jié)構(gòu)域或Ig樣結(jié)構(gòu)域的受體酪氨酸激酶。III型RTK的實(shí)例包括但不限于PDGF受體、M-CSF受體、FGF受體、Flt3受體(亦稱Flk2)和Kit受體。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，III型RTK是Kit(在本領(lǐng)域也稱為SCF受體)。Kit,與其它III型RTK相似，由通過單一跨膜(TM)結(jié)構(gòu)域連接于胞質(zhì)區(qū)糖基化的細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(胞外域)構(gòu)成(綜述于Schlessinger(2000)Cell103:211-225)。III型RTK，例如Kit或PDGFR，的另一標(biāo)志是帶有大的激酶插入?yún)^(qū)的胞質(zhì)蛋白酪氨酸激酶(PTK)結(jié)構(gòu)域。已知存在至少兩種Kit受體的剪切同工型，較短的利用框內(nèi)的剪接位點(diǎn)。本發(fā)明包括Kit以及其它上述RTK的所有同工型。本文中所用的受體酪氨酸激酶(RTK)的“Ig樣結(jié)構(gòu)域”意于包括本領(lǐng)域公知的存在于RTK胞外域中的結(jié)構(gòu)域。在III型受體酪氨酸激酶(III型RTK)家族例如Kit的胞外域中，存在5個(gè)這樣的結(jié)構(gòu)域，已知為D1、D2、D3、D4和D5。III型RTK的D1、D2和D3結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)結(jié)合RTK的配體(綜述于Ullrich和Schlessinger(1990)Cell61:203_212)。因此，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，術(shù)語“Ig樣結(jié)構(gòu)域”不意于包括負(fù)責(zé)配體結(jié)合的RTK的結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，Ig樣結(jié)構(gòu)域是III型RTK的D4和/或D5結(jié)構(gòu)域。在VEGF受體家族的胞外域中，存在7個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域，已知為Dl、D2、D3、D4、D5、D6和D7。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，Ig樣結(jié)構(gòu)域是VEGF受體家族的D7結(jié)構(gòu)域。本文中所用的術(shù)語“VEGF受體家族”，亦稱V型RTK，包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的RTK受體。如上所述，這些RTK在其胞外域中具有7個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域。VEGF家族受體的實(shí)例為VEGFR-1(亦稱Flt-1)、VEGFR-2(亦稱KDR或Flk-1)和VEGFR-3(亦稱Flt-4)。術(shù)語受體酪氨酸激酶(RTK)的“胞外域”是本領(lǐng)域公知的，并且指RTK的細(xì)胞外部分，即在質(zhì)膜外的RTK的部分。術(shù)語受體酪氨酸激酶的胞外域的“膜近側(cè)區(qū)”指的是接近質(zhì)膜的RTK的細(xì)胞外部分，并優(yōu)選地不直接負(fù)責(zé)配體與RTK的結(jié)合。膜近側(cè)區(qū)的實(shí)例包括但不限于III型受體酪氨酸激酶的D4結(jié)構(gòu)域、III型受體酪氨酸激酶的D5結(jié)構(gòu)域、III型受體酪氨酸激酶的D3-D4鉸鏈區(qū)、III型受體酪氨酸激酶的D4-D5鉸鏈區(qū)和V型受體酪氨酸激酶的D7結(jié)構(gòu)域。本文中所用的術(shù)語“同型相互作用”指的是來自兩個(gè)單體受體的兩個(gè)相同的膜近側(cè)區(qū)之間的相互作用。本文中所用的術(shù)語“異型相互作用”指的是來自兩個(gè)單體受體的兩個(gè)不同的膜近側(cè)區(qū)之間的相互作用。異型相互作用可以是兩個(gè)不同類型的單體受體二聚化的結(jié)果，或者同種單體受體的野生型和突變體形式二聚化的結(jié)果。例如，本領(lǐng)域公知癌癥患者可以攜帶某一受體的野生型等位基因和突變體等位基因。本文中所用的術(shù)語“單體狀態(tài)”指的是其中RTK分子由單一多肽鏈組成的RTK的狀態(tài)，該單一多肽鏈不與相同或不同類型的第二RTK多肽結(jié)合。RTK二聚化導(dǎo)致自磷酸化和受體活化。因此，單體狀態(tài)的RTK是非活性狀態(tài)。單體狀態(tài)也是其中單一RTK的D4或D5結(jié)構(gòu)域不與第二RTK的D4或D5結(jié)構(gòu)域分別結(jié)合的狀態(tài)。短語“鎖定受體酪氨酸激酶的胞外域在非活性狀態(tài)”指的是本發(fā)明的成分抑制受體酪氨酸激酶的活性的能力。換言之，該短語包括本發(fā)明的成分將平衡轉(zhuǎn)向形成非活性或抑制性的受體構(gòu)型的能力。例如，與不存在本發(fā)明的成分時(shí)受體活性相比，本發(fā)明的成分可以抑制受體酪氨酸激酶的活性至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%。本文中所用的術(shù)語“非活性狀態(tài)”指的是其中RTK分子不能激活下游的信號(hào)傳導(dǎo)的RTK的狀態(tài)。非活性狀態(tài)可以是這樣的狀態(tài)，其中受體酪氨酸激酶的胞外域被允許二聚化，但是兩個(gè)單體的Ig樣結(jié)構(gòu)域(例如III型受體酪氨酸激酶的D4-D4或D5-D5結(jié)構(gòu)域或者V型受體酪氨酸激酶的D7-D7結(jié)構(gòu)域)之間的定位、定向、構(gòu)象和/或距離發(fā)生改變，從而抑制了受體酪氨酸激酶的活性(例如受體內(nèi)化受抑制和/或受體的酪氨酸自磷酸化受抑制和/或受體激活下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑的能力受抑制)。非活性狀態(tài)也包括如上所述的單體狀態(tài)。非活性狀態(tài)也可以是這樣的狀態(tài)，其中受體酪氨酸激酶的胞外域結(jié)合于受體配體并二聚化，但是還沒有發(fā)生允許受體活化的構(gòu)象變化。實(shí)施例22-25進(jìn)一步討論了表明存在對(duì)于RTK活化至關(guān)重要(例如通過介導(dǎo)D4或D5同型相互作用)但是對(duì)于受體二聚化不是必要的特定保守氨基酸殘基的實(shí)驗(yàn)。術(shù)語“非活性狀態(tài)”包括這樣的狀態(tài)，其中與沒有本發(fā)明的成分時(shí)的受體活性相比，本發(fā)明的成分可以降低或抑制受體酪氨酸激酶的活性至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%。本文中描述的任何功能試驗(yàn)可用于確定本發(fā)明的成分抑制受體酪氨酸激酶活性的能力。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分可以表現(xiàn)出寬的效應(yīng)，例如當(dāng)大部分或全部目標(biāo)RTK滅活時(shí)。在其他的實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分可以表現(xiàn)出較窄的效應(yīng)，例如當(dāng)部分靶RTK滅活時(shí)。在這樣的實(shí)施方式中，與沒有所述成分時(shí)的受體相比，至少5%、10%,15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%、90%或95%的受體被鎖定在非活性狀態(tài)。本文中所使用的術(shù)語“構(gòu)象表位”或“非線性表位”或“不連續(xù)表位”可互換地使用以指由至少兩個(gè)不是單蛋白質(zhì)鏈中的連續(xù)氨基酸的氨基酸組成的表位。例如，構(gòu)象表位可以是由一段(strech)插入氨基酸分開，但是足夠靠近以被本發(fā)明的成分作為單一表位識(shí)別的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸組成。作為進(jìn)一步的實(shí)例，在單蛋白質(zhì)鏈上由插入氨基酸分開的氨基酸或者存在于分離的蛋白質(zhì)鏈上的氨基酸可以由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或復(fù)合體的構(gòu)象形狀而拉近，以成為可以被本發(fā)明的成分結(jié)合的構(gòu)象表位。特定的不連續(xù)表位和構(gòu)象表位在本文中進(jìn)行描述(參見例如表4和5)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，通常，本發(fā)明的成分結(jié)合的線性表位可以取決于或不取決于RTK的二級(jí)、三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)。例如，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分可以結(jié)合一組氨基酸而無論它們是否以天然的三維蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行折疊。在其他的實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分可能不識(shí)別組成該表位的單個(gè)氨基酸殘基，而是可能需要特別的構(gòu)象(彎曲、盤旋、轉(zhuǎn)角或折疊)以識(shí)別和結(jié)合表位。在以下各分節(jié)中進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的各個(gè)方面。I.結(jié)合人受體酪氨酸激酶胞外域的抗體在本發(fā)明的一個(gè)方面，結(jié)合人受體酪氨酸激酶的胞外域例如Ig樣結(jié)構(gòu)域或鉸鏈區(qū)的成分是抗體或其抗原結(jié)合片段。在本文中所指的“抗體”包括整個(gè)的抗體和任何抗原結(jié)合片段(即抗原結(jié)合部分”)或其單鏈。抗體”指包含通過二硫鍵相互連接的至少兩個(gè)重(H)鏈和兩個(gè)輕(L)鏈的糖蛋白，或其抗原結(jié)合部分。各個(gè)重鏈由重鏈可變區(qū)(在這里縮寫為\)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，CH1、CH2和CH3。各個(gè)輕鏈由輕鏈可變區(qū)(在這里縮寫為VJ和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)結(jié)構(gòu)域，Cy組成。Vj^nt區(qū)可以進(jìn)一步細(xì)分成稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的超變區(qū)，其間交替散布著更加保守的稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的區(qū)域。各個(gè)VH和\由三個(gè)⑶R和四個(gè)FR組成，按以下順序從氨基端至羧基端排列FR1，⑶R1，F(xiàn)R2，⑶R2，F(xiàn)R3，CDR3，F(xiàn)R4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。抗體的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一成分(Clq))的結(jié)合。本文中所用的術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡(jiǎn)稱“抗體部分”)指的是保留特異性結(jié)合抗原(例如Kit的D4或D5結(jié)構(gòu)域)能力的抗體的一個(gè)或多個(gè)片段。已經(jīng)表明，全長(zhǎng)抗體的片段可以執(zhí)行抗體的抗原結(jié)合功能。包含在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”中的結(jié)合片段的實(shí)例包括(i)Fab片段，由\、VH、(^結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的單價(jià)片段；(ii)F(ab')2片段，包含在鉸鏈區(qū)通過二硫橋連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；(iii)Fab’片段，主要是帶有部分鉸鏈區(qū)的Fab(參見，F(xiàn)UNDAMENTALIMMUNOLOGY(Paul編著，第三版1993)；(iv)由VH和CH1結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fd片段；(v)由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fv片段，(vi)dAb片段(Ward等，(1989)NatureMi:544_546)，其由VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成；(vii)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)；以及(viii)納米體，含有單一的可變結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域的重鏈可變區(qū)。而且，盡管Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域\和VH由獨(dú)立的基因編碼，但是它們可以使用重組方法通過使得它們能夠形成單蛋白質(zhì)鏈的合成接頭連接的，其中\(zhòng)和配對(duì)以形成單價(jià)分子(已知為單鏈Fv(scFv)；參見例如Bird等(1988)Science242423~426和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85=5879-5883)。這樣的單鏈抗體也意于包括在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”中。這些抗體片段使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法獲得，并且片段以與完整抗體同樣的方法進(jìn)行用途篩選。本文中所用的“分離的抗體”意于指基本上沒有具有不同抗原特異性的其它抗體的抗體(例如特異性結(jié)合RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域的分離的抗體基本上沒有特異性結(jié)合除了RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域之外的抗原的抗體)。而且，分離的抗體可以是基本上沒有其它的細(xì)胞物質(zhì)和/或化學(xué)物質(zhì)。但是，“分離的抗體”可以包括全都特異性結(jié)合例如RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域的多克隆抗體。本文中所用的術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組成”指的是單分子組成的抗體分子的制劑。單克隆抗體組成顯示對(duì)特定表位的單一結(jié)合特異性和親合性。本文中所用的術(shù)語“人抗體”意于包括具有其中框架區(qū)和CDR區(qū)均源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)的抗體。而且，如果抗體含有恒定區(qū)，該恒定區(qū)也源自于人種系免疫球蛋白序列。本發(fā)明的人抗體可以包括不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如體外隨機(jī)或定點(diǎn)誘變或者體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變)。然而，本文中所用的術(shù)語“人抗體”不意于包括其中來自另一哺乳動(dòng)物種(例如小鼠)的種系的CDR序列嫁接于人框架序列的抗體。術(shù)語“人單克隆抗體”是指具有其中框架區(qū)和CDR區(qū)均源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)的顯示單一結(jié)合特異性的單克隆抗體。在一種實(shí)施方式中，人單克隆抗體由包括由非人類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物例如轉(zhuǎn)基因小鼠獲得的B細(xì)胞的雜交瘤產(chǎn)生，所述非人類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物具有融入無限增殖細(xì)胞的包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組。本文中所用的術(shù)語“重組人抗體”包括通過重組方法制備、表達(dá)、創(chuàng)造或分離的所有人抗體，例如(a)從對(duì)于人免疫球蛋白基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體的動(dòng)物(例如小鼠)或由其制備的雜交瘤分離的抗體(以下進(jìn)一步描述)，(b)從經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達(dá)人抗體的宿主細(xì)胞分離的抗體，例如從轉(zhuǎn)染瘤的抗體，(c)從重組、組合的人抗體文庫(kù)分離的抗體，和(d)通過包括將人免疫球蛋白基因序列與其它DNA序列剪接的任何其它方法制備、表達(dá)、創(chuàng)造或分離的抗體。這樣的重組人抗體具有其中框架區(qū)和CDR區(qū)域源自于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)。然而，在某些實(shí)施方式中，這樣的重組人抗體可以進(jìn)行體外誘變(或在使用人Ig序列轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物時(shí)，進(jìn)行體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，從而盡管重組抗體的區(qū)的氨基酸序列源自人種系Vh和\序列和與之相關(guān)，但它們可以并不是天然存在于體內(nèi)人抗體種系庫(kù)內(nèi)。本文中所用的“同種型”指的是由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類(例如IgM或IgGl)。短語“識(shí)別抗原的抗體”和“抗原特異性的抗體”在本文中與術(shù)語“特異性結(jié)合抗原的抗體”互換地使用。術(shù)語“人抗體衍生物”指的是人抗體的任何修飾形式，例如抗體和另一種物質(zhì)或抗體的綴合物。術(shù)語“人源化抗體”意于表示其中源自另一哺乳動(dòng)物種例如小鼠的CDR序列嫁接于人框架序列上的抗體?？梢栽谌丝蚣苄蛄袃?nèi)進(jìn)行另外的構(gòu)架區(qū)修飾。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，當(dāng)序列“源自于”特定的種時(shí)，所述序列可以是蛋白質(zhì)序列，例如當(dāng)可變區(qū)氨基酸取自鼠抗體時(shí)，或者所述序列可以是DNA序列，例如當(dāng)編碼可變區(qū)的核酸取自鼠DNA時(shí)。也可以基于人和非人(例如鼠或兔)抗體來設(shè)計(jì)人源化抗體。所述設(shè)計(jì)的抗體(可能結(jié)合了人的和非人的殘基)可以是化學(xué)合成的。所述序列也可以在DNA水平合成，并在體外或體內(nèi)表達(dá)以產(chǎn)生人源化抗體。術(shù)語“嵌合抗體”意于指其中可變區(qū)序列源自于一個(gè)種而恒定區(qū)序列源自于另一個(gè)種的抗體，例如其中可變區(qū)序列源自于小鼠抗體，而恒定區(qū)序列源自于人抗體的抗體。術(shù)語“抗體模擬物”或“抗體類似物”意于指的是能夠模擬抗體結(jié)合抗原的能力的分子，但它不局限于天然的抗體結(jié)構(gòu)。此類抗體模擬物的實(shí)例包括但不限于Adnectin(即基于纖連蛋白的結(jié)合分子)、親和體、DARPin、抗運(yùn)載蛋白(Anticalin)、高親合性多聚體和Versabody，盡管它們它們模擬傳統(tǒng)的抗體結(jié)合，它們?nèi)坎捎猛ㄟ^完全不同的機(jī)制產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)并通過完全不同的機(jī)制發(fā)揮作用。當(dāng)本發(fā)明的實(shí)施方式涉及抗體或其抗原結(jié)合部分時(shí)，它們也可以應(yīng)用于如上所述的抗體模擬物。本文中所用的“特異性結(jié)合”RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域的抗體意指以1x10_7M或更低、更優(yōu)選5x10、或更低、更優(yōu)選IxlO-8M或更低、更優(yōu)選5x10_9M或更低的的Kd結(jié)合RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域的抗體。本文中所用的術(shù)語“基本上不結(jié)合”蛋白質(zhì)或細(xì)胞表示不結(jié)合或不以高親和性結(jié)合蛋白質(zhì)或細(xì)胞，即以χο_6Μ或更高、更優(yōu)選1x10_5M或更高、更優(yōu)選1X10_4M或更高、更優(yōu)選1x10_3M或更高、甚至更優(yōu)選1X10_2M或更高的Kd結(jié)合蛋白質(zhì)或細(xì)胞。本文中所用的術(shù)語〃κ#〃或“Ka”意指特定抗體-抗原相互作用的結(jié)合速率，而本文中所用的術(shù)語"Kiiw“或“K/’意指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。本文中所用的術(shù)語“KD”意指解離常數(shù)，其從Kd與Ka的比率(即Kd/Ka)獲得，并表示為摩爾濃度(M)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公認(rèn)的方法確定抗體的Kd值。測(cè)定抗體的Kd的優(yōu)選方法是使用表面等離子體共振，優(yōu)選使用生物傳感器系統(tǒng)，例如Biacore系統(tǒng)。本文中所用的術(shù)語“高親和性”在涉及IgG型抗體時(shí)，指的是對(duì)于RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域，抗體具有10_8M或更低、更優(yōu)選10_9M或更低、甚至更優(yōu)選ΙΟ,Μ或更低的KD。然而，對(duì)于其它抗體同種型“高親和性”結(jié)合可能有所改變。例如，IgM同種型的“高親和性”結(jié)合指的是抗體具有10_7M或更低、更優(yōu)選10_8M或更低、更優(yōu)選10_9M或更低的KD。Si^本發(fā)明的抗體特異性結(jié)合RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域，例如人受體酪氨酸激酶III型家族的成員。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分與RTK單體的Ig樣結(jié)構(gòu)域的結(jié)合將胞外域鎖定在非活性狀態(tài)，例如單體狀態(tài)，并因此拮抗RTK二聚化和激活下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑的能力。例如，所述抗體可以阻斷配體誘導(dǎo)的受體酪氨酸激酶的酪氨酸自磷酸化和/或受體內(nèi)化。選擇或設(shè)計(jì)本發(fā)明的抗體以結(jié)合RTK的特定Ig樣結(jié)構(gòu)域，例如人Kit的D4結(jié)構(gòu)域或D5結(jié)構(gòu)域或者VEGF受體的D7結(jié)構(gòu)域。在其它實(shí)施方式中，選擇或設(shè)計(jì)抗體或其抗原結(jié)合部分以結(jié)合與RTK(例如Kit受體)的結(jié)構(gòu)域具有同源性的蛋白質(zhì)。例如，可以選擇或設(shè)計(jì)抗體以結(jié)合與Kit受體的結(jié)構(gòu)域(例如D4或D5結(jié)構(gòu)域)具有至少50%的同一性、至少60%的同一性、至少70%的同一性、至少80%的同一性、至少90%的同一性、或至少95%、96%、97%、98%或99%的同一性的結(jié)構(gòu)域。這樣的抗體或其抗原結(jié)合部分將能夠結(jié)合與Kit的D4或D5結(jié)構(gòu)域在功能上類似的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域(可能在Kit和其它RTK中)。也可以選擇或設(shè)計(jì)本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分以結(jié)合由RTK(例如人III型RTK)的Ig樣結(jié)構(gòu)域衍生的特殊基序或共有序列，從而使抗體或其抗原結(jié)合部分特異性結(jié)合人RTKIII型家族的成員之間以及III型RTK和其它RTK(例如V型RTK)之間共有的表位或結(jié)構(gòu)域。例如，可以通過使用序列比對(duì)算法來比對(duì)各種RTK的結(jié)構(gòu)域(例如在RTK類型或各物種之間D4結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域)找到這類線性共有序列(參見圖6B)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以比對(duì)例如來自各種物種(例如人、小鼠、大鼠)的KitD4結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)序列以確定在被比對(duì)的序列的至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少100%中哪些蛋白質(zhì)殘基是保守的。然后，這樣的共有序列可以用于產(chǎn)生特異性結(jié)合該共有序列的抗體或其它成分，并因此結(jié)合KitRTK的最保守的殘基。類似地，人們也可以比對(duì)V型RTK的D7結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)序列(參見圖6)以獲得可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的成分的共有序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，最高度保守的殘基是哪些通過進(jìn)化保留并最可能對(duì)于蛋白質(zhì)功能具有重要性的殘基?；蛘撸绻葘?duì)在各種不同類的RTK之間進(jìn)行，對(duì)于這樣的共有序列產(chǎn)生的抗體將允許抗體結(jié)合多種RTK類型中的相似Ig樣結(jié)構(gòu)域。在一種具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分(例如抗體或其抗原結(jié)合部分)結(jié)合D4相互作用位點(diǎn)的以下共有序列=LX1RX2X3X4X5X6X7G,其中L是亮氨酸，R是精氨酸，G是甘氨酸；X1選自蘇氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、天門冬酰胺或賴氨酸；X2選自亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸；X3選自賴氨酸、組氨酸、天門冬酰胺和精氨酸；X4選自甘氨酸、纈氨酸、丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸；X5選自蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸；X6選自谷氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺；以及X7選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸、賴氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和蘇氨酸。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分(例如抗體或其抗原結(jié)合部分)結(jié)合VEGF受體家族成員的D7結(jié)構(gòu)域的以下共有序列=IX1RVX2X3EDX4G(SEQIDNO:1)，其中I是異亮氨酸，R是精氨酸，E是谷氨酸，D是天冬氨酸，G是甘氨酸A1選自谷氨酸、精氨酸和谷氨酰胺；X2選自精氨酸和蘇氨酸；X3選自谷氨酸和賴氨酸；以及X4選自谷氨酸和丙氨酸。本發(fā)明的抗體不結(jié)合RTK的配體結(jié)合位點(diǎn)，例如Kit受體的SCF結(jié)合位點(diǎn)。因此，本文中描述的抗體不拮抗受體結(jié)合其目標(biāo)配體的能力。在一些實(shí)施方式中，抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合人Kit受體的特定序列，例如人Kit受體的殘基309-413、殘基410-519、381Arg和386Glu或者418Tyr和5°5Asn。在其它實(shí)施方式中，抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合代表蛋白質(zhì)中三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)基序或共有序列。這樣的基序或共有序列不代表氨基酸的連續(xù)鏈，而是導(dǎo)致RTK的三維折疊的非連續(xù)的氨基酸排列(即“結(jié)構(gòu)基序”或“非線性表位”)。這樣的基序的實(shí)例是Kit受體的D4-D4或D5-D5結(jié)合界面。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體結(jié)合例如D4-D4或D5-D5界面中的非線性表位，從而阻止RTK的活化。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分可以結(jié)合構(gòu)成表4(下文中)中描述的小腔或口袋的Kit受體中的一個(gè)或多個(gè)殘基。例如，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分可以結(jié)合Kit受體的D3-D4鉸鏈區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)以下殘基來自D3結(jié)構(gòu)域的K218、S220、Y221、L222和來自D4結(jié)構(gòu)域的F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、I371、Y373。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分也可以結(jié)合構(gòu)成Kit受體的D4結(jié)構(gòu)域中的凹面的一個(gè)或多個(gè)以下殘基Y350、R353、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386和T390。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分可以結(jié)合形成Kit受體的D2-D3鉸鏈區(qū)中的口袋的一個(gè)或多個(gè)以下殘基來自D2結(jié)構(gòu)域的Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206和F208以及來自D3結(jié)構(gòu)域的V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268和Y269。因此，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分可以結(jié)合連續(xù)的或不連續(xù)的氨基酸殘基，并起到阻止RTK的膜近側(cè)區(qū)以使酪氨酸激酶能夠活化的距離和定向進(jìn)行定位所需的運(yùn)動(dòng)的分子楔的作用。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分也可以起到阻止同型D4或D5受體的相互作用或使配體-受體相互作用位點(diǎn)不穩(wěn)定的作用。在一些優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分可以結(jié)合Kit受體上的一個(gè)或多個(gè)以下殘基Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206、P206、F208、K127、A207、V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268、Y269、T295、L222、L222、L223、E306、V308、R224、V308、K310、K218、A219、S220、K218、A220、Y221、A339、D327、D398、E338、E368、E386、F312、F324、F340、F355、G311、G384、G387、G388、I371、K342、K358、L382、L379、N326、N367、N370、N410、P341、S369、T385、V325、V407、V409、Y373、Y350、Y408、T380、T390、R381、R353、T411、K412、E414、K471、F433、G470、L472、V497、F469、A431或G432。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分可以容易地靶向于其它III型RTK中的相應(yīng)殘基，例如形成相似的口袋或空腔的那些殘基或通過結(jié)構(gòu)比對(duì)或序列比對(duì)處于相同的位置的那些殘基。在一種具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合III型RTK上的構(gòu)象表位或非連續(xù)表位。構(gòu)象表位或非連續(xù)表位可以由來自III型RTK(例如人Kit受體或PDGF受體)的D3、D4或D5結(jié)構(gòu)域或者D4-D5或D3-D4鉸鏈區(qū)的兩個(gè)或多個(gè)殘基組成。例如，所述構(gòu)象表位或非連續(xù)表位可以由下面表4中所列的兩個(gè)或多個(gè)殘基組成。在一種特定實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合由2個(gè)或多個(gè)選自Y125、H180、R181、K203、V204、R205、P206、V238、S239、S240、H263、G265、D266、F267、N268和Y269的氨基酸組成的構(gòu)象表位。在相似的實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分可以結(jié)合由選自以下的氨基酸組之一的2個(gè)或多個(gè)氨基酸組成的構(gòu)象表位P206、F208、V238和S239；K127、A207、F208和T295；L222、A339、F340、K342、E368、S369、N370、1371和Y373；L222、L223、E306、V308、F312、E338、F340和1371；R224、V308、K310、G311、F340、P341和D398；K218、A219、S220、N367、E368和S369；K218、A220、E368和S369；G384、T385、T411、K412、E414和K471;Y408、F433、G470、K471和L472；F324、V325、N326和N410；D327、N410、T41UK412和V497；G384、G387、V409和K471；L382、G387、V407和V409；Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206、F208、V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268和Y269；P206、F208、V238和S239；K218、S220、Y221、L222、F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、1371和Y373；G384、G387、G388、Y408、V409、T411、F433、F469、G470和K471；D327、T411、K412、E414、A431、G432和K471；Y350、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386和T390；Y350、R353和F355。如以上所指出的，本發(fā)明的抗體可以結(jié)合形成在表4中確定的口袋或空腔的所有氨基酸殘基，或者它們可以結(jié)合形成口袋或空腔的殘基的一部分。應(yīng)當(dāng)理解，在某些實(shí)施方式中，當(dāng)說明本發(fā)明的抗體結(jié)合表位例如構(gòu)象表位時(shí)，意圖是抗體僅結(jié)合那些構(gòu)成該表位(例如表4中確定的口袋或空腔)的那些特定殘基，而不是在該受體的線性氨基酸序列中的其它殘基。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合構(gòu)象表位，其中所述構(gòu)象表位由選自表5中所列的肽的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成。在一種具體實(shí)施方式中，構(gòu)象表位由選自第一肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基和選自第二肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成，其中第一和第二肽選自表5中所列的肽的組。因而，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合構(gòu)象表位，其中所述第一和第二肽組如下Ala219-LeU222和Thr304-Val308；Asp309-Gly311和Arg224-Gly226；Thr303-Glu306和Ala219_Leu222；Asn367-Asn370和Ser217_Tyr221；Ala339-Pro343和Asn396_Val399；Ala339-Pro343和Glu368-Arg372；Lys358-Tyr362和Val374_His378；Asp357_Glu360和Leu377_Thr380；Met351-Glu360和His378_Thr389；His378_Thr389和Val323_Asp332；Val409-Ile415和Ala493-Thr500；Val409-Ile415和Ala431_Thr437；Val409-Ile415和Phe469_Val473；Val409-Ile415和Val325_Asn330；Val409-Ile415和Arg381-Gly387；Gly466-Leu472和Gly384-Gly388；Val325_Glu329和Tyr494-Lys499；Thr411-Leu416和Val497_Ala502；Ile415-Leu421和Ala502_Ala507；Ala502_Ala507和Lys484_Thr488；以及Ala502_Ala507和Gly445-Cys450。本發(fā)明的抗體可以結(jié)合形成前述第一和第二肽組的所有氨基酸殘基，或者它們可以結(jié)合形成第一和第二肽組的殘基的一部分。應(yīng)當(dāng)理解，在某些實(shí)施方式中，當(dāng)說到本發(fā)明的抗體結(jié)合表位例如構(gòu)象表位時(shí)，意圖是抗體僅結(jié)合構(gòu)成該表位(例如表5中確定的特定肽)的那些特異性殘基，而不是在該受體的線性氨基酸序列中的其它殘基。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合由選自E33、P34、D72、E76、N77、K78、Q79、K158、D159、N250、S251、Q252、T253、K254、L255、N260、W262、H264、G265、E344、N352、R353、F355、T356、D357、Y362、S365、E366、N367、N370和G466的2個(gè)或多個(gè)氨基酸組成的構(gòu)象表位或非連續(xù)表位。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合人PDGFRii的氨基酸殘基385Arg和^g1u，或者PDGFrα中相應(yīng)的殘基。人PDGFRβ的殘基385Arg和39qGIU類似于Kit受體的殘基381Arg和386Glu,并介導(dǎo)PDGFRβ的同型D4-D4相互作用。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分可以通過阻止對(duì)于胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域以酪氨酸激酶活化必要的距離和定向進(jìn)行定位所必需的III型RTK的膜近側(cè)區(qū)之間的關(guān)鍵同型相互作用(例如人PDGFR3的385Arg和39°Glu之間形成的鹽橋)而發(fā)揮其對(duì)受體活化的抑制作用。本文中討論的實(shí)驗(yàn)證明同型D4-D4相互作用對(duì)于PDGFRii的二聚化不是必要的，而PDGFRβ二聚化對(duì)于受體活化是必要的然而并非足夠的。因此，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分可以允許PDGFRii二聚化而阻止活化?；诮Y(jié)構(gòu)的序列比對(duì)已經(jīng)表明在Kit、PDGFRα、PDGFRβ和CSFlR中，EF環(huán)的大小以及包含重要氨基酸的D4-D4界面是保守的。因此，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段可以靶向于III型RTK的D4或D5結(jié)構(gòu)域的保守區(qū)。在另外的實(shí)施方式中，選擇或設(shè)計(jì)本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分以特異性結(jié)合突變體RTK。在優(yōu)選實(shí)施方式中，突變體RTK是致瘤的或致癌的突變體。在一種具體實(shí)施方式中，選擇或設(shè)計(jì)抗體或其抗原結(jié)合部分以結(jié)合致癌的Kit受體突變體。可以被本發(fā)明的抗體靶向的幾種Kit受體突變體是具有一個(gè)或多個(gè)以下氨基酸中的突變的Kit受體Thr417、Tyr418、Asp419、Leu421、Arg420、Tyr503或Ala502。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明的方法將可以應(yīng)用于Kit中的其它突變或其它RTK中的突變。靶向突變體RTK的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是治療抗體可以僅結(jié)合包含突變的細(xì)胞上的RTK，從而保持健康細(xì)胞大部分或全部不受影響。因此，在突變是致瘤性突變的情況下，僅腫瘤細(xì)胞被作為治療靶標(biāo)，從而潛在地減少副作用和劑量要求。優(yōu)選地，抗體以5xlO_8M或更低的KD、1x10_8M或更低的KD、5xlO_9M或更低的KD，或者1x10、至ΙχΙΟ,Μ之間或更低的Kd結(jié)合人RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域。本領(lǐng)域已知用于評(píng)價(jià)抗體對(duì)于RTK(例如Kit)的Ig樣結(jié)構(gòu)域的結(jié)合能力的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)，包括例如ELISA、蛋白質(zhì)印跡和RIA0抗體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)(例如結(jié)合親合力)也可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)來評(píng)定，例如通過ELISA、Scatchard禾口Biacore分析。工程化和修飾的抗體根據(jù)本發(fā)明的方法制備的抗體的Vh和/或\序列可以用作工程化修飾的抗體的起始材料，所述修飾的抗體可以具有從起始抗體發(fā)生改變的性質(zhì)?？贵w可以通過修飾一個(gè)或兩個(gè)原始可變區(qū)(即Vh和/或內(nèi)(例如一或多個(gè)CDR區(qū)和/或一或多個(gè)構(gòu)架區(qū)內(nèi))的一或多個(gè)殘基進(jìn)行工程化。另外地或者可選地，可以通過修飾恒定區(qū)內(nèi)的殘基來進(jìn)行工程化，例如改變抗體的效應(yīng)子功能。一種可以進(jìn)行的可變區(qū)工程化是⑶R接枝?？贵w主要地通過位于6個(gè)重鏈和輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。為此，在各抗體之間CDR中的氨基酸序列比CDR外的序列更加多樣化。因?yàn)镃DR序列負(fù)責(zé)大多數(shù)抗體-抗原相互作用，可以通過構(gòu)建表達(dá)載體來表達(dá)模擬特定的天然存在抗體的性質(zhì)的重組抗體，所述表達(dá)載體包括來自特定的天然存在抗體的CDR序列，這些CDR序列被接枝到來自具有不同性質(zhì)的不同抗體的框架序列上(參見，例如Riechmann，L.等(1998)NatureM2:323_327Jones,P.等(1986)Nature321:522_525；Queen,C.等(1989)Proc.Natl.Acad.Sei.U.S.Α.8610029-10033；授予Winter的美國(guó)專利No.5，225，539，以及授予Queen等的美國(guó)專利No.5，530,101；5，585，089；5，693，762和6，180，370)?？梢詮墓驳腄NA數(shù)據(jù)庫(kù)或包括種系抗體基因序列的發(fā)表的參考文獻(xiàn)來獲得抗體的框架序列。例如，人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列可以從“VBase”人種系序列數(shù)據(jù)庫(kù)中找到(可在互聯(lián)網(wǎng)上在mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase網(wǎng)站獲得)，以及在Kabat，Ε.Α.等(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，F(xiàn)ifthEdition，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91—3242；Tomlinson，I.M.等(1992)"TheRepertoireofHumanGermlineV11SequencesRevealsaboutFiftyGroupsofVhSegmentswithDifferentHypervariableLoops“J.Mol.Biol.227776-798；和Cox,J.P.L等(1994)“ADirectoryofHumanGerm-lineVhSegmentsRevealsaStrongBiasintheirUsage“Eur.J.Immunol.24:827_836中找至!每一篇文獻(xiàn)的內(nèi)容均通過引用的方式明確并入本文中。作為另一實(shí)例，人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列可以從Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中找到。使用一種稱為GappedBLAST的序列相似性檢索方法相對(duì)于編譯蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)比較抗體蛋白質(zhì)序列(Altschul等(1997)NucleicAcidsResearch253389-3402),S是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。BLAST是一種探試算法(heuristicalgorithm)，其中抗體序列和數(shù)據(jù)庫(kù)序列之間的統(tǒng)計(jì)上顯著的比對(duì)很可能含有比對(duì)字段(alignedword)的高分片段對(duì)(high-scoringsegmentpair)(HSP)。不能通過延伸或者修剪提高分值的片段對(duì)稱為命中(hit)。簡(jiǎn)言之，VBASE來源的核苷酸序列(vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbasel/list2.Php)被翻譯，且FR1-FR3框架區(qū)之間和包括上述框架區(qū)之間的區(qū)域得到保持。數(shù)據(jù)庫(kù)序列平均長(zhǎng)度為98個(gè)殘基。去除在蛋白質(zhì)全長(zhǎng)范圍內(nèi)精確匹配的重復(fù)序列。使用具有缺省的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)(除了被關(guān)閉的低復(fù)雜性過濾器)的程序blastp和BL0SUM62的替代矩陣進(jìn)行蛋白質(zhì)的BLAST檢索過濾出產(chǎn)生序列匹配的前5個(gè)命中。核苷酸序列在所有6個(gè)框架中被翻譯，而在數(shù)據(jù)庫(kù)序列的匹配片段中沒有終止密碼子的框架被認(rèn)為是潛在的命中。這隨后使用BLAST程序tblastx進(jìn)行證實(shí)，其在所有6個(gè)框架中翻譯抗體序列，并將那些翻譯與在所有6個(gè)框架中動(dòng)態(tài)地翻譯的VBASE核苷酸序列進(jìn)行比較?？梢匀缟纤鲱愃频貙?duì)VBASE進(jìn)行其它人種系序列數(shù)據(jù)庫(kù)，例如可從IMGT(http://imgt.cines.fr)獲得的那些的檢索。同一性是在全長(zhǎng)序列上抗體序列和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)之間的精確的氨基酸匹配。陽性結(jié)果(同一性+置換匹配)不是相同的，但是氨基酸置換由BL0SUM62替代矩陣指導(dǎo)。如果抗體序列以相同的同一性與兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)序列相匹配，那么具有最多陽性結(jié)果的命中將被確定為匹配序列命中。確認(rèn)的Vh⑶Rl、⑶R2和⑶R3序列以及Vk⑶Rl、⑶R2和⑶R3序列可以接枝到構(gòu)架區(qū)上，所述框架區(qū)具有與框架序列所來源的種系免疫球蛋白基因中發(fā)現(xiàn)的那些序列相同的序列，或者CDR序列可以接枝到與種系序列相比含有一或多個(gè)突變的構(gòu)架區(qū)上。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在某些情況下，在構(gòu)架區(qū)內(nèi)的突變殘基對(duì)于維持或提高抗體的抗原結(jié)合能力是有益的(參見例如授予Queen等的美國(guó)專利No.5，530，101；5，585,089；5，693，762和6，180，370)。另一類型的可變區(qū)修飾是突變V1^P/或VkCDR1、CDR2和/或CDR3區(qū)內(nèi)的氨基酸殘基，從而改進(jìn)目的抗體的一種或多種結(jié)合性質(zhì)(例如親合性)?？梢赃M(jìn)行定點(diǎn)誘變或PCR介導(dǎo)的誘變來引入突變，并且可以在本領(lǐng)域已知的體外或體內(nèi)試驗(yàn)中評(píng)價(jià)對(duì)抗體結(jié)合的影響或其它感興趣的功能性質(zhì)。例如，可以突變本發(fā)明的抗體來產(chǎn)生文庫(kù)，然后可以就與RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域例如人KitRTK的D4或D5結(jié)構(gòu)域，的結(jié)合對(duì)文庫(kù)進(jìn)行篩選。優(yōu)選地，引入保守修飾(如以上討論的)。突變可以是氨基酸置換、添加或缺失，但優(yōu)選是置換。而且，一般⑶R區(qū)內(nèi)不超過一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)殘基被改變。另一種類型的框架修飾包括突變構(gòu)架區(qū)內(nèi)、或者甚至一個(gè)或多個(gè)⑶R區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)殘基以去除T細(xì)胞表位，從而降低抗體潛在的免疫原性。該方法也稱為“脫免疫(deimmunization)”，并在Carr等人的美國(guó)專利公開No.20030153043中更加詳細(xì)地進(jìn)行了描述。在框架或CDR區(qū)內(nèi)進(jìn)行的修飾之外或者替代以上修飾，本發(fā)明的抗體可以工程化以包含F(xiàn)c區(qū)內(nèi)的修飾，從而通常改變抗體的一種或多種功能性質(zhì)，例如血清半衰期、補(bǔ)體結(jié)合、Fc受體結(jié)合和/或抗原依賴性細(xì)胞毒性。而且，本發(fā)明的抗體可以進(jìn)行化學(xué)修飾(例如一個(gè)或多個(gè)化學(xué)部分可以附著于抗體)或者進(jìn)行修飾以改變它的糖基化作用，而再改變抗體的一種或多種功能性質(zhì)。在下文中更加詳細(xì)地描述這些實(shí)施方式中的每一個(gè)。Fc區(qū)中殘基的編號(hào)是Kabat的EU索引的編號(hào)。在一種實(shí)施方式中，修飾CHl的鉸鏈區(qū)從而改變(例如增加或減少)鉸鏈區(qū)中半胱氨酸殘基的數(shù)量。該方法在Bodmer等人的美國(guó)專利No.5，677，425中進(jìn)一步描述。改變CHl鉸鏈區(qū)中半胱氨酸殘基的數(shù)目例如以幫助輕鏈和重鏈的組裝或者提高或降低抗體的穩(wěn)定性。在另一實(shí)施方式中，使抗體的Fc鉸鏈區(qū)突變以降低抗體的生物半衰期。更具體地說，將一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變引入Fc鉸鏈片段的CH2-CH3結(jié)構(gòu)域界面區(qū)，使得抗體相對(duì)于天然的Fc鉸鏈結(jié)構(gòu)域的葡萄球菌A蛋白(SpA)結(jié)合具有受損的SpA結(jié)合。該方法在Ward等人的美國(guó)專利No.6，165，745中進(jìn)一步描述。在另一實(shí)施方式中，抗體經(jīng)修飾以增加其生物半衰期。多種方法均可行。例如，如授予Ward的美國(guó)專利No.6，277，375中描述的，可以引入一個(gè)或多個(gè)以下突變T252L、T254S、T256F。或者，為了提高生物半衰期，如在Presta等人的美國(guó)專利No.5，869，046和6，121，022中所述，可以在CHl或CL區(qū)內(nèi)改變抗體以包含從IgG的Fc區(qū)CH2結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)環(huán)獲得的補(bǔ)救受體(salvagereceptor)結(jié)合表位。只要抗體與RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域的結(jié)合不受損，這些策略將是有效的。在再其它實(shí)施方式中，通過以不同的氨基酸殘基來置換至少一個(gè)氨基酸殘基而改變Fc區(qū)，以改變抗體的效應(yīng)子功能。例如，選自氨基酸殘基234、235、236、237、297、318、320和322的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可以被不同的氨基酸殘基取代，從而抗體具有對(duì)效應(yīng)子配體的改變的親和性，但保持親本抗體的抗原結(jié)合能力。其親和性發(fā)生改變的效應(yīng)子配體可以是例如Fc受體或補(bǔ)體的Cl成分。該方法在Winter的美國(guó)專利No.5，624，821和5，648，260中有進(jìn)一步的詳細(xì)描述。在另一實(shí)例中，選自氨基酸殘基329、331和322的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可以被不同的氨基酸殘基置換，從而抗體具有改變的Clq結(jié)合和/或降低的或消除的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(⑶C)。該方法在Idusogie等人的美國(guó)專利No.6，194，551中進(jìn)一步詳細(xì)描述。在另一實(shí)例中，改變氨基酸位置231和239內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，從而改變抗體固定補(bǔ)體的能力。該方法在Bodmer等人的PCT公開WO94/29351中進(jìn)一步描述。在又一個(gè)實(shí)例中，通過修飾以下位置的一個(gè)或多個(gè)氨基酸來修飾Fc區(qū)以提高抗體介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的能力和/或提高抗體對(duì)Fcγ受體的親和力238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。該方法在Presta的PCT公開WO00/42072中進(jìn)一步描述。人IgGl上與FcyRl、FcγRII、FcγRIII和FcRn的結(jié)合位點(diǎn)已經(jīng)作圖，并且具有改進(jìn)的結(jié)合的變異體已經(jīng)描述(參見Shields，R.L.等(2001)J.Biol.Chem.Z迅6591-6604)。位置256、290、298、333、334和339的特定突變顯示出提高了對(duì)FcγRIII的結(jié)合。另外，以下結(jié)合突變體顯示出提高了FcYRIII的結(jié)合T256A/S298A，S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。在再另一實(shí)施方式中，如美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/957，271(通過引用的方式將該專利以其全部?jī)?nèi)容并入本文)中描述的那樣，通過引入半胱氨酸殘基來修飾本發(fā)明抗體的C-末端。這樣的修飾包括但是不局限于在全長(zhǎng)重鏈序列的C-末端或其附近置換現(xiàn)有的氨基酸殘基，以及將含有半胱氨酸的延伸段引入全長(zhǎng)重鏈序列的C-末端。在優(yōu)選實(shí)施方式中，含有半胱氨酸的延伸段包括序列丙氨酸-丙氨酸-半胱氨酸(從N-末端至C-末端)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，這樣的C-末端半胱氨酸修飾的存在提供了結(jié)合伴體分子例如治療劑或標(biāo)記分子的位置。特別是，由于C-末端半胱氨酸修飾周到反應(yīng)性硫醇基的存在可如下文詳述的用于綴合使用二硫接頭的伴體分子。用這樣的方式結(jié)合抗體與伴體分子能夠提高對(duì)連接的特定位點(diǎn)的控制。此外，通過在C-末端處或其附近引入連接位點(diǎn)，可以優(yōu)化結(jié)合，從而降低或消除對(duì)抗體功能性質(zhì)的干擾，并能夠簡(jiǎn)化對(duì)綴合物制劑的分析和質(zhì)量控制。在再另一實(shí)施方式中，抗體的糖基化作用被修飾。例如，可以產(chǎn)生無糖基化抗體(即抗體缺少糖基化)。可以改變糖基化作用以例如提高抗體對(duì)抗原的親和性。這樣的糖修飾可以通過例如改變抗體序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)而實(shí)現(xiàn)。例如，可以進(jìn)行導(dǎo)致消除一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)框架糖基化位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換，從而消除該位點(diǎn)的糖基化。這樣的無糖基化可以增加抗體對(duì)抗原的親和性。在授予Co等的美國(guó)專利No.5，714，350和6，350，861中進(jìn)一步詳細(xì)描述了這樣的方法。在授予Hanai等人的美國(guó)專利7，214，775、授予Presta的美國(guó)專利No.6，737，056、授予Presta的美國(guó)公開No.20070020260、授予Dickey等的PCT公開No.W0/2007/084926、授予Zhu等人的PCT公開No.W0/2006/089294和授予Ravetch的PCT公開No.W0/2007/055916中進(jìn)一步詳細(xì)描述了用于改變糖基化的其它方法，上述每一篇文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容均通過引用的方式并入本文。另外地或可選地，可以產(chǎn)生具有改變的糖基化類型的抗體，例如具有減少量的巖藻糖殘基的低巖藻糖化(hypofucosylated)抗體或具有增加的對(duì)開(bisecting)GlcNac結(jié)構(gòu)的抗體。已經(jīng)證明這種改變的糖基化模式提高了抗體的ADCC能力。通過例如在具有改變的糖基化機(jī)構(gòu)的宿主細(xì)胞中表達(dá)抗體可以實(shí)現(xiàn)這種糖修飾。具有改變的糖基化機(jī)構(gòu)的細(xì)胞在本領(lǐng)域中有描述，并且可用作表達(dá)本發(fā)明的重組抗體的宿主細(xì)胞，從而產(chǎn)生具有改變的糖基化的抗體。例如，細(xì)胞系Ms704、Ms705和Ms709缺少巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因，F(xiàn)UT8(α(1,6)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)，從而在Ms704、Ms705和Ms709細(xì)胞系中表達(dá)的抗體在其糖類化合物上缺少巖藻糖。使用兩個(gè)置換載體通過靶向破壞CH0/DG44細(xì)胞中的FUT8基因來產(chǎn)生Ms704、Ms705和Ms709FUT8+細(xì)胞系。(參見Yamane等人的美國(guó)專利公開No.20040110704和Yamane-Ohnuki等(2004)BiotechnolBioeng泣614_22)。作為另一實(shí)例，Hanai等的EP1，176，195描述了具有功能受損的FUT8基因(其編碼巖藻糖轉(zhuǎn)移酶)的細(xì)胞系，從而在這樣的細(xì)胞系中表達(dá)的抗體通過減少或消除α-1，6鍵-相關(guān)的酶而表現(xiàn)出低巖藻糖化。Hanai等也描述了具有將巖藻糖添加至N-乙酰葡糖胺(其結(jié)合抗體的Fc區(qū))的低的酶活性或不具有所述酶活性的細(xì)胞系，例如大鼠骨髓瘤細(xì)胞系YB2/0(ATCCCRL1662)。Presta的PCT公開WO03/035835描述了變異CHO細(xì)胞系、Lecl3細(xì)胞，其具有降低的將巖藻糖連接到Asn(297)-連接的糖上的能力，也導(dǎo)致在該宿主細(xì)胞中表達(dá)的抗體的低巖藻糖化(也參見Shields，R.L.等(2002)J.Biol.Chem.277:26733_26740)。Umana等的PCT公開WO99/54342描述了工程化以表達(dá)糖蛋白-修飾的糖基轉(zhuǎn)移酶(例如β(1，4)-N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶III(GnTIII))的細(xì)胞系，使得在該工程化細(xì)胞系中表達(dá)的抗體表現(xiàn)出對(duì)開GlcNac結(jié)構(gòu)增加，這引起所述抗體的ADCC活性增加(也參見Umana等(1999)Nat.Biotech.17176-180).可選地，所述抗體的巖藻糖殘基可以使用巖藻糖苷酶切割。例如，巖藻糖苷酶α-L-巖藻糖苷酶從抗體除去巖藻糖殘基。(Tarentino，A.L.等(1975)Biochem.145516-23)。另外地或可選地，可以制備具有改變類型的糖基化的抗體，其中該改變涉及所述抗體的唾液酸化水平。這樣的改變被描述于Dickey等的PCT公開W0/2007/084926號(hào)和Ravetch等的PCT公開WCV2007/055916號(hào)，兩者都通過引用以其全部?jī)?nèi)容并入本文。例如，可使用利用唾液酸酶(諸如產(chǎn)脲節(jié)桿菌(Arthrobacterureafacens)唾液酸酶)的酶促反應(yīng)。這種反應(yīng)的條件被一般地描述于美國(guó)專利5，831，077中，其通過引用以其全部?jī)?nèi)容由此并入。適當(dāng)?shù)拿傅钠渌窍拗菩詫?shí)例是神經(jīng)氨糖酸苷酶和N-糖苷酶F，如分別在Schloemer等J.Virology,15(4)，882-893(1975)中和在Leibiger等，BiochemJ.，338，529-538(1999)中描述的。去唾液酸化抗體可以通過使用親和層析進(jìn)一步純化?？蛇x地，可使用增加唾液酸化水平的方法，例如通過使用唾液酸轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行。這種反應(yīng)的條件被一般地描述于Basset等，ScandinavianJournalofImmunology,51(3),307-311(2000)中。在本文中本發(fā)明考慮的另一種抗體修飾是聚乙二醇化。例如，抗體可以被聚乙二醇化，以例如增加所述抗體的生物(例如血清)半衰期。為使抗體聚乙二醇化，所述抗體或其片段通常在其中一個(gè)或多個(gè)PEG基團(tuán)形成與所述抗體或抗體片段的連接的條件下與聚乙二醇(PEG)(諸如PEG的活性酯或醛衍生物)反應(yīng)。優(yōu)選地，聚乙二醇化經(jīng)由與反應(yīng)性PEG分子(或類似的反應(yīng)性水溶性聚合物)的?；磻?yīng)或烷基化反應(yīng)進(jìn)行。如本文所使用，術(shù)語“聚乙二醇”意圖包括已經(jīng)用于衍生其它蛋白質(zhì)的任何形式的PEG，諸如單(Cl-ClO)烷氧基_或芳氧基_聚乙二醇或聚乙二醇_馬來酰亞胺。在某些實(shí)施方式，待乙二醇化的抗體是無糖基化抗體。用于蛋白質(zhì)聚乙二醇化的方法是本領(lǐng)域已知的并且可以被應(yīng)用于本發(fā)明的抗體。例如，參見Nishimura等的EP0154316和Ishikawa等的EPO401384。同樣，這里描述的聚乙二醇化方法也適用如下所述的本發(fā)明的肽類分子?？贵w片段和抗體模擬物本發(fā)明不限于傳統(tǒng)的抗體，而是可以通過利用抗體片段和抗體模擬物進(jìn)行實(shí)施。如下文所詳述的，各種抗體片段和抗體模擬物技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)被開發(fā)出來并且在本領(lǐng)域中是廣為人知的。盡管許多的這些技術(shù)，諸如結(jié)構(gòu)域抗體、納米體和UniBody，使用傳統(tǒng)抗體結(jié)構(gòu)的片段或?qū)鹘y(tǒng)抗體結(jié)構(gòu)的其它修飾，但仍存在采用結(jié)合結(jié)構(gòu)的替代的技術(shù)，諸如Adnectin、親和體、DARPin、抗運(yùn)載蛋白、高親合性多聚體和Versabody，盡管它們模擬傳統(tǒng)的抗體結(jié)合，但是通過完全不同的機(jī)理產(chǎn)生并經(jīng)由不同的機(jī)理起作用。這些替代結(jié)構(gòu)的一些在Gill和Damle(2006)17:653_658中進(jìn)行了綜述。結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)是抗體的最小功能結(jié)合單元，相應(yīng)于人抗體的重(VH)鏈或輕(VL)鏈的可變區(qū)。結(jié)構(gòu)域抗體具有大約13kDa的分子量。Domantis已經(jīng)開發(fā)出完全人VH和VLdAb的一系列大的和高度功能性的文庫(kù)(在各文庫(kù)中超過一百億不同的序列)，并運(yùn)用這些文庫(kù)來選擇特異于治療靶標(biāo)的dAb。與許多常規(guī)抗體相反，結(jié)構(gòu)域抗體在細(xì)菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中良好地表達(dá)。通過參考美國(guó)專利6，291，158,6,582，915,6,593，081、6，172，197,6,696，245；美國(guó)專利申請(qǐng)No.2004/0110941；歐洲專利申請(qǐng)No.1433846和歐洲專利0368684和0616640；W005/035572、W004/101790、W004/081026、W004/05882UW004/003019和W003/002609可獲得結(jié)構(gòu)域抗體和其制備方法的更多細(xì)節(jié)，上述文獻(xiàn)每一篇通過引用以其全部?jī)?nèi)容并入本文.納米體是包含天然存在的重鏈抗體的獨(dú)特結(jié)構(gòu)性和功能性特性的源自抗體的治療性蛋白質(zhì)。這些重鏈抗體包含單一可變結(jié)構(gòu)域(VHH)和兩個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(CH2和CH3)。重要的是，克隆的和分離的VHH結(jié)構(gòu)域是具有原始重鏈抗體的完全的抗原結(jié)合能力的完全穩(wěn)定的多肽。納米體與人抗體的VH結(jié)構(gòu)域具有高同源性，并可以被進(jìn)一步人源化而沒有任何活性損失。重要的是，納米體具有低的致免疫能力，這已經(jīng)在采用納米體前導(dǎo)化合物的靈長(zhǎng)類動(dòng)物研究中得到了證實(shí)。納米體將常規(guī)抗體的優(yōu)點(diǎn)和小分子藥物的重要特征相結(jié)合。像常規(guī)抗體一樣，納米體顯示出高的靶特異性、對(duì)它們的靶的高親合力和低的固有毒性。然而，如小分子藥物一樣，它們可以抑制酶并容易地到達(dá)受體裂縫(receptorcleft)。而且，納米體極其穩(wěn)定，可以通過除了注射之外的方式進(jìn)行施用(例如，參見WO04/041867，其通過引用以其全部?jī)?nèi)容并入本文)并易于制造。納米體的其它優(yōu)點(diǎn)包括由于它們的小尺寸而識(shí)別不常見的或隱藏的表位，從而以高親合力、由于獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致的選擇性及藥物形式靈活性結(jié)合到蛋白質(zhì)靶的空腔或活性部位，因而調(diào)整半衰期和藥物開發(fā)的容易度和速度。納米體通過單一基因進(jìn)行編碼并在幾乎所有的原核和真核宿主中高效產(chǎn)生，例如大腸桿菌(例如見U.S.6，765，087，其通過引用以其全部并入本文)、霉菌(例如曲霉屬(Aspergillus)或木霄屬(Trichoderma))禾口酵母(例如酵母屬(Saccharomyces)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、漢遜酵母屬(Hansenula)或畢赤氏酵母屬(Pichia))(例如見美國(guó)6，838，254，其通過引用以其全部并入本文)。該產(chǎn)生方法可擴(kuò)大規(guī)模并已經(jīng)產(chǎn)生出數(shù)公斤量的納米體。因?yàn)榧{米體相比于常規(guī)抗體表現(xiàn)出優(yōu)異的穩(wěn)定性，所以它們可以被配制成長(zhǎng)貯存期的即用溶液。Nanoclone法(例如見WO06/079372，其通過引用以其全部并入本文)是基于B細(xì)胞的自動(dòng)化高通量選擇的，用于產(chǎn)生針對(duì)期望靶的納米體的專用方法，并且可被用于本發(fā)明。UniBody是另一種抗體片段技術(shù)，然而這個(gè)技術(shù)是基于去除IgG4抗體的絞鏈區(qū)。該絞鏈區(qū)的缺失產(chǎn)生大小基本上為常規(guī)IgG4抗體的一半并具有單價(jià)結(jié)合區(qū)而不是IgG4抗體的二價(jià)結(jié)合區(qū)的分子。也眾所周知的是，IgG4抗體是惰性的，因此不與免疫系統(tǒng)相互作用，這對(duì)于其中不期望免疫應(yīng)答的疾病的治療可能是有利的，并且該優(yōu)點(diǎn)傳遞到UniBody。例如，UniBody可起到抑制或沉默而不是殺死它們所結(jié)合的細(xì)胞的作用。另外，結(jié)合癌細(xì)胞的UniBody不刺激它們?cè)鲋?。而且，因?yàn)閁niBody的大小為常規(guī)IgG4抗體大小的一半左右，所以它們可以潛在有利的效力在較大的實(shí)體瘤上顯示出更好的分布。UniBody以與整個(gè)IgG4抗體相似的速率從機(jī)體清除，并且能夠以與全抗體相似的對(duì)抗原的親合性結(jié)合。通過參考專利申請(qǐng)W02007/059782——其通過引用以其全部并入本文，可獲得UniBody的更多細(xì)節(jié)。Adnectin分子是來源于纖連蛋白的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域的工程化結(jié)合蛋白。纖連蛋白在人體內(nèi)天然存在。它作為不溶性糖蛋白二聚物存在于細(xì)胞外基質(zhì)中并還充當(dāng)連接蛋白。它還以可溶的形式作為二硫連接的二聚體存在于血漿中。通過肝臟細(xì)胞(肝細(xì)胞)合成纖連蛋白的血漿形式，而通過軟骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮的一些細(xì)胞產(chǎn)生ECM形式(見WardΜ.禾口Marcey，D.，callutheran.edu/Academic_Programs/Departments/BioDev/omm/fibro/fibro.htm)。如早先提及，纖連蛋白可天然地作為細(xì)胞粘附分子發(fā)揮其作用，或者它可通過在細(xì)胞外基質(zhì)中進(jìn)行接觸而介導(dǎo)細(xì)胞的相互作用。通常，纖連蛋白由三個(gè)不同的蛋白質(zhì)模塊——I型、II型和III型模塊一一組成。對(duì)于纖連蛋白的結(jié)構(gòu)或功能的綜述，見Pankov和Yamada(2002)JCellSci.；115(Pt20)=3861-3,Hohenester和Engel(2002)21:115_128，和Lucena等(2007)InvestClin.48:249_262。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，adnectin分子通過改變由分布在兩個(gè)β折疊之間的多個(gè)β鏈組成的天然蛋白質(zhì)而衍生于纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域。取決于起源的組織，纖連蛋白可包含多個(gè)III型結(jié)構(gòu)域，其可以被表示為例如節(jié)113、￥113、卞113等。kiFM結(jié)構(gòu)域包含整聯(lián)蛋白結(jié)合基序，并進(jìn)一步包含連接所述β鏈的三個(gè)環(huán)。這些環(huán)可以被認(rèn)為相當(dāng)于IgG重鏈的抗原結(jié)合環(huán)，并且它們可以通過下文討論的方法加以改變以特異性結(jié)合目標(biāo)靶，例如RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域，諸如人KitRTK的D4或D5結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，可用于本發(fā)明的目的的纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域是表現(xiàn)出與編碼纖連蛋白III型分子的結(jié)構(gòu)的序列(其可從ProteinDataBank(PDB,rcsb.org/pdb/home/home.do)以訪|、可代石馬(accessioncode):lttg獲取)具有至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的序列同一性的序列。Adnectin分子還可來源于uiFr^相關(guān)分子的聚合物，而不是簡(jiǎn)單的單體kiFM結(jié)構(gòu)。盡管天然kiFM結(jié)構(gòu)域通常結(jié)合整聯(lián)蛋白，但經(jīng)改裝變成adnectin分子的wFM蛋白被改變以結(jié)合目標(biāo)抗原，例如RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域，諸如人Kit的D4或D5結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)kiFM分子的改變包括對(duì)β鏈的至少一個(gè)突變。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，連接kiFM分子的β鏈的環(huán)區(qū)被改變以結(jié)合人受體酪氨酸激酶(例如III型受體酪氨酸激酶，諸如人Kit)的Ig樣結(jié)構(gòu)域。10Fn3中的改變可通過本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行，包括但不限于易錯(cuò)PCR、定點(diǎn)誘變、DNA改組或在本文提及的其它類型的重組誘變。在一個(gè)實(shí)例中，編碼wFM序列的DNA的變異體可以直接體外合成，并且之后在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯?？蛇x地，天然kiFM序列可使用標(biāo)準(zhǔn)方法從基因組分離或克隆(如在例如美國(guó)專利申請(qǐng)No.20070082365中進(jìn)行的)，然后使用本領(lǐng)域已知的誘變方法進(jìn)行突變。在一個(gè)實(shí)施方式中，靶蛋白(例如，RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域如KitRTK的D4或05結(jié)構(gòu)域)可以固定在固相載體上，例如柱樹脂或微孔滴定板中的孔。然后，將靶與潛在結(jié)合蛋白的文庫(kù)接觸。該文庫(kù)可包含通過kiFM序列的誘變/隨機(jī)化或通過kiFM環(huán)區(qū)(不是β鏈)的誘變/隨機(jī)化而來源于野生型kiFM的kiFM克隆或adnectin分子。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述文庫(kù)可以是通過Szostak等的美國(guó)專利申請(qǐng)No.09/007,005和09/247，190、Szostak等的W0989/31700以及Roberts&Szostak(1997)94:12297_12302描述的技術(shù)產(chǎn)生的RNA-蛋白質(zhì)融合文庫(kù)。所述文庫(kù)也可以是DNA-蛋白質(zhì)文庫(kù)(例如，如描述于Lohse，美國(guó)專利申請(qǐng)No.60/110,549、美國(guó)專利申請(qǐng)No.09/459,190和W000/32823)。然后，所述融合文庫(kù)與固定的靶(例如人KitRTK的D4或D5結(jié)構(gòu)域)一起溫育，并洗滌固相載體以除去非特異性結(jié)合的成分。然后，在嚴(yán)格條件下洗脫緊密結(jié)合物，并且使用PCR來擴(kuò)增遺傳信息或產(chǎn)生結(jié)合分子的新的文庫(kù)，以重復(fù)所述過程(有或者沒有另外的誘變)?？梢灾貜?fù)選擇/誘變過程，直到獲得對(duì)靶具有足夠的親合性的結(jié)合物。用于本發(fā)明的Adnectin分子可以使用Adnexus(Briston-MyersSquibb公司)采用的PROfusion技術(shù)進(jìn)行工程化。PROfusion技術(shù)是基于上文所述的技術(shù)建立的(例如Roberts&Szostak(1997)9412297-12302)。產(chǎn)生改變的kiFM結(jié)構(gòu)域的文庫(kù)和選擇可用于本發(fā)明的適當(dāng)結(jié)合物的方法被充分描述于下列美國(guó)專利和專利申請(qǐng)文件中并通過引用并入本文美國(guó)專利No.7，115，396,6,818，418、6，537，749,6，660，473,7，195，880,6，416，950,6，214，553,6623926,6，312，927,6，602，685,6，518，018,6，207，446,6，258，558,6，436，665,6，281，344,7，270，950,6，951，725,6,846，655,7,078，197,6,429，300,7,125，669,6,537，749,6,660，473和美國(guó)專利申請(qǐng)No20070082365,20050255548,20050038229,20030143616,20020182597,20020177158、20040086980、20040253612、20030022236、20030013160、20030027194、20030013110,20040259155,20020182687,20060270604,20060246059,20030100004,20030143616和20020182597。纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域(諸如1QFn3)的多樣性的產(chǎn)生及隨后的選擇步驟可以使用本領(lǐng)域已知的其它方法進(jìn)行，諸如噬菌體展示、核糖體展示或酵母表面展示，例如LipOV§ek等(2007)JournalofMolecularBiology3681024-1041；Sergeeva等(2OO6)AdvDrugDelivRev.581622-1654；Petty等(2OO7)TrendsBiotechnol.25:7_15;Rothe等(2006)ExpertOpinBiolTher.6177—187；禾口Hoogenboom(2005)NatBiotechnol.23:1105_1116。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，上文引用的參考文獻(xiàn)中的方法可用來從優(yōu)選的kiFM結(jié)構(gòu)域之外的蛋白質(zhì)衍生抗體模擬物。可用于經(jīng)由上述引用的方法產(chǎn)生抗體模擬物的其他分子非限制性地包括人纖連蛋白模塊1FnS-9Fr^和11Fr^-17FnS以及來自非人類動(dòng)物和原核生物的相關(guān)Fn3模塊。此外，也可使用來自與kiFM具有序列同源性的其它蛋白質(zhì)——諸如腱生蛋白(tenascin)和粗纖維調(diào)節(jié)素(imdulin)——的Fn3模塊。具有免疫球蛋白樣折疊(但是具有與Vh結(jié)構(gòu)域無關(guān)的序列)的其它示例性蛋白質(zhì)包括N-鈣粘蛋白、ICAM-2、肌聯(lián)蛋白(titin)、GCSF受體、細(xì)胞因子受體、糖苷酶抑制劑、E-鈣粘蛋白和抗生素色蛋白。具有相關(guān)結(jié)構(gòu)的其它結(jié)構(gòu)域可以來源于髓磷脂膜粘附分子P0、CD8、CD4、CD2、I類MHC、T細(xì)胞抗原受體、⑶1、VCAM-I的C2和I-組結(jié)構(gòu)域、肌球蛋白-結(jié)合蛋白C的I-組免疫球蛋白折疊、肌球蛋白-結(jié)合蛋白H的I-組免疫球蛋白折疊、端蛋白(telokin)的I-組免疫球蛋白折疊、telikin、NCAM、tWitChin、神經(jīng)膠質(zhì)蛋白、生長(zhǎng)激素受體、紅細(xì)胞生成素受體、催乳素受體、GC-SF受體、干擾素-Y受體、β-半乳糖苷酶/葡糖苷酸酶、β-葡糖苷酸酶和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶?？蛇x地，包括一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白樣折疊的任何其他的蛋白質(zhì)可以用于產(chǎn)生adnectin樣結(jié)合成分。這樣的蛋白質(zhì)可以例如使用程序SCOP加以確定(Murzin等，J.Mol.Biol.247:536(1995)；LoConte等，NucleicAcidsRes.25:257(2000)。適體是本發(fā)明包括的另一種類型的抗體模擬物。適體通常是小的核苷酸聚合物，其結(jié)合特定的分子靶。適體可以是單鏈或雙鏈核酸分子(DNA或RNA)，盡管DNA基適體最通常是雙鏈的。對(duì)于適體核酸沒有限定的長(zhǎng)度；然而，適體分子最常見具有在15和40個(gè)核苷酸之間的長(zhǎng)度。適體經(jīng)常形成復(fù)合三維結(jié)構(gòu)，其決定它們對(duì)靶分子的親合性。適體相比于簡(jiǎn)單的抗體可以提供許多優(yōu)勢(shì)，主要是因?yàn)樗鼈兛梢詭缀跬耆隗w外被工程化和被擴(kuò)增。而且，適體通常很少或不誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。適體可以使用各種技術(shù)產(chǎn)生，但最初使用體外選擇(Ellington和Szostak.(1990)Nature.346(6287):818_22)和SELEX法(通過指數(shù)富集導(dǎo)致系統(tǒng)性配體進(jìn)化)(Schneider等1992.JMolBiol.228(3):862_9)——其內(nèi)容通過引用并入本文——進(jìn)行開發(fā)。制備和使用適體的其它方法已經(jīng)公開，包括Klussmann.TheAptamerHandbookFunctionalOligonucleotidesandTheirApplications.ISBN978-3-527-31059-3；Ulrich等2006.CombChemHighThroughputScreen9(8)619-32；Cerchia禾口deFranciscis.2007.MethodsMolBiol.361187-200；Ireson和Kelland.2006.MolCancerTher.20065(12):2957_62；美國(guó)專利No5582981；5840867；5756291；6261783；6458559；5792613；6111095；以及美國(guó)專利申請(qǐng)No11/482,671；11/102，428；11/291，610；和10/627，543，其都通過引用并入本文。SELEX法明顯是最流行的并且以三個(gè)基本步驟進(jìn)行。首先，針對(duì)與特定分子靶的結(jié)合對(duì)候選核酸分子的文庫(kù)進(jìn)行挑選。其次，從非結(jié)合物分離出對(duì)于所述靶具有足夠親合性的核酸。第三，擴(kuò)增結(jié)合的核酸，形成第二文庫(kù)，并且重復(fù)該過程。在各次重復(fù)時(shí)，選擇對(duì)于靶分子具有越來越高的親合性的適體。SELEX法被更充分描述于通過引用并入本文的下列出版物中Bugaut等2006.4(22):4082_8;Stoltenburg等2007BiomolEng.200724(4)381-403；和Gopinath.2007.AnalBioanalChem.2007.387(1):171_82。本發(fā)明的“適體”也包括由肽而不是核苷酸制成的適體。肽適體與核苷酸適體具有一些共同的性質(zhì)(例如，小的尺寸和以高親合性結(jié)合靶分子的能力)并且它們可以通過與用于產(chǎn)生核苷酸適體的選擇法具有相似原理的選擇法產(chǎn)生，例如Baines和Colas.2006.DrugDiscovToday.11(7-8):334_41；和Bickle等2006.NatProtoc.1(3):1066_91，其通過引用并入本文。親和體分子表示來源于葡萄球菌蛋白A的IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域之一的基于58個(gè)氨基酸殘基蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的一類新的親合性蛋白質(zhì)。這一種三螺旋束結(jié)構(gòu)域已經(jīng)用作構(gòu)建組合噬菌粒文庫(kù)的支架，可使用噬菌體展示技術(shù)從該文庫(kù)選擇靶向于期望分子的親和體變體(NordK，GunneriussonE，RingdahlJ，StahlS，UhlenM，NygrenPA,Bindingproteinsselectedfromcombinatoriallibrariesofanα-helicalbacterialreceptordomain,NatBiotechnol1997；15772-7.RonmarkJ,GronlundH，UhlenM，NygrenPA,HumanimmunoglobulinA(IgA)-specificligandsfromcombinatorialengineeringofproteinA，EurJBiochem2002;269:2647_55)。與它們的低分子量(6kDa)結(jié)合，親和體分子的簡(jiǎn)單、穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)使得它們適于各式各樣的應(yīng)用，例如作為檢測(cè)試劑(RonmarkJ，HanssonM,NguyenT等，Constructionandcharacterizationofaffibody-FcchimerasproducedinEscherichiacoli，JImmunolMethods2002;261:199-211)，以及用于抑制受體相互作用(SandstormK,XuΖ,ForsbergG,NygrenΡΑ,InhibitionoftheCD28-CD80co_stimulationsignalbyaCD28_bindingAffibodyliganddevelopedbycombinatorialproteinengineering，ProteinEng2003;16:691-7)。通過參考美國(guó)專利No.5，831，012(其通過引用以其全部并入本文)可獲得親和體和其制備方法的更多細(xì)節(jié)。DARPin(設(shè)計(jì)的錨蛋白重復(fù)序列蛋白質(zhì))是抗體模擬DRP(設(shè)計(jì)的重復(fù)序列蛋白質(zhì))技術(shù)的一個(gè)實(shí)例，該技術(shù)已經(jīng)被開發(fā)為利用非抗體多肽的結(jié)合能力。重復(fù)序列蛋白質(zhì)如錨蛋白或富亮氨酸重復(fù)序列蛋白質(zhì)是遍在的結(jié)合分子，其在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外存在，這與抗體不同。它們的獨(dú)特的模塊結(jié)構(gòu)的特征在于重復(fù)結(jié)構(gòu)單元(重復(fù)序列)，其堆疊在一起以形成顯示出可變的和模塊的靶_結(jié)合表面的細(xì)長(zhǎng)重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域。基于該模塊性，具有高度多樣化結(jié)合特異性的多肽的組合文庫(kù)可以被產(chǎn)生。該策略包括展示可變表面殘基的自相容性重復(fù)序列的共有設(shè)計(jì)以及它們隨機(jī)裝配成重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域。DARPin可以在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中以很高的產(chǎn)量產(chǎn)生并且它們屬于已知的最穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。對(duì)寬范圍的靶蛋白質(zhì)——包括人受體、細(xì)胞因子、激酶、人蛋白酶、病毒和膜蛋白質(zhì)——具有高度特異性、高親合性的DARPin已經(jīng)被選擇?？梢垣@得具有單數(shù)位納摩爾至皮摩爾范圍內(nèi)的親合性的DARPin。DARPin已經(jīng)用于各種各樣的應(yīng)用，包括ELISA、夾心ELISA、流式細(xì)胞術(shù)分析(FACS)、免疫組織化學(xué)(IHC)、芯片應(yīng)用、親和純化或蛋白質(zhì)印跡。DARPin也已證明在細(xì)胞內(nèi)空間具有高度的活性，例如作為融合于綠色熒光蛋白(GFP)的胞內(nèi)標(biāo)記蛋白。DARPin被進(jìn)一步用于以PM范圍內(nèi)IC50抑制病毒進(jìn)入。DARPin不僅對(duì)于阻斷蛋白質(zhì)相互作用是理想的，而且對(duì)于抑制酶也是理想的。蛋白酶、激酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白已經(jīng)被成功抑制，最經(jīng)常變構(gòu)性抑制模式。在腫瘤上的極快和特異性富集以及非常有利的腫瘤_血液比率使得DARPin很適于體內(nèi)診斷或治療方法。關(guān)于DARPin及其他DRP技術(shù)的其它信息可發(fā)現(xiàn)于美國(guó)專利申請(qǐng)公開No.2004/0132028和國(guó)際專利申請(qǐng)公開No.WO02/20565，兩者都通過弓|用以其全部?jī)?nèi)容并入本文?？惯\(yùn)載蛋白是另外的抗體模擬技術(shù)，然而，在這種情況下，結(jié)合特異性源自于脂鈣蛋白(lipocalin)——在人組織和體液中天然存在且大量表達(dá)的低分子量蛋白質(zhì)家族。月旨鈣蛋白已進(jìn)化為執(zhí)行與化學(xué)上敏感的或不溶性的化合物的生理運(yùn)輸和儲(chǔ)存有關(guān)的許多體內(nèi)功能。脂鈣蛋白具有穩(wěn)固的內(nèi)在結(jié)構(gòu)，其包含高度保存的β桶，該β桶在所述蛋白質(zhì)一個(gè)末端支持四個(gè)環(huán)。這些環(huán)形成結(jié)合袋的入口，并且在所述分子的這個(gè)部分的構(gòu)象差異造成在各個(gè)脂鈣蛋白之間結(jié)合特異性的變化。盡管由保守β折疊框架支持的超變環(huán)的整體結(jié)構(gòu)類似于免疫球蛋白，但是脂鈣蛋白與抗體在大小、由160-180個(gè)氨基酸(其比單一免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域稍大)的單一多肽鏈組成方面顯著不同。脂鈣蛋白被克隆并且它們的環(huán)進(jìn)行工程化以產(chǎn)生抗運(yùn)載蛋白。結(jié)構(gòu)上多樣的抗運(yùn)載蛋白的文庫(kù)已經(jīng)被產(chǎn)生，并且抗運(yùn)載蛋白展示允許對(duì)結(jié)合功能進(jìn)行選擇和篩選，之后在原核或真核系統(tǒng)中表達(dá)和產(chǎn)生用于進(jìn)一步分析的可溶性蛋白質(zhì)。研究已經(jīng)成功地證明，可以開發(fā)對(duì)于幾乎任何可以被分離的人靶蛋白特異性的抗運(yùn)載蛋白，并且可以獲得在納摩爾或以上的范圍內(nèi)的結(jié)合親合性?？惯\(yùn)載蛋白還可以被設(shè)計(jì)成雙靶向蛋白質(zhì)，所謂的Duocalin。Duocalin結(jié)合在使用標(biāo)準(zhǔn)制造方法容易產(chǎn)生的一個(gè)單體蛋白質(zhì)中的兩個(gè)獨(dú)立的治療靶標(biāo)上，同時(shí)保持靶特異性和親合性，而無論它的兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)取向如何。通過單一分子對(duì)多個(gè)靶的調(diào)節(jié)在已知涉及一種以上病因的疾病中是特別有利的。而且，二價(jià)或多價(jià)結(jié)合形式如Duocalin在靶向疾病中的細(xì)胞表面分子、介導(dǎo)對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激動(dòng)效應(yīng)或誘導(dǎo)經(jīng)由細(xì)胞表面受體的結(jié)合和成簇而增強(qiáng)的內(nèi)化效應(yīng)方面具有顯著的能力。而且，Duocalin的高內(nèi)在穩(wěn)定性與單體抗運(yùn)載蛋白相當(dāng)，從而為Duocalin提供靈活的制劉和輸送可能。關(guān)于抗運(yùn)載蛋白的其它信息可發(fā)現(xiàn)于美國(guó)專利7，250，297和國(guó)際專利申請(qǐng)公布No.WO99/16873中，兩者都通過引用以其全部?jī)?nèi)容并入本文?？捎糜诒景l(fā)明的另一個(gè)抗體模擬技術(shù)是高親合性多聚體。高親合性多聚體是通過體外外顯子改組和噬菌體展示從人的細(xì)胞外受體結(jié)構(gòu)域的大家族發(fā)展而來，從而產(chǎn)生具有結(jié)合和抑制性質(zhì)的多結(jié)構(gòu)域蛋白。連接多個(gè)獨(dú)立的結(jié)合結(jié)構(gòu)域已經(jīng)表明產(chǎn)生親合力(avidity)，并且相比于常規(guī)的單一表位結(jié)合蛋白質(zhì)，引起親合性和特異性的改善。其它潛在優(yōu)點(diǎn)包括在大腸桿菌中多靶特異性分子的簡(jiǎn)單和有效的產(chǎn)生、熱穩(wěn)定性改善和蛋白酶抗性。已經(jīng)獲得針對(duì)各種靶的、具有亞納摩爾親合性的高親合性多聚體。關(guān)于高親合性多聚體的其它信息可發(fā)現(xiàn)于美國(guó)專利申請(qǐng)公開No.2006/0286603、2006/0234299,2006/0223114,2006/0177831,2006/0008844,2005/0221384,2005/0164301、2005/0089932、2005/0053973、2005/0048512、2004/0175756，其全部都通過引用以其全部?jī)?nèi)容并入于此。Versabody是可用于本發(fā)明的另一個(gè)抗體模擬技術(shù)。Versabody是具有>15%的半胱氨酸的3-5kDa的小蛋白質(zhì)，其形成高二硫化密度的骨架，取代典型蛋白質(zhì)具有的疏水核心。用少量二硫化物置換大量疏水性氨基酸(包括疏水核心)產(chǎn)生較小、更親水(較少聚集和非特異性結(jié)合)、更耐蛋白酶和更耐熱的蛋白質(zhì)，并且所述蛋白質(zhì)具有較低密度的T細(xì)胞表位，因?yàn)閷?duì)MHC呈遞貢獻(xiàn)最大的殘基是疏水性的。這四個(gè)性質(zhì)已知全部影響免疫原性，并且預(yù)期它們一起引起大的免疫原性降低。Versabody的靈感來自通過水蛭、蛇、蜘蛛、蝎子、蝸牛和?？a(chǎn)生的天然可注射生物藥物，其已知出乎意料地表現(xiàn)出低免疫原性。從選擇的天然蛋白質(zhì)家族開始，通過設(shè)計(jì)和通過篩選尺寸、疏水性、蛋白水解抗原加工和表位密度得以最小化至遠(yuǎn)低于天然可注射蛋白質(zhì)的平均水平。給定Versabody的結(jié)構(gòu)，這些抗體模擬物提供多種多樣的形式，包括多價(jià)、多特異性、半衰期機(jī)理的多樣性、組織靶向模塊和抗體Fc區(qū)的缺失。而且，Versabody在大腸桿菌中以高產(chǎn)率制造，并且因?yàn)樗鼈兊挠H水性和小尺寸，Versabody高度可溶并可以配制成高濃度。Versabody是異常耐熱的(它們可以被煮沸)，因而提供延長(zhǎng)的貯存期。關(guān)于Versabody的其它信息可發(fā)現(xiàn)于美國(guó)專利申請(qǐng)公開No.2007/0191272，其通過引用以其全部?jī)?nèi)容由此并入。SMIP(SmallModularImmunoPharmaceuticals-TrubionPharmaceuticals)被工程化以保持并優(yōu)化靶結(jié)合、效應(yīng)子功能、體內(nèi)半衰期和表達(dá)水平。SMIPS由三個(gè)不同的模塊結(jié)構(gòu)域組成。首先，它們包含可以由賦予特異性的任何蛋白質(zhì)(例如細(xì)胞表面受體、單鏈抗體、可溶蛋白質(zhì)等等)組成的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。其次，它們包含在結(jié)合結(jié)構(gòu)域和效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域之間充當(dāng)柔性接頭，以及幫助控制SMIP藥物的多聚化的鉸鏈結(jié)構(gòu)域。最后，SMIP包含可以來源于各種分子的效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域，包括Fc結(jié)構(gòu)域或其它特別地設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)。所述設(shè)計(jì)的模塊化(其允許采用各種不同的結(jié)合、鉸鏈和效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域簡(jiǎn)單地構(gòu)建SMIP)提供了快速和個(gè)性化的藥物設(shè)計(jì)。關(guān)于SMIP的更多信息，包括如何設(shè)計(jì)它們的實(shí)例，可以發(fā)現(xiàn)于Zhao等(2007)Blood1102569-77和下列美國(guó)專利申請(qǐng)No.20050238646、20050202534、20050202028、20050202023,20050202012,20050186216,20050180970和20050175614。上文提供的抗體片段和抗體模擬物技術(shù)的詳細(xì)描述不意圖是可被用于本說明書的全部技術(shù)的完全列表。例如，并且非限制性地，各種另外的技術(shù)，包括可選的基于多肽的技術(shù)，諸如在Qui等，NatureBiotechnology,25(8)921-929(2007)(通過引用以其全部?jī)?nèi)容由此并入)中概述的互補(bǔ)決定區(qū)的融合，以及基于核酸的技術(shù)，如描述于美國(guó)專利5，789，157,5,864，026,5,712，375,5,763，566,6,013，443,6,376，474,6,613，526、6，114，120、6，261，774和6，387，620(全部通過引用由此并入)中的RNA適體技術(shù)，可用于本發(fā)明中。抗體物理特件本發(fā)明的抗體，其結(jié)合RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域，可以進(jìn)一步通過各種物理特性加以表征?；谶@些物理特性，各種測(cè)定方法可用來檢測(cè)和/或區(qū)別不同類的抗體。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體可以在輕鏈或重鏈可變區(qū)中包含一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)。一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)在可變區(qū)中的存在可以導(dǎo)致抗體的免疫原性增加或由于抗原結(jié)合改變而引起抗體的PK改變(Marshall等(1972)AnnuRevBiochem41673-702；GalaFA和MorrisonSL(2004)JImmunol1725489-94；Wallick等(1988)JExpMed1681099-109；SpiroRG(2002)Glycobiology這43R_56R;Parekh等(1985)Nature316452-7;Mimura等(2000)MolImmunol37697-706)已知糖基化在包含N-X-S/T序列的基序上發(fā)生。使用Glycoblot測(cè)定可檢測(cè)可變區(qū)糖基化，該測(cè)定切割抗體以產(chǎn)生Fab，然后使用測(cè)量高碘酸鹽氧化和希夫堿形成的測(cè)定方法檢測(cè)糖基化?？蛇x地，可以使用Dionex薄層色譜(Dionex-LC)檢測(cè)可變區(qū)糖基化，其從Fab切割糖以成為單糖并分析各種糖含量。在一些情況下，可優(yōu)選具有不包含可變區(qū)糖基化的抗體。這可以通過選擇在可變區(qū)不包含糖基化基序的抗體或者通過使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在糖基化基序內(nèi)使殘基突變加以實(shí)現(xiàn)。各抗體具有獨(dú)特的等電點(diǎn)(pi)，但是通常抗體將落在6和9.5之間的pH范圍內(nèi)。IgGl抗體的pi通常落入7-9.5的pH范圍內(nèi)，而IgG4抗體的pi通常落入6_8的pH范圍內(nèi)。抗體可具有在該范圍之外的pi。盡管效應(yīng)通常是未知的，但推測(cè)具有在正常范圍之外的Pl的抗體可能在體內(nèi)條件下產(chǎn)生一些展開和不穩(wěn)定性?？梢允褂妹?xì)管等電聚焦分析檢測(cè)等電點(diǎn)，所述測(cè)定建立PH梯度并可利用激光聚焦以提高準(zhǔn)確度(Janini等(2002)Electrophoresis231605-11；Ma等(2001)Chromatographia53:S75-89；Hunt等(1998)JChromatogrA_355-67)。在一些情況下，優(yōu)選具有包含落于正常范圍內(nèi)的pi值的抗體。這可以通過選擇具有在正常范圍內(nèi)的pi的抗體或者通過使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)突變帶電表面殘基加以實(shí)現(xiàn)。各抗體具有作為熱穩(wěn)定性指標(biāo)的解鏈溫度(KrishnamurthyR和ManningMC(2002)CurrPharmBiotechnol2:361-71)。較高的熱穩(wěn)定性表示體內(nèi)總體抗體穩(wěn)定性更高。使用諸如差示掃描量熱法的技術(shù)可以測(cè)量抗體的熔點(diǎn)(Chen等(2003)PharmRes迎1952-60;Ghirlando等(1999)ImmunolLett6847-52)Tmi表示抗體最初展開的溫度。Tm2表示抗體完全展開的溫度。通常，優(yōu)選的是，本發(fā)明的抗體的Tmi大于60°C、優(yōu)選大于65°C、甚至更優(yōu)選大于70°C?？蛇x地，可以使用圓二色性測(cè)量抗體的熱穩(wěn)定性(Murray等(2002)J.ChromatogrSci迎343_9)。在優(yōu)選的實(shí)施方式，可以期望不迅速地降解的抗體。可以使用毛細(xì)管電泳(CE)和MALDI-MS測(cè)量抗體的斷裂，如本領(lǐng)域充分了解的(AlexanderAJ和HughesDE(1995)AnalChem67:3626_32)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，選擇具有最小聚集效應(yīng)的抗體。聚集可能導(dǎo)致引發(fā)不需要的免疫應(yīng)答和/或?qū)е赂淖兊幕虿焕乃幬锎x動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。通常，具有25%或以下的聚集的抗體是可接受的，優(yōu)選20%或以下，甚至更優(yōu)選15%或以下，甚至更優(yōu)選10%或以下并且甚至更優(yōu)選5%或以下?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域熟知的幾種技術(shù)測(cè)量聚集，包括尺寸排阻柱(SEC)高效液相色譜法(HPLC)和光散射以鑒定單體、二聚體、三聚物或多聚體。本發(fā)明的多克降抗體的產(chǎn)牛本發(fā)明的多克隆抗體可以通過本領(lǐng)域熟知的多種技術(shù)產(chǎn)生。多克隆抗體源自于不同的B細(xì)胞系，因此可識(shí)別同一抗原上的多個(gè)表位。通常通過用目標(biāo)抗原(例如RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域，諸如人Kit的D4或D5結(jié)構(gòu)域或人VEGF的D7結(jié)構(gòu)域)免疫適當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物產(chǎn)生多克隆抗體。經(jīng)常被用來產(chǎn)生多克隆抗體的動(dòng)物是雞、山羊、豚鼠、倉(cāng)鼠、馬、小鼠、大鼠、綿羊和最常用的兔子。在下文的實(shí)施例14中，通過用Kit的第四(D4)或第五(D5)Ig樣結(jié)構(gòu)域或Kit的完整胞外域免疫兔子產(chǎn)生多克隆抗Kit抗體。產(chǎn)生多克隆抗體的標(biāo)準(zhǔn)方法是本領(lǐng)域廣泛熟知的，并可以與本發(fā)明的方法結(jié)合(例如research,cm.utexas.edu/bkitto/Kittolabpage/Protocols/Immunology/PAb.html；美國(guó)專利No.4，719，290、6，335，163、5，789，208,2,520，076,2,543，215和3，597，409，其完整內(nèi)容通過引用并入本文)。本發(fā)明的單克隆抗體的產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體(mAb)可以通過多種技術(shù)產(chǎn)生，包括常規(guī)單克隆抗體方法，例如Kohler和Milstein(1975)Nature256:495的標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞雜交技術(shù)。盡管體細(xì)胞雜交法是優(yōu)選的，但原則上，其它產(chǎn)生單克隆抗體的技術(shù)可以被使用，例如B淋巴細(xì)胞的病毒性或致癌性轉(zhuǎn)化。應(yīng)該注意到，抗體(單克隆或多克隆)或其抗原結(jié)合部分可以針對(duì)RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域、更優(yōu)選人KitRTK的D4或D5結(jié)構(gòu)域上的任何表位而產(chǎn)生，或者針對(duì)在本文論述的共有序列而產(chǎn)生，或者針對(duì)在本文描述的任何構(gòu)象、非連續(xù)或線性表位而產(chǎn)生。本領(lǐng)域已知的幾種方法可用于特異性選擇特異性結(jié)合目標(biāo)非連續(xù)表位的抗體或其抗原結(jié)合片段。例如，在通過引用并入本文的美國(guó)公開No.2005/0169925中公開的技術(shù)允許選擇結(jié)合蛋白質(zhì)序列內(nèi)兩個(gè)不同的肽的抗體。這樣的方法可根據(jù)本發(fā)明用于特異性靶向于在本文公開的構(gòu)象和非連續(xù)表位。如果構(gòu)象表位是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，這樣的結(jié)構(gòu)通常很容易在較小的肽(例如<50個(gè)氨基酸)中形成。因此，用較小的肽免疫動(dòng)物可以捕獲一些構(gòu)象表位?？蛇x地，包含構(gòu)象表位的兩個(gè)小肽(例如表5中確定的肽)可以經(jīng)由柔性接頭(例如，聚乙二醇或一段極性的、不帶電的氨基酸)連接。所述接頭允許肽試探各種相互作用取向。采用這種構(gòu)建體進(jìn)行免疫，繼之以適當(dāng)?shù)暮Y選，可允許鑒定針對(duì)構(gòu)象表位的抗體。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過用RTK的特定結(jié)構(gòu)域(例如，Kit胞外域的結(jié)構(gòu)域4或結(jié)構(gòu)域5)免疫動(dòng)物，接著篩選結(jié)合目標(biāo)表位的抗體，可以產(chǎn)生針對(duì)特定構(gòu)象或線性表位的肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，冷凍電鏡術(shù)(Jiang等(2008)Nature451,1130-1134Joachim(2006)OxfordUniversityPress_ISBN=0195182189)可用來鑒定由本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段結(jié)合的表位。在另一個(gè)實(shí)施方案中，RTK或其結(jié)構(gòu)域可以與結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段一起結(jié)晶并通過X-射線晶體衍射法分析，以確定被結(jié)合的精確表位。此外，可以通過用來自小鼠或另一個(gè)物種的相應(yīng)序列替換RTK序列的部分對(duì)表位進(jìn)行作圖。針對(duì)目標(biāo)表位的抗體選擇性地結(jié)合人序列區(qū)，因此，有可能對(duì)靶表位進(jìn)行順序作圖。該基于嵌合體的表位作圖技術(shù)已經(jīng)成功地用于鑒定各種情況下的表位(參見Henriksson和Pettersson(1997)JournalofAutoimmunity.10(6):559_568；Netzer等(1999)JBiolChem.1999Apr16；274(16)11267-74；Hsia等(1996)Mol.Microbiol.19，53-63，其完整內(nèi)容通過引用并入本文)。據(jù)認(rèn)為，靶RTK(例如KitRTK)中的目標(biāo)表位未被糖基化。然而，如果目標(biāo)RTK被糖基化，抗體或其抗原結(jié)合部分(及本發(fā)明的其他成分)可被產(chǎn)生以使得它們結(jié)合有關(guān)的氨基酸和/或糖殘基。例如，本領(lǐng)域已知Kit蛋白質(zhì)具有最少10個(gè)潛在的N-連接糖基化位點(diǎn)。(Morstyn,Foote,Lieschke(2004)HematopoieticGrowthFactorsinOncology:BasicScienceandClinicalTherapeutics.HumanaPress.ISBN:1588293025)。進(jìn)一步認(rèn)為，Kit可表現(xiàn)出0-連接糖基化以及與唾液酸殘基的連接(WypychJ等(1995)Blood.85(1)66-73)。因此，本發(fā)明考慮，抗體或其抗原結(jié)合部分(及本發(fā)明的其他成分)可被產(chǎn)生以使得它們也結(jié)合可以連接于在本文鑒定的任何表位的糖殘基。出于該目的，可以在動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生抗原性目標(biāo)肽以使得它被適當(dāng)糖基化，并且然后糖基化的抗原肽可用于免疫動(dòng)物。產(chǎn)生糖基化肽的適當(dāng)?shù)募?xì)胞和技術(shù)是本領(lǐng)域已知的并在下文進(jìn)一步描述(參見例如，可從GlycoFi，Inc.，Lebanon,NHandBioffa；Princeton,NJ獲得的技術(shù))。可使用任何標(biāo)準(zhǔn)方法諸如等電點(diǎn)聚焦(IEF)、酸水解(以確定單糖組成)、化學(xué)或酶促裂解和質(zhì)譜法(MS)鑒定聚糖而檢測(cè)肽的適當(dāng)糖基化。也可使用由Procogniabrocognia.com)提供的技術(shù)——其使用基于植物凝血素的陣列來加速聚糖分析。特別地，可以使用如還原性堿性裂解或“β-消除”、肽作圖、液相色譜和質(zhì)譜或這些技術(shù)的任何組合的技術(shù)檢測(cè)0-糖基化。用于制備雜交瘤的優(yōu)選的動(dòng)物系統(tǒng)是鼠系統(tǒng)。在小鼠中產(chǎn)生雜交瘤是非常完善的方法。免疫方案和分離用于融合的免疫脾細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。融合伴體(例如鼠骨髓瘤細(xì)胞)和融合方法也是已知的。本發(fā)明的嵌合或人源化抗體可以基于如上所述制備的鼠單克隆抗體的序列進(jìn)行制備。編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白的DNA可以使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)從感興趣的的鼠雜交瘤獲得并工程化以包含非鼠(例如人)的免疫球蛋白序列。例如，為產(chǎn)生嵌合抗體，可以使用本領(lǐng)域已知的方法(例如見Cabilly等的美國(guó)專利No.4，816，567)將鼠可變區(qū)連接到人恒定區(qū)。為產(chǎn)生人源化抗體，可以使用本領(lǐng)域已知的方法將鼠CDR區(qū)插入人框架中(例如，見Winter的美國(guó)專利5，225，539和Queen等的美國(guó)專利5，530，101,5,585,089、5，693，762和6，180，370)。可選地，在已知人和非人序列的情況下，可以在DNA或蛋白水平設(shè)計(jì)人源化抗體。這樣的抗體可以直接進(jìn)行化學(xué)合成，或者DNA可以被合成并進(jìn)行體外或體內(nèi)表達(dá)以產(chǎn)生人源化抗體。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體是人單克隆抗體。可以使用攜帶部分人免疫系統(tǒng)而不是小鼠系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠產(chǎn)生針對(duì)RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域(例如Kit的D4或D5結(jié)構(gòu)域)的這類人單克隆抗體。這些轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體小鼠包括在本文被分別稱為HuMAb小鼠和KMmice的小鼠，并且在本文被統(tǒng)稱為“人Ig小鼠”。HuMAbmouse(Medarex,Inc.)包含編碼未重排的人重鏈(μ和Y)和κ輕鏈免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座(miniloci)，連同滅活內(nèi)源性μ和κ鏈基因座的靶向突變(見例如Lonberg等(1994)Nature368(6474):856_859)。因此，所述小鼠表現(xiàn)出小鼠IgM或κ的表達(dá)減少，并且響應(yīng)于免疫時(shí)引入的人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變以產(chǎn)生高親合性人IgGK單克隆(Lonberg，N.等(1994)，同上；在Lonberg，N.(1994)HandbookofExperimentalPharmacologyil^:49_101中綜述；Lonberg,N.禾口Huszar,D.(1995)Intern.Rev.Immunol.1365-93,以及Harding,F.禾口Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.m=536-546)。HuMab小鼠的制備和使用以及這樣的小鼠攜帶的基因組修飾被進(jìn)一步描述在Taylor，L.等(1992)NucleicAcidsResearch206287-6295；Chen,J.φ(1993)InternationalImmunology5647-656；Tuaillonφ(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA迎3720_3724;Choi等(1993)NatureGenetics4117-123；Chen,J.等(1993)EMBOJ.12821-830；Tuaillon等(1994)J.Immunol.1522912-2920；Taylor,L.等(1994)InternationalImmunologyβ:579_591；和Fishwild，D.等(1996)NatureBiotechnology14845-851中，其全部?jī)?nèi)容都通過引用明確地由此并入。進(jìn)一步參見美國(guó)專利5，545，806；5，569，825；5，625，126；5，633，425；5，789，650；5，877，397；5，661，016；5,814,318；5，874，299；和5，770,429，其全部授予Lonberg和Kay；授予Surani等的美國(guó)專利5,545,807;PCT公開WO92/03918、WO93/12227、WO94/25585、WO97/13852、WO98/24884和WO99/45962，其全部授予Lonberg和Kay；和授予Korman等的PCT公開WO01/14424。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以使用在轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體上攜帶人免疫球蛋白序列的小鼠(如攜帶人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠)產(chǎn)生本發(fā)明的人抗體。這類小鼠，在本文稱為“KMmice”，被詳細(xì)描述于授予Ishida等的PCT公開WO02/43478中。更進(jìn)一步，可選擇的表達(dá)人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物系統(tǒng)在本領(lǐng)域中是可獲得的，并可用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。例如，稱為XenomousdAbgenix，Inc.)的可選轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)可被使用；這樣的小鼠被描述于例如授予Kucherlapati的美國(guó)專利5，939，598、6,075，181,6,114，598,6,150，584和6，162，963中。而且，可選擇的表達(dá)人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)染色體動(dòng)物系統(tǒng)在本領(lǐng)域中是可獲得的，并可用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。例如，攜帶人重鏈轉(zhuǎn)染色體和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠，稱為"TC小鼠”，可以被使用；這類小鼠被描述于Tomizuka等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97-.722-727中。而且，攜帶人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)染色體的母牛已經(jīng)在本領(lǐng)域中進(jìn)行了描述(Kuroiwa等(2002)NatureBiotechnology20:889_894)并且可用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。本發(fā)明的人單克隆抗體還可以使用用于篩選人免疫球蛋白基因文庫(kù)的噬菌體展示方法加以制備。用于分離人抗體的這類噬菌體展示方法在本領(lǐng)域中被建立。例如，參見授予Ladner等的美國(guó)專利5，223，409,5,403，484和5，571，698；授予Dower等的美國(guó)專利5，427，908和5，580，717；授予McCafferty等的美國(guó)專利5，969，108和6，172，197；以及授予Griffiths等的美國(guó)專利5，885，793,6,521，404,6,544，731,6,555，313,6,582，915和6，593，081。本發(fā)明的人單克隆抗體還可以使用SCID小鼠進(jìn)行制備，其中人免疫細(xì)胞已經(jīng)被重構(gòu)以使得在免疫時(shí)可以產(chǎn)生人抗體應(yīng)答。這樣的小鼠被描述在例如授予Wilson等的美國(guó)專利5，476，996和5，698，767中。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體可以使用熟知的噬菌體展示技術(shù)產(chǎn)生，如描述于Marks，J.D.等((1991).J.Mol.Biol.222，581)，Nissim，A.等((1994)EMBOJ.13，692)以及美國(guó)專利6，794，132、6562341、6057098、5821047和6512097中。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體可使用酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)進(jìn)行尋找，如在例如美國(guó)專利6，423，538,6,300，065,6,696，251,6,699，658中所描述的。吿丨丨m_A絲賄側(cè)為產(chǎn)生制備本發(fā)明的人單克隆抗體的雜交瘤，來自免疫小鼠的脾細(xì)胞和/或淋巴結(jié)細(xì)胞可以被分離并且融合到適當(dāng)?shù)臒o限增殖化細(xì)胞系，如小鼠骨髓瘤細(xì)胞系?？梢詫?duì)得到的雜交瘤進(jìn)行抗原特異性抗體產(chǎn)生的篩選。例如，可以采用50%PEG將來自免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞的單細(xì)胞懸液融合于六分之一數(shù)目的P3X63-Ag8.653非分泌性小鼠骨髓瘤細(xì)胞(ATCC，CRL1580)?？蛇x地，可以使用基于電場(chǎng)的電融合法，使用CytoPulse大室細(xì)胞融合電感受器(CytoPulseSciences,Inc.，GlenBurnieMaryland)對(duì)來自免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞的單細(xì)胞懸液進(jìn)行融合。在平底微孔滴定板上以大約2xl05接種細(xì)胞，接下來在含有20%胎兒克隆血清、18%“653”條件培養(yǎng)基、5%origen(IGEN)、4mML-谷氨酰胺、ImM丙酮酸鈉、5mMHEPES、0.055mM2-巰基乙醇、50單位/ml青霉素、50mg/ml鏈霉素、50mg/ml慶大霉素和IXHAT(Sigma;HAT在融合之后24小時(shí)添加)的選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩周。在大約兩周之后，可以在HAT被替換為HT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。然后，可以通過ELISA對(duì)各細(xì)胞進(jìn)行人單克隆IgM和IgG抗體篩選。一旦大規(guī)模的雜交瘤生長(zhǎng)發(fā)生，則通?？梢栽?0-14天之后觀察培養(yǎng)基。分泌抗體的雜交瘤可以被重新接種，再次篩選，并且如果仍然是人IgG陽性的，則單克隆抗體可以通過有限稀釋進(jìn)行至少兩次分種。然后，體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆，以在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生少量的用于鑒定的抗體。為純化人單克隆抗體，可以將選擇的雜交瘤在兩升旋轉(zhuǎn)燒瓶中培養(yǎng)以用于單克隆抗體純化。在用蛋白A-瓊脂糖(PharmacihPiscatawayj.J.)進(jìn)行親和層析之前，可以過濾并濃縮上清液。洗脫的IgG可以通過凝膠電泳和高效液相色譜進(jìn)行檢驗(yàn)以確保純度。緩沖溶液可以被替換成PBS，并且可以使用1.43的消光系數(shù)通過0D■確定濃度。單克隆抗體可以被等分并且儲(chǔ)存在-80°C。制備本發(fā)明的單克隆抗體也可以使用例如本領(lǐng)域所熟知的重組DNA技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染方法的組合(例如Morrison,S.(1985)Science2291202)在宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染瘤(雜交瘤的一種類型)中產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。例如，為表達(dá)所述抗體或其抗體片段，編碼部分或全長(zhǎng)輕鏈和重鏈的DNA可以通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(例如，PCR擴(kuò)增或使用表達(dá)目標(biāo)抗體的雜交瘤進(jìn)行cDNA克隆)獲得并且所述DNA可以被插入表達(dá)載體中以使得基因被可操作地連接于轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列。在本文中，術(shù)語“可操作地連接”意圖指抗體基因被接合入載體以使得在所述載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列發(fā)揮它們調(diào)節(jié)所述抗體基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的預(yù)期功能。選擇表達(dá)載體和表達(dá)調(diào)控序列以與所使用的表達(dá)宿主細(xì)胞相容?？贵w輕鏈基因和抗體重鏈基因可以被插入獨(dú)立的載體中，或者更通常地，兩種基因被插入同一表達(dá)載體中。所述抗體基因通過標(biāo)準(zhǔn)方法(例如在抗體基因片段和載體上的互補(bǔ)限制性位點(diǎn)的接合，或者如果不存在限制性位點(diǎn)的話通過平端連接)被插入所述表達(dá)載體中。所描述的抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)可用于通過將它們插入已經(jīng)編碼需要的同種型的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的表達(dá)載體中以使得Vh片段被可操作地連接于所述載體內(nèi)的Ch片段，而Vk片段被可操作地連接于所述載體內(nèi)的Q片段而產(chǎn)生任何抗體同種型的全長(zhǎng)抗體基因。另外地或替代地，重組表達(dá)載體可以編碼促進(jìn)抗體鏈從宿主細(xì)胞分泌的信號(hào)肽。抗體鏈基因可以被克隆入所述載體以使得信號(hào)肽在框架內(nèi)(in-frame)被連接到抗體鏈基因的氨基端。信號(hào)肽可以是免疫球蛋白信號(hào)肽或異源信號(hào)肽(即，來自非免疫球蛋白的信號(hào)肽)。除了所述抗體鏈基因之外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體攜帶調(diào)控序列，其調(diào)控所述抗體鏈基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。術(shù)語“調(diào)控序列”意圖包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及其他控制抗體鏈基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯的表達(dá)調(diào)控元件(例如多腺苷酸化信號(hào))。這樣的調(diào)控序列被描述在例如Goeddel(GeneExpressionTechnology.MethodsinEnzymology185,AcademicPress，SanDiego,CA(1990))中。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)，包括調(diào)控序列的選擇，可取決于如待轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的選擇、期望的蛋白質(zhì)表達(dá)水平等因素。用于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)選調(diào)控序列包括指導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高水平的蛋白質(zhì)表達(dá)的病毒元件，如來源于巨細(xì)胞病毒(CMV)、猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(AdMLP))和多瘤病毒的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子?？蛇x地，可以使用非病毒調(diào)控序列，如遍在啟動(dòng)子或β-球蛋白啟動(dòng)子。更進(jìn)一步，由來自不同來源的序列組成的調(diào)控元件，如SRa啟動(dòng)子系統(tǒng)，其包含來自SV40早期啟動(dòng)子和人T細(xì)胞白血病毒1型的長(zhǎng)末端重復(fù)序列的序歹丨J(Takebe,Y.等(1988)Mol.Cell.Biol.8466-472)除了抗體鏈基因和調(diào)控序列之外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體可攜帶另外的序列，諸如調(diào)節(jié)載體在宿主細(xì)胞中的復(fù)制的序列(例如復(fù)制起點(diǎn))和選擇性標(biāo)記基因。選擇性標(biāo)記基因幫助選擇所述載體已經(jīng)被引入的宿主細(xì)胞(參見例如Axel等的美國(guó)專利4，399，216、4，634，665和5，179，017)。例如，通常，選擇性標(biāo)記基因賦予所述載體已經(jīng)被引入的宿主細(xì)胞對(duì)藥物諸如G418、潮霉素或氨甲喋呤的抗性。優(yōu)選的選擇性標(biāo)記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用于以氨甲喋呤進(jìn)行選擇/擴(kuò)增的dhfr-宿主細(xì)胞)和neo基因(用于G418選擇)。為了表達(dá)輕鏈和重鏈，編碼重鏈和輕鏈的表達(dá)載體通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。術(shù)語“轉(zhuǎn)染”的各種形式意圖包括常用來將外源性DNA引入真核或原核宿主細(xì)胞的各種技術(shù)，例如電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染等等。盡管理論上在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的抗體是可能的，但是在真核細(xì)胞中表達(dá)抗體是最優(yōu)選的，并且最優(yōu)選哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，因?yàn)檫@類真核細(xì)胞、特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞比原核細(xì)胞更可能裝配和分泌適當(dāng)折疊的免疫活性抗體。已經(jīng)報(bào)告，抗體基因的原核生物表達(dá)對(duì)于以高產(chǎn)量產(chǎn)生活性抗體是無效的。(Boss，Μ.Α.和Wood，C.R.(1985)ImmunologyToday6:12-13)。表達(dá)本發(fā)明的重組抗體的優(yōu)選哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CH0細(xì)胞)(包括dhfr-CHO細(xì)胞，其描述于Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77=4216-4220中，與DHFR選擇性標(biāo)記一起使用，如描述于R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159601-621)中)、NSO骨髓瘤細(xì)胞、COS細(xì)胞和SP2細(xì)胞。特別地，對(duì)于采用NSO骨髓瘤細(xì)胞，另一個(gè)優(yōu)選的表達(dá)系統(tǒng)是GS基因表達(dá)系統(tǒng)，其公開于WO87/04462、W089/01036和EP338，841中。當(dāng)編碼抗體基因的重組表達(dá)載體被引入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞時(shí)，通過培養(yǎng)宿主細(xì)胞一段足以允許所述抗體在宿主細(xì)胞中表達(dá)或更優(yōu)選所述抗體分泌入宿主細(xì)胞在其中生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中的一段時(shí)間產(chǎn)生所述抗體?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化方法從培養(yǎng)基回收抗體。結(jié)合RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域的抗體的鑒定通過例如標(biāo)準(zhǔn)ELISA，可以檢測(cè)本發(fā)明的抗體與胞外域例如RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域(或任何選擇的區(qū)域，如在本文論述的共有序列)的結(jié)合。簡(jiǎn)言之，用在PBS中的0.25μg/ml純化的Ig樣結(jié)構(gòu)域(或優(yōu)選的受體結(jié)構(gòu)域)包被微孔滴定板，然后用在PBS中的5%牛血清白蛋白封閉?？贵w的稀釋物(例如，來自免疫小鼠——例如用人Kit的D4或D5結(jié)構(gòu)域免疫的小鼠——的血漿的稀釋物)被添加至每一孔并在37°C溫育1-2小時(shí)。用PBS/Tween洗滌所述板，然后與偶聯(lián)于堿性磷酸酶的第二試劑(例如對(duì)于人抗體，為山羊抗人IgGFc特異性多克隆試劑)在37°C溫育1小時(shí)。在洗滌之后，用pNPP底物(lmg/ml)對(duì)所述板進(jìn)行顯色，并在405-650的OD下分析。優(yōu)選地，顯示出最高滴度的小鼠將用于融合。如上所述的ELISA測(cè)定還可以用來篩選顯示出與免疫原的陽性反應(yīng)性的雜交瘤。以高親合力結(jié)合例如RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域的雜交瘤被分種并進(jìn)一步進(jìn)行鑒定。來自各雜交瘤的一個(gè)克隆(其保持親本細(xì)胞的反應(yīng)性(通過ELISA))可以被選擇來用于制備儲(chǔ)存于_140°C的5-10小瓶細(xì)胞庫(kù)和用于抗體純化。為純化抗RTK抗體，可以使選擇的雜交瘤在兩升旋轉(zhuǎn)燒瓶中培養(yǎng)用于單克隆抗體純化。在用蛋白A-瓊脂糖(Pharmacia，Piscataway，NJ)進(jìn)行親和層析之前，可以過濾并濃縮上清液。洗脫的IgG可以通過凝膠電泳和高效液相色譜進(jìn)行檢驗(yàn)以確保純度。緩沖溶液可以被替換成PBS，并且可以使用1.43消光系數(shù)通過OD28tl測(cè)定濃度。單克隆抗體可以被等分并且儲(chǔ)存在-80°C。為確定所選擇的單克隆抗體是否結(jié)合獨(dú)特表位，可以使用市售試劑(Pierce，Rockford,IL)生物素化各抗體?？梢允褂萌缟纤鲆訰TK的Ig樣結(jié)構(gòu)域(例如Kit_D4結(jié)構(gòu)域或Kit-D5結(jié)構(gòu)域)包被的RTK包被ELISA板進(jìn)行使用未標(biāo)記的單克隆抗體和生物素化單克隆抗體的競(jìng)爭(zhēng)研究。生物素化mAb結(jié)合可以采用鏈霉-抗生物素蛋白-堿性磷酸酶探針進(jìn)行檢測(cè)。為確定純化抗體的同種型，可以使用對(duì)于具有特定同種型的抗體具有特異性的試劑進(jìn)行同種型ELISA。例如，為確定人單克隆抗體的同種型，可以用lyg/ml的抗人免疫球蛋白在4°C包被微孔滴定板的孔過夜。在用1%BSA封閉之后，所述板與lyg/ml或更低的測(cè)試單克隆抗體或純化的同種型對(duì)照在環(huán)境溫度反應(yīng)一至兩個(gè)小時(shí)。然后，所述孔與人IgGl或人IgM-特異性堿性磷酸酶偶聯(lián)的探針反應(yīng)。如上所述對(duì)板進(jìn)行顯色和分析?？梢酝ㄟ^蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)一步測(cè)試抗RTK人IgG與RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域或在本文給出的共有序列的反應(yīng)性。簡(jiǎn)言之，RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域，如KitRTK的D4或D5結(jié)構(gòu)域，可以被制備并進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。在電泳之后，將分離的抗原轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜、用10%胎牛血清封閉、并用待測(cè)試的單克隆抗體探測(cè)?？梢允褂每谷薎gG堿性磷酸酶檢測(cè)人IgG結(jié)合，并用BCIP/NBT底物片(SigmaChem.Co.，St.Louis,Mo.)進(jìn)行顯色。表位作圖可用來確定本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段的結(jié)合位點(diǎn)。可獲得進(jìn)一步允許構(gòu)象表位作圖的幾種方法。例如，可以使用公開于Timmerman等(MolDivers.2004；8(2):61_77)的方法。Timmerman等能夠使用兩種新的技術(shù)DomainScan和MatrixScan成功地對(duì)非連續(xù)/構(gòu)象表位作圖。也可以使用公開于Ansong等(JThrombHaemost.2006.4(4):842_7)中的技術(shù)。Ansong等使用親合性定向質(zhì)譜(affinitydirectedmassspectrometry)來對(duì)抗體R8B12識(shí)別的非連續(xù)表位進(jìn)行作圖。此外，成像技術(shù)如ProteinTomography可用于使靶RTK的抗體或肽結(jié)合成像。ProteinTomography先前已經(jīng)用于觀察分子相互作用，并用來顯示抑制性抗體通過結(jié)合EGFR的結(jié)構(gòu)域III起作用，從而將EGFR鎖定為非柔性和非活性的構(gòu)象(Lammerts等ProcNatlAcadSciUSA.2008.105(16):6109_14)。更多的傳統(tǒng)方法諸如定點(diǎn)誘變也可被用于對(duì)非連續(xù)表位作圖。據(jù)認(rèn)為參與非連續(xù)表位的氨基酸區(qū)可以被選擇性突變并分析其與本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段的結(jié)合。當(dāng)任一個(gè)區(qū)被突變時(shí)，所述抗體喪失結(jié)合能力可表明所述結(jié)合取決于兩個(gè)氨基酸片段。如上所述，一些線性表位的特征在于為了結(jié)合本發(fā)明的成分必須存在的特定三維結(jié)構(gòu)。當(dāng)RTK處于其天然或折疊狀態(tài)時(shí)以及再次當(dāng)RTK變性時(shí)，這樣的表位可以通過分析所述抗體(或另一成分)的結(jié)合發(fā)現(xiàn)。結(jié)合僅僅在折疊狀態(tài)發(fā)生這一觀察結(jié)果表明所述表位或者是特征在于特定折疊結(jié)構(gòu)的線性表位或者是僅僅存在于折疊蛋白質(zhì)中的非連續(xù)表位。除了在本文描述的活性分析之外，ProteinTomography還可用來確定本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段是否能結(jié)合和滅活受體酪氨酸激酶。結(jié)合相互作用的可視化可表明，所述抗體的結(jié)合可影響兩個(gè)胞外域在細(xì)胞表面界面的定位或者改變或阻止在所述受體酪氨酸激酶中的構(gòu)象變化。π.^^immmmmm在本發(fā)明的另一個(gè)方面，結(jié)合人受體酪氨酸激酶的胞外域例如Ig樣結(jié)構(gòu)域或絞鏈區(qū)的成分是小分子。本發(fā)明的小分子的特征在于特定功能特征或性質(zhì)。例如，所述小分子結(jié)合RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域，例如KitRTK的D4或D5結(jié)構(gòu)域，或者RTK的絞鏈區(qū)，例如KitRTK的D3-D4或D4-D5絞鏈區(qū)。在優(yōu)選的實(shí)施方式，小分子抑制劑與D3-D4或D4-D5絞鏈區(qū)的結(jié)合將阻止使得膜近側(cè)D4和D5結(jié)構(gòu)域能夠處于允許酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的反式自磷酸化和活化，隨后是下游信號(hào)傳導(dǎo)通路的募集和活化的距離和取向(位置)的運(yùn)動(dòng)。在一些實(shí)施方式中，小分子結(jié)合可允許受體酪氨酸激酶的胞外域二聚化，但影響在兩個(gè)單體的Ig樣結(jié)構(gòu)域(例如，III型受體酪氨酸激酶的D4-D4或D5-D5結(jié)構(gòu)域或者V型受體酪氨酸激酶的D7-D7結(jié)構(gòu)域)之間的定位、取向和/或距離，從而抑制受體酪氨酸激酶的活性。換句話說，所述成分或小分子可允許配體誘導(dǎo)的受體酪氨酸激酶胞外域的二聚化，但影響兩個(gè)胞外域在細(xì)胞表面界面的定位，從而抑制受體酪氨酸激酶的活性(例如，抑制受體內(nèi)化作用和/或抑制所述受體的酪氨酸自磷酸化和/或抑制所述受體激活下游信號(hào)傳導(dǎo)通路的能力)。術(shù)語“小分子化合物”、“小分子藥物”、“小分子”或“小分子抑制劑”在本文可互換使用以用來指對(duì)其對(duì)RTK的影響和它們抑制RTK(例如KitRTK)的二聚化或活性的能力進(jìn)行篩選的本發(fā)明的化合物。這些化合物可包含在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)>MolecularLibrariesScreeningCenterNetwork(MLSCN)巾白勺ftr^·、才目#數(shù)據(jù)庫(kù)中的化合物、或者它們的衍生物和/或功能類似物。如本文所使用，“類似物”或“功能類似物”是指化合物或小分子抑制劑，其在結(jié)構(gòu)上類似于母體化合物，但在組成上稍微不同(例如，一個(gè)或多個(gè)原子或功能團(tuán)被添加、除去或改變)。相比于初始化合物，類似物可具有或不具有不同的化學(xué)或物理特性，并可具有或不具有改善的生物學(xué)和/或化學(xué)活性。例如，與母體化合物相比，類似物可以是更疏水性的或者它可具有改變的活性(增加、降低或與母體化合物相同)。所述類似物可以是初始化合物的天然或非天然發(fā)生(例如重組)的變體。其它類型的類似物包括化合物的異構(gòu)體(對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體等等)和其它類型的化合物手性變體，以及結(jié)構(gòu)異構(gòu)體。所述類似物可以是線性化合物的分支或環(huán)狀變體。例如，線性化合物可具有支化的或另外取代以賦予某些期望的性質(zhì)(例如改善的親水性或生物利用度)的類似物。如本文所使用，“衍生物”是指化合物或小分子抑制劑的化學(xué)上或生物學(xué)上的改良形式，其結(jié)構(gòu)上類似于母體化合物并且(實(shí)際上或理論上)可衍生于該母體化合物?！把苌铩迸c“類似物”或“功能類似物”的區(qū)別在于母體化合物可以是產(chǎn)生“衍生物”的起始物質(zhì)，而母體化合物不是必須被用作產(chǎn)生“類似物”或“功能類似物”的起始物質(zhì)。衍生物可以具有或不具有與所述母體化合物不同的化學(xué)或物理特性。例如，與母體化合物相比，衍生物可以是更親水性的或者它可具有改變的反應(yīng)性。衍生化(即，通過化學(xué)或其它手段修飾)可包括在分子內(nèi)一個(gè)或多個(gè)部分的取代(例如，官能團(tuán)的改變)。例如，氫可以用鹵素如氟或氯取代，或者羥基(一0H)可以用羧酸部分(一C00H)取代。術(shù)語“衍生物”也包括偶聯(lián)物和母體化合物的前藥(即化學(xué)修飾衍生物，其在生理?xiàng)l件下可轉(zhuǎn)化為原始化合物)。例如，前藥可以是活性劑的無活性形式。在生理?xiàng)l件下，前藥可以轉(zhuǎn)化為所述化合物的活性形式。例如，可以通過用?；鶊F(tuán)(?；八?或氨基甲酸酯基團(tuán)(氨基甲酸酯前藥)置換氮原子上的一個(gè)或兩個(gè)氫原子形成前藥。關(guān)于前藥的更多詳細(xì)信息可例如發(fā)現(xiàn)于Fleisher等，AdvancedDrugDeliveryReviews19(1996)115；DesignofProdrugs,H.Bundgaard(編輯)，Elsevier，1985；和H.Bundgaard，DrugsoftheFuture16(1991)443。術(shù)語“衍生物”也用于描述全部溶劑合物，例如水合物或加合物(例如與醇的加合物)、活性代謝物和母體化合物的鹽?？梢灾苽涞柠}的類型取決于在化合物內(nèi)的部分的性質(zhì)。例如，酸性基團(tuán)如羧酸基團(tuán)可以形成堿金屬鹽或堿土金屬鹽(例如鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽)和與生理上可容許的季銨離子的鹽以及與氨水和生理上可容許的有機(jī)胺如三乙胺、乙醇胺或三(2-羥乙基)胺)的酸加成鹽。堿性基團(tuán)可以例如與無機(jī)酸如鹽酸(“HC1”)、硫酸或磷酸形成酸加成鹽，或者與有機(jī)羧酸和磺酸如乙酸、檸檬酸、苯甲酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、甲磺酸或?qū)妆交撬嵝纬伤峒映甥}。除了堿性氮原子之外同時(shí)包含堿性基團(tuán)和酸性基團(tuán)(如羧基)的化合物可以作為兩性離子存在?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的慣用方法獲得鹽，例如通過在溶劑或稀釋劑中結(jié)合化合物和無機(jī)或有機(jī)酸或堿，或者通過陽離子交換或陰離子交換從其它鹽獲得所述鹽。小分子已知具有1200或以下、1000或以下、900或以下、800或以下、700或以下、600或以下、500或以下、400或以下、300或以下、200或以下、100或以下、50或以下、25或以下或者10或以下的分子量。本發(fā)明的小分子抑制劑被選擇或設(shè)計(jì)來結(jié)合RTK的胞外域，例如Ig樣結(jié)構(gòu)域或絞鏈區(qū)。在一些實(shí)施方式中，小分子抑制劑被選擇或設(shè)計(jì)來結(jié)合人Kit或PDGFR的Ig樣結(jié)構(gòu)域或絞鏈區(qū)，例如人Kit受體的D4或D5結(jié)構(gòu)域、或D3-D4和/或D4-D5絞鏈區(qū)，從而拮抗受體二聚化和轉(zhuǎn)變成活性形式的能力，例如自磷酸化和活化細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑。在其它實(shí)施方式中，小分子抑制劑被選擇來結(jié)合與Kit受體的結(jié)構(gòu)域具有同源性的結(jié)構(gòu)域。例如，本發(fā)明的小分子可以針對(duì)與RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域(例如Kit的D4或D5結(jié)構(gòu)域)、RTK的絞鏈區(qū)(例如Kit或PDGFR受體的D3-D4或D4-D5絞鏈區(qū))具有至少50%同一性、至少60%同一性、至少70%同一性、至少80%同一性、至少90%同一性、或至少95%或99%同一性的結(jié)構(gòu)域。這樣的小分子將能夠結(jié)合在功能上類似于例如Kit或PDGF受體的D4或D5結(jié)構(gòu)域或D3-D4和/或D4-D5絞鏈區(qū)的蛋白結(jié)構(gòu)域——可能在Kit和其它RTK中。本發(fā)明的小分子抑制劑也可結(jié)合來源于RTK(例如人III型RTK)的Ig樣結(jié)構(gòu)域或絞鏈區(qū)的特定基序或共有序列，這允許所述小分子抑制劑特異性結(jié)合RTK家族的成員(例如人RTK的III型家族的成員)中共有的結(jié)構(gòu)域。在一種具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的小分子結(jié)合D4相互作用位點(diǎn)的以下共有序列LX1RX2X3X4X5X6X7G,其中L是亮氨酸，R是精氨酸，G是甘氨酸A1選自蘇氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、天門冬酰胺或賴氨酸；X2選自亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸；X3選自賴氨酸、組氨酸、天門冬酰胺和精氨酸；X4選自甘氨酸、纈氨酸、丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸；X5選自蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸；X6選自谷氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺；以及X7選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸、賴氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和蘇氨酸。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的小分子結(jié)合VEGF受體家族成員的D7結(jié)構(gòu)域的以下共有序列=IX1RVX2X3EDX4G(SEQIDNO:1)，其中I是異亮氨酸，R是精氨酸，E是谷氨酸，D是天冬氨酸，G是甘氨酸A1選自谷氨酸、精氨酸和谷氨酰胺；X2選自精氨酸和蘇氨酸；X3選自谷氨酸和賴氨酸；以及X4選自谷氨酸和丙氨酸。在其它實(shí)施方式中，小分子抑制劑結(jié)合代表蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)基序或共有序列。這樣的基序或共有序列不表示氨基酸的連續(xù)鏈，而是產(chǎn)生于RTK的三維折疊的非線性的氨基酸排列(即“結(jié)構(gòu)基序”)。這樣的基序的實(shí)例是基于Kit受體的D3-D4和/或D4-D5鉸鏈區(qū)設(shè)計(jì)的基序。這樣的基序和共有序列可以根據(jù)關(guān)于抗體的章節(jié)I中論述的方法設(shè)計(jì)。重要地，本發(fā)明的小分子抑制劑不結(jié)合RTK的配體結(jié)合位點(diǎn)，例如Kit受體的SCF結(jié)合位點(diǎn)。換言之，小分子抑制劑不結(jié)合負(fù)責(zé)配體結(jié)合的RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域。在另外的實(shí)施方式中，選擇或設(shè)計(jì)本發(fā)明的小分子抑制劑來特異性結(jié)合RTK的突變胞外域，例如突變Ig樣結(jié)構(gòu)域或突變鉸鏈區(qū)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，突變體RTK是致瘤的或致癌的突變體。在一種具體實(shí)施方式中，選擇或設(shè)計(jì)小分子抑制劑來結(jié)合致癌的Kit受體突變體。可以被本發(fā)明的小分子靶向的Kit受體突變體具有一個(gè)或多個(gè)以下氨基酸中的突變的Kit受體Thr417、Tyr418、Asp419、Leu421、Arg420、Tyr503或Ala502。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明的方法可以應(yīng)用于Kit中的其它突變或其它RTK中的突變。靶向于突變體RTK的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是治療性小分子可以僅結(jié)合包含突變的細(xì)胞上的RTK，而使得健康細(xì)胞大部分或全部不受影響。因此，在突變是致瘤性突變的情況下，僅腫瘤細(xì)胞將被用作治療靶標(biāo)，潛在地減少副作用和劑量要求。在一些實(shí)施方式中，所述小分子結(jié)合人Kit受體的特定序列，例如人Kit受體的殘基309-413、殘基410-519,381Arg和386Glu或418Tyr和505Asno在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的小分子可以結(jié)合Kit受體中構(gòu)成在表4(下文中)中所描述的小腔或口袋的一個(gè)或多個(gè)殘基。例如，本發(fā)明的小分子可以結(jié)合Kit受體的D3-D4鉸鏈區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)以下殘基來自D3結(jié)構(gòu)域的K218、S220、Y221、L222和來自D4結(jié)構(gòu)域的F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、1371、Y373。本發(fā)明的小分子也可以結(jié)合構(gòu)成Kit受體的D4結(jié)構(gòu)域中的凹面的一個(gè)或多個(gè)以下殘基Y350、R353、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386和T390。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的小分子可以結(jié)合形成Kit受體的D2-D3鉸鏈區(qū)中的口袋的一個(gè)或多個(gè)以下殘基來自D2結(jié)構(gòu)域的Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206和F208以及來自D3結(jié)構(gòu)域的V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268和Y269。因此，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的小分子可以結(jié)合連續(xù)的或不連續(xù)的氨基酸殘基，并起到阻止RTK的膜近側(cè)區(qū)以使酪氨酸激酶能夠活化的距離和定向來定位所需的運(yùn)動(dòng)的分子楔的作用。本發(fā)明的小分子也可以起到阻止同型D4或D5受體相互作用或使配體-受體相互作用位點(diǎn)不穩(wěn)定的作用。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的小分子可以結(jié)合Kit受體上的的一個(gè)或多個(gè)以下殘基Y125、G126、Η180、R181、Κ203、V204、R205、Ρ206、P206、F208、K127、A207、V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268、Y269、T295、L222、L222、L223、E306、V308、R224、V308、K310、K218、A219、S220、K218、A220、Y221、A339、D327、D398、E338、E368、E386、F312、F324、F340、F355、G311、G384、G387、G388、I371、K342、K358、L382、L379、N326、N367、N370、N410、P341、S369、T385、V325、V407、V409、Y373、Y350、Y408、T380、T390、R381、R353、T411、K412、E414、K471、F433、G470、L472、V497、F469、A431或G432。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的小分子可以容易地被靶向于其它III型RTK中的相應(yīng)殘基，例如形成相似的口袋或空腔的那些殘基或通過結(jié)構(gòu)比對(duì)或序列比對(duì)處于相同的位置的那些殘基。在一種具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的小分子結(jié)合III型RTK上的構(gòu)象表位或非連續(xù)表位。構(gòu)象表位或非連續(xù)表位可以由來自III型RTK(例如人Kit受體或PDGF受體)的D3、D4或D5結(jié)構(gòu)域或者D4-D5或D3-D4鉸鏈區(qū)的兩個(gè)或多個(gè)殘基組成。例如，所述構(gòu)象表位或非連續(xù)表位可以由下表4中所列的兩個(gè)或多個(gè)殘基組成。在一種具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的小分子結(jié)合由選自Y125、H180、R181、K203、V204、R205、P206、V238、S239、S240、H263、G265、D266、F267、N268和Y269的2個(gè)或多個(gè)氨基酸組成的構(gòu)象表位。在相似的具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的小分子可以結(jié)合由選自以下氨基酸組之一的2個(gè)或多個(gè)氨基酸組成的構(gòu)象表位P206、F208、V238和S239；K127、A207、F208和T295；L222、A339、F340、K342、E368、S369、N370、1371和Y373；L222、L223、E306、V308、F312、E338、F340和1371；R224、V308、K310、G311、F340、P341和D398；K218、A219、S220、N367、E368和S369；K218、A220、E368和S369；G384、T385、T411、K412、E414和K471；Y408、F433、G470、K471和L472；F324、V325、N326和N410；D327、N410、T411、K412和V497；G384、G387、V409和K471；L382、G387、V407和V409；Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206、F208、V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268和Y269；P206、F208、V238和S239；K218、S220、Y221、L222、F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、I371和Y373；G384、G387、G388、Y408、V409、T411、F433、F469、G470和K471；D327、T411、K412、E414、A431、G432和K471；Y350、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386和T390；Y350、R353和F355。如以上所指出的，本發(fā)明的小分子可以結(jié)合形成在表4中確定的口袋或空腔的所有氨基酸殘基，或者它們可以結(jié)合形成口袋或空腔的殘基的一部分。應(yīng)理解，在某些實(shí)施方式中，當(dāng)涉及結(jié)合表位(例如構(gòu)象表位)的本發(fā)明的小分子時(shí)，意圖是所述小分子僅結(jié)合那些構(gòu)成該表位(例如表4中確定的口袋或空腔)的那些特定殘基，而不是在該受體的線性氨基酸序列中的其它殘基。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的小分子結(jié)合構(gòu)象表位，其中所述構(gòu)象表位由選自表5中所列的肽的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成。在一種具體實(shí)施方式中，構(gòu)象表位由選自第一肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基和選自第二肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成，其中第一和第二肽選自表5中所列的肽的組。因而，本發(fā)明的小分子可以結(jié)合其中第一和第二肽組如下的構(gòu)象表位Ala219-Leu222和Thr304_Val308；Asp309_Gly311和Arg224_Gly226；Thr303-Glu306和Ala219_Leu222；Asn367_Asn370和Ser217_Tyr221；Ala339-Pro343禾口Asn396-Val399；Ala339-Pro343和Glu368_Arg372；Lys358-Tyr362和Val374_His378；Asp357-Glu360和Leu377_Thr380；Met351_Glu360和His378_Thr389；His378_Thr389和Val323-Asp332；Val409-Ile415和Ala493_Thr500；Val409-Ile415和Ala431_Thr437；Val409-Ile415和Phe469_Val473；Val409-Ile415和Val325_Asn330；Val409-Ile415和Arg381-Gly387；Gly466-Leu472和Gly384_Gly388；Val325_Glu329和Tyr494_Lys499；Thr411-Leu416和Val497_Ala502；Ile415_Leu421和Ala502_Ala507；Ala502_Ala507禾口Lys484-Thr488；和Ala502_Ala507和Gly445_Cys450。本發(fā)明的小分子可以結(jié)合形成上述第一和第二肽組的所有氨基酸殘基，或者它們可以結(jié)合形成第一和第二肽組的殘基的一部分。應(yīng)理解，在某些實(shí)施方式中，當(dāng)涉及結(jié)合表位(例如構(gòu)象表位)的本發(fā)明的小分子時(shí)，意圖是所述小分子僅結(jié)合那些構(gòu)成該表位(例如表5中確定的特定肽)的那些特定殘基，而不是在該受體的線性氨基酸序列中的其它殘基。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的小分子可以結(jié)合由2個(gè)或多個(gè)選自E33、P34、D72、E76、N77、K78、Q79、K158、D159、N250、S251、Q252、T253、K254、L255、N260、W262、H264、G265、E344、N352、R353、F355、T356、D357、Y362、S365、E366、N367、N370和G466的氨基酸組成的構(gòu)象表位或非連續(xù)表位。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的小分子結(jié)合人PDGFRβ的氨基酸殘基385Arg和39°G1u或PDGFRα中的相應(yīng)殘基。人PDGFRβ的殘基385Arg和39qGIu類似于Kit受體殘基381Arg和386Glu并介導(dǎo)PDGFRii的同型D4-D4相互作用。本發(fā)明的小分子可以通過阻止III型RTK的膜近側(cè)區(qū)之間的關(guān)鍵同型相互作用(例如人PDGFR3的385Arg和39°Glu之間形成的鹽橋)發(fā)揮其對(duì)受體活化的抑制作用，所述膜近側(cè)區(qū)之間的關(guān)鍵同型相互作用對(duì)于將胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域定位在對(duì)于酪氨酸激酶活化至關(guān)重要的距離和定向是是必要的。本文中論述的實(shí)驗(yàn)表明，同型D4-D4相互作用對(duì)于PDGFRβ二聚化不是必要的，而PDGFRβ二聚化對(duì)于受體活化是必要的然而并非足夠的。因此，本發(fā)明的小分子可以允許PDGFRii的二聚化而同時(shí)阻止活化?；诮Y(jié)構(gòu)的序列比對(duì)已經(jīng)表明EF環(huán)的大小以及包含關(guān)鍵氨基酸的D4-D4界面在Kit,PDGFRα,PDGFR^和CSFlR中是保守的。因此，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的小分子可以靶向于III型RTK的D4或D5結(jié)構(gòu)域的保守區(qū)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的小分子以高親和性結(jié)合Kit的Ig樣結(jié)構(gòu)域或鉸鏈區(qū)(例如Kit受體的D3-D4和/或D4-D5鉸鏈區(qū)或D4-D4和/或D5-D5界面結(jié)合位點(diǎn))，例如Kd為IxlO-7M或更低、Kd為5x10、或更低、Kd為IxKT8M更低、Kd為5x10、更低、或者Kd為IxlO-8M和ΙχΙΟ,Μ之間或更低的親和性。本發(fā)明的小分子抑制劑可以通過本領(lǐng)域已知的幾種方法進(jìn)行制備或選擇。篩選方法可用于從文庫(kù)鑒定結(jié)合希望的RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域或鉸鏈區(qū)(例如人KitRTK的D4或D5結(jié)構(gòu)域)的小分子。一種方法(Chemetics(Nuevolutions))利用文庫(kù)中各分子的DNA標(biāo)簽來輔助選擇。Chemetics系統(tǒng)允許篩選用于靶向結(jié)合的數(shù)百萬化合物。涉及基于小分子文庫(kù)和標(biāo)簽的篩選的專利是美國(guó)專利申請(qǐng)20070026397；20060292603；20060269920；20060246450；20060234231；20060099592；20040049008；20030143561，將這些專利以其全文通過引用的方式并入本文。其它可以用于從文庫(kù)鑒定結(jié)合希望的RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域或鉸鏈區(qū)(例如人KitRTKD4或D5結(jié)構(gòu)域)的小分子的公知方法包括利用其中文庫(kù)成員以鑒定標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記(即，文庫(kù)中存在的各個(gè)標(biāo)記與文庫(kù)中存在的不同化合物結(jié)構(gòu)相關(guān)，從而鑒別標(biāo)記得知標(biāo)記分子的結(jié)構(gòu))的文庫(kù)的方法。標(biāo)記的文庫(kù)的一種方法利用寡核苷酸標(biāo)簽，如在例如以下文獻(xiàn)中描述PCT公開WO2005/058479A2(DirectSelect技術(shù))和美國(guó)專利No.5，573，905；5，708，153；5，723，598，6，060，596；公開的PCT申請(qǐng)WO93/06121；WO93/20242；WO94/13623；WO00/23458；WO02/074929和WO02/103008，以及Brenner和Lerner(Proc.Natl.Acad.Sci.USA89,5381-5383(1992)；Nielsen禾口Janda(Methods.ACompaniontoMethodsinEnzymology6,361-371(1994)；以及Nielsen、Brenner禾口Janda(J.Am.Chem.Soc.115，9812-9813(1993))，每一篇文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容均通過引用的方式并入本文中。這樣的標(biāo)簽可以使用例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，以產(chǎn)生很多標(biāo)簽拷貝并通過測(cè)序鑒定所述標(biāo)簽。然后標(biāo)簽的序列確認(rèn)結(jié)合分子的結(jié)構(gòu)，所述結(jié)合分子可以純化形式進(jìn)行合成并測(cè)試活性。組合化學(xué)文庫(kù)的預(yù)備和篩選是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。可用于鑒定本發(fā)明的成分的這類組合化學(xué)文庫(kù)包括但不局限于肽文庫(kù)(參見，例如美國(guó)專利No.5，010，175，F(xiàn)urka,Int.J.Pept.Prot.Res.37487493(1991)和Houghton等，Nature354:8488(1991))。用于產(chǎn)生化學(xué)多樣性文庫(kù)的其它化學(xué)物質(zhì)是本領(lǐng)域公知的并且可以使用。這樣的化學(xué)物包括但不局限于類肽(例如PCT公開No.WO91/19735)，編碼肽(例如PCT公開WO93/20242)，隨機(jī)生物寡聚物(例如PCT公開No.W092/00091)，苯并二氮革(例如美國(guó)專利No.5,288,514),diversomer如乙內(nèi)酰脲、苯并二氮革和二肽(Hobbs等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA9069096913(1993))，插烯多肽(vinylogouspolyp印tide)(Hagihara等，J.Amer.Chem.Soc.1146568(1992))、具有葡萄糖骨架的非肽類肽模擬物(Hirschmann等，J.Amer.Chem.Soc.114:92179218(1992))，小化合物文庫(kù)的類似有機(jī)合成(Chen等，J.Amer.Chem.Soc.1162661(1994))、寡氨酉旨(oligocarbamate)(Cho等，Science2611303(1993))和/或肽基膦酸酯(Campbell等，J.Org.Chem.59:658(1994))、核酸文庫(kù)(參見Ausubel，Berger和Russell&Sambrook，所有同上)、肽核酸文庫(kù)(參見例如美國(guó)專利No.5，539，083)、碳水化合物文庫(kù)(參見例如Liang等，Science,27415201522(1996)和美國(guó)專利No.5，593，853)、小有機(jī)分子文庫(kù)(參見例如苯并二氮草，BaumC&EN,Jan18，33頁(1993)；類異戊二烯，美國(guó)專利No.5，569，588；噻唑烷酮和間噻嗪酮，美國(guó)專利No.5，549，974；吡咯烷，美國(guó)專利No.5，525，735和5，519，134；嗎啉代化合物，美國(guó)專利No.5，506，337；苯并二氮草，5，288，514等)。各前述出版物通過引用的方式并入本文。公眾數(shù)據(jù)庫(kù)也是可利用的，并常用于小分子篩選，例如PubChem(pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)，Zinc(Irwin和Shoichet(2005)J.Chem.Inf.Model.45(1)177-82)和ChemBank(SeiIer等(2008)NucleicAcidsRes.36(數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)行號(hào)):D351_D359)。用于制備組合文庫(kù)的裝置是市場(chǎng)上可買到的(見，例如357MPS,390MPS,AdvancedChemTech,LouisvilleKy.,Symphony,Rainin,Woburn,Mass.,433AAppliedBiosystems,FosterCity,Calif.，9050Plus,Millipore,Bedford,Mass·)。此外，許多組合文庫(kù)本身是市場(chǎng)上可買到的(見例如，ComGenex,Princeton,N.J.，Tripos,Inc.，St.Louis,Mo.,3DPharmaceuticals,Exton,Pa.,MartekBiosciences,Columbia,Md.，等)。而且，因?yàn)楹Y選方法被非常好地限定，通常與專業(yè)公司簽訂合同以鑒定用于目標(biāo)靶的特定化合物(例如BioFocusDPI(biofocus.com)禾口QuantumLead(q-lead.com))。本領(lǐng)域眾所周知的并且可應(yīng)用于本發(fā)明的方法的其它選擇小分子的方法是Huang和StuartL.Schreiber(1997)ProcNatlAcadSciUSA.94(25):13396_13401;Hung等(2005)Science310:670_674;Zhang等(2007)ProcNatlAcadSci104:4606_4611；或者在Gordon(2007)ACSChem.Biol.29-16中綜述的任何一種方法，其全部都通過引用以其全部?jī)?nèi)容并入本文。除了實(shí)驗(yàn)篩選法之外，本發(fā)明的小分子還可以使用虛擬篩選法加以選擇。虛擬篩選技術(shù)使用統(tǒng)計(jì)分析和蛋白質(zhì)對(duì)接(docking)模擬來預(yù)測(cè)來自文庫(kù)的哪些小分子將結(jié)合蛋白質(zhì)或其中的特定表位。最常見地，虛擬篩選方法比較蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)和文庫(kù)中小分子的三維結(jié)構(gòu)。使用對(duì)蛋白質(zhì)-分子相互作用進(jìn)行建模的不同策略，盡管常用的是模擬在原子之間的結(jié)合能——包括氫鍵、靜電力和范德華相互作用——的算法。通常，虛擬篩選方法可以掃描超過一百萬個(gè)化合物的文庫(kù)并返回可能是強(qiáng)結(jié)合物的小分子的短的名單。對(duì)虛擬篩選的若干綜述可以獲得，其詳述了可用來鑒定本發(fā)明的小分子的技術(shù)(Engel等(2008)J.Am.Chem.Soc.,130(15),5115-5123；McInnes.(2007).CurrOpinChemBiol.Oct；11(5)494-502；Reddy等(2007)CurrProteinP印tSci.Aug;8(4):329_51；Muegge禾口Oloff.(2006)DrugDiscoveryToday.3(4)405-411；Kitchen等(2004)NatureReviewsDrugDiscovery3,935-949)小分子篩選的進(jìn)一步的實(shí)例可以在美國(guó)專利申請(qǐng)2005/0124678中找到，其通過引用并入本文。本發(fā)明的小分子可以包含在下表中描繪的骨架結(jié)構(gòu)之一。在該表中引用的參考文獻(xiàn)均通過引用的方式以其全文并入本文中?；鶊F(tuán)禮、&、13和R4的僅限制于它們不應(yīng)干擾或顯著抑制所指出的反應(yīng)，并且可以包括氫、烷基、取代烷基、雜烷基、取代雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、取代環(huán)烷基、取代雜環(huán)烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、雜芳烷基、取代芳烷基、取代雜芳烷基、雜方基、取代雜芳基、鹵素、烷氧基、芳氧基、氨基、取代氨基和本領(lǐng)域已知的其它基團(tuán)。適宜的取代基包括但不局限于烷基、烷氧基、硫代烷氧基、硝基、羥基、巰基、芳氧基、芳基-S-、商素、羧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、氰基、氰酸酯、腈、異氰酸酯、硫氰酸酯、氨基甲?；腿〈被柞；?。<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>III結(jié)合厶受佳酪氫酸邀酶的Ig搓結(jié)構(gòu)域的腿差公王在本發(fā)明的另一方面，結(jié)合人受體酪氨酸激酶的胞外域(例如Ig樣結(jié)構(gòu)域或鉸鏈區(qū))的成分是肽類分子。所述肽類分子可以基于RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域或源自這樣的結(jié)構(gòu)域的共有序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。在一種具體實(shí)施方式中，肽類分子結(jié)合D4相互作用位點(diǎn)的以下共有序列LX1RX2X3X4X5X6X7G,其中L是亮氨酸，R是精氨酸，G是甘氨酸A1選自蘇氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、天門冬酰胺或賴氨酸；X2選自亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸；X3選自賴氨酸、組氨酸、天門冬酰胺和精氨酸；X4選自甘氨酸、纈氨酸、丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸；X5選自蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸；X6選自谷氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺；以及X7選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸、賴氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和蘇氨酸。因而，在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽類分子包含或由匹配上述共有序列(LX1RX2X3X4X5X6X7G)的序列組成，其中L是亮氨酸，R是精氨酸，G是甘氨酸A1選自蘇氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、天門冬酰胺或賴氨酸；X2選自亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸；X3選自賴氨酸、組氨酸、天門冬酰胺和精氨酸；X4選自甘氨酸、纈氨酸、丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸；X5選自蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸；X6選自谷氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺；以及X7選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸、賴氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和蘇氨酸。在另一實(shí)施方式中，所述肽類分子結(jié)合VEGF受體家族成員的D7結(jié)構(gòu)域的以下共有序列=IX1RVX2X3EDX4G(SEQIDNO:1)，其中I是異亮氨酸，R是精氨酸，E是谷氨酸，D是天冬氨酸，G是甘氨酸A1選自谷氨酸、精氨酸和谷氨酰胺；X2選自精氨酸和蘇氨酸；X3選自谷氨酸和賴氨酸；和X4選自谷氨酸和丙氨酸。因而，在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽類成分包含或由匹配該共有序列IX1RVX2X3EDX4G(SEQIDNO1)的序列組成，其中I是異亮氨酸，R是精氨酸，E是谷氨酸，D是天冬氨酸，G是甘氨酸A1選自谷氨酸、精氨酸和谷氨酰胺；X2選自精氨酸和蘇氨酸；X3選自谷氨酸和賴氨酸；以及X4選自谷氨酸和丙氨酸。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽類成分可以包含整個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，例如人Kit的D4或D5結(jié)構(gòu)域，如D4結(jié)構(gòu)域(殘基309-413)或D5結(jié)構(gòu)域(殘基410-519)。作為進(jìn)一步的實(shí)例，本發(fā)明的肽類成分可以包含V型RTK的D7結(jié)構(gòu)域(或其片段)，例如VEGFR的D7結(jié)構(gòu)域。這樣的肽類分子結(jié)合RTK并通過阻止RTK活化而起到拮抗劑的作用(參見下面實(shí)施例16)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽類成分可以與RTK(例如III型RTK)的結(jié)構(gòu)域具有低至50%的同一性，例如，本發(fā)明的肽類成分可以與RTK的D4或D5結(jié)構(gòu)域具有至少50%的同一性、至少60%的同一性、至少70%的同一性、至少80%的同一性、至少90%的同一性、或至少95%、96%、97%或98%的同一性。在一種具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽類成分與人KitRTK的氨基酸殘基309-413具有至少80%的同一性、至少90%的同一性或至少95%、96%、97%或98%的同一性。在類似的實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽類成分與人KitRTK的氨基酸殘基410-519具有至少80%的同一性、至少90%的同一性或至少95%、96%、97%或98%的同一性。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽類成分結(jié)合或包含人Kit受體的特定序列，例如人Kit受體的殘基309-413、殘基410-519、381Arg和386Glu或418Tyr和5°5Asn。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽類成分可以結(jié)合(或包含或由其組成)Kit受體中的一或多個(gè)殘基，這些殘基構(gòu)成在表4(下文)中所描述的小腔或口袋。例如，本發(fā)明的肽類分子可以結(jié)合(或包含或由其組成)Kit受體的D3-D4鉸鏈區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)以下殘基來自D3結(jié)構(gòu)域的K218、S220、Y221、L222和來自D4結(jié)構(gòu)域的F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、I371、Y373。本發(fā)明的肽類分子也可以結(jié)合(或包含或由其組成)構(gòu)成Kit受體的D4結(jié)構(gòu)域中的凹面的一個(gè)或多個(gè)以下殘基Y350、R353、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386和T390。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽類分子可以結(jié)合(或包含或由其組成)形成Kit受體的D2-D3鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)以下殘基來自D2結(jié)構(gòu)域的Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206和F208以及來自D3結(jié)構(gòu)域的V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268和Y269。本發(fā)明的肽類成分可以結(jié)合連續(xù)的或不連續(xù)的氨基酸殘基，并起到阻止RTK的膜近側(cè)區(qū)以使酪氨酸激酶能夠活化的距離和定向進(jìn)行定位所需的運(yùn)動(dòng)的分子楔的作用。本發(fā)明的肽類分子也可以起到阻止同型D4或D5受體相互作用或使配體-受體相互作用位點(diǎn)不穩(wěn)定的作用。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽類分子可結(jié)合(或包含或由其組成)Kit受體上的一個(gè)或多個(gè)以下殘基Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206、P206、F208、K127、A207、V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268、Y269、T295、L222、L222、L223、E306、V308、R224、V308、K310、K218、A219、S220、K218、A220、Y221、A339、D327、D398、E338、E368、E386、F312、F324、F340、F355、G311、G384、G387、G388、1371、K342、K358、L382、L379、N326、N367、N370、N410、P341、S369、T385、V325、V407、V409、Y373、Y350、Y408、T380、T390、R381、R353、T411、K412、E414、K471、F433、G470、L472、V497、F469、A431或G432。本發(fā)明的肽類成分可以結(jié)合(或包含或由其組成)形成在表4中確定的口袋或空腔的所有氨基酸殘基，或者它們可以結(jié)合(或包含或由其組成)形成口袋或空腔的殘基的一部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽類分子可以容易地被靶向于其它III型RTK中的相應(yīng)殘基，例如形成相似的口袋或空腔的那些殘基或通過結(jié)構(gòu)比對(duì)或序列比對(duì)處于相同的位置的那些殘基。在一種具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽類分子結(jié)合III型RTK上的構(gòu)象表位或非連續(xù)表位。構(gòu)象表位或非連續(xù)表位可以由來自III型RTK(例如人Kit受體或PDGF受體)的D3、D4或D5結(jié)構(gòu)域或者D4-D5或D3-D4鉸鏈區(qū)的兩個(gè)或多個(gè)殘基組成。例如，所述構(gòu)象表位或非連續(xù)表位可以由下表4中所列的兩個(gè)或多個(gè)殘基組成。在一種特定實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽類分子結(jié)合由選自Y125、H180、R181、K203、V204、R205、P206、V238、S239、S240、H263、G265、D266、F267、N268和Y269的2個(gè)或多個(gè)氨基酸組成的構(gòu)象表位。在相似的實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽類分子可以結(jié)合由選自以下氨基酸組中的一種的2個(gè)或多個(gè)氨基酸組成的構(gòu)象表位P206、F208、V238和S239；K127、A207、F208和T295；L222、A339、F340、K342、E368、S369、N370、1371和Y373；L222、L223、E306、V308、F312、E338、F340和1371；R224、V308、K310、G311、F340、P341和D398；K218、A219、S220、N367、E368和S369；K218、A220、E368和S369；G384、T385、T411、K412、E414和K471;Y408、F433、G470、K471和L472；F324、V325、N326和N410；D327、N410、T411、K412和V497；G384、G387、V409和K471；L382、G387、V407和V409；Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206、F208、V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268和Y269；P206、F208、V238和S239；K218、S220、Y221、L222、F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、I371和Y373；G384、G387、G388、Y408、V409、T411、F433、F469、G470和K471；D327、T411、K412、E414、A431、G432和K471；Y350、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386和T390；Y350、R353和F355。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽類分子結(jié)合由選自表5中所列的肽的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成的構(gòu)象表位。在一種具體實(shí)施方式中，構(gòu)象表位由選自第一肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸和選自第二肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸組成，其中第一和第二肽選自表5中所列的肽的組。因而，本發(fā)明的肽類分子可以結(jié)合其中第一和第二肽組如下的構(gòu)象表位Ala219-Leu222和Thr304_Val308；Asp309-Gly311和Arg224_Gly226；Thr303-Glu306和Ala219-Leu222；Asn367_Asn370和Ser217-Tyr221；Ala339-Pro343和Asn396_Val399；Ala339-Pro343和Glu368_Arg372；Lys358-Tyr362和Val374_His378；Asp357_Glu360和Leu377-Thr380；Met351_Glu360和His378_Thr389；His378-Thr389和Val323_Asp332；Val409-Ile415和Ala493-Thr500；Val409-Ile415和Ala431-Thr437；Val409-Ile415和Phe469-Val473；Val409-Ile415和Val325_Asn330；Val409-Ile415和Arg381-Gly387；Gly466-Leu472和Gly384_Gly388；Val325_Glu329和Tyr494_Lys499；Thr411-Leu416和Val497-Ala502；Ile415_Leu421和Ala502_Ala507；Ala502_Ala507和Lys484_Thr488；及Ala502-Ala507和Gly445-Cys450。本發(fā)明的肽類成分可以結(jié)合形成上述第一和第二肽組的所有氨基酸殘基，或者它們可以結(jié)合形成第一和第二肽組的殘基的一部分。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽類成分可以結(jié)合(或包含或由其組成)2個(gè)或多個(gè)選自E33、P34、D72、E76、N77、K78、Q79、K158、D159、N250、S251、Q252、T253、K254、L255、N260、W262、H264、G265、E344、N352、R353、F355、T356、D357、Y362、S365、E366、N367、N370和G466的氨基酸。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽類分子結(jié)合或包含人PDGFRii的氨基酸殘基385Arg和39qGIu或PDGFRα中的相應(yīng)殘基。人PDGFRβ的殘基385Arg和39qGIu類似于Kit受體的殘基381Arg和386Glu并介導(dǎo)PDGFRβ的同型D4-D4相互作用。本發(fā)明的肽類分子可以通過阻止III型RTK的膜近側(cè)區(qū)之間的關(guān)鍵同型相互作用(例如人PDGFRii的385Arg和39°Glu之間形成的鹽橋)發(fā)揮其對(duì)受體活化的抑制作用，所述膜近側(cè)區(qū)之間的關(guān)鍵同型相互作用對(duì)于將胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域定位在對(duì)于酪氨酸激酶活化至關(guān)重要的距離和定向上是至關(guān)重要的。本文中論述的實(shí)驗(yàn)表明同型D4-D4相互作用對(duì)于PDGFRii二聚化不是必要的，而PDGFRβ二聚化對(duì)于受體活化是必要的然而并非足夠的。因此，本發(fā)明的肽類分子可以允許PDGFRii的二聚化而同時(shí)阻止活化。基于結(jié)構(gòu)的序列比對(duì)已經(jīng)表明EF環(huán)的大小以及包含關(guān)鍵氨基酸的D4-D4界面在Kit、PDGFRα、PDGFRβ和CSFlR中是保守的。因此，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽類分子可以靶向于III型RTK的D4或D5結(jié)構(gòu)域的保守區(qū)。本發(fā)明的肽類成分可以是包含或由本文中確定的任一氨基酸序列(例如SEQIDNO:1-89、92、93和105-157)組成。例如，本發(fā)明的肽類成分可以是包含或由以下任一氨基酸序列組成的肽:EVVDKGFIN(SEQIDNO2)、ASYL(SEQIDNO3)、TLEVV(SEQIDNO4)、ASYLTLEVV(SEQIDNO5)、DKG,REG,DKGREG(SEQIDNO6)、VVSVSKASYLL(SEQIDNO7)、VTTTLEVVD(SEQIDNO8)、REGEEFTVTCTI(SEQIDNO9)、TTLE(SEQIDNO10)、TTLEASYL(SEQIDNO:11)、KSENESNIR(SEQIDNO:12)、NESN(SEQIDNO:13)、SKASY(SEQIDNO14)、NESNSKASY(SEQIDNO15)、AFPKP(SEQIDNO16)、NSDV(SEQIDNO17),AFPKPNSDV(SEQIDNO:18)、ESNIR(SEQIDNO:19)、AFPKPESNIR(SEQIDNO:20)、DKffEDYPKSE(SEQIDNO21)、IRYVSELHL(SEQIDNO22)、LTRLKGTEGGT(SEQIDNO23)、GENVDLIVEYE(SEQIDNO24)、MNRTFTDKffE(SEQIDNO25)、KffEDY(SEQIDNO26)、VSELH(SEQIDNO27)、KffEDYVSELH(SEQIDNO28)、DKffE(SEQIDNO29)、LHLT(SEQIDNO30)、DKffELHLT(SEQIDNO31)、HLTRLKGTEGGT(SEQIDNO32)、MNRTFTDKffE(SEQIDNO25)、HLTRLKGTEGGT(SEQIDNO32)、MNRTFTDKffEHLTRLKGTEGGT(SEQIDNO33)、VFVNDGENVD(SEQIDNO:34)、VNTKPEI(SEQIDNO:35)、AYNDVGKT(SEQIDNO:36)、VNTKPEIAYNDVGKT(SEQIDNO:37)、AGFPEPT(SEQIDNO:38)、VNTKPEIAGFPEPT(SEQIDNO39)、FGKLV(SEQIDNO40)、VNTKPEIFGKLV(SEQIDNO41)、VNDGEN(SEQIDNO42)、VNTKPEIVNDGEN(SEQIDNO43)、RLKGTEG(SEQIDNO44)、VNTKPEIRLKGTEG(SEQIDNO45)、GPPFGKL(SEQIDNO46)、GTEGG(SEQIDNO47)、GPPFGKLGTEGG(SEQIDNO48)、VNDGE(SEQIDNO49)、YNDVGK(SEQIDNO50)、VNDGEYNDVGK(SEQIDNO:51)、TKPEILTYDRL(SEQIDNO:52)、DRLVNGMLQC(SEQIDNO:53)、GKTSAYFNFAFK(SEQIDNO:54),CPGTEQRCSAS(SEQIDNO:55)、CSASVLPVDVQ(SEQIDNO:56)、DSSAFKHNGT(SEQIDNO57)、GTVECKAYND(SEQIDNO58)、LNSSGPPFGKL(SEQIDNO59)、FAFKGNNKEQI(SEQIDNO60)、TKPEIL(SEQIDNO61)、VGKTSA(SEQIDNO62)、TKPEILVGKTSA(SEQIDNO63)、ILTYDRL(SEQIDNO:64)、AYFNFA(SEQIDNO:65)、ILTYDRLAYFNFA(SEQIDNO:66)、KHNGT(SEQIDNO67)、AYFNFAKHNGT(SEQIDNO68)、GTEQRC(SEQIDNO69)、AYFNFAGTEQRC(SEQIDNO:70)、YHRKVRPVSSHGDFNY(SEQIDNO:71)、PFVS(SEQIDNO:72)、KAFT(SEQIDNO:73)、LAi7KESNIY(SEQIDNO:74)、LLEVFEFI(SEQIDNO:75)、RVKGFPD(SEQIDNO:76)、KASNES(SEQIDNO:77)、KAES(SEQIDNO:78)、GTTKEK(SEQIDNO:79)、YFGKL(SEQIDNO80)、FVNN(SEQIDNO81)、DNTKV(SEQIDNO82)、GGVK(SEQIDNO83)、LGVV(SEQIDNO84)、YGHRKVRPFVSSSHGDFNY(SEQIDNO85)、PFVS(SEQIDNO72)、KSYLFPKNESNIY(SEQIDNO:86)、GGGYVTFFGK(SEQIDNO:87)、DTKEAGK(SEQIDNO:88)、YFKLTRLET(SEQIDNO89)禾口YRF。本發(fā)明的肽類分子可以被進(jìn)一步修飾以增加其穩(wěn)定性、生物利用度或溶解度。例如，在所述肽類分子內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)L-氨基酸殘基可以用D-氨基酸殘基替換。如應(yīng)用于本發(fā)明的肽類分子的術(shù)語“模擬物”意圖包括模擬D-肽結(jié)構(gòu)的化學(xué)結(jié)構(gòu)并保持D-肽結(jié)構(gòu)的功能特性的模擬物。術(shù)語“模擬物”進(jìn)一步意圖包括如下所述的肽的“類似物”和/或“衍生物”。設(shè)計(jì)肽類似物、衍生物和模擬物的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，見Farmer，P.S.inDruRDesiRn(Ε.J.Ariens編輯)AcademicPress,NewYork,1980,vol.10,pp.119-143；Ball.J.B.禾口Alewood，P.F.(1990)J.Mol.Recognition355；Morgan,B.Α.和Gainor,J.A.(1989)Ann.Rep.Med.Chem.24243；以及Freidinger,R.Μ.(1989)TrendsPharmacol.Sci.10:270。也參見Sawyer,Τ·K.(1995)"PeptidomimeticDesignandChemicalApproachestoPeptideMetabolism"inTaylor,M.D.禾口Amidon,G.L.(編輯)Peptide-BasedDrugDesign:ControllingTransportandMetabolism,Chapter17；Smith,A.B.3rd等(1995)J.Am.Chem.Soc.117:11113_11123；Smith,A.B.3rd等(1994)J.Am.Chem.Soc.116:9947_9962；和Hirschman，R.等(1993)J.Am.Chem.Soc.11512550-12568。如本文所使用，本發(fā)明的肽類分子的“衍生物”是指其中在所述分子上的一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)已經(jīng)用取代基團(tuán)衍生化的肽類分子的一種形式。肽衍生物的實(shí)例包括其中氨基酸側(cè)鏈、肽主鏈或氨基或羧基末端進(jìn)行衍生化的肽(例如具有甲基化酰胺鍵的肽化合物)。如本文所使用，本發(fā)明的肽類分子的“類似物”是指保持所述分子的功能活性所需的所述分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，但還包含不同于所述分子的某些化學(xué)結(jié)構(gòu)的肽類分子。天然存在的肽的類似物的實(shí)例是包括一個(gè)或多個(gè)非天然存在的氨基酸的肽。如本文所使用，本發(fā)明的肽類分子的“模擬物”是指其中對(duì)于所述分子的功能活性所需的所述分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)已經(jīng)被其它模擬所述分子的構(gòu)象的化學(xué)結(jié)構(gòu)替換的肽類分子。肽模擬物的實(shí)例包括其中肽主鏈被一個(gè)或多個(gè)苯并二氮草分子取代的肽化合物。(例如，見James，G.L.等(1993)Science2601937-1942)。本發(fā)明的肽類分子的類似物意圖包括其中肽結(jié)構(gòu)的一個(gè)或多個(gè)L-或D-氨基酸被類似氨基酸置換而使得所述分子的性質(zhì)得以保持的分子。優(yōu)選地，在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基處進(jìn)行保守的氨基酸置換?！氨Ｊ氐陌被嶂脫Q”是其中氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替換的置換。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基族已經(jīng)在本領(lǐng)域定義，包括堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天門冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β_分支側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。可以在本發(fā)明的肽類分子的結(jié)構(gòu)中進(jìn)行的同系置換的非限制實(shí)例包括用D-酪氨酸、D-吡啶基丙氨酸或D-高苯丙氨酸置換D-苯丙氨酸，用D-纈氨酸或其它具有脂族側(cè)鏈的天然或非天然氨基酸置換D-亮氨酸和/或用D-亮氨酸或其它具有脂族側(cè)鏈的天然或非天然氨基酸置換D-纈氨酸。術(shù)語模擬物，特別是肽模擬物，意圖包括等排體。如本文所使用的，術(shù)語“等排體”意圖包括，因?yàn)榈谝换瘜W(xué)結(jié)構(gòu)的立體構(gòu)象適合對(duì)于第二結(jié)構(gòu)特異的結(jié)合位點(diǎn)，可用來替換第二化學(xué)結(jié)構(gòu)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。所述術(shù)語明確地包括本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的肽主鏈修飾(即酰胺鍵模擬物)。這樣的修飾包括酰胺氮、α-碳、酰胺羰基、酰胺鍵的完全置換，延伸、缺失或主鏈交聯(lián)的修飾。幾種肽主鏈修飾是已知的，包括Ψ[CH2S]、Ψ[CH2NH]、Ψ[CSNH2]、Ψ[NHCO]、Ψ[COCH2]和Ψ[(E)或(Z)CH=CH]。在上文使用的命名中，Ψ表示酰胺鍵不存在。替代酰胺基的結(jié)構(gòu)在括號(hào)內(nèi)具體說明。其它可能的修飾包括N-烷基(或芳基)取代(V[C0NR])、或主鏈交聯(lián)以構(gòu)建內(nèi)酰胺及其它環(huán)狀結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的調(diào)節(jié)化合物的其它衍生物包括C-末端羥甲基衍生物、0-修飾衍生物(例如C-末端羥甲基二甲苯醚)、N-末端修飾的衍生物，包括取代的酰胺如烷基酰胺和酰胼。本發(fā)明的肽類分子可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行制備。所述肽類分子，例如人KitRTK的D4結(jié)構(gòu)域，可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從人細(xì)胞克隆，插入重組載體，并在體外細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)(例如，通過將所述載體轉(zhuǎn)染入酵母細(xì)胞中)?？蛇x地，可以設(shè)計(jì)并經(jīng)由已知的合成法從頭合成所述肽類分子，例如Atherton等(1989)Oxford，EnglandIRLPress.ISBN0199630674;Stewart等(1984).第二版，Rockford:PierceChemicalCompany,91.ISBN0935940030；Merrifield(1963)J.Am.Chem.Soc.85:2149_2154。然后，使用在本文描述的任何分析方法，例如在下文實(shí)施例部分描述的那些，測(cè)試所述肽類分子的功能活性。IV.用于鑒定本發(fā)明的成分的篩詵分析可以使用在本文中描述的任何一種測(cè)定和本領(lǐng)域熟知的那些測(cè)定方法篩選本發(fā)明的成分的RTK抑制活性。例如，可測(cè)定受體內(nèi)化作用、受體自磷酸化和/或激酶信號(hào)傳導(dǎo)的分析方法可用來鑒定阻止目標(biāo)RTK(例如Kit受體)的活化的成分?？梢酝ㄟ^使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如通過使用phosphoELISA方法(可在Invitrogen獲得)來確定RTK或下游分子的磷酸化狀態(tài)，而實(shí)現(xiàn)新的抑制劑成分的篩選。所述受體(例如Kit受體)的磷酸化狀態(tài)可以使用市場(chǎng)上可買到的試劑盒，例如C-Kit[pY823]ELISAKIT,HU(BioSource；CatalogNumber-KH00401)；c-KIT[TOTAL]ELISAKIT,HU(BioSource；CatalogNumber-KH00391)，加以測(cè)定。本發(fā)明的抗體、小分子和其它成分可以使用這樣的試劑盒來測(cè)定它們的RTK抑制活性而進(jìn)行篩選。例如，在用適當(dāng)?shù)呐潴w和本發(fā)明的成分處理之后，可以進(jìn)行phosphoELISA以確定磷酸化狀態(tài)，從而確定目標(biāo)RTK的活化狀態(tài)。本發(fā)明的成分可以被鑒定為阻止RTK活化的那些成分。下文的實(shí)施例15和16描述了包括使用抗磷酸酪氨酸抗體檢測(cè)RTK活化的分析方法。下文的實(shí)施例20描述了使用phosphoELISA系統(tǒng)檢測(cè)受體活化的一種可能的分析方法。實(shí)施例22-25(包括與其相關(guān)的方法和介紹)進(jìn)一步描述了本文使用的確定RTK的活化狀態(tài)的方法。因?yàn)槭荏w活化可導(dǎo)致胞吞作用和受體內(nèi)化作用，所以在一些實(shí)施方式中，通過測(cè)量本發(fā)明的成分阻止受體內(nèi)化作用的能力而測(cè)定本發(fā)明的成分抑制目標(biāo)RTK的能力是有用的。下文的實(shí)施例25(和與其相關(guān)的方法)描述了對(duì)PDGF受體突變體的內(nèi)化和降解的測(cè)量。受體內(nèi)化測(cè)定是本領(lǐng)域熟知的，并描述于如Fukunaga等(2006)LifeSciences.80(1).p.17-23；Bernhagen等(2007)NatureMedicine13,587-596；natureprotocols.com/2007/04/18/receptor_internalization_assay.php)，其中各文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容以引用的方式并入本文。測(cè)定受體內(nèi)化的一個(gè)眾所周知的方法是用熒光蛋白(例如綠色熒光蛋白(GFP))或其它適當(dāng)?shù)臉?biāo)記劑標(biāo)記配體。在配體結(jié)合受體后，熒光顯微術(shù)可用來使受體內(nèi)化作用可視化。類似地，本發(fā)明的成分可以用標(biāo)記劑進(jìn)行標(biāo)記，并且熒光顯微術(shù)可用來使受體內(nèi)化可視化。如果所述成分能夠抑制所述受體的活性，則相比于適當(dāng)?shù)膶?duì)照，在配體存在的情況下降低熒光的內(nèi)化(例如僅可在其中所述成分與受體結(jié)合的細(xì)胞邊緣而不是在內(nèi)涵體或囊泡中觀察到熒光)。除了上述的這些之外，各種其它受體活化測(cè)定是本領(lǐng)域已知的，其任何一個(gè)可用于評(píng)價(jià)本發(fā)明的成分的功能。根據(jù)本發(fā)明可使得的進(jìn)一步的受體活化測(cè)定被描述于美國(guó)專利6，287，784；6，025，145；5，599，681；5，766，863；5，891，650；5，914，237；7，056，685和許多科學(xué)出版物中，包括但不限于=Amir-Zaltsman等(2000)Luminescencel5(6):377_80；Nakayama禾口Parandoosh(1999)JournalofImmunoIogicalMethods.225(1-2)，27,67-74；Pikeφ(1987)MethodsofEnzymologyl46353-362；Atienza等(2005)JournalofBiomolecularScreening.11(6)634-643；Hunter等(1982).JournalofBiologicalChemistry257(9)4843-4848；White禾口Backer(1991)MethodsinEnzymology20165-67;Madden等(1991)AnalBiochem199:210_215;Cleaveland等(1990)AnalyticalBiochemistry190249-253；Lazaro^(1991)AnalyticalBiochemistry192257-261；Hunter禾口Cooper(1985)AnnRevBiochem54897-930；Ullrich禾口Schlessinger(1990)Cell61:203_212；Knutson和Buck(1991)ArchivesofBiochemistryandBiophysics285(2)197-204)；King等(1993)LifeSciences531465-1472；Wang.(1985)MolecularandCellularBiology5(12):3640_3643；Glenney等(1988)JournalofImmunologicalMethods109277-285；Kamps(1991)MethodsinEnzymology20110卜110;Kozma等(1991)MethodsinEnzymology201:28_43;Holmes等(1992)Science256:1205-10;及Corfas等(1993)PNAS，USA90:1624_1628。通過配體結(jié)合的受體活化通常啟動(dòng)后續(xù)的細(xì)胞內(nèi)事件，例如第二信使如IP3增力口，第二信使再釋放鈣離子的細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存。因此，受體活性可以通過測(cè)量第二信使，如IP3、環(huán)核苷酸、細(xì)胞內(nèi)鈣或磷酸化信號(hào)傳導(dǎo)分子，如STAT、PI3K、Grb2或其它本領(lǐng)域已知的可能目標(biāo)，的量加以測(cè)定。美國(guó)專利7，056，685描述并引用了幾種根據(jù)本發(fā)明可用來檢測(cè)受體活性的方法，其通過引用的方式并入本文。上面描述的許多分析方法，如受體內(nèi)化作用測(cè)定或受體活化測(cè)定，可包括使用免疫結(jié)合測(cè)定檢測(cè)或定量目標(biāo)RTK(例如當(dāng)在受體內(nèi)化作用測(cè)定期間使用放射性標(biāo)記的抗體檢測(cè)在細(xì)胞表面上的RTK的量時(shí))。免疫結(jié)合測(cè)定在本領(lǐng)域中被廣泛地描述(參見，例如美國(guó)專利4，366，241；4,376,110；4，517，288和4，837，168)。對(duì)于一般性免疫測(cè)定的綜述，也參見MethodsinCellBiology:AntibodiesinCellBiology,volume37(Asai,ed.1993)；BasicandClinicalImmunology(Stites&Terr編輯，第七版1991)。免疫分析，如可以用于受體內(nèi)化作用研究、受體活化研究或受體檢測(cè)分析的那些，經(jīng)常采用標(biāo)記劑來特異性結(jié)合和標(biāo)記由檢測(cè)抗體和RTK形成的復(fù)合物(見美國(guó)專利7，056，685，其通過引用并入本文)。標(biāo)記劑本身可以是用于檢測(cè)受體的抗體(這里所述的抗體可以是或不是本發(fā)明的成分)?？蛇x地，標(biāo)記劑可以是第三試劑，諸如第二或第三抗體(例如結(jié)合對(duì)于目標(biāo)RTK特異性的小鼠單克隆抗體的抗小鼠抗體)。能夠特異性結(jié)合免疫球蛋白恒定區(qū)的蛋白質(zhì)，如A蛋白或G蛋白，在免疫結(jié)合分析中也可用作標(biāo)記劑。這些蛋白質(zhì)表現(xiàn)出強(qiáng)的與來自多個(gè)物種的免疫球蛋白恒定區(qū)的非免疫原性反應(yīng)性(例如見Kronval等(1973)，J.Immunol.Ill1401-1406；Akerstrom等(1985)，J.Immunol.135:25892542)。所述標(biāo)記劑還可以用一個(gè)可檢測(cè)試劑(如生物素)加以修飾，另一個(gè)分子(如鏈霉抗生物蛋白)可以特異性結(jié)合該可檢測(cè)試劑。多種可檢測(cè)成分為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知。通常使用的分析方法包括非競(jìng)爭(zhēng)性分析(例如夾心式分析)以及競(jìng)爭(zhēng)性分析。通常使用的分析形式包括蛋白質(zhì)印跡(免疫印跡)，其用來檢測(cè)和定量蛋白質(zhì)在樣品中的存在。用于所述測(cè)定中的特定標(biāo)記或可檢測(cè)基團(tuán)不是本發(fā)明的關(guān)鍵方面，只要它不顯著地干擾用于檢測(cè)RTK的免疫球蛋白或設(shè)計(jì)用來結(jié)合和滅活RTK的本發(fā)明的成分的特異性結(jié)合?？蓹z測(cè)基團(tuán)可以是具有可檢測(cè)的物理或化學(xué)性質(zhì)的任何材料。這樣的可檢測(cè)標(biāo)記在免疫分析領(lǐng)域已經(jīng)得到充分的發(fā)展，并且一般而言，大多數(shù)可用于這類方法的任何標(biāo)記可以被用于本發(fā)明。因此，標(biāo)記是可通過光譜學(xué)、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、電學(xué)、光學(xué)或化學(xué)方法檢測(cè)的任何組成。在本發(fā)明中有用的標(biāo)記包括熒光染料(例如異硫氰酸熒光素、德克薩斯紅、若丹明等等)、放射性標(biāo)記(例如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶及其他ELISA中常用的酶)和比色標(biāo)記如膠體金或有色玻璃或塑料珠(例如聚苯乙烯、聚丙烯或膠乳)?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域熟知的方法將所述標(biāo)記直接或間接地偶聯(lián)到所述測(cè)定的期望成分上。所述標(biāo)記還可以被直接結(jié)合到信號(hào)產(chǎn)生化合物上，例如通過與酶或熒光團(tuán)結(jié)合。作為標(biāo)記的目標(biāo)酶主要是水解酶，特別是磷酸酶、酯酶和糖苷酶，或氧化酶(oxidotase)，特別是過氧化物酶。熒光化合物包括熒光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、丹磺酰、傘形酮等等?；瘜W(xué)發(fā)光化合物包括螢光素和2，3_二氫鄰苯二甲酰胼，例如魯米諾。對(duì)于可使用的各種標(biāo)記或信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的綜述見美國(guó)專利4，391，904。檢測(cè)標(biāo)記的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。因此，例如，在所述標(biāo)記是放射性標(biāo)記的情況下，檢測(cè)手段包括閃爍計(jì)數(shù)器或如在放射自顯影術(shù)中的攝影膠片。在標(biāo)記是熒光標(biāo)記時(shí)，可以通過用適當(dāng)波長(zhǎng)的光激發(fā)熒光團(tuán)并檢測(cè)所得到的熒光進(jìn)行檢測(cè)。熒光可以目測(cè)、利用攝影膠片、利用電子檢測(cè)器(如電荷耦合器件(CCD)或光電倍增器等等)進(jìn)行檢測(cè)。類似地，可以通過提供酶的適當(dāng)?shù)孜锊z測(cè)所得到的反應(yīng)產(chǎn)物檢測(cè)酶標(biāo)記。最后，簡(jiǎn)單的比色標(biāo)記可以簡(jiǎn)單地通過觀察與所述標(biāo)記相關(guān)的顏色進(jìn)行檢測(cè)。因此，在各種浸量尺(dipstick)測(cè)定中，結(jié)合的金通常顯粉色，而各種結(jié)合珠顯現(xiàn)所述珠的顏色。在本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，本發(fā)明的成分可結(jié)合在目標(biāo)RTK上的表位上并仍允許受體酪氨酸激酶的胞外域二聚化。在該實(shí)施方式中，所述成分的結(jié)合可影響兩個(gè)單體的Ig樣結(jié)構(gòu)域(例如，III型受體酪氨酸激酶的D4-D4或D5-D5結(jié)構(gòu)域或者V型受體酪氨酸激酶的D7-D7結(jié)構(gòu)域)之間的定位、取向和/或距離，從而抑制受體酪氨酸激酶的活性。換句話說，所述成分可允許配體誘導(dǎo)的受體酪氨酸激酶胞外域的二聚化，但影響兩個(gè)胞外域在細(xì)胞表面界面的定位或者改變或阻止受體酪氨酸激酶的構(gòu)象變化，從而抑制受體酪氨酸激酶的活性(例如，抑制受體內(nèi)化作用和/或抑制所述受體的酪氨酸自磷酸化和/或抑制所述受體激活下游信號(hào)傳導(dǎo)通路的能力)。因此，在一些實(shí)施方式中，使用能夠鑒定允許受體二聚化但仍使受體無活性的成分的測(cè)定方法是有用的。這樣的測(cè)定方法在下文中描述。例如，實(shí)施例18描述了采用PDGF受體進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，由此使用交聯(lián)檢測(cè)受體二聚化，并使用磷酸酪氨酸特異性抗體測(cè)定受體活化。而且，實(shí)施例23表明PDGFR的突變體對(duì)配體誘導(dǎo)的酪氨酸自磷酸化有影響，這不是由配體誘導(dǎo)的受體二聚化中的缺陷引起的(也參見實(shí)施例22-25的方法和介紹)。通過熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)分析也可以確定RTK的構(gòu)象狀態(tài)。關(guān)于確定蛋白質(zhì)構(gòu)象和相互作用的熒光方法的綜述可以發(fā)現(xiàn)于Johnson(2005)Traffic.2005Dec；6(12)1078-92，其通過引用并入本文。在FRET測(cè)定中，用合適的FRET熒光團(tuán)標(biāo)記目標(biāo)RTK。在標(biāo)記RTK之后，表達(dá)標(biāo)記的RTK的細(xì)胞與本發(fā)明的測(cè)試成分以及RTK的配體(例如，對(duì)于KitRTK是SCF)—起溫育。FRET分析將允許觀察在RTK中與配體結(jié)合、RTK二聚化和/或受體活化相關(guān)的構(gòu)象變化。通過該方法，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可直接評(píng)價(jià)表明RTK二聚化而無下游活化的蛋白質(zhì)構(gòu)象變化。存在許多可用來進(jìn)行FRET分析的方法，并且大部分的不同源于使用不同的熒光團(tuán)或?qū)晒鈭F(tuán)摻入目標(biāo)蛋白質(zhì)的不同技術(shù)。FRET熒光團(tuán)和分析方法在本領(lǐng)域中是熟知的，并且FRET技術(shù)的簡(jiǎn)述可獲自Heyduk.(2002)CurrentOpinioninBiotechnology.13(4).292-296及其中的參考文獻(xiàn)。下列出版物詳述FRET方法并通過引用的方式并入本文Kajihara等(2006)NatMethods.3(11):923_9；Biener-Ramanujan等(2006)GrowthHormIGFRes.16(4):247_57;Taniguchi等(2007)Biochemistry.46(18)5349-57；美國(guó)專利No.6，689，574；5，891，646和WIP0公開TO/2002/033102。FRET熒光團(tuán)可以被摻入RTK的任何結(jié)構(gòu)域或絞鏈區(qū)以檢測(cè)構(gòu)象變化(例如，III型RTK的D4或D5結(jié)69構(gòu)域或者V型RTK的D7結(jié)構(gòu)域)，條件是所述熒光團(tuán)不干擾RTK的功能或本發(fā)明的成分結(jié)合RTK的能力?？捎糜贔RET的熒光團(tuán)通常與可用于如下文討論的生物發(fā)光能量共振轉(zhuǎn)移(BRET)的那些熒光團(tuán)相同。最常用的FRET方法是將反應(yīng)性半胱氨酸殘基工程化到目標(biāo)蛋白質(zhì)中。然后，熒光團(tuán)可以容易地與選擇的半胱氨酸殘基反應(yīng)。通常，構(gòu)建融合蛋白質(zhì)，由此將目標(biāo)蛋白質(zhì)與綠色熒光蛋白融合(見Neininger等(2001)EMB0Reports.2(8):703_708)。另外的方法和可用于FRET的熒光團(tuán)被描述于Huebsch和Mooney(2007)Biomaterials.28(15)2424-37；Schmid禾口Birbach(2007)ThrombHaemost.97(3)378-84；Jares-Erijman禾口Jovin(2006)CurrOpinChemBiol.10(5):409_16Johansson(2006)MethodsMolBiol.335:17-29;Wallrabe和Periasamy(2005)CurrOpinBiotechnol.16(1):19_27;以及CleggRM(1995)CurrOpinBiotechnol.6(1):103-10，其通過引用并入本文。在其它實(shí)施方式中，可能不知道或難以確定(取決于受體)是哪種RTK構(gòu)象特別地表示在無活化的情況下的二聚化。在這類情況下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可將確定受體二聚化的測(cè)定方法和確定受體活化的測(cè)定方法結(jié)合。例如，可結(jié)合上述討論到的任何受體活化測(cè)定方法使用傳統(tǒng)的交聯(lián)研究(由Rodriguez等(1990)MolecularEndocrinology，4(12)，1782-1790示例)檢測(cè)RTK二聚化。FRET和相似系統(tǒng)也可用于直接測(cè)量受體活化或二聚化。例如，通過將適當(dāng)?shù)腇RET熒光團(tuán)摻入RTK的胞質(zhì)域和摻入磷酸化目標(biāo)蛋白(即下游信號(hào)傳導(dǎo)分子)，F(xiàn)RET將能夠確定下游信號(hào)傳導(dǎo)分子是否正被RTK募集。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，成功的本發(fā)明的成分是允許受體二聚化(如通過交聯(lián)或FRET所測(cè)量的)，但阻止受體活化(通過FRET或BRET分析或通過其它受體活化測(cè)定(例如使用抗磷酸酪氨酸抗體的自磷酸化測(cè)定和蛋白質(zhì)印跡)檢測(cè)為不存在熒光)的成分。因此，使用在本文描述的技術(shù)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地測(cè)試成分(例如小分子、肽或抗體)，以確定它們是否抑制RTK活性和它們是否允許受體二聚化。特別地，生物發(fā)光能量共振轉(zhuǎn)移(BRET)分析可用來鑒定抑制RTK活性的成分。美國(guó)專利公開20060199226、WIP0公開W0/2006/094073和Tan等(2007.MolecularPharmacology.72=1440-1446)具體描述鑒定活化RTK的配體的方法，并因此通過引用的方式并入本文。這些技術(shù)已經(jīng)被用于確定體外和體內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用(Pfleger等(2006)NatureProtocols1337-345;Kroeger等(2001)，J.Biol.Chem.,276(16):12736-43；和Harikumar等(2004)MolPharmacol65:28_35；其通過引用的方式全部并入本文)。通過篩選阻止RTK活化的那些成分，BRET可用于從測(cè)試化合物中鑒定本發(fā)明的成分。如在通過引用并入本文的美國(guó)專利公開2006/0199226中討論的，基于BRET的測(cè)定可用于監(jiān)測(cè)具有生物發(fā)光供體分子(DM)的蛋白質(zhì)與具有熒光受體部分(AM)的蛋白質(zhì)的相互作用。簡(jiǎn)言之，表達(dá)RTK-DM融合體的細(xì)胞將底物的化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光。如果存在非常接近RTK-DM融合體的AM(例如，信號(hào)傳導(dǎo)蛋白質(zhì)-AM融合體)，則細(xì)胞將在發(fā)現(xiàn)特定波長(zhǎng)的光。例如，基于BRET的測(cè)定可用于評(píng)價(jià)在RTK-熒光素酶融合體和GFP-信號(hào)傳導(dǎo)蛋白融合體之間的相互作用。這稍微不同于FRET分析(其中供體分子可通過特定波長(zhǎng)的光激發(fā)而不是通過化學(xué)能轉(zhuǎn)化)?？捎糜贐RET分析的具有熒光素酶活性的生物發(fā)光蛋白質(zhì)的實(shí)例可以在美國(guó)專利5，229，285,5,219，737,5,843，746,5,196，524,5,670，356中找到?？蛇x的DM包括酶，其可以作用于適當(dāng)?shù)牡孜镆援a(chǎn)生熒光信號(hào)。這樣的酶的具體實(shí)例是半乳糖苷酶、堿性磷酸酶、β-葡糖苷酸酶和β-葡糖苷酶。這些酶的合成發(fā)光底物是本領(lǐng)域所熟知的，并且可從公司如TropixInc.(Bedford,Mass.，USA)商購(gòu)獲得。DM也可以從昆蟲分離或進(jìn)行工程化(美國(guó)專利5，670，356)。取決于底物，DM發(fā)射不同的波長(zhǎng)的光。DM底物的非限制性實(shí)例包括腸腔素(coelenterazine)、苯并噻唑、螢光素、烯醇甲酸酯(enolformate)、萜和醛等等。DM部分可以被直接與RTK蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端部分融合。優(yōu)選地，BDM結(jié)構(gòu)域在RTK-DM融合體內(nèi)的位置不改變天然蛋白質(zhì)的活性或本發(fā)明的成分的結(jié)合。RTK-DM融合蛋白質(zhì)可以被檢測(cè)，以確保它保持生化特性，如配體結(jié)合和與所述天然蛋白質(zhì)的下游信號(hào)傳導(dǎo)分子相互作用的能力。在BRET分析中AM可以再發(fā)射熒光形式的轉(zhuǎn)移能量。AM的實(shí)例包括綠色熒光蛋白(GFP)，或其同工型和衍生物，諸如YFP、EGFP,EYFP等等(R.Y.Tsien,(1998)Ann.Rev.Biochem.63509-544)。優(yōu)選地，AM結(jié)構(gòu)域在AM-蛋白質(zhì)融合體內(nèi)的位置不改變所述天然蛋白質(zhì)的活性。AM-第二蛋白質(zhì)融合蛋白可以被檢測(cè)以確保它保持同源天然蛋白質(zhì)的生化特性，諸如與RTK的相互作用。例如，可以使用GFP蛋白質(zhì)與通過目標(biāo)RTK磷酸化或可以結(jié)合目標(biāo)RTK的任何底物的氨基末端融合體。V.包含本發(fā)明的成分的藥物組合物在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含與藥學(xué)上可接受的載體一起配制的本發(fā)明的成分(例如單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分、抗體模擬物、小分子或本發(fā)明的肽類分子)之一或組合的組合物例如藥物組合物。這樣的組合物可包括一種或組合的(例如，兩種或多種)本發(fā)明的抗體、或者免疫綴合物、小分子或肽類分子。例如，本發(fā)明的藥物組合物可以包含結(jié)合在靶RTK上不同的表位或者具有互補(bǔ)的活性的抗體和小分子的組合，例如結(jié)合III型RTK的D3-D4絞鏈區(qū)的小分子與結(jié)合III型RTK的D4結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體組合。本發(fā)明的藥物組合物還可以聯(lián)合治療施用，即與其它藥劑結(jié)合。例如，聯(lián)合治療可以包括與至少一種其它抗癌劑聯(lián)合的本發(fā)明的抗RTK抗體(或者小分子或肽類分子)。可被用于聯(lián)合治療的治療劑的實(shí)例在下文更詳細(xì)地描述。如本文所使用的，“藥學(xué)上可接受的載體”包括生理上相容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等等。優(yōu)選地，所述載體適于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、非腸道、脊柱或表皮施用(例如通過注射或輸注)。取決于給藥途徑，活性化合物，即本發(fā)明的成分，可以包被在材料中以防止所述化合物免受酸和其它可能滅活所述化合物的自然條件的作用。本發(fā)明的藥物化合物可包括一種或多種藥學(xué)上可接受的鹽?！八帉W(xué)上可接受的鹽”是指保持母體化合物的期望的生物活性而不施加任何不想要的毒理效應(yīng)的鹽(例如見Berge,S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.66:1_19)。這樣的鹽的實(shí)例包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括源于非毒性無機(jī)酸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸等等的那些鹽，以及源自非毒性有機(jī)酸如脂族單羧酸和二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳香酸、脂族和芳族磺酸等等的那些鹽。堿加成鹽包括源于堿土金屬如鈉、鉀、鎂、鈣等等的那些鹽以及源自非毒性有機(jī)胺如N，N'-二芐基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等等的那些鹽。本發(fā)明的藥物組合物還可包括藥學(xué)上可接受的抗氧化劑。藥學(xué)上可接受的抗氧化劑的實(shí)例包括(1)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉等等；(2)油溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁羥茴醚(BHA)、丁羥甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等等；和(3)金屬螯合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等等。可用于本發(fā)明的藥物組合物中的適當(dāng)?shù)乃暂d體和非水性載體的實(shí)例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等等)和其適當(dāng)?shù)幕旌衔?、植物油如橄欖油及可注射的有機(jī)酯如油酸乙酯。例如，可以通過利用包衣材料(如卵磷脂)、在分散劑的情況下通過維持所需要的顆粒大小和通過利用表面活性劑維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。這些組合物還可包含輔助劑如防腐劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑和分散劑。通過滅菌方法和通過包含各種抗菌劑和抗真菌劑(例如對(duì)羥苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等等)可以確保防止微生物的存在。將等滲劑如糖、氯化鈉等等包括入所述組合物也可能是期望的。此夕卜，通過包含延遲吸收的物質(zhì)如單硬脂酸鋁和明膠，可以引起注射藥物形式的吸收延長(zhǎng)。藥學(xué)上可接受的載體包括無菌水溶液或分散液和用于臨時(shí)制備無菌注射溶液或分散液的無菌粉末。用于藥學(xué)上活性物質(zhì)的這類介質(zhì)和試劑在本領(lǐng)域中是已知的。除非任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性化合物不相容，可以考慮任何常規(guī)介質(zhì)或試劑在本發(fā)明的藥物組合物中的使用。補(bǔ)充活性化合物也可以被加入所述組合物中。藥物組合物通常必須是無菌的并且在制造和儲(chǔ)存的條件下是穩(wěn)定的。所述組合物可以被配制為溶液、微乳劑、脂質(zhì)體或其它適于高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。所述載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等等)及其適當(dāng)?shù)幕旌衔?。例如，通過利用包衣(如卵磷脂)、在分散劑的情況下通過維持所需要的顆粒大小和通過利用表面活性劑可以維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。在很多情況下，優(yōu)選在所述組合物中包括等滲劑例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨醇)或氯化鈉。通過將延遲吸收的物質(zhì)(例如單硬脂酸鹽和明膠)包括在所述組合物內(nèi)可以引起可注射組合物的吸收延長(zhǎng)?？梢酝ㄟ^將活性化合物以需要的量與按照需要的上文列舉的組分之一或其組合一起加入適當(dāng)?shù)娜軇┲校缓鬅o菌微過濾制備無菌注射溶液。通常，可以通過將所述活性化合物加入包含基本分散介質(zhì)和來自上文列舉的物質(zhì)的其它需要的組分的無菌載體中制備分散液。在用于制備無菌注射液的無菌粉末的情況中，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，其從先前無菌過濾的溶液產(chǎn)生活性成分加任何附加的需要成分的粉末?？梢耘c載體物質(zhì)結(jié)合以產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量取決于所治療的對(duì)象和特定施用模式。可以與載體結(jié)合以產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量一般是產(chǎn)生治療效應(yīng)的組合物的量。通常，以100%算，該量的范圍為約0.01%至約99%的活性成分，優(yōu)選從約0.1%至約70%，最優(yōu)選約至約30%的活性成分與藥學(xué)上可接受的載體組合。調(diào)節(jié)給藥方案以提供最佳的期望反應(yīng)(例如治療反應(yīng))。例如，可以施用單一大丸劑，可以隨著時(shí)間施用幾個(gè)分開的劑量，或者可以根據(jù)治療情況的緊迫性而按比例減少或增加所述劑量。由于便于施用和劑量的均勻性，將非腸道組合物配制成單位劑型是特別有利的。如本文所使用，單位劑型是指適合作為用于待治療對(duì)象的單一劑量的物理上分散的單位；各單元包含與需要的藥物載體結(jié)合的適于產(chǎn)生期望治療效應(yīng)的預(yù)定量的活性化合物。本發(fā)明的單位劑型的規(guī)格由以下因素規(guī)定并直接取決于以下因素(a)活性化合物的獨(dú)特性質(zhì)和待實(shí)現(xiàn)的特定治療效應(yīng)，和(b)在配制這類活性化合物用于治療個(gè)體敏感性的領(lǐng)域中固有的限制。對(duì)于所述抗體、小分子或肽類分子的施用，劑量范圍為宿主體重的約0.0001至100mg/kg，并更通常是0.01至5mg/kg。例如，劑重可以是0.3mg/kg體重、lmg/kg體重、3mg/kg體重、5mg/kg體重或10mg/kg體重或在l_10mg/kg的范圍內(nèi)。示例性的治療方案要求每周施用一次、每?jī)芍芤淮?、每三周一次、每四周一次、一月一次、?個(gè)月一次或每三至6個(gè)月一次。對(duì)于本發(fā)明的成分，優(yōu)選的給藥方案包括經(jīng)由靜脈內(nèi)施用，lmg/kg體重或3mg/kg體重，其中使用下列給藥時(shí)間表之一給予所述抗體(i)每四周給予六個(gè)劑量，然后每三個(gè)月；(ii)每三周；(iii)3mg/kg體重一次，然后每三周lmg/kg體重?？蛇x地，所述抗體、小分子或肽類分子可以作為緩釋制劑進(jìn)行施用，在這種情況下需要較低頻度的施用。劑量和頻率隨所施用的物質(zhì)在患者中的半衰期而變化。通常，人抗體顯示出最長(zhǎng)的半衰期，接下來是人源化抗體、嵌合抗體和非人類抗體。施用的劑量和頻率可以取決于治療是預(yù)防性或者是治療性的。在預(yù)防性應(yīng)用中，以相對(duì)不頻繁的間隔在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)施用以相對(duì)低的劑量施用。一些患者在他們的余生中持續(xù)接受治療。在治療性應(yīng)用中，有時(shí)要求相對(duì)短的時(shí)間間隔和相對(duì)高的劑量，直到疾病的進(jìn)展被減緩或終止，并優(yōu)選直到患者顯示出疾病癥狀的部分或完全改善。其后，可以給予患者預(yù)防性方案。活性成分和小分子在本發(fā)明的藥物組合物中的實(shí)際劑量水平可以有所變化，以便獲得對(duì)特定患者、組成和施用模式有效實(shí)現(xiàn)期望治療響應(yīng)而對(duì)所述患者無毒性的活性成分的量。所選擇的劑量水平取決于各種藥代動(dòng)力學(xué)因素，包括所使用的本發(fā)明的特定組合、或者其酯、鹽或酰胺的活性、給藥途徑、施用時(shí)間、使用的特定化合物的排泄速率、治療持續(xù)時(shí)間、與所使用的特定組合聯(lián)合使用的其它藥物、化合物和/或材料、待治療患者的年齡、性另IJ、體重、病癥、總體健康狀況和在先病史、以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)熟知的類似因素。本發(fā)明的抗RTK成分的“治療有效劑量”優(yōu)選引起病癥嚴(yán)重程度的降低、無疾病癥狀期間的頻率和持續(xù)時(shí)間增加或者防止由于疾病折磨而導(dǎo)致?lián)p傷或殘疾。例如，對(duì)于腫瘤的治療，相對(duì)于未治療的對(duì)象，“治療有效劑量”優(yōu)選抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或腫瘤生長(zhǎng)至少約20%、更優(yōu)選至少約40%、甚至更優(yōu)選至少約60%和更優(yōu)選至少約80%?；衔镆种颇[瘤生長(zhǎng)的能力可以在預(yù)測(cè)在人腫瘤中的功效的動(dòng)物模型中進(jìn)行評(píng)價(jià)?？蛇x地，可以通過用普通技術(shù)人員已知的測(cè)定方法檢查化合物的抑制能力，如這類體外抑制，評(píng)價(jià)組合物的這一性質(zhì)。治療有效量的治療化合物可以降低腫瘤大小，或者以其它方式改善對(duì)象的癥狀?；谌鐚?duì)象身材、對(duì)象癥狀的嚴(yán)重程度和所選擇的特定組合或給藥途徑等因素，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠確定這樣的量。本發(fā)明的抗RTK成分可以被測(cè)試以確定其是否有效拮抗RTK。測(cè)試抗RTK成分的一個(gè)方法是證實(shí)在抗RTK成分和RTK之間存在相互作用。例如，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可測(cè)試本發(fā)明的抗體、小分子或肽類分子是否結(jié)合人KitRTK的D4或D5結(jié)構(gòu)域。這樣的對(duì)結(jié)合的測(cè)試是本領(lǐng)域熟知的并且可包括標(biāo)記(例如放射性標(biāo)記)抗RTK成分，在結(jié)合可發(fā)生的條件下溫育抗RTK成分和RTK，然后在凝膠或熒光屏上分離/顯像復(fù)合物。類似地，ELISA技術(shù)可用來測(cè)定結(jié)合。確定本發(fā)明的成分是否拮抗RTK的另一種方法是檢測(cè)RTK的胞質(zhì)域的磷酸化狀態(tài)。在具體實(shí)施方式中，有效拮抗劑將阻止RTK的活化和自磷酸化。使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法例如通過使用特異性結(jié)合RTK的磷酸化殘基的抗體，可以檢測(cè)RTK的磷酸化。檢測(cè)磷酸化事件的其它方法包括描述于美國(guó)專利6548266；或Goshe等(2006)BriefFunctGenomicProteomic.4:363_76；deGraauw等(2006)Electrophoresis.27:2676_86；Schmidt等(2007)JChromatogrBAnalytTechnolBiomedLifeSci.849:154_62中的方法；或利用用于PerkinElmer的采用[γ_33Ρ]ΑΤΡ的激酶磷酸化分析的FlashPlates(SMP200)方案。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，這些方法以及在實(shí)施例中示范的那些方法，也可用來測(cè)定通過RTK磷酸化并且作為在所述細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)物的蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)。檢測(cè)這樣的蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)還表明RTK是否已經(jīng)被本發(fā)明的成分有效地拮抗。可以使用本領(lǐng)域已知的各種方法的一種或多種，經(jīng)由一種或多種給藥途徑施用本發(fā)明的組合物。如普通技術(shù)人員理解的，施用路徑和/或模式將取決于期望的結(jié)果。本發(fā)明的結(jié)合成分的優(yōu)選施用途徑包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、脊柱或其它非腸道施用途徑，例如通過注射或輸注。如本文所使用的，短語“非腸道施用”是指除了腸內(nèi)和局部施用之外的施用模式，通常通過注射進(jìn)行，并且非限制性地包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注。可選地，本發(fā)明的抗RTK結(jié)合成分可以經(jīng)由諸如局部、表皮或黏膜給藥途徑的非腸道途徑施用，例如鼻內(nèi)、口腔、陰道、直腸、舌下或局部給藥?？梢杂梅乐够钚曰衔锟焖籴尫诺妮d體制備所述活性化合物，諸如控釋制劑，包括植入物、經(jīng)皮貼劑和微膠囊輸送系統(tǒng)?？墒褂每缮锝到獾纳锵嗳菪跃酆衔?，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備這樣的制劑的許多方法被授予專利或通常是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。參見例如SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems,J.R.Robinson,ed.,MarcelDekker,Inc.,NewYork,1978。可以用本領(lǐng)域已知的醫(yī)療器械施用藥物組合物。例如，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的藥物組合物可以用無針皮下注射裝置諸如在美國(guó)專利5，399，163,5,383，851、5，312，335,5,064，413,4,941，880,4,790，824或4，596，556中公開的裝置進(jìn)行施用?？捎糜诒景l(fā)明的公知的植入物和模塊的實(shí)例包括美國(guó)專利4，487，603，其披露了用于以控制的速率分配藥物的可植入微輸液泵；美國(guó)專利4，486，194，其披露了用于經(jīng)皮膚施用藥物的治療裝置；美國(guó)專利4，447，233，其披露了用于以精確的輸注速率輸送藥物的藥物輸液泵；美國(guó)專利4，447，224，其披露了用于連續(xù)輸送藥物的可變流植入式輸注裝置；美國(guó)專利4，439，196，其披露了具有多腔隔室的蠕動(dòng)藥物輸送系統(tǒng)；和美國(guó)專利4，475，196，其披露蠕動(dòng)藥物輸送系統(tǒng)。這些專利通過引用的方式并入本文。許多其它這樣的植入物、輸送系統(tǒng)和模塊是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。V.使用本發(fā)明的成分的方法在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供治療對(duì)象的RTK相關(guān)疾病的方法，包括向所述對(duì)象施用治療有效量的本發(fā)明的成分。本發(fā)明的抗RTK成分例如抗體、小分子或肽類分子具有許多涉及受體酪氨酸激酶相關(guān)疾病的診斷和治療的體外和體內(nèi)診斷和治療用途。本發(fā)明的結(jié)合成分可以被施用于在培養(yǎng)中、體外或活體外的細(xì)胞，或者施用于人類對(duì)象(例如體內(nèi)施用)以治療、預(yù)防和診斷受體酪氨酸激酶相關(guān)疾病。如本文所使用的，“受體酪氨酸激酶相關(guān)疾病”是由RTK活性介導(dǎo)或與異常RTK表達(dá)或活化有關(guān)的疾病或病癥。受體酪氨酸激酶相關(guān)疾病的實(shí)例包括與例如FGF受體、HGF受體、胰島素受體、IGF-I受體、NGF受體、VEGF受體、PDGF受體-α、PDGF受體-β、CSF-I受體和Flt3受體有關(guān)的疾病或病癥，如年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、動(dòng)脈粥樣硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病或疼痛相關(guān)疾病。受體酪氨酸激酶相關(guān)疾病的具體實(shí)例包括但不限于胃腸間質(zhì)瘤(GIST)、急性骨髓性白血病(AML)、小細(xì)胞性肺癌(SCLC)、乳腺癌、骨轉(zhuǎn)移乳腺癌和腱鞘巨細(xì)胞瘤。受體酪氨酸激酶相關(guān)疾病的其它實(shí)例包括結(jié)腸癌(包括小腸癌)、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、黑素瘤(例如轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤)、急性骨髓性白血病、腎癌、膀胱癌、卵巢癌和前列腺癌?？梢允褂帽景l(fā)明方法治療的其它癌的實(shí)例包括腎癌(例如腎細(xì)胞癌)、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、腦腫瘤、慢性或急性白血病包括急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)、成人T細(xì)胞性白血病(T-ALL)、慢性粒細(xì)胞性白血病、急性淋巴母細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、淋巴瘤(例如霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、原發(fā)性CNS淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤、伯基特氏腫瘤、間變大細(xì)胞性淋巴瘤(ALCL)、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、結(jié)節(jié)性小裂細(xì)胞性淋巴瘤(nodularsmallcleaved-celllymphomas)、外周T細(xì)胞淋巴瘤、倫納特淋巴瘤、免疫母細(xì)胞性淋巴瘤、T細(xì)胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、中心母細(xì)胞(entroblastic)/中心細(xì)胞性(cb/cc)濾泡性淋巴瘤癌、彌散性B系大細(xì)胞淋巴瘤、血管免疫母細(xì)胞性淋巴結(jié)病(AILD)樣T細(xì)胞淋巴瘤和HIV相關(guān)體腔基淋巴瘤)、胚胎性癌、鼻咽的未分化性癌(例如Schmincke氏腫瘤)、Castleman氏病、卡波濟(jì)氏肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤、Waldenstrom氏巨球蛋白血癥及其他B細(xì)胞淋巴瘤、鼻咽癌、骨癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內(nèi)惡性黑色素瘤、子宮癌、直腸癌、肛區(qū)癌、胃癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、食管癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、兒童期實(shí)體瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的腫瘤、腫瘤血管發(fā)生、脊柱軸(spinalaxis)腫瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、垂體腺瘤、表皮樣癌、鱗狀上皮細(xì)胞癌、環(huán)境誘導(dǎo)型癌包括由石棉誘導(dǎo)的那些癌(例如間皮瘤)和所述癌的組合。而且，假設(shè)III型或V型RTK在各種腫瘤細(xì)胞上表達(dá)，本發(fā)明的結(jié)合成分、組合物和方法可用于治療患有致瘤障礙(例如以存在表達(dá)Kit的腫瘤細(xì)胞為特征的障礙，例如胃腸間質(zhì)瘤、肥大細(xì)胞病和急性骨髓性白血病)的對(duì)象。其他的患有致瘤障礙的對(duì)象的實(shí)例包括患有腎癌(例如腎細(xì)胞癌)、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、腦腫瘤、慢性或急性白血病(包括急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)、成人T細(xì)胞性白血病(T-ALL)、慢性粒細(xì)胞性白血病、急性淋巴母細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病)、淋巴瘤(例如霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、原發(fā)性CNS淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤、伯基特氏腫瘤、間變大細(xì)胞性淋巴瘤(ALCL)、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、結(jié)節(jié)性小裂細(xì)胞性淋巴瘤、外周T細(xì)胞淋巴瘤、倫納特淋巴瘤、免疫母細(xì)胞性淋巴瘤、T細(xì)胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、中心母細(xì)胞/中心細(xì)胞性(cb/cc)濾泡性淋巴瘤癌、彌散性B系大細(xì)胞淋巴瘤、血管免疫母細(xì)胞性淋巴結(jié)病(AILD)樣T細(xì)胞淋巴瘤和HIV相關(guān)體腔基淋巴瘤)、胚胎性癌、鼻咽的未分化性癌(例如Schmincke氏腫瘤)、Castleman氏病、卡波濟(jì)氏肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤、Waldenstrom氏巨球蛋白血癥及其他B細(xì)胞淋巴瘤、鼻咽癌、骨癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內(nèi)惡性黑色素瘤、子宮癌、直腸癌、肛區(qū)癌、胃癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、食管癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、兒童期實(shí)體瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的腫瘤、腫瘤血管發(fā)生、脊柱軸腫瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、垂體腺瘤、表皮樣癌、鱗狀上皮細(xì)胞癌、環(huán)境誘導(dǎo)型癌包括由石棉誘導(dǎo)的那些癌(例如間皮瘤)和所述癌的組合的對(duì)象。如本文所使用的，術(shù)語“對(duì)象”意圖包括人和非人動(dòng)物。非人動(dòng)物包括所有脊椎動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物，諸如非人靈長(zhǎng)類、綿羊、狗、貓、牛、馬、雞、兩棲動(dòng)物和爬行動(dòng)物。優(yōu)選的對(duì)象包括患有受體酪氨酸激酶相關(guān)疾病的人類對(duì)象。本發(fā)明的成分(例如抗體、其抗原結(jié)合部分、小分子、肽類分子、抗體模擬物和組合物)在RTK相關(guān)疾病的治療和診斷中具有用途。例如，人單克隆抗體、多特異性或雙特異性分子、小分子或肽類分子可用于在體內(nèi)或體外引發(fā)一種或多種下列生物學(xué)活性抑制表達(dá)RTK(例如Kit或PDGFR)的細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或殺死所述細(xì)胞；在人效應(yīng)細(xì)胞存在的情況下介導(dǎo)表達(dá)RTK(例如Kit或PDGFR)的細(xì)胞的吞噬ADCC或；或?qū)TK(例如RTKIII型家族成員)的胞外域鎖定至無活性狀態(tài)和/或單體狀態(tài)，從而拮抗所述受體的活性。體內(nèi)和體外施用本發(fā)明的抗RTK成分的適當(dāng)路徑是本領(lǐng)域所熟知的，并且可以由普通技術(shù)人員加以選擇。例如，可以通過注射(例如靜脈內(nèi)或皮下注射)施用所述抗RTK成分。所使用分子的適當(dāng)劑量將取決于對(duì)象的年齡和體重以及結(jié)合成分組合物的濃度和/或配制。如先前描述的，本發(fā)明的抗RTK成分可以與一種或其它更多種治療劑(例如細(xì)胞毒性劑、放射毒性劑或免疫抑制劑)共同施用。所述成分可以與所述藥劑連接或可以與所述藥劑分開施用。在后一種情況(分開施用)下，所述結(jié)合成分可以在所述劑之前、之后或同時(shí)施用，或者可以與其它已知的治療例如抗癌治療(例如放射)共同施用。這樣的治療劑特別包括抗腫瘤劑如多柔比星(阿霉素)、順鉬、博萊霉素硫酸鹽、卡莫司汀、苯丁酸氮芥和環(huán)磷酰胺羥基脲等，它們本身僅僅在對(duì)患者具有毒性或亞毒性的水平下才有效。順鉬以IOOmg/劑，每四周一次進(jìn)行靜脈施用，而阿霉素以60-75mg/ml劑量，每21天一次進(jìn)行靜脈施用。本發(fā)明的抗RTK結(jié)合成分與化療劑的共同施用提供經(jīng)由對(duì)人腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性效應(yīng)的不同機(jī)理起作用的兩種抗癌藥。這樣的共同施用可以解決由于抗藥性的產(chǎn)生或腫瘤細(xì)胞的抗原性變化(其將使它們不與所述結(jié)合成分起反應(yīng))帶來的問題。當(dāng)施用本發(fā)明的抗RTK成分_伴體分子結(jié)合物預(yù)防和/或治療與異常細(xì)胞增殖有關(guān)的疾病時(shí)，可以使用約0.001μM至20μM或約0.01μM至5μM的施用化合物循環(huán)濃度。對(duì)于患者經(jīng)口施用在本文描述的化合物，通常劑量范圍為約Img/日至約10，OOOmg/日，更通常從約IOmg/日至約1，OOOmg/日，以及最通常從約50mg/日至約500mg/日。從患者體重方面來說，典型的劑量范圍為約0.01至約150mg/kg/日，更通常從約0.1至約15mg/kg/日，以及最通常從約1至約10mg/kg/日，例如5mg/kg/日或3mg/kg/日。在至少一些實(shí)施方式中，延遲或抑制腫瘤生長(zhǎng)的患者劑量可以是1μmol/kg/日或更低。例如，患者劑量可以是0.9、0.6、0.5、0.45、0.3、0.2、0.15或0.1μmol/kg/日或更低(指藥物的摩爾數(shù))。優(yōu)選地，當(dāng)以每日劑量在至少五天的期間內(nèi)施用時(shí)，抗RTK成分-藥物結(jié)合物延遲腫瘤的生長(zhǎng)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的結(jié)合物可通過將這類化合物連接至抗RTK結(jié)合成分而用于將化合物(例如治療劑、標(biāo)記、細(xì)胞毒素、放射性毒素、免疫抑制劑等等)靶向于具有RTK細(xì)胞表面受體的細(xì)胞。例如，抗RTK成分可以被結(jié)合至在美國(guó)專利6，281，354和6，548，530、美國(guó)專利公開20030050331、20030064984、20030073852和20040087497中描述的或者公布于WO03/022806中的毒素化合物的任何一種，這些文獻(xiàn)通過引用的方式以全部?jī)?nèi)容由此并入。因此，本發(fā)明還提供活體外或體內(nèi)定位表達(dá)RTK的細(xì)胞的方法(例如利用可檢測(cè)標(biāo)記，如放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子)。靶特異性效應(yīng)細(xì)胞，例如連接至本發(fā)明的組分(例如抗體、其抗原結(jié)合部分、小分子或肽類分子)的效應(yīng)細(xì)胞，也可以用作治療劑。用于靶向的效應(yīng)細(xì)胞可以是人白細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞或單核細(xì)胞。其它細(xì)胞包括嗜酸性粒細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞及其他IgG或IgA受體攜帶細(xì)胞。如果需要，效應(yīng)細(xì)胞可以從待治療的對(duì)象獲得。靶特異性效應(yīng)細(xì)胞可以作為在生理上可接受的溶液中的細(xì)胞懸液進(jìn)行施用。施用的細(xì)胞數(shù)目可以在IO8-IO9的數(shù)量級(jí)，但將隨治療目的而變化。通常，所述量將足以獲得在靶細(xì)胞(例如表達(dá)RTK的腫瘤細(xì)胞)的定位并且通過例如吞噬作用實(shí)現(xiàn)細(xì)胞殺傷。施用途徑也可以變化。用靶特異性效應(yīng)細(xì)胞治療可以連同其它去除靶細(xì)胞的技術(shù)一起進(jìn)行。例如，使用本發(fā)明的成分和/或裝備有這些組分的效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行的抗腫瘤治療可與化療一起使用。本發(fā)明進(jìn)一步提供檢測(cè)樣品中人RTK抗原的存在或者測(cè)量人RTK抗原(例如人KitRTK或PDGFR的Ig樣結(jié)構(gòu)域)的量的方法，包括使所述樣品和對(duì)照樣品與RTK結(jié)合成分(例如人單克隆抗體)或特異性結(jié)合人RTK的其它結(jié)合成分在允許所述抗體或其它成分與人RTK(如Kit)之間形成復(fù)合物的條件下接觸。然后，檢測(cè)復(fù)合物的形成，其中在樣品之間相比于對(duì)照樣品的復(fù)合物形成差異指示RTK(例如人KitRTK或PDGFRRTK)在所述樣品中的存在。包含抗RTK結(jié)合成分(例如，抗體、其抗原結(jié)合部分、小分子或肽類分子)和使用說明的試劑盒也在本發(fā)明范圍內(nèi)。所述試劑盒可進(jìn)一步包含一種或多個(gè)另外的試劑(如免疫抑制劑、細(xì)胞毒性劑或放射性毒劑)或者一種或多種另外的本發(fā)明的抗RTK成分(例如具有結(jié)合與第一抗RTK成分不同的RTK抗原中的表位的互補(bǔ)活性的抗RTK結(jié)合成分)。通常，試劑盒包括指明所述試劑盒的內(nèi)含物的指定用途的標(biāo)簽。術(shù)語標(biāo)簽包括任何文字或者在所述試劑盒上，或者與所述試劑盒一起提供的記錄材料，或者以另外的方式與所述試劑盒結(jié)合的記錄材料。本發(fā)明通過下列實(shí)施例進(jìn)一步闡述，其不應(yīng)該被解釋為進(jìn)一步限制。全部附圖的內(nèi)容和本申請(qǐng)通篇引用的全部參考文獻(xiàn)、專利和公開的專利申請(qǐng)以及附圖通過引用的方式以它們的全部?jī)?nèi)容明確并入本文。實(shí)施例實(shí)施例1-19的介紹干細(xì)胞因子(SCF)通過結(jié)合于Kit胞外域而導(dǎo)致酪氨酸激酶活化，從而啟動(dòng)多種細(xì)胞響應(yīng)。在下面的一些實(shí)施例中，描述了在SCF刺激之前和之后Kit的整個(gè)胞外域的晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)表明Kit二聚化是由SCF結(jié)合驅(qū)動(dòng)的，SCF結(jié)合唯一的作用在于將兩個(gè)Kit分子帶到一起。受體二聚化之后是使得兩個(gè)Kit分子的膜近側(cè)Ig樣結(jié)構(gòu)域D4和D5之間能夠發(fā)生側(cè)向相互作用的構(gòu)象變化。培養(yǎng)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)表明，Kit活化受到在D4-D4相互作用至關(guān)重要的氨基酸的點(diǎn)突變的影響。而且，多種致癌突變被對(duì)應(yīng)到D5-D5界面。因?yàn)镵it結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵標(biāo)志(配體誘導(dǎo)的受體二聚化和D4-D4界面中的關(guān)鍵殘基)在其它受體中是保守的，在本報(bào)告中揭示的Kit的機(jī)制可應(yīng)用于其它的受體活化。這表明被靶向這些界面的藥物或生物制劑可用作治療劑。如在本文中描述的闡明SCF刺激之前和之后Kit的整個(gè)胞外域的X射線晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)提供了關(guān)于SCF誘導(dǎo)的Kit二聚化和活化的有價(jià)值的認(rèn)識(shí)。結(jié)構(gòu)表明，稱為Dl、D2和D3的Kit的前三個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)SCF結(jié)合。SCF結(jié)合的主要作用是交聯(lián)兩個(gè)Kit分子以提高細(xì)胞膜上Kit的局部濃度。這促進(jìn)Kit膜近側(cè)區(qū)中大的構(gòu)象變化，從而引起鄰近Kit分子的D4或D5之間的同型相互作用。兩個(gè)相鄰Kit分子的D4之間的側(cè)向相互作用通過來自各D4原聚體的EF環(huán)的兩對(duì)鹽橋進(jìn)行直接接觸而發(fā)生。膜近則的D5結(jié)構(gòu)域提供相鄰Kit分子之間的進(jìn)一步的間接相互作用，以進(jìn)一步穩(wěn)定所述胞外域的近膜部分和將其定位在能夠活化胞質(zhì)酪氨酸激酶的距離和方向。在以下數(shù)個(gè)實(shí)施例中描述了在單體和SCF誘導(dǎo)的同型二聚體(SCF-Kit22復(fù)合物)形式中Kit的整個(gè)胞外域的晶體結(jié)構(gòu)。未占據(jù)的單體形式以3.0人分辨率和SCF誘導(dǎo)的同型二聚體形式以3.5人分辨率的詳圖提供了關(guān)于Kit及其他RTK的激活機(jī)制的新見解。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，如下所述的實(shí)驗(yàn)可以用其它RTK進(jìn)行?？梢酝ㄟ^本發(fā)明的方法使用的實(shí)例RTK序列包括但不限于KitmRNA的Genbank參考序列NM_000222.2(編碼蛋白質(zhì)NP_000213.1；MRGARGAWDFLCVLLLLLRVQTGSSQPSVSPGEPSPPSIHPGKSDLIVRVGDEIRLLCTDPGFVKWTFEILDETNENKQNEWITEKAEATNTGKYTCTNKHGLSNSIYVFVRDPAKLFLVDRSLYGKEDNDTLVRCPLTDPEVTNYSLKGCQGKPLPKDLRFIPDPKAGIMIKSVKRAYHRLCLHCSVDQEGKSVLSEKFILKVRPAFKAVPVVSVSKASYLLREGEEFTVTCTIKDVSSSVYSTWKRENSQTKLQEKYNSWHH⑶FNYERQATLTISSARVNDSGVFMCYANNTFGSANVTTTLEVVDKGFINIFPMINTTVFVNDGENVDLIVEYEAFPKPEHQQWIYMNRTFTDKWEDYPKSENESNIRYVSELHLTRLKGTEGGTYTFLVSNSDVNAAIAFNVYVNTKPEILTYDRLVNGMLQCVAAGFPEPTIDffYFCPGTEQRCSASVLPVDVQTLNSSGPPFGKLVVQSSIDSSAFKHNGTVECKAYNDVGKTSAYFNFAFKGNNKEQIHPHTLFTPLLIGFVIVAGMMCIIVMILTYKYLQKPMYEVQWKVVEEINGNNYVYIDPTQLPYDHKWEFPRNRLSFGKTLGAGAFGKVVEATAYGLIKSDAAMTVAVKMLKPSAHLTEREALMSELKVLSYLGNHMNIVNLLGACTIGGPTLVITEYCCY⑶LLNFLRRKRDSFICSKQEDHAEAALYKNLLHSKESSCSDSTNEYMDMKPGVSYVVPTKADKRRSVRIGSYIERDVTPAIMEDDELALDLEDLLSFSYQVAKGMAFLASKNCIHRDLAARNILLTHGRITKICDFGLARDIKNDSNYVVKGNARLPVKWMAPESIFNCVYTFESDVWSYGIFLWELFSLGSSPYPGMPVDSKFYKMIKEGFRMLSPEHAPAEMYDIMKTCffDADPLKRPTFKQIVQLIEKQISESTNHIYSNLANCSPNRQKPWDHSVRINSVGSTASSSQPLLVHDDV(SEQIDNO92))或KitmRNA的變體2的Genbank參考序列NM_001093772.1(編碼蛋白質(zhì)ΝΡ_001087241.1；MRGARGAWDFLCVLLLLLRVQTGSSQPSVSPGEPSPPSIHPGKSDLIVRV⑶EIRLLCTDPGFVKffTFEILDETNENKQNEWITEKAEATNTGKYTCTNKHGLSNSIYVFVRDPAKLFLVDRSLYGKEDNDTLVRCPLTDPEVTNYSLKGCQGKPLPKDLRFIPDPKAGIMIKSVKRAYHRLCLHCSVDQEGKSVLSEKFILKVRPAFKAVPVVSVSKASYLLREGEEFTVTCTIKDVSSSVYSTWKRENSQTKLQEKYNSWHHGDFNYERQATLTISSARVNDSGVFMCYANNTFGSANVTTTLEVVDKGFINIFPMINTTVFVNDGENVDLIVEYEAFPKPEHQQWIYMNRTFTDKWEDYPKSENESNIRYVSELHLTRLKGTEGGTYTFLVSNSDVNAAIAFNVYVNTKPEILTYDRLVNGMLQCVAAGFPEPTIDWYFCPGTEQRCSASVLPVDVQTLNSSGPPFGKLVVQSSIDSSAFKHNGTVECKAYNDVGKTSAYFNFAFKEQIHPHTLFTPLLIGFVIVAGMMCIIVMILTYKYLQKPMYEVQWKVVEEINGNNYVYIDPTQLPYDHKWEFPRNRLSFGKTLGAGAFGKVVEATAYGLIKSDAAMTVAVKMLKPSAHLTEREALMSELKVLSYLGNHMNIVNLLGACTIGGPTLVITEYCCYGDLLNFLRRKRDSFICSKQEDHAEAALYKNLLHSKESSCSDSTNEYMDMKPGVSYVVPTKADKRRSVRIGSYIERDVTPAIMEDDELALDLEDLLSFSYQVAKGMAFLASKNCIHRDLAARNILLTHGRITKICDFGLARDIKNDSNYWKGNARLPVKWMAPESIFNCVYTFESDVWSYGIFLWELFSLGSSPYPGMPVDSKFYKMIKEGFRMLSPEHAPAEMYDIMKTCWDADPLKRPTFKQIVQLIEKQISESTNHIYSNLANCSPNRQKPVVDHSVRINSVGSTASSSQPLLVHDDV(SEQIDNO93))，其中通過標(biāo)準(zhǔn)的1-字母氨基酸代碼來表示蛋白質(zhì)。實(shí)施例1:SCF和Kit的表達(dá)、純化和結(jié)晶使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)由稱為D1、D2、D3、D4和D5的五個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域組成的Kit的完整胞外域。純化的Kit胞外域單體或SCF誘導(dǎo)的Kit胞外域同型二聚體(SCF-KU22復(fù)合物)各對(duì)于晶體生長(zhǎng)和優(yōu)化進(jìn)行大規(guī)模的篩選，然后確定其晶體結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)表汰和純化使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞(Sf9)中表達(dá)在C-末端含有多組氨酸標(biāo)簽的可溶性Kit胞外域(氨基酸1-519)。通過Ni螯合然后進(jìn)行大小排阻層析(Superdex200，GEHealthcare)來純化Kit胞外域。在使用內(nèi)糖苷酶Fl進(jìn)行部分去糖基化后，通過陰離子交換層析(MonoQ，GEHealthcare)進(jìn)一步純化胞外域。如前所述，進(jìn)行SCF(1-141)表達(dá)、重折疊和純化(Langley等(1994)ArchBiochemBiophys311:55_61；Zhang等(2000)ProcNatlAcadSciUSA97:7732_7737)。細(xì)胞系和表汰載體分別在補(bǔ)充了10%FCS和10%CS的DMEM中培養(yǎng)HEK和NIH3T3細(xì)胞。在SCF刺激前，如前所述在無血清培養(yǎng)基中使細(xì)胞饑餓過夜。(Kouhara等(1997)Cell30:693-702)。根據(jù)制造商說明使用Lipofectamin(Invitrogen)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將全長(zhǎng)Kit的cDNA分種到用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的RK5表達(dá)載體中并分種到用于穩(wěn)定表達(dá)的pBABE/puro載體中(Kouhara等(1997)Cell30:693-702)。通過以重組Kit胞外域免疫兔產(chǎn)生抗Kit抗體。單克隆抗Kit抗體(SantaCruz)用于免疫印跡分析。抗磷酸酪氨酸(抗pTyr)抗體購(gòu)自UpstateBiotechnology。結(jié)晶和數(shù)據(jù)收集單獨(dú)的Kit胞外域或與SCF的復(fù)合體的樣品就晶體生長(zhǎng)和優(yōu)化進(jìn)行大量篩選。在4°溫度下在含有聚乙二醇(PEG)作為沉淀劑的磷酸鹽緩沖液(0.IMNa-Pi緩沖液pH6.0，0.2MKCl,12%PEG400)中獲得尺寸約0.12x0.1x0.05mm的去糖基化胞外域的晶體。全部晶體被浸入補(bǔ)充有5-18%甘油的貯備溶液數(shù)秒鐘；快速冷卻，并在數(shù)據(jù)收集期間保持在100°K的氮?dú)饬髦?。所述晶體屬于六方晶格設(shè)置的晶胞大小為a=162.4人和c=67.1A的棱形空間群R3，其中每一個(gè)不對(duì)稱單元具有一個(gè)分子。通過將所述晶體在277K下浸泡入含有濃度范圍為0.ImM至50mM的重原子試劑的貯備溶液數(shù)秒至10天制備Kit的鉬、溴和碘衍生物。采用聚乙二醇(PEG)作為沉淀劑(0.2M硫酸銨、8-12%PEG8000、5_8%乙二醇，pH7.0-8.5)在4°C生長(zhǎng)SCF-Kit復(fù)合物的晶體，并用NSLS，BrookhavenNationalLaboratory的X25束線的ADSD量子-210C⑶檢測(cè)器以3.5人的分辨率收集衍射數(shù)據(jù)。晶體屬于單斜空間群C2，具有晶胞大小a=269.5人、b=52.1人、c=189.8人、β=108.2°，其由不對(duì)稱單元中的兩組SCF和Kit分子組成。使用DENZO和SCALEPACK以及HKL2000程序包。(Otwinowski等(1997)MethodsEnzymol.276:307-326)處理并估算所有數(shù)據(jù)集。數(shù)據(jù)收集統(tǒng)計(jì)資料總結(jié)在表IA中。實(shí)施例2:結(jié)構(gòu)測(cè)定通過使用具有反常散射的多對(duì)同晶置換(MIRAS)和通過多波長(zhǎng)反常散射(MAD)以3.0人的分辨率計(jì)算實(shí)驗(yàn)相(表1A)。所得到的電子密度圖顯示出β夾心結(jié)構(gòu)的連續(xù)電子密度和清晰的溶劑_蛋白質(zhì)邊界。單體Kit胞外域的分子模型被人工構(gòu)建到實(shí)驗(yàn)電子密度圖中。使用25.4%的結(jié)晶R-因子和29.6%的自由R-因子的原始數(shù)據(jù)集，將所述結(jié)構(gòu)優(yōu)化至3.0人的分辨率(表1B)。使用該報(bào)告中描述的單體形式和SCF結(jié)構(gòu)(Zhang等(2000)ProcNatlAcadSciUSA97:7732_7737；可用代碼1EXZ從ProteinDataBank獲得)作為搜索模型，通過分子置換解析SCF-Kit22復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。使用設(shè)置為24.9%的結(jié)晶R-因子和29.5%的自由R-因子的原始數(shù)據(jù)集將所述結(jié)構(gòu)優(yōu)化至3.5人的分辨率(表IA和1B)。使用Pymol(pymol.sourceforge.net)禾口CCP4MG(Potterton等(2004)ActaCrystallogrDBiolCrystallogr60:2288-2294)軟件產(chǎn)生分子圖像。Kit單體和SCF-Kit復(fù)合物的原子坐標(biāo)和結(jié)構(gòu)因子已經(jīng)存儲(chǔ)于ProteinDataBank(rcsb.org/pdb)，其獲取碼分別為2EC8和2E9W。表1A.數(shù)據(jù)收集和相位統(tǒng)計(jì)(phasingstatistics)<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>c(A)67.5966.9467.6269.0269.1369.09189.79β(*)108.24分辨率(A)50-3.050-3.150-3.050-3.350-3.350-3.350-3.5(3.11-3.0(3.2-3.1)(3.11-3.00(3.42-3.3)(3.42-3.3)(3.42-3.3)(3.63-3.50)))總偏轉(zhuǎn)數(shù)15612668961120301785997904379258113481獨(dú)特偏轉(zhuǎn)13342235352628119468195501947331962數(shù)完全性99.8(10099.2(99.6)99.5(97.1)95.4(97.2)95.4(97.0)95.0(96.4)98.5(91.4)(%)ω)1/σ(1)11.7(7.5)11.3(3.0)21.7(9.5)13.0(5.9)11.6(4.8)11.2(4.7)19.1(6.6)R合并(％)7.6(17.0)8.6(32.1)8.5(20.8)11.1(22.8)10.7(27.0)11.9(27.5)6.1(17.6)相位統(tǒng)計(jì)_MIRASMAD分辨率(A)50-3.050-3.050-3.050-3.350-3.350-3.3位點(diǎn)數(shù)36333Riso(Q)(%)22.011.6Rcullis0.85/0.680.80/0.810.790.74/0.810.81/0.98(iso/anom)'d)定相功率0.88/1.481.07/0.651.101.32/1.060.97/0.16(iso/anom)(e)<FOM>(f)0.50_048_括號(hào)中的值表示最高分辨率殼(resolutionshell)的統(tǒng)計(jì)數(shù)字。(a)完全性=(獨(dú)立偏轉(zhuǎn)數(shù))/(總理論偏轉(zhuǎn)數(shù))。(b)R^λ-=Σ|//-</>|/Σ//,其中"是觀察到的強(qiáng)度，而<">是從對(duì)稱的相關(guān)偏轉(zhuǎn)的多個(gè)觀察獲得的平均強(qiáng)庋·(c)iiso=L||Fph|-|Fp丨丨/Σ|Ρρ|，(d),Rcullis=XIFh-(Fph-Fp)/Z|Fph-Fp|,㈦定相功率=r.m.s.(|Fh|/E),其中分別地Fph和Fp是導(dǎo)數(shù)和天然結(jié)構(gòu)因子振幅，F(xiàn)h是重原子結(jié)構(gòu)振幅。E是缺乏閉合差的余數(shù)。(f)<FOM>是值的平均數(shù)字。_表1B.精修統(tǒng)計(jì)_Kit_SCF-Kit_分辨率(A)27.7-3.039.0-3.5偏轉(zhuǎn)數(shù)(工作/測(cè)試)12521/65030351/1594Rcryst(a)/Rfree(b)(%)25.4/29.624.9/29.5<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>實(shí)施例3=Kit胞外域結(jié)構(gòu)的分析胞外域結(jié)構(gòu)的一般件分析Kit胞外域顯示出細(xì)長(zhǎng)的蛇紋石狀，具有大約170x60x50人的尺寸(圖1A)。Kit的D1、D2、D3、D4*D5結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出典型的免疫球蛋白超家族(IgSF)折疊，其由裝配成由兩個(gè)反平行β折疊組成的β夾心結(jié)構(gòu)的八個(gè)β鏈——稱為ABCC’DEFG——組成(圖1Α)。Dl、D2、D3和D5各包含連接Β5和F5的半胱氨酸殘基(分別是鏈B和F的第五個(gè)氨基酸)的保守二硫鍵；和橋接兩個(gè)β折疊以形成Ig樣折疊的疏水核心的中心的位置(Harpaz和Chothia(1994)JMolBiol238:528-539)。D2和D5包含兩個(gè)二硫鍵，而D4不包含任何半胱氨酸殘基，然而，即使在Β5和F5處的保守半胱氨酸殘基分別被纈氨酸和苯丙氨酸殘基替換，D4的Ig樣折疊的完整性也得以保持。沿著兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的軸在Dl和D2之間的角度為76°(圖1Α、B)，其類似在白介素受體的第一和第二Ig樣結(jié)構(gòu)域之間的取向(Vigers等(1997)Nature，386:190-194)。相反，在D2和D3之間的角度是150°，在D3和D4之間是119°，而在D4和D5之間是162°。對(duì)于不同的Ig樣結(jié)構(gòu)域，在ABED和A，GFCβ-折疊之間的取向?qū)τ贒1-D2是180°，對(duì)于D2-D3是180°，對(duì)于D3-D4是90°，而對(duì)于D4-D5是180°(圖1)。Kit胞外域的全部五個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域與用作Ig折疊的標(biāo)準(zhǔn)的端蛋白的疊合(Holden等(1992)J.Mol.Biol.227:840_851)顯示出對(duì)于等效Cα原子的1.5-2.9人的均方根(r.m.s.)差。D2是五個(gè)KitIg樣結(jié)構(gòu)域中最不同的(圖8)，如當(dāng)與端蛋白疊合時(shí)它的較高的r.m.s.d.所顯示?；谠贗g樣結(jié)構(gòu)域中關(guān)鍵氨基酸的結(jié)構(gòu)保守性和它們的二級(jí)結(jié)構(gòu)拓?fù)鋵W(xué)(Harpaz等(1994)JMolBiol238:528_539;Halaby等(1999)ProteinEng12:563-571)，D1、D2、D3和D4屬于I-亞組，而D5與IgSF的C2和IgCAM亞組有關(guān)。而且，在IgSF的結(jié)構(gòu)上保守的20個(gè)指紋殘基(Harpaz等(1994)JMolBiol238:528-539)中，10-14個(gè)殘基在KitdIg樣結(jié)構(gòu)域五個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域中是保守的(表2)。表2.對(duì)于Kit結(jié)構(gòu)域和作為典型的I-組IgSFa)的端蛋白(PDB碼=ITLK)，IgSF的20個(gè)關(guān)鍵指紋殘基位置DlD2_D3_D4D5端蛋白特征A'BlGly51Asp129Gly226Gly328Asn423Gly56GlyBlIle54Thrl32Phe229Val331Gly424Ala59脂族B3Leu56Val134Val231Leu333Leu426Phe61大疏水性B5Cys58Cys136Cys233Val335Cys428Cys63CysB7Asp60Leul38Ile235Tyr337Ala430Val65中性或疏水性C2(Phe63)Tyr146Ser244Gln346Ile438Val73疏水性C4Trp66Leu148Trp246Trp348Trp440Trp75TrpCD-(Leu156)(Leu253)Phe355-Val82大疏水性Dl-(Asp159)(Gln258)(Lys358)-His87堿性和成鹽橋D2-(Leu160)(Glu257)(Trp359)-Phe88疏水性E4Trp82Ilel70Leu275Leu377Ile478LeulOO疏水性，幾乎LeuE6Thr84Ilel72Ile277Leu379Ser480lie102疏水性EF2Ala87Val175Ala280Leu382-Val105疏水性EF6Asn91Tyrl79Asp284Glu386-Asp109AspFlGly93Leul82Gly286Gly388Gly487AlalllGly或Ala或(Asp)F3Tyr95Leu184Phe288Tyr390Val489Tyrl13TyrF5Cys97Cys186Cys290Phe392Cys491Cysl15CysG6lie107Phe204Thr303Phe405Phe504Alal28疏水性G8Val109Leu202Leu305Val407Phe506Leul30疏水性GlOVallllVal210Val307Val409-_Val132疏水性(1)20個(gè)關(guān)鍵指紋殘基的位置和各指紋殘基的特征在第一欄和最后一欄示出，其由Harpaz和Chothia,1994定義。_KitIg樣結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)的詳細(xì)分析KitDl0Dl折疊是由兩個(gè)β折疊組成的β夾心結(jié)構(gòu)。一個(gè)折疊由三條鏈Α、B和E形成，而第二個(gè)折疊由五條鏈A’、G、F、C和C，組成(ABE/A'GFCC')。第一鏈——被Pro41處的順式構(gòu)象中斷，被分成兩個(gè)較短的A和A’鏈，其分別與B和G鏈配對(duì)。連接B5的Cys58與F5的Cys97的二硫鍵橋接兩個(gè)β折疊。相對(duì)長(zhǎng)的C’鏈一其與C鏈相互作用一一使多肽鏈的C-末端朝向Dl上側(cè)，Dl被直接連接到E鏈。根據(jù)Ig樣結(jié)構(gòu)域命名法，Dl屬于IgSF的12-亞組(Casasnovas等(1998)ProcNatlAcadSciUSA95:4134-4139)。KitD2。D2由小的β折疊和第二β折疊以及在E鏈和F鏈之間的交叉處的另外的螺旋(殘基177-179)組成，所述小的β折疊由B、E和D鏈形成，而第二β折疊由A’、G、F和C鏈組成(BED/A，GFC)。盡管I-組IgSF的20個(gè)標(biāo)志殘基的11個(gè)在D2上被鑒定，但是該Ig樣結(jié)構(gòu)域在許多方面不同于標(biāo)準(zhǔn)的Il-組的IgSF。D2在C4位置具有Leu殘基，而其它Il-組的IgSF具有保守的Trp。在B鏈中氫鍵的模式被改變，原因在于兩個(gè)短β鏈(其被稱為B和B’鏈)的形成。另外的B’鏈與A鏈排成一行，從而形成具有ΑΒ’拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的短β折疊。G鏈被分成兩個(gè)短鏈一一G(底側(cè))和G’(頂側(cè))，原因在于氨基酸197-199處的插入，其導(dǎo)致與Α’鏈形成β折疊。由在G鏈中殘基197-199處的“結(jié)”所引起的氫鍵模式的破壞由在Serl97的側(cè)鏈和Cysl86的主鏈酰胺之間的氫鍵來補(bǔ)償。值得注意的是，Serl97在來自不同物種的Kit中和在其它III型RTK中作為Ser或Thr殘基是保守的。D2在橋接⑶環(huán)與F鏈的末端的Cys151和Cysl83之間包含另外的二硫鍵，以對(duì)C鏈和⑶環(huán)提供另外的穩(wěn)定性。所述另外的二硫橋可補(bǔ)償在C鏈和F鏈之間減少的氫鍵網(wǎng)絡(luò)。這兩個(gè)Cys在從斑馬魚到人的Kit中是高度保守的。KitD3。D3由屬于IgSF的II-亞組的兩組β折疊(ABED/A’GFC)組成。兩個(gè)β折疊通過在B鏈上的Cys233和F鏈上的Cys290之間的二硫鍵橋接。端蛋白(PDB碼1TLK)和D3結(jié)構(gòu)的比較顯示出對(duì)于D3的98個(gè)比對(duì)的Cα殘基的10.4的Z分?jǐn)?shù)和2.0的均方根偏差。KitD4。盡管D4缺乏在B5和F5的半胱氨酸之間的特征二硫鍵，但是D4保持了IgSF拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。此外，I-組IgSF的20個(gè)指紋殘基中的13個(gè)在D4中是保守的。通過在分別存在于B5和F5上的隱蔽脂肪族(Val335)和芳香族(Phe392)殘基——其構(gòu)成所述結(jié)構(gòu)域的疏水核心的一部分——之間的相互作用，D4的結(jié)構(gòu)完整性得以保持。使用DALI的結(jié)構(gòu)比較表明，在KitIg樣結(jié)構(gòu)域之中，D4最類似于端蛋白(以ProteinDataBank碼ITLK獲取)，對(duì)于89個(gè)比對(duì)的Cα殘基，Z分?jǐn)?shù)為11.9，而r.m.s.d.為1.5人。Val335和Phe392的Cα-Cα之間8.6A的距離是在缺乏連接Β5和F5的二硫鍵的IgSF結(jié)構(gòu)域中的相似位置之間可見的距離范圍之內(nèi)。例如，肌聯(lián)蛋白Ig樣結(jié)構(gòu)域Μ5(ProteinDataBank碼1Μ)(也缺乏二硫鍵)以2人的r.m.s.d與D4疊合，并在B5和F5位置之間具有8.9人的距離。D4由包含四個(gè)鏈的兩個(gè)β折疊組成，具有ABED/A，GFC排列。Thr321(A，鏈的第一個(gè)殘基)與高度保守的Phe405的芳環(huán)形成范德華接觸。值得注意的是，向所述結(jié)構(gòu)域的上部折疊的⑶環(huán)通過三種主要相互作用而穩(wěn)定。Thr354的側(cè)鏈與Gln347的側(cè)鏈和Trp348的主鏈羰基形成氫鍵。位于疏水核心邊緣的疏水性殘基(Trp348、Tyr350、Trp359、Val377、Leu379和Tyr390)為Phe355提供疏水環(huán)境。盡管⑶環(huán)不表現(xiàn)出顯著的序列保守性，但在所有III型家族RTK中該環(huán)都包含八個(gè)氨基酸。KitD5。D5屬于IgSF的C2和IgCAM亞組，并且在該模塊中20個(gè)指紋殘基中的10個(gè)是保守的。D5表現(xiàn)出ABED/Cre拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，在B5的Cys428和F5的Cys491之間、橋接所述兩個(gè)β折疊的二硫鍵，和橋接C鏈和⑶環(huán)的第二二硫鍵。兩個(gè)二硫鍵在所有Kit和III型RTK中都是保守的。值得注意的是，D5的上半部類似于神經(jīng)細(xì)胞粘附分子軸突蛋白-1/TAG-l(ProteinDataBank碼1CS6)的第三Ig。若干標(biāo)志可以被鑒定，盡管在端蛋白(ProteinDataBank碼1FHG)、FGFR(ProteinDataBank碼1CVS)中和在RTKMusk(ProteinDataBank碼2IEP)中程度較低。它們包括兩個(gè)Ala殘基(Ala430和Ala493)，接近于連接B5與F5的二硫鍵；在該區(qū)域內(nèi)小的側(cè)鏈的存在使得能夠在所述結(jié)構(gòu)域頂部上緊密填充。在A、B、C和G鏈中，第二標(biāo)志分別是Pro和Gly殘基Pro413、Gly432、Pro436和Gly498的環(huán)排列。第三標(biāo)志是在F9中存在Asn殘基(Asn495)，其分別與TO和BC環(huán)的Val497和Pro434的主鏈形成氫鍵。合起來，在D5頂部的這三個(gè)標(biāo)志產(chǎn)生緊密填充的結(jié)構(gòu)，類似于細(xì)胞粘附蛋白的Ig樣結(jié)構(gòu)域。實(shí)施例4=Kit單體形式中的內(nèi)部Ig樣結(jié)構(gòu)域相互作用在Kit的5個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域之間的內(nèi)部結(jié)構(gòu)域相互作用負(fù)責(zé)保持Kit胞外域單體的總體拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(圖1)。Dl相對(duì)于D2的取向由大規(guī)模的包埋的表面積(由在兩個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域之間的許多相互作用引起)確定(圖1B)。在D1-D2界面中1240人2的包埋表面積比桿樣多結(jié)構(gòu)域IgSF結(jié)構(gòu)大多數(shù)內(nèi)部Ig樣結(jié)構(gòu)域界面的包埋表面積的(Su等(1998)SCienCe281:991-995)大得多，在Kit胞外域包括三個(gè)其它內(nèi)部Ig樣界面(范圍在500和800人2之間)。該界面主要由在Dl的A’和G鏈、EF和CC’環(huán)與D2的A鏈N-末端區(qū)、B鏈C-末端、BC和DE環(huán)之間的疏水性和靜電相互作用形成(圖1B)。而且，在包括來自Dl的G鏈、連接Dl和D2的接頭區(qū)以及D2的BC環(huán)的氨基酸的D1-D2界面中的許多殘基在來自不同物種的Kit中是保守的(圖1B)。D2-D3交界面的包埋表面積是大約780人2。D2_D3界面由小的疏水性補(bǔ)丁組成，該疏水性補(bǔ)丁由兩種靜電相互作用圍繞。該界面由在D2的EF環(huán)和D3的DE環(huán)之間的相互作用和在D2-D3接頭區(qū)與D3的TO和BC環(huán)之間的相互作用形成(圖1C)。D3-D4界面的包埋表面積是大約570A2。D3和D4主要通過D3的A’和G鏈與D4的BC和DE環(huán)相互作用(圖ID)。D3-D4界面的長(zhǎng)度是大約20人，原因在于D4相對(duì)于D3以沿著兩個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)軸的119°的角度形成排列。D4-D5界面形成760人2的包埋表面積，主要由疏水性相互作用介導(dǎo)(圖1E)。所述界面由在D4的A、G和F鏈與D5的BC和DE環(huán)以及與D4-D5接頭區(qū)之間的相互作用形成(圖1E)。關(guān)于Kit單體中內(nèi)部Ig樣結(jié)構(gòu)域相互作用的逐個(gè)結(jié)構(gòu)域的詳細(xì)信息D1-D2界面。在Dl的殘基Ile47、Ile70、Leu71、Ala89、Tyrl08和PhellO與D2的Leull9、Prol37、Leul38、Prol41、Prol66和Lysl67的側(cè)鏈之間的疏水相互作用使結(jié)構(gòu)域間相互作用穩(wěn)定(圖1B)。在圍繞所述疏水性補(bǔ)丁的區(qū)域中存在兩個(gè)主要的靜電相互作用，包括在Dl的Argll2與D2的Aspl40之間的相互作用和在Dl的Asp72與D2的Argl35之間的相互作用(圖1B)。D2-D3界面。所述疏水性補(bǔ)丁由Argl77的脂肪族部分和Pro206、Phe208、Val238和Phe267的側(cè)鏈組成。所述靜電相互作用包括在D2的Glul28和Aspl29的側(cè)鏈與D3的Lys209之間的氫鍵(圖1C)。在Argl77的側(cè)鏈和Glul28的側(cè)鏈之間的鹽橋使D2中Argl77的側(cè)鏈和Pro206的側(cè)鏈以及D3中Phe267的位置穩(wěn)定，以為D2中的Argl77的側(cè)鏈的脂肪族部分產(chǎn)生疏水環(huán)境(圖1C)。第二靜電相互作用由在D2中的ArglSl側(cè)鏈與D3的Asp266的側(cè)鏈介導(dǎo)。D3-D4界面。D3-D4界面中的疏水相互作用包括在來自D3的Val308和Leu222與來自D4的Phe312、Phe340和Ile371之間的那些。比起其它內(nèi)部Ig樣結(jié)構(gòu)域界面，D3-D4界面覆蓋較小的包埋面積(圖1D)。D4-D5界面。在D4-D5界面上的疏水性補(bǔ)丁包括分別來自D4的A和G鏈的Phe324和Tyr408以及來自D5的BC環(huán)的Phe433。此外，范德華接觸有助于穩(wěn)定圍繞所述疏水性補(bǔ)丁的界面；04的？1^324、617384、11^389、17『408、4811410、11^411和]^{351與05的￥31497、Phe433、Gly470、Phe649和Lys471相互作用(圖1E)。實(shí)施例5結(jié)合的SCF-Kit復(fù)合物的總體結(jié)構(gòu)分析SCF-Kit復(fù)合物的結(jié)構(gòu)顯示出22化學(xué)計(jì)量，其中在不對(duì)稱單元中的兩組11復(fù)合物通過非結(jié)晶二重對(duì)稱而相關(guān)(圖2)。在晶格中觀察到的SCF-Kit22復(fù)合物與證明Kit二聚化由二聚的SCF配體驅(qū)動(dòng)的實(shí)驗(yàn)一致(Philo等(1996)JBiolChem2716895-6902；Lemmon^(1997)JBiolChem272:6311-6317)。兩組Kit胞外域和SCF分子類似倒置的字母“A”，具有170x130x70人的尺寸(圖2A和圖9)。與Kit結(jié)合的SCF的總體結(jié)構(gòu)類似于早先描述的游離SCF的結(jié)構(gòu)(Zhang等(2000)ProcNatlAcadSciUSA97:7732_7737Jiang等(2000)EmboJ19:3192-3203)。SCF-Kit22復(fù)合物的結(jié)構(gòu)表明單個(gè)SCF原聚體直接結(jié)合單個(gè)Kit原聚體的D1、D2和D3(圖2B)。因此，單一受體原聚體與SCF原聚體上的相似二重相關(guān)表面形成對(duì)稱復(fù)合物。Kit的二聚化也由在Kit的兩個(gè)膜近側(cè)Ig樣結(jié)構(gòu)域之間的同型相互作用，即D4-D4和D5-D5相互作用介導(dǎo)(圖2B)。這導(dǎo)致D4和D5相對(duì)于所述分子的剩余部分發(fā)生顯著構(gòu)型改變，這使得彼此相距15人之內(nèi)的C-末端接近到其中它們連接跨膜結(jié)構(gòu)域的位置(圖2B和圖9)。所述結(jié)構(gòu)的特征還在于在復(fù)合物中心處大空腔的存在，其尺寸為50x50x15人(圖2B)。所述晶體結(jié)構(gòu)證明，SCF的各原聚體專門結(jié)合單一Kit分子，并且受體二聚化由SCF二聚體驅(qū)動(dòng)，這促進(jìn)另外的受體_受體相互作用。實(shí)施例6=Kit的SCF結(jié)合區(qū)的分析SCF結(jié)合于由Kit的D1、D2和D3以以下構(gòu)型形成凹面，其中SCF的四個(gè)螺旋束垂直于D1、D2和D3的長(zhǎng)軸而取向，并且SCF和Kit的C-末端朝向相反方向(圖2、3和圖9)。包埋在Kit和各SCF原聚體之間的界面中的溶劑可及表面積是大約2060人2;在已知的配體受體界面的范圍內(nèi)的包埋表面積。將SCF-Kit界面分成三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是可能的(圖3A、B、表2和表3)。位點(diǎn)-I位于Dl上，位點(diǎn)-II位于D2和D2-D3接頭區(qū)中，而位點(diǎn)-III位于D3中。位點(diǎn)I、II和III的包埋表面積分別為大約280,770和1010人2。位點(diǎn)-ISCF的αC-β2環(huán)與Dl的C，鏈垂直排列，如圖3C所示。Dl的Asp72、Glu73和Thr74與SCF的Lys99，、serl01，和Phel02，以6_8人的Ca距離接近地定位，表明這些殘基可能參與在Dl和SCF之間的相互作用。由于aC_i32環(huán)的弱的側(cè)鏈電子密度，具體的相互作用不能被確定。位點(diǎn)-IISCF結(jié)合大部分通過在Kit上的帶電表明的互補(bǔ)靜電相互作用介導(dǎo)(圖3A、B、D)。鹽橋在Kit的堿性氨基酸Argl22、Argl81、Lys203和Arg205與在SCF上的酸性氨基酸Asp54，、Asp77，、Asp84，和Glu88，之間形成。通過在Kit的Glul98和SCF的Asp54，之間的鹽橋使Argl22的構(gòu)象穩(wěn)定。圖3D表明，在D2上三個(gè)主要相互作用殘基Tyrl25、Argl81和Lys203在同一平面上排列并與SCF的aB和aC的Asp77’、Asn81’、Asp84’、Ser53’和Thr57，形成氫鍵。在D2的Ser123和Ile201與SCF的Val50，和Thr57，之間的范德華接觸也有助于配體-受體復(fù)合物的形成。然而，在來自其它物種的Kit和SCF中位點(diǎn)-II的殘基存在顯著差異(圖3、圖8和10)。盡管ArglSl和Lys203在哺乳動(dòng)物中作為堿性氨基酸無變化，但是在小鼠和大鼠中Tyrl25由苯丙氨酸置換，這很可能產(chǎn)生氫鍵損失。Kit的Arg205是高度保守的氨基酸，而在小鼠和大鼠中Glu88’分別由亮氨酸和丙氨酸殘基置換。而且，人中的Kit的Argl22和SCF的Asp54’在小鼠和大鼠中分別由亮氨酸或纈氨酸置換。這些置換可解釋嚙齒動(dòng)物SCF對(duì)人Kit的親和性降低(Lev等(1992b)JBiolChem26715970-15977)。位點(diǎn)-IIISCF的N-末端片段與D3的D鏈相互作用(圖3A、E)。氫鍵在SCF的AsnlO’的側(cè)鏈與Ser261的主鏈酰胺和羰基以及與D3上的Asp260和Trp262的側(cè)鏈之間形成。此外，SCF的Thr9，和Asnll，分別結(jié)合Kit的Ser261的側(cè)鏈和主鏈酰胺和His263。SCF的突變分析表明AsnlO’用丙氨酸或谷氨酸殘基置換使SCF對(duì)于Kit的結(jié)合親和性降低了大約10倍，并且AsnlO，(或者在其它物種中是Asp)是生物活性所必需的(Hsu等(1998)Biochemistry37:2251-2262)。來自不同物種的SCF中受體結(jié)合界面的比較表明，AsnlO’(或Asp)是高度保守的殘基(圖8)。另外的重要相互作用通過SCF的Asn6’和Arg7’經(jīng)由與Kit的D3上的Tyr259、Thr269、Ser240、Val242、Ser241、Ser244的范德華接觸而介導(dǎo)。表3.在Kit原聚體之間的SCF-Kit相互作用和嗜同性相互作用<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table>(1)氫鍵和鹽橋和(2)范德華接觸分別具有2.5-3.5和4.0A內(nèi)的距離范圍。實(shí)施例7:Kit/SCF結(jié)構(gòu)和與結(jié)合有關(guān)的構(gòu)象變化的分析使Kit的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域準(zhǔn)備SCF結(jié)合Kit單體形式的單個(gè)D1、D2和D3的結(jié)構(gòu)與SCF-誘導(dǎo)的同型二聚體形式的相應(yīng)結(jié)構(gòu)的疊合對(duì)于在Dl、D2和D3中的82、92和100個(gè)比對(duì)的Ca殘基分別顯示出0.5、0.8和1.1人的r.m.s.d.值。類似地，Kit單體的完整D1-D2-D3區(qū)的結(jié)構(gòu)與SCF-Kit22復(fù)合物中的相應(yīng)結(jié)構(gòu)的疊合對(duì)于D1-D2-D3區(qū)的274個(gè)比對(duì)的Ca殘基顯示出1.1人的r.m.s.d.。值得注意地，在Kit的SCF結(jié)合袋的結(jié)構(gòu)中不存在顯著的主鏈變化(圖3和圖11)。然而，在SCF結(jié)合時(shí)若干微小的結(jié)構(gòu)變化在SCF結(jié)合裂縫中檢測(cè)到。在SCF結(jié)合之后，在D2的G、F和C鏈(氨基酸167-187和143-166)的上半部中觀察到結(jié)構(gòu)改變。這些鏈位于與SCF結(jié)合界面相反的一面并且不參與介導(dǎo)與SCF的任何直接接觸?？偟恼f來，Kit單體的結(jié)構(gòu)與SCF占據(jù)的Kit二聚體的結(jié)構(gòu)的比較表明Kit的D1-D2-D3區(qū)可以被視為功能單元，其準(zhǔn)備SCF結(jié)合，接下來是由二聚SCF分子驅(qū)動(dòng)的Kit二聚化。結(jié)合Kit的SCF分子的構(gòu)象變化盡管結(jié)合Kit的SCF的總體結(jié)構(gòu)類似于游離SCF的結(jié)構(gòu)，但是在兩個(gè)原聚體之間的角度、連接環(huán)的構(gòu)象和所述分子的柔性N末端的結(jié)構(gòu)方面存在顯著的差異(圖4)。公開的SCF二聚體結(jié)構(gòu)(在ProteinDataBank中的獲取碼1EXZ和1SCF)的比較表明，在游離SCF同型二聚體的兩個(gè)原聚體之間的角度(在aC螺旋之間的角度)在不同結(jié)構(gòu)中可變化2°至6°，表明某種程度的靈活性存在于SCF二聚體中。在Kit結(jié)合的SCF原聚體之間的角度與游離SCF的角度的差異范圍增加3-9°。圖4顯示出Kit結(jié)合的SCF結(jié)構(gòu)，其中在SCF原聚體之間的角度增加5°。圖4B表明，從Cys4，至Asnll，的游離SCF的N_末端具有隨機(jī)螺旋結(jié)構(gòu)(Zhang等(2000)ProcNatlAcadSciUSA97:7732-7737)。也表明，前四個(gè)氨基酸的缺失導(dǎo)致SCF對(duì)Kit的結(jié)合親和性下降大約25%，表明在Cys4’和Cys89’之間的二硫橋在維持SCF的功能完整性方面起作用(Langley等(1994)ArchBiochemBiophys311:55_61)。圖4B也表明結(jié)合Kit的SCF的N-末端區(qū)的Thr9’和AsnlO’經(jīng)歷構(gòu)象變化，其中它們的Cα位置在受體結(jié)合后移動(dòng)3至5人(圖4Β)。在N-末端的Cys4’和αC螺旋的Cys89’之間的二硫橋看起來在介導(dǎo)SCF的N-末端中發(fā)生的構(gòu)象變化中起重要作用。在游離SCF中Cys24’的位置在受體占據(jù)后不改變，如通過Ca位置的1.2人的均方根偏差(r.m.s.d.)所揭示的。最后，游離SCF的aC-β2或者被擾亂或者具有與結(jié)合Kit的SCF中的環(huán)的結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)。圖4C表明SCF的aC-β2環(huán)在受體結(jié)合后經(jīng)歷大的構(gòu)象變化，一種對(duì)于SCF-Kit界面的位置-I的建立關(guān)鍵的變化。在SCF結(jié)合的Kit中D4和D5取向的大重排1(^單體形式的單個(gè)01、02、03、04和05的結(jié)構(gòu)與SCF誘導(dǎo)的同型二聚體形式的相應(yīng)單個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域的疊合顯示出KitIg樣結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)在SCF結(jié)合之后的微小變化。相比之下，Kit單體形式的D3-D4-D5區(qū)與同型二聚體形式的相應(yīng)區(qū)域的疊合揭示出在D4和D5相對(duì)于彼此和相對(duì)于Kit的配體結(jié)合區(qū)的取向中發(fā)生大的結(jié)構(gòu)改變(圖5A和圖12)。單體Kit的各單個(gè)結(jié)構(gòu)域D3、D4和D5可以分別以對(duì)于D3、D4和D5的98、101和85個(gè)Ca原子的0.9,0.9和1.9人的r.m.s.d.值與它們?cè)赟CF-占據(jù)的Kit中的對(duì)應(yīng)物疊合。然而，Kit單體的D3結(jié)構(gòu)與在配體-占據(jù)的同型二聚體形式中的D3結(jié)構(gòu)的疊合揭示在SCF結(jié)合的Kit中D4和D5的取向中存在顯著的移動(dòng)(圖5A)。D4和D5相對(duì)于配體結(jié)合區(qū)的再取向通過沿著分別穿過D3-D4和D4-D5界面的連接D3至D4的接頭中的軸旋轉(zhuǎn)和連接D4至D5的接頭中的軸旋轉(zhuǎn)而發(fā)生(圖5A)。游離和配體結(jié)合的Kit的比較表明配體占據(jù)的Kit的D4相對(duì)于D3旋轉(zhuǎn)22人,而配體占據(jù)的Kit的D5相對(duì)于D4旋轉(zhuǎn)27人(圖5A)。D4和D5在SCF占據(jù)的Kit中的重排引起受體-受體相互作用，其通過兩個(gè)相鄰Kit分子的D4-D4和D5-D5相互作用介導(dǎo)(圖5B)。D5的DE環(huán)的構(gòu)象在SCF占據(jù)的胞外域中被改變。由受體二聚化驅(qū)動(dòng)的D4和D5重取向賦予D5的DE環(huán)新的構(gòu)型(圖5A)。在Kit同型二聚體中的D4D4相互作用在兩個(gè)相鄰Kit分子的D4之間的同型相互作用通過在SCF-KU22復(fù)合物中的D4-D4界面介導(dǎo)。D4-D4界面通過由各Kit原聚體的D4的ABED鏈形成的兩個(gè)β折疊介導(dǎo)，以形成幾乎平面的排列，其中各原聚體的Arg381指向彼此，從而產(chǎn)生360Α2的包埋表面積。圖6A表明Arg381和Glu386跨過Kit二聚體的二重軸形成鹽橋和范德華接觸。此外，各原聚體的Arg381的側(cè)鏈與相鄰Kit分子的相應(yīng)殘基的主鏈羰基形成氫鍵。基于結(jié)構(gòu)的序列分析已經(jīng)表明D4-D4界面在大多數(shù)III型RTK(包括CSF1R、PDGFRa和PDGFRβ)中是保守的(圖6Β和圖8)。在PDGFRα中，Glu386被天冬氨酸替代；一個(gè)也可以作為鹽橋伴體起作用的殘基。一對(duì)堿性(Arg381)和酸性(Glu386)殘基在不同物種的III型RTK中是嚴(yán)格保守的。在D4-D4界面中發(fā)現(xiàn)的序列基序在V型RTK(VEGFR家族)的全部成員——包括VEGFRl(Fltl)、VEGFR_2(Flkl)和VEGFR3(Flt4)——的膜近側(cè)第七Ig樣結(jié)構(gòu)域(D7)中也是保守的。在VEGFR中，堿性(Arg)和酸性(Asp)殘基位于EF環(huán)中。盡管負(fù)責(zé)III型RTKD4-D4界面的核心基序位于VEGFR的不同Ig樣結(jié)構(gòu)域(S卩，D7相對(duì)于III型的D4)，可能的是，類似于在Kit的D4-D4界面中觀察到的那些受體-受體相互作用將也在RTK的VEGFR家族的全部成員的相似的D7-D7界面(圖6A)中發(fā)生(Ruch等(2007)Nature.Struct.Mol.Biol.14:249_250)。在Kit同型二聚體中的D5-D5相互作用圖2B和圖5B、6C表明，在SCF-Kit22復(fù)合物中，相鄰D5原聚體是平行的并且彼此很接近，以及具有可能垂直于細(xì)胞膜的取向。D5的β折疊拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)采取非典型的排列，其與大多數(shù)其中A鏈分成A鏈和Α’鏈的I-組IgSF不同。D5的A鏈與B鏈配對(duì)，得到ABED/CFG的β折疊拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。因此，位于兩個(gè)β折疊(ABED/CFG)邊緣的A和G鏈幾乎平行，在Cα中彼此相距6.5-11.5人。而且，一個(gè)原聚體的A和G鏈以二重對(duì)稱面向相鄰D5的A和G鏈。兩個(gè)相鄰Kit原聚體的Asn505的側(cè)鏈彼此相距大約4.2人,但是可介導(dǎo)在兩個(gè)天冬酰胺之間的間接相互作用的水或金屬離子不能在該弱電子密度區(qū)域檢測(cè)到。通過兩個(gè)相鄰Kit分子的Tyr418介導(dǎo)另外的D5-D5相互作用(圖6C)。相鄰Tyr418側(cè)鏈的羥基之間的相互作用可以通過水分子介導(dǎo)。也表明，相鄰D5結(jié)構(gòu)域的相對(duì)位置通過相鄰原聚體的Tyr418和Asn505形成的間接相互作用介導(dǎo)。D5的G-鏈經(jīng)由短接頭連接至Kit的跨膜結(jié)構(gòu)域。實(shí)施例8受體活化的機(jī)理Kit胞外域單體和SCF誘導(dǎo)的二聚體的結(jié)構(gòu)提供了關(guān)于Kit和其它在胞外域中包含五個(gè)或七個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域的RTK的配體誘導(dǎo)活化的機(jī)理的新的觀點(diǎn)。Kit胞外域單體的D1、D2和D3的結(jié)構(gòu)與在SCF誘導(dǎo)的胞外域二聚體中的相應(yīng)區(qū)域的比較顯示，在SCF結(jié)合之后在SCF結(jié)合袋和在Dl、D2和D3的其它部分中幾乎沒有結(jié)構(gòu)改變。基于它們的不同生物化學(xué)功能，我們已經(jīng)將Kit的胞外域分成三個(gè)獨(dú)立的功能單元。第一個(gè)單元由三個(gè)膜遠(yuǎn)側(cè)Ig樣結(jié)構(gòu)域Dl、D2和D3組成。D1-D2-D3區(qū)作為單獨(dú)的模塊起作用，其用作特異性SCF結(jié)合單元。SCF結(jié)合單元通過柔性接頭(D3-D4界面)被連接至D4；D4是由另外的柔性接頭(D4-D5界面)連接至D5的第二個(gè)獨(dú)立單元，D5被定義為第三個(gè)獨(dú)立單元。D4和D5的功能是分別介導(dǎo)側(cè)面D4-D4和D5-D5相互作用，其使兩個(gè)相鄰Kit胞外域的膜近側(cè)區(qū)之間的相互作用匯合并使之穩(wěn)定。依據(jù)這種觀點(diǎn)，Kit的二聚化由二價(jià)SCF結(jié)合驅(qū)動(dòng)，該二價(jià)SCF結(jié)合的唯一功能在于結(jié)合SCF并將兩個(gè)Kit分子集合到一起。SCF誘導(dǎo)Kit二聚化之后是D4和D5取向相對(duì)于D1-D2-D3SCF-結(jié)合單元的位置發(fā)生大變化。在本文中給出的數(shù)據(jù)證明在D3-D4和D4-D5界面的柔性接頭使得能夠進(jìn)行側(cè)向相互作用，導(dǎo)致在受體二聚化之后發(fā)生大的構(gòu)象變化。二聚化可在從柔性連接的單體到剛性二聚體的過渡中選擇特定構(gòu)象，而不是誘導(dǎo)Kit發(fā)生構(gòu)象變化。這在Kit的兩個(gè)相鄰D4和兩個(gè)相鄰D5之間形成復(fù)合物時(shí)達(dá)到頂點(diǎn)，從而將D5的C-末端帶到在其中兩個(gè)相鄰Kit分子的跨膜結(jié)構(gòu)域彼此相距15人之內(nèi)的細(xì)胞膜上的一個(gè)點(diǎn)。實(shí)際上，SCF誘導(dǎo)的Kit的酪氨酸自磷酸化(圖7B)和下游信號(hào)傳導(dǎo)通路的刺激受到在Kit的D4內(nèi)Arg381或Glu386的點(diǎn)突變的強(qiáng)烈影響。PDGF-受體活化和下游信號(hào)傳導(dǎo)通路的刺激也受到PDGFR的D4中類似點(diǎn)突變的影響。本文給出的數(shù)據(jù)表明，在Kit的膜近側(cè)區(qū)之間的同型相互作用主要通過D4-D4界面介導(dǎo)，并且D5-D5界面通過促進(jìn)兩個(gè)Kit胞外域在細(xì)胞表面界面的精確定位而起協(xié)作的次要作用。SCF-Kit復(fù)合物表現(xiàn)出靜電場(chǎng)的強(qiáng)極化，具有下列特征(i)總體帶負(fù)電的表面；(ii)在SCF(負(fù))和配體結(jié)合D1-D2-D3單元(正)之間的互補(bǔ)性；和(iii)恰在D4-D4界面之上和周圍的強(qiáng)負(fù)極性表面(圖6D、3B和圖13)。該數(shù)據(jù)證明，SCF與Kit的結(jié)合以至少兩個(gè)步驟發(fā)生首先，在SCF和D1-D2-D3之間的靜電引力將沿著Kit上的相對(duì)配體結(jié)合區(qū)排列SCF。由于Steering效應(yīng)，靜電引力也可導(dǎo)致更快的SCF結(jié)合速率(Muellera等(2002)BiochinaandBiophysicaActa.1592:237_250)。接著，SCF-Kit復(fù)合物形成將通過另外的相互作用而穩(wěn)定，包括結(jié)合的SCF分子中的構(gòu)象變化介導(dǎo)的那些相互作用。在D4上的強(qiáng)極化靜電表面也可通過誘導(dǎo)在相鄰Kit受體的D4結(jié)構(gòu)域之間的排斥而將Kit保持在單體無活性結(jié)構(gòu)中發(fā)揮作用(圖6D)。相鄰受體的D4對(duì)于D4和D5對(duì)于D5的結(jié)合親和性可能太低以致不能在細(xì)胞表面上的局部受體濃度通過SCF驅(qū)動(dòng)的受體二聚化和通過維度效應(yīng)(effectofdimensionality)增加之前促進(jìn)Kit胞外域二聚化。一旦達(dá)到這樣的局部濃度閾，則在相鄰D4之間的吸引力克服靜電推斥將達(dá)到兩個(gè)相鄰D4單位能彼此結(jié)合的程度。有趣地，保持D4-D4界面的主要相互作用，即在相鄰Kit分子中的Arg381和Glu386之間的雙重鹽橋也受靜電相互作用介導(dǎo)。Kit和C-鈣粘蛋白(Boggon等(2002)Science2961308-1313)的胞外域各由五個(gè)串列的Ig樣結(jié)構(gòu)域組成并且兩者都表現(xiàn)出相似的細(xì)長(zhǎng)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)；對(duì)于Kit是170人,而對(duì)于C-鈣粘蛋白是185人。而且，細(xì)菌粘附分子侵襲素表現(xiàn)出非常相似的細(xì)長(zhǎng)構(gòu)造和內(nèi)部Ig樣結(jié)構(gòu)域拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(Hamburger等(1999)Science286:291-295)。Kit胞外域可能已經(jīng)從編碼調(diào)節(jié)細(xì)胞間相互作用的蛋白質(zhì)的共同祖先基因發(fā)生了演化。盡管傳統(tǒng)的鈣粘蛋白利用它們的最膜遠(yuǎn)側(cè)的Ig樣結(jié)構(gòu)域進(jìn)行介導(dǎo)細(xì)胞間相互作用的同型結(jié)合，但是Kit的胞外域已經(jīng)演化成起細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)受體的作用，所述細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)受體結(jié)合膜錨定的或可溶的SCF同工型以誘導(dǎo)受體二聚化和活化(圖7C)。由于Kit結(jié)構(gòu)的標(biāo)志、配體結(jié)合和受體二聚化在其它受體中是保守的，本文對(duì)于Kit活化描述的機(jī)理可以是許多受體活化的一般機(jī)理(圖7C)。而且，本文描述的結(jié)構(gòu)信息可以被用于設(shè)計(jì)新的治療干預(yù)方法，用于治療癌癥和由活化受體驅(qū)動(dòng)的其它疾病。實(shí)施例9在人類疾病中Kit突變的分析各種人類疾病由Kit基因的突變所引起。在人類中，在Kit胞外域中的失能突變導(dǎo)致花斑性狀(Fleischman等(1996)JInvestDermatol107:703_706；Murakami等(2005)JInvestDermatol.124:670-672)。Kit基因座中這些外顯子-2和外顯子-3點(diǎn)突變導(dǎo)致Cysl36被精氨酸殘基替代，而Alal78被蘇氨酸殘基替代。兩種突變都發(fā)生于D2——在Kit上的SCF結(jié)合位點(diǎn)的關(guān)鍵成分(圖7A)。花斑Cysl36Arg突變將導(dǎo)致在保持D2的結(jié)構(gòu)和功能完整性并由此保持它識(shí)別SCF的能力中發(fā)揮關(guān)鍵作用的重要二硫鍵的喪失。Alal78位于非常接近D2-D3界面的D2的EF環(huán)中(圖7A)?；ò逜lal78Thr突變可破壞對(duì)于維持D2-D3界面完整性必需的相互作用和D2和/或D3結(jié)合SCF需要的相互作用(圖7A)。在Kit基因座中的各種獲功突變被發(fā)現(xiàn)于不同的癌癥中，包括GIST、AML和SCLC(見Forbes等(2006)COSMIC2005.BRJ.CANCER,94318-22.Somaticmutationdatabase:CatalogueofSomaticMutationsinCancerhttp://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/)。在JM和在Kit的PTK結(jié)構(gòu)域中，許多致癌突變被鑒定。多種致癌突變也發(fā)現(xiàn)于Kit胞外域(圖7A)中，包括框架內(nèi)(in-frame)缺失、點(diǎn)突變、框架內(nèi)重復(fù)和插入(其共同導(dǎo)致形成Kit的活化形式)。在外顯子-8處涉及Asp419的缺失或置換的框架內(nèi)缺失和插入突變?cè)诨加蠥ML的患者中進(jìn)行了描述，而Ala502-Tyr503和Ala502-Phe506序列的重復(fù)在GIST中被鑒定(圖7A)。Asp419位于連接D5的A鏈和AB環(huán)的區(qū)域，而Ala502-Tyr503位于Kit的D5的G鏈上。有趣地是，幾乎全部發(fā)現(xiàn)于Kit胞外域的活化致癌突變被定位至D5-D5界面(圖7A)。致癌D5突變的作用方式的最合理的解釋是這些突變通過增加結(jié)合速率(on-rate)或降低了解離速率(off-rate)或以利于增強(qiáng)的D5-D5相互作用的方式改變兩個(gè)過程的速率而增強(qiáng)在相鄰D5結(jié)構(gòu)域之間的結(jié)合親和性和同型相互作用。上文的分析表明D4和D5區(qū)是治療所針對(duì)靶村的良好候選。藥物、藥劑或生物制品可用于結(jié)合Kit，以促進(jìn)Kit二聚化/活化，或更優(yōu)選阻止二聚化/活化。實(shí)施例10=Kit胞外域的表達(dá)、純化和部分去糖基化在C末端包含另外的五個(gè)組氨酸殘基的編碼人Kit的氨基酸1-519的DNA構(gòu)建體I^S^ilJpFastBacl(Invitrogen,Inc.)中。卞艮Bac—toBac(Invitrogen)中描述的方法制備表達(dá)胞外域Kit蛋白的桿狀病毒。在15L補(bǔ)充有10%熱滅活胎牛血清的Grace昆蟲培養(yǎng)基中，采用WaveBioreactor(WaveBiotech,LLC,System20/50)使昆蟲Sf9細(xì)胞生長(zhǎng)至23XIO6個(gè)細(xì)胞/ml，然后用攜帶Kit胞外域基因的重組桿狀病毒感染。盡管胞外域Kit包含來自人Kit的信號(hào)序列，所述蛋白質(zhì)在昆蟲細(xì)胞中積累，而不是被分泌出來。在72小時(shí)之后收獲細(xì)胞并在1.4升的含有200mMNaCl、10%甘油、1%NDP-40和2mMPMSF的50mM磷酸鉀緩沖液(pH8)中在冰上裂解20分鐘。在離心和過濾之后，使用采用Ni-NTA珠的親和層析，繼之以采用Superdex200的凝膠過濾來純化Kit的胞外域。在包含25mMNaCl和甘油的25mMTris緩沖液(pH8.5)中的純化的重組Kit胞外域在4°C用重組內(nèi)切糖苷酶(end0glyC0SylaSe)Fl處理12小時(shí)，重組內(nèi)切糖苷酶Fl以10lw/w的最終比率添加至Kit溶液中。然后，將核酸內(nèi)切酶Fl處理的Kit胞外域裝載在預(yù)平衡過的16/10MonoQ柱上并用包含400mMNaCl和1%甘油的窄梯度的Tris緩沖液(pH8.5)洗脫。去糖基化Kit胞外域的級(jí)分被收集并使用旋轉(zhuǎn)濃縮器濃縮至35mg/ml。純化的、部分去糖基化的Kit胞外域制劑被分成等分試驗(yàn)并在液N2中快速冷凍。使用該方法，從15升培養(yǎng)細(xì)胞中純化出IOmg的部分去糖基化的Kit胞外域。如前所述，表達(dá)、重折疊和純化SCF(1-141)(Zhang等(2000)ProcNatlAcadSciUSA97:7732-7737)。Kit的胞外域(氨基酸1-514)使用桿狀病毒系統(tǒng)在Sf9昆蟲細(xì)胞中也以分泌形式表達(dá)并如前所述進(jìn)行純化(Lemmon等(1997)JBiolChem272:6311_6317)。實(shí)施例11結(jié)構(gòu)測(cè)定和優(yōu)化使用Kit胞外域單體晶體的多波長(zhǎng)反常衍射(MAD)和多對(duì)同型置換加反常散射(MIRAS)的組合油定實(shí)驗(yàn)相。使用CNS(Brunger等(1998)ActaCrystallogrDBiolCrystallogr54:905-921)禾口SHARP(Bricogne等(2003)ActaCrystallogrDBiolCrystallogr59=2023-2030)程序包進(jìn)行重原子探測(cè)和定相。對(duì)于鉬衍生物(K2Pt(NO2)4),檢測(cè)到一個(gè)主要的位點(diǎn)和兩個(gè)次要的位點(diǎn)，而對(duì)于碘浸泡晶體，檢測(cè)到一個(gè)主要的位點(diǎn)和五個(gè)次要的位點(diǎn)。使用CNS，在三種波長(zhǎng)下，對(duì)于鉬衍生物，以高達(dá)3.3人的分辨率計(jì)算MAD相。使用CNS和SHARP，對(duì)于鉬和碘衍生物，以高達(dá)3.O人的分辨率計(jì)算MIRAS相。溶劑翻轉(zhuǎn)(flipping)密度改變導(dǎo)致具有可解釋特性的電子密度圖，其具有連續(xù)的電子密度和非常清晰的溶劑-蛋白質(zhì)邊界。弱電子密度特性的區(qū)域，包括D2中的F、G和C鏈的上半部和CD環(huán)以及D5中的CD環(huán)、D鏈、DE環(huán)和EF環(huán)和F鏈的下半部，通過比較通過MIRAS和MAD定相計(jì)算的電子密度圖加以證實(shí)。數(shù)據(jù)收集和相位統(tǒng)計(jì)在表IA和IB中概述。使用0)01\將Kit的分子模型人工構(gòu)建到實(shí)驗(yàn)電子密度圖中(Emsley和Cowtan(2004)ActaCrystallogrDBiolCrystallogr60:2126-2132)。對(duì)于自由R-因子的計(jì)算，在優(yōu)化過程中忽略5%的數(shù)據(jù)。使用CNS，針對(duì)原始數(shù)據(jù)以3.O人的分辨率進(jìn)行優(yōu)化。在所述優(yōu)化的最后階段，通過CCP4程序包的Refmac5(Murshudov等(1997)ActaCrystallogrDBiolCrystallogr53:240-255)，采用使用TLSMD網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器產(chǎn)生的三個(gè)TLS組(Painter等(2006)JApplCryst39:109-111)，進(jìn)行平移/釋放/螺旋(translation/liberation/screw,TLS)優(yōu)化。使用PHASER(McCoy等(2005)ActaCrystallogrDBiolCrystallogr61458-464)，通過分子置換解析SCF-Kit復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。使用PHASER，針對(duì)原始數(shù)據(jù)集，分別使用Kit的D1D2D3和D4以及SCF作為檢索模型，發(fā)現(xiàn)Kit胞外域的D1D2D3D4和SCF的清晰的分子置換方案。使Kit(D1D2D3D4)-SCF復(fù)合結(jié)構(gòu)進(jìn)行從20至4人的剛性體優(yōu)化，得到43.8%的Rcryst0使用CNS進(jìn)行模型重建和優(yōu)化，分別得到31.6%和34.0%的Rcryst和Rfree值在D5的區(qū)域中的連續(xù)電子密度被發(fā)現(xiàn)于2σ2Fo_Fc和3σFo-Fc圖中。使用COOT在圖中人工追蹤D5的鏈，接下來在各步驟之后進(jìn)行優(yōu)化。在整個(gè)初始優(yōu)化期間，非晶體對(duì)稱(NCS)約束被施加于所述殘基。針對(duì)原始X射線衍射數(shù)據(jù)以3.5人的分辨率進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。在基本上建立完整的SCF-Kit復(fù)合分子之后，NCS約束被去除，導(dǎo)致R和Rfree的值降低而電子密度提高。在優(yōu)化的最后階段，NCS約束被完全去除。采用PROCHECK(Laskowski等(1993)JApplCryst26:283-291)分析所述模型的立體化學(xué)。優(yōu)化統(tǒng)計(jì)的總結(jié)示于表IB中。實(shí)施例12=SCF的放射性標(biāo)記和配體置換測(cè)定使用Iodo-GenIodinationTubes(Pierce)按照制造商的說明用ImCi的125I(PerkinElmer)SEASCFaoygh對(duì)于置換結(jié)合分析，表達(dá)WTKit或Kit突變體的3T3細(xì)胞在包含10%FCS的DMEM中生長(zhǎng)。用包含IOmMHEPES(pH7.4)和0.BSA的DMEM(DMEM-BSA)洗滌細(xì)胞三次，然后在室溫下與2ng的125I-標(biāo)記-SCF在濃度增加的天然SCF存在的情況下溫育1小時(shí)。然后，細(xì)胞用冷DMEM-BSA洗滌三次，在室溫下在0.5ml的0.5MNaOH中裂解1小時(shí)，并將100μ1的細(xì)胞溶解產(chǎn)物用于IOml的Opti-Fluor閃爍液(PerkinElmer)，以使用LS6500閃爍計(jì)數(shù)器(BeckmanCoulter)測(cè)量與細(xì)胞相關(guān)的放射性。實(shí)施例13保守性分析人SCF和Kit的氨基酸序列被用作查詢序列，以使用PSI-BLAST(Altschul等(1990)JMolBiol215403-410)搜索非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)(nr)的同源序列。使用Clustalff(Higgins(1994)MethodsMolBiol25:307_318)對(duì)SCF序列或Kit序列進(jìn)行序列對(duì)比，然后基于IgSF折疊約束對(duì)KitIg樣結(jié)構(gòu)域中的20個(gè)關(guān)鍵殘基進(jìn)行人工調(diào)節(jié)。通過SCF-Kit復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)所揭示的氨基酸序列的比對(duì)被提交到Consurf3.O服務(wù)器(Landau等(2005)NucleicAcidsRes33:W299-302)以對(duì)于所述比對(duì)的各個(gè)位置產(chǎn)生最大似然性歸一化進(jìn)化率，其中低發(fā)散率對(duì)應(yīng)于高序列保守性。對(duì)于Consurf輸出，連續(xù)保守性得分被分配入9個(gè)箱元(bin)的離散標(biāo)度中以用于可視化，使得箱元9包含最保守的(栗色)位置，而箱元1包含變化最大的(青色)位置。實(shí)施例14蛋白質(zhì)表達(dá)、純化和抗體的產(chǎn)生使用PCR反應(yīng)，從全長(zhǎng)人Kit的cDNA擴(kuò)增編碼人Kit的第四Ig樣結(jié)構(gòu)域(殘基309-413；KitD4)的DNA。BL21(DE3)大腸桿菌密碼子Plus細(xì)胞用指導(dǎo)KitD4合成的細(xì)菌表達(dá)載體(pET-NusA組氨酸標(biāo)記的)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，接下來在16°C培養(yǎng)過夜。使用金屬螯合親和柱(Ni-NTA；QIAGEN)從BL21溶解產(chǎn)物純化KitD4_NusA融合蛋白，接下來使用陰離子交換色譜(SourceQ柱；GEHealthcare)進(jìn)一步純化。然后，在4°C使D4_NusA與TEV蛋白酶溫育過夜，以從D4切割NusA和組氨酸標(biāo)簽。使用凝膠過濾色譜法(Superdex200柱；GEHealthcare)進(jìn)行額外的KitD4純化步驟。人Kit的第五Ig樣結(jié)構(gòu)域(殘基410-519；KitD5)在大腸桿菌BL21菌株(DE3)細(xì)胞中表達(dá)并利用使用包含6.OM鹽酸胍的IOmMTris緩沖液(pH8.0)的再折疊步驟從細(xì)菌包涵體純化。使用陰離子交換色譜(Q瓊脂糖柱；GEHealthcare)并接下來使用凝膠過濾色譜法(Superdex200柱；GEHealthcare)進(jìn)行的純化以及使用陰離子交換色譜的另外的純化步驟，進(jìn)一步純化再折疊KitD5。使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，例如在實(shí)施例1中描述的方法，產(chǎn)生抗分離的D4、D5或抗完整Kit胞外域(氨基酸1-519;KitEC)或抗包含來自人Kit的C-末端區(qū)域的片段(殘基876-976)的GST-融合蛋白的兔多克隆抗體。例如，抗Kit胞外域的多克隆抗體可以通過用純化的Kit胞外域免疫兔子并通過標(biāo)準(zhǔn)方法收集所產(chǎn)生的抗體而產(chǎn)生。使用經(jīng)A蛋白親和層析純化的抗體制劑，進(jìn)行其中抗體對(duì)Kit活化的效應(yīng)被測(cè)試的實(shí)驗(yàn)，例如實(shí)施例15和圖14中的實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例15使用針對(duì)Kit的D5結(jié)構(gòu)域的抗體抑制SCF-誘導(dǎo)的Kit活化表達(dá)人Kit的3T3細(xì)胞與包含增加濃度的針對(duì)分離的重組Kit的D5產(chǎn)生的多克隆兔抗體一起溫育(圖14)。作為對(duì)照，細(xì)胞用針對(duì)SCF的兔多克隆抗體或針對(duì)完整Kit胞外域的兔多克隆抗體處理，所述完整Kit胞外域在使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生。采用抗Kit抗體使細(xì)胞溶解產(chǎn)物進(jìn)行免疫沉淀，接下來進(jìn)行SDS-PAGE并用抗Kit抗體或抗P-Tyr抗體進(jìn)行免疫印跡(圖14)。該實(shí)驗(yàn)表明抗D5抗體阻斷Kit的SCF誘導(dǎo)的酪氨酸自磷酸化。實(shí)施例16通過分離的重組KitD4結(jié)構(gòu)域抑制SCF-誘導(dǎo)的Kit活化表達(dá)Kit的3T3細(xì)胞與增加濃度的、在大腸桿菌中表達(dá)的純化重組D4在23°C溫育10分鐘，接著進(jìn)行SCF溫育。采用抗Kit抗體對(duì)未刺激或刺激的細(xì)胞的溶解產(chǎn)物進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)，接下來進(jìn)行SDS-PAGE并用抗Kit抗體或抗p-Tyr抗體進(jìn)行免疫印跡(圖15)。該實(shí)驗(yàn)表明分離的D4的存在干擾Kit的SCF誘導(dǎo)的酪氨酸自磷酸化。實(shí)施例17=SCF誘導(dǎo)的Kit刺激實(shí)驗(yàn)在包含10%小牛血清的DMEM中培養(yǎng)表達(dá)人Kit的3T3細(xì)胞。在SCF刺激前，如Yuzawaetal(2007)Cell，130:323所述在無血清培養(yǎng)基中使細(xì)胞饑餓過夜。用包含IOmM的HEPES(pH7.4)和0.BSA的冷DMEM洗滌饑餓細(xì)胞三次，接下來與增加濃度的抗體或與Kit-D4在23°C溫育10分鐘，如在圖14或圖15中所示。細(xì)胞用lOOng/mlSCF在23°C刺激10分鐘，并用冷PBS洗滌三次。采用抗Kit抗體，使未刺激或SCF刺激的細(xì)胞的溶解產(chǎn)物發(fā)生免疫沉淀，接下來進(jìn)行SDS-PAGE并用抗Kit抗體或抗p-Tyr抗體進(jìn)行免疫印跡。實(shí)施例18在PDGFRβ的D4中關(guān)鍵氨基酸的點(diǎn)突變阻止PDGF誘導(dǎo)的PDGF受體β的活化和經(jīng)由PDGFRii的信號(hào)傳導(dǎo)來源于表達(dá)WTPDGFRii或在D4中關(guān)鍵氨基酸的點(diǎn)突變體(基于在Kit胞外域X射線晶體結(jié)構(gòu)中與D4-D4界面的序列相似性)的PDGFR-/-小鼠的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)被用來證明，R385或E390的突變阻止PDGF誘導(dǎo)的受體活化(圖16A)、或者PDGF-誘導(dǎo)的MAP激酶應(yīng)答和Akt刺激(圖16B)。而且，使用采用共價(jià)交聯(lián)劑的交聯(lián)實(shí)驗(yàn)，我們證明，E390A點(diǎn)突變不干擾PDGF誘導(dǎo)的受體二聚化。然而，與以活化狀態(tài)存在于細(xì)胞表面的WTPDGFRii共價(jià)交聯(lián)的二聚體不同，E390A突變體的共價(jià)交聯(lián)的二聚體是無活性的(圖16C)。該實(shí)驗(yàn)表明在D4中的關(guān)鍵E390殘基的突變阻止對(duì)于PDGFR活化必需的D4-D4相互作用。然而，PDGF誘導(dǎo)的PDGFR二聚化不受阻止受體活化的D4中的點(diǎn)突變影響，表明D4-D4在介導(dǎo)胞外域的膜近側(cè)區(qū)的定位以能夠活化PDGFR的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域中起重要作用。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式包括結(jié)合或靶向PDGFR中的殘基R385或E390的成分。所述成分可用于滅活所述受體，而保持受體二聚化。本實(shí)施例也表明，基于一個(gè)RTK的晶體結(jié)構(gòu)(在該情況下是Kit胞外域晶體結(jié)構(gòu))的信息可以被容易地轉(zhuǎn)移到其它RTK。這里，在鑒定對(duì)于PDGF受體的活化而言重要的氨基酸方面，關(guān)于KitD4的認(rèn)識(shí)是正確的。一組涉及PDGFR的更詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)被描述于實(shí)施例22-25中。實(shí)施例19=Kit胞外域的分子表面分析在本文描述的SCF結(jié)合之前和之后測(cè)定Kit的完整胞外域的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)表明，SCF誘導(dǎo)的受體二聚化之后是在兩個(gè)相鄰Kit分子的膜近側(cè)Ig樣結(jié)構(gòu)域D4和D5之間的同型側(cè)向相互作用。同型D4和D5相互作用使得兩個(gè)相鄰受體的胞質(zhì)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域以能夠進(jìn)行酪氨酸自磷酸化和激酶活化的距離和取向進(jìn)行定位。在本文也已證明，對(duì)于D4同型相互作用關(guān)鍵的單一氨基酸殘基的突變影響SCF誘導(dǎo)的Kit活化和PDGF誘導(dǎo)的PDGF受體活化(參見實(shí)施例22-25)。在本文描述的結(jié)構(gòu)分析提供了關(guān)于如何設(shè)計(jì)抑制性成分(諸如結(jié)合由RTK胞外域(例如D3、D4或D5區(qū)域)形成的空腔的淺區(qū)域中的構(gòu)象表位或非連續(xù)表位的單克隆抗體或結(jié)合Kit和其它類型RTK的胞外域的D3-D4和D4-D5絞鏈區(qū)的小分子抑制劑)的新的見解。在所述胞外域中四個(gè)區(qū)域最初被定靶(A)可以產(chǎn)生結(jié)合D3-D4絞鏈區(qū)并作為分子楔起作用的本發(fā)明的成分，所述分子楔阻止膜近側(cè)區(qū)以能夠活化酪氨酸激酶的距離和取向進(jìn)行定位所需的運(yùn)動(dòng)(參見圖17)；(B)可以產(chǎn)生結(jié)合D4-D5絞鏈區(qū)并作為分子楔起作用的成分，所述分子楔阻止膜近側(cè)區(qū)以能夠活化酪氨酸激酶的距離和取向進(jìn)行定位所需的運(yùn)動(dòng)(參見圖18)；(C)可以產(chǎn)生結(jié)合D4D4界面而阻止同型D4受體相互作用的成分(參見圖19)；(D)可以產(chǎn)生結(jié)合D2-D3絞鏈區(qū)處的凹面而導(dǎo)致配體-受體相互作用不穩(wěn)定的成分(參見圖20)；和(E)可以產(chǎn)生結(jié)合在Kit表面上的形成各種連續(xù)和非連續(xù)表位的肽區(qū)域(表5)的成分。使用ComputedAtlasofSurfaceTopographyofproteins(CASTp)月艮務(wù)器分析Kit胞外域和SCF-Kit復(fù)合物(PDB碼2EC8和2E9W)的分子表面，以提供與在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)上的凹面區(qū)域的位置有關(guān)的信息，并使得能夠描繪和測(cè)量蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)上的凹面區(qū)域(Dundas等，(2006)NuclAcidsRes，34:W116_W118)。使用Pymol可視化并檢查所鑒定的空腔(DeLano.(2002)DeLanoScientific,SanCarlos,CA,USA)。(A)在D3-D4絞鏈區(qū)中的空腔(圖17)若干空腔分散在胞外域單體結(jié)構(gòu)中的D3-D4界面上。參與界定所述空腔的氨基酸在表4中概述。在兩個(gè)Kit受體之間形成同型相互作用時(shí)，D3-D4絞鏈區(qū)被改變，導(dǎo)致形成由下列殘基產(chǎn)生的淺的空腔來自D3的K218、S220、Y221、L222和來自D4的F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、1371、Y373。圖17顯示了未被占據(jù)的單體(圖17A)和SCF結(jié)合的二聚體(圖17B)D3-D4絞鏈區(qū)的帶狀柵圖以及D3-D4口袋的網(wǎng)格表示。(B)在D4-D5絞鏈區(qū)中的空腔(圖18)通過Kit單體中D4的AB環(huán)和EF環(huán)、D4-D5連接接頭和D5的DE環(huán)和!7G環(huán)的部分形成小空腔。界定上述空腔的殘基在表4中概述。所述空腔的形狀和大小在Kit胞外域二聚結(jié)構(gòu)中被改變。由D4的EF環(huán)和G鏈、D4-D5接頭和D5的B鏈和DE環(huán)形成的主要空腔位于D4的EF環(huán)之下，一個(gè)對(duì)于D4同型界面的形成很關(guān)鍵的區(qū)域。注意，位置靠近所述空腔的D5的DE環(huán)可具有較高的靈活性，如通過來自非結(jié)合的和占據(jù)的Kit結(jié)構(gòu)兩者的較低電子密度特性所揭示的。圖18顯示了未被占據(jù)的單體(圖18A)和SCF二聚體(圖18B)的帶狀柵圖以及在D4-D5絞鏈區(qū)周圍的淺空腔的網(wǎng)格表示。(C)在介導(dǎo)D4同型相互作用的區(qū)域中的空腔由KitD4的⑶環(huán)和EF環(huán)形成的凹面正好位于D4同型界面的上方。來自D4的殘基Y350、R353、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386和T390為胞外域二聚結(jié)構(gòu)中的凹面提供了大約130A2的表面積。在D4同型界面中起重要作用的Glu386的側(cè)鏈伸向所述表面的中心。所述凹面的特征是由帶電殘基(Glu386和Lys358)圍繞的小的疏水性補(bǔ)丁。在同型D4D4相互作用時(shí)所述表面的尺寸和可及性被改變，使得變化發(fā)生在CD環(huán)的構(gòu)象中，其變成向著所述結(jié)構(gòu)域頂部向上折疊。參與凹面形成的殘基在表4中概述。圖19A描繪了覆蓋在配體占據(jù)的KitD4(未示出)之上的Kit的未被占據(jù)的D4結(jié)構(gòu)域(金色)的帶狀柵圖，其中在配體占據(jù)的(綠色)和未被占據(jù)的胞外域結(jié)構(gòu)(紅色)之間CD和EF環(huán)的構(gòu)象不同。用于D4D4相互作用的關(guān)鍵殘基以棍型形式示出。圖19B和19C示出了未被占據(jù)的Kit(圖19B)和SCF占據(jù)的Kit結(jié)構(gòu)(圖19C)的帶狀柵圖以及D4同型界面之上的淺空腔的網(wǎng)格表示。(D)配體結(jié)合D2和D3區(qū)域的凹面淺的凹面位于D2和D3結(jié)構(gòu)域的一部分配體結(jié)合表面上。包括在小口袋中的殘基是來自Kit的D2結(jié)構(gòu)域的Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206和F208,以及來自D3結(jié)構(gòu)域的V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268和Y269。通過由親水性殘基圍繞的小的疏水性補(bǔ)丁產(chǎn)生所述口袋。在未被占據(jù)的和SCF占據(jù)的Kit結(jié)構(gòu)之間沒有大的改變，其中總包埋表面積為大約500A2。圖20A和20B顯示了未被占據(jù)的Kit(A)和SCF結(jié)合的Kit(B)的帶狀柵圖以及D2-D3口袋的網(wǎng)格表示。表4游離Kit<table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table>(E)如上所述進(jìn)行kit酪氨酸激酶的結(jié)構(gòu)分析。所述分析顯示出可以是本發(fā)明的成分的靶標(biāo)的連續(xù)和非連續(xù)表位。在表5中，表位1、4、5、6、8、12-16、19、22_23和31-39是連續(xù)表位。這些表位由KIT蛋白質(zhì)中的連續(xù)氨基酸組成。表5中的表位2、3、7、9-11、17、18、20,21,24-30和40-43是非連續(xù)構(gòu)象表位，其由通過KIT蛋白質(zhì)的折疊而使其接近的KIT蛋白質(zhì)的至少2個(gè)肽組成。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table>實(shí)施例20=RTK活性測(cè)定使包含目標(biāo)RTK的細(xì)胞暴露于所述受體的活化配體和本發(fā)明的成分。通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法(例如抗體純化)可以分離目標(biāo)RTK。在純化之后，結(jié)合RTK的抗體(不是本發(fā)明的成分，而僅僅是結(jié)構(gòu)結(jié)合物，如用于純化)被預(yù)包被在96孔微量滴定板上。然后，將RTK和校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物添加至RTK蛋白質(zhì)被捕獲的單獨(dú)的孔中。接下來添加檢測(cè)抗體，其可以是磷酸位點(diǎn)特異性的(例如c-KitpY823或在活化時(shí)被磷酸化的Kit的其它殘基；phosphoELISA系統(tǒng)使用兔抗體)。使用被結(jié)合到標(biāo)記或酶(例如辣根過氧化酶被用于phosphoELISA系統(tǒng))的二抗(例如抗兔Ab，以檢測(cè)兔來源的一抗)，之后使用比色底物檢測(cè)抗體-Kit復(fù)合物。然后，添加終止溶液，并對(duì)所述板進(jìn)行讀數(shù)(例如使用450nm光源和檢測(cè)器)。phosphoELISA的詳細(xì)方案可從Invitrogen獲得(invitrogen.com/content,cfm？pageid=11655；invitrogen.com/downloads/F1027_BN_pELISA1006.pdf；invitrogen.com/downloads/F1028_BN_pELISA1006.pdfC-KIT[pY823]ELISAKIT,HU(BioSource)CatalogNumber-KH00401；c-KIT[TOTAL]ELISAKIT,HU(BioSource)CatalogNumber-KH00391)。實(shí)施例21受體內(nèi)化作用測(cè)定表達(dá)目標(biāo)RTK的細(xì)胞首先與適當(dāng)?shù)呐潴w一起溫育(例如表達(dá)Kit的細(xì)胞與SCF—起溫育)，從而誘導(dǎo)受體內(nèi)化作用。通過在冷PBS中洗滌細(xì)胞終止受體內(nèi)化過程。然后，通過在具有足以解離所述配體鹽濃度和/或PH水平的溶液中洗滌所述細(xì)胞除去殘留的表面結(jié)合的配體。然后，將細(xì)胞重懸于適當(dāng)?shù)木彌_液中。此時(shí)，所述細(xì)胞將包含內(nèi)化的受體，因此較少量的受體仍保持在細(xì)胞表面上。進(jìn)行另一組相似的實(shí)驗(yàn)，其中所述細(xì)胞暴露于適當(dāng)?shù)呐潴w和本發(fā)明的測(cè)試成分。如果所述測(cè)試成分阻止靶RTK的活化，則受體內(nèi)化作用將被抑制。當(dāng)相比于上述實(shí)驗(yàn)中描述的細(xì)胞(其中受體活化發(fā)生)時(shí)，這些細(xì)胞顯示出降低的內(nèi)化作用和在細(xì)胞表面上更大量的受體。也設(shè)立對(duì)照組，其中細(xì)胞僅僅用緩沖液或乙醇溶液——一種藥物溶解的常見載體——處理。在上述實(shí)驗(yàn)中在細(xì)胞表面上的受體的量的測(cè)定可以通過使所述細(xì)胞與對(duì)所述受體具有特異性的小鼠抗體一起溫育，接下來與結(jié)合于熒光團(tuán)諸如綠色熒光蛋白(GFP)的抗小鼠抗體一起溫育而實(shí)現(xiàn)。然后，熒光顯微術(shù)可用來顯像和對(duì)細(xì)胞表面上的受體進(jìn)行定量。細(xì)胞表面受體的定量或顯像的可選技術(shù)在本領(lǐng)域中是熟知的，并包括各種熒光和放射性技術(shù)。例如，一種方法包括使細(xì)胞與放射性標(biāo)記的抗受體抗體一起溫育?？蛇x地，所述受體的天然配體可以被結(jié)合于熒光分子或放射性標(biāo)記并與所述細(xì)胞一起溫育。另外的受體內(nèi)化作用測(cè)定方法是本領(lǐng)域熟知的并描述于例如Jim6neZ等(1999)BiochemicalPharmacology.57(10)1125-1131；Bernhagen等(2007)NatureMedicine.13(5)587-596；和Conway等(2001)J.CellPhysiol.189(3):341_55，其中每一個(gè)文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容通過引用的方式并入本文。實(shí)施例22-25的介紹受體酪氨酸激酶(RTK)活化的一般公認(rèn)機(jī)理是，配體誘導(dǎo)的受體二聚化促進(jìn)在催化核心的活化環(huán)中關(guān)鍵調(diào)節(jié)性酪氨酸殘基的反式自磷酸化；這是一個(gè)對(duì)于酪氨酸激酶活化必需的步驟。這之后進(jìn)行所述胞質(zhì)域中的多個(gè)酪氨酸殘基的自磷酸化，所述多個(gè)酪氨酸殘基充當(dāng)各種信號(hào)傳導(dǎo)蛋白質(zhì)的SH2(Src同源物2)或PTB(磷酸酪氨酸結(jié)合)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合位點(diǎn)，所述信號(hào)傳導(dǎo)蛋白質(zhì)在募集和/或酪氨酸磷酸化時(shí)以受控方式發(fā)送信號(hào)至各種胞內(nèi)區(qū)室(Schlessinger,J.(2000)Cell103,211-225；Pawson,Τ.&Nash,P.(2003)Science300,445-452；和Hunter,Τ·(2000)Cell100，113-127)。盡管全部RTK都通過二聚化而活化，但不同的RTK家族已經(jīng)進(jìn)化成利用不同的分子策略來進(jìn)行配體誘導(dǎo)的受體二聚化和活化(Burgess，A.W.等(2003)MolCell12，541-552；Schlessinger,J.等(2000)MolecularCell6，743-750)。III型RTK(包括PDGF、SCF,CSF和Flt3L)的全部配體是能夠通過二價(jià)結(jié)合于兩個(gè)相鄰受體分子的等同位置而交聯(lián)它們的同族受體的二聚分子。PDGF原聚體由中央的四鏈折疊組成，其在分子的一端具有特征性的半胱氨酸結(jié)。兩個(gè)PDGF原聚體以反平行的方式排列并且通過兩個(gè)鏈間二硫橋彼此連接(Oefner，C.等(1992)EMBOJ.11，3921-3926.)。相反，各SCF、CSF或Flt3L原聚體由短螺線折疊組成并且通過非共價(jià)相互作用彼此連接(Jiang，X.等(2000)EmboJ19,3192-3203；Zhang,Ζ.等(2000)ProcNatlAcadSciUSA97,7732-7737；Pandit,J.等(1992)Science258，1358-62；和Savvides，S.N.等(2000)NatStructMolBiol7，486-491)。盡管它們的多樣性折疊，這兩種生長(zhǎng)因子亞型結(jié)合并以基本上相同的方式激活它們的同族RTK，導(dǎo)致活化配體/RTK22復(fù)合物的形成(Savvides,S.N.等(2000)NatStructMolBiol7,486-491)0所有III型RTK由細(xì)胞外配體結(jié)合區(qū)和胞質(zhì)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域組成，所述細(xì)胞外配體結(jié)合區(qū)包含五個(gè)串聯(lián)Ig樣結(jié)構(gòu)域，繼之以單個(gè)跨膜螺旋，而所述胞質(zhì)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域具有與發(fā)生自磷酸化和通過異源蛋白質(zhì)激酶的磷酸化的調(diào)節(jié)區(qū)側(cè)鄰的大的激酶插入?yún)^(qū)域(Hubbard，S.R.(1999)ProgBiophysMolBiol71,343-358)通過分析基于相關(guān)受體酪氨酸激酶Kit的細(xì)胞外區(qū)域的晶體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的突變體受體的性質(zhì)探索PDGF受體β(PDGFRii)活化的機(jī)理?；谶@些實(shí)驗(yàn)，證明了在D4(細(xì)胞外區(qū)的第四Ig樣結(jié)構(gòu)域)中々印385或6111390突變的？061^的PDGF誘導(dǎo)型活化受到影響，導(dǎo)致各種PDGF誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答受損。這些實(shí)驗(yàn)也表明，同型D4相互作用(其可能通過在Arg385和Glu390之間的鹽橋介導(dǎo))在PDGFR^和全部III型RTK的活化中起重要作用?；瘜W(xué)交聯(lián)劑也被用于共價(jià)交聯(lián)PDGF-刺激的細(xì)胞，以證明PDGFRii的Glu390Ala突變體經(jīng)歷典型的PDGF誘導(dǎo)的受體二聚化。然而，與在配體刺激的細(xì)胞的表面上表達(dá)的以活化態(tài)的WTPDGFR不同，PDGF誘導(dǎo)的Glu390Ala二聚體是無活性的。盡管介導(dǎo)D4同型相互作用所需的保守氨基酸對(duì)于PDGFRii活化(以及III型RTK中的相似相互作用)是關(guān)鍵的，但是這些相互作用對(duì)于PDGFRii二聚化不是必要的。而且，PDGFRii二聚化對(duì)于酪氨酸激酶活化是必需的，但不足以活化酪氨酸激酶。類似于Kit的D4結(jié)構(gòu)域，PDGFRα和PDGFRβ的D4結(jié)構(gòu)域缺乏橋接位于Ig樣結(jié)構(gòu)域的Β5和F5中的半胱氨酸殘基的特征性二硫鍵。在圖21中給出的氨基酸序列比對(duì)表明，I組IgSF折疊的20個(gè)指紋殘基中的13個(gè)在PDGFR的D4結(jié)構(gòu)域中是保守的，并且相應(yīng)于指紋殘基的鏈的編號(hào)和長(zhǎng)度在Kit、PDGFRα、PDGFRβ和CSFlR的D4結(jié)構(gòu)域中是高度保守的。這表明，本發(fā)明的抑制劑可以被設(shè)計(jì)來抑制包括全部III型RTK的各種受體分子。Kit的D4結(jié)構(gòu)域由兩個(gè)β折疊組成，各包含具有ABED/A，GFC排列的四個(gè)鏈，并且同型D4接觸通過從兩個(gè)相鄰Kit分子伸出的D4的EF環(huán)介導(dǎo)。在本文披露的Kit結(jié)構(gòu)表明，EF環(huán)中的Arg381和Glu386跨過Kit二聚體的二重軸形成鹽橋和范德華接觸。此外，各原聚體的Arg381的側(cè)鏈與相鄰Kit分子的相應(yīng)殘基的主鏈羰基形成氫鍵。基于結(jié)構(gòu)的序列對(duì)比已經(jīng)表明，EF環(huán)的尺寸和D4-D4界面包含的關(guān)鍵氨基酸在Kit、PDGFRa、PDGFR3和CSF1R中是保守的。在PDGFRa中，Glu386被天冬氨酸替代，這是也可起鹽橋伴體作用的殘基。此外，一對(duì)堿性和酸性(Glu/Asp)殘基在從紅鰭東方飩(Takifugurubripes)到人的不同物種的PDGFRa和PDGFR0中是嚴(yán)格保守的(圖21)，從而為該區(qū)域的功能重要性提供了進(jìn)一步的支持。如此，靶向于具有不同氨基酸序列的RTK(例如III型RTK)或靶向于在本文描述的那些具有相似功能的變體結(jié)構(gòu)域的本發(fā)明的成分也屬于本發(fā)明的范圍。與實(shí)施例22-25相關(guān)的方法序列對(duì)比和同源件津模使用C0NSEQ服務(wù)器(Berezin,C.等(2004)Bioinformatics20,1322-1324)以及根據(jù)IgSF折疊特征(Harpaz，Y.&Chothia，C.(1994)JournalofMolecularBiology238,528-539)和根據(jù)人Kit結(jié)構(gòu)的D4的Ig折疊的核心殘基(Yuzawa,S.等(2007)Cell130,323-334)進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)。各序列的獲取碼是PDGFRa人(P16234)、小鼠(P26618)、雞(Q9PUF6)、蛙(P26619)和河豚(Q8AXC7)；PDGFR^人(P09619)、狗(Q6QNF3)、小鼠(P05622)、河豚(P79749)和Kit人(Q96RW7)。使用WHATIF服務(wù)器(Rodriguez,R.等(1998)Bioinformatics14,523-528)基于D4Kit結(jié)構(gòu)(PDB碼2E9W)產(chǎn)生PDGFR3的D4的同源性模型。使用PyMOL(Delano，W.L.；pymol.org)制圖。試劑和抗體從Sigma購(gòu)買L_組氨醇和抗標(biāo)記抗體。抗MAPK、磷酸_MAPK、Akt、磷酸_Akt和磷脂酶CY的抗體購(gòu)自CellSignalingTechnology。抗磷酸酪氨酸(4G10)抗體來自于UpstateTechnology?？狗核乜贵w(P4D1)來自SantaCruze?？筆DGFR0的抗體通過用來自PDGFR3的胞質(zhì)域的合成肽免疫兔子而產(chǎn)生。PDGFBBcDNA獲自StuartAaronson。PDGFBB購(gòu)自Invitrogen，以及如原先所描述的在細(xì)菌中產(chǎn)生(Hoppe，J.等(1990)EuropeanJournalofBiochemistry187,207-214)。125I放射性核素購(gòu)自PerkinElmer。Bo1ton-Hunter試劑和I0D0-GEN預(yù)包被碘化管來自Piece。FITC-鬼筆環(huán)肽購(gòu)自Invitrogen。細(xì)胞系和逆轉(zhuǎn)錄病毒感染來源于PDGFRa和PDGFR3缺陷(PDGFRa/日)的小鼠胚的成纖維細(xì)胞由PhilipSariano和AndriusKazlauskas提供。PDGFR3cDNA由DanielDeMaio提供。PDGFR3cDNA被亞克隆到pLXSHD逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，且標(biāo)記-標(biāo)簽被添加至所述受體的C-末端。根據(jù)生產(chǎn)商的說明(Stratagen)，通過定點(diǎn)誘變產(chǎn)生在D4中的所有突變體。編碼WT和突變體PDGFR旦的逆轉(zhuǎn)錄病毒在293GPG細(xì)胞中產(chǎn)生(0ry，D.S.等(1996)Proc.Nat.Acad.Sci.93,11400-11406)。感染之后，用L-組氨醇選擇細(xì)胞，并且所選擇細(xì)胞的集合被用于實(shí)驗(yàn)。免疫沉淀和免疫印跡在包含50mMHepesU50mMNaClUmMEDTA、1%TritonX_100、25mM氟化鈉、ImM原釩酸鹽、ImM苯基-甲磺酰氟、5iig的抑肽酶和亮抑酶肽的緩沖液(pH7.5)中裂解未刺激的或PDGF刺激的細(xì)胞。用所示的抗體免疫沉淀等量的細(xì)胞溶解產(chǎn)物，通過SDS-PAGE解析免疫沉淀物并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜。膜用不同的抗體進(jìn)行免疫印跡。使用光密度計(jì)(Amersham)掃描月莫并用Imagequant軟^[牛(Moleculardynamics)iHtf定量。PDGFR的體外磷酸化測(cè)定使細(xì)胞進(jìn)行血清饑餓16小時(shí)，并在包含150mMNaCl,50mMHepes(pH7.4)、lmMEDTA、25mMNaF、0.ImM原釩酸鈉、5iig/ml亮抑酶肽和抑肽酶、ImMPMSF和1%NP40的裂解緩沖液中溶解。溶解產(chǎn)物用抗PDGFR0抗體進(jìn)行免疫沉淀，而免疫沉淀物在包含50mMHepes(pH7.4)、ImMATP和lOmMMgCl2的反應(yīng)緩沖液中在室溫下溫育5分鐘。在溫育之后，通過SDS-PAGE分析沉淀物，繼之以采用抗磷酸酪氨酸抗體的免疫印跡分析。剝?nèi)ツ?，用抗?biāo)記標(biāo)簽抗體進(jìn)行再印跡分析以測(cè)定總PDGFR0水平。警體二聚體的化學(xué)交聯(lián)在150mm板中生長(zhǎng)細(xì)胞直到達(dá)到80%匯合，并且在與所示濃度的PDGF在包含50mMHepes(pH7)的DMEM中在4°C溫育之前，使細(xì)胞血清饑餓16小時(shí)。在90分鐘之后，用PBS(pH7.4)徹底洗滌細(xì)胞。板被轉(zhuǎn)移到室溫下并且辛二酸二琥珀酰亞胺酯(DSS)被添加至0.5mM的終濃度。在30分鐘之后通過與10mMTris緩沖液溫育15分鐘淬滅交聯(lián)反應(yīng)，繼之以深度的PBS洗滌火。在50mMH印es、150mMNaCl、lmMEDTAU%TritonX_100、25mM氟化鈉、ImM原釩酸鈉、ImM苯基甲磺酰氟、5yg/ml抑肽酶和5ug/ml亮抑酶肽(pH7.4)中的細(xì)胞溶解產(chǎn)物用抗PDGFR抗體進(jìn)行免疫沉淀，并通過SDS-PAGE解析。硝酸纖維素膜用針對(duì)標(biāo)記-標(biāo)簽的抗體或抗磷酸酪氨酸(4G10)抗體進(jìn)行免疫印跡，以分別檢測(cè)總受體和磷酸化受體的水平。PDGF誘導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組將MEF在蓋玻片上接種24小時(shí)這到亞匯合，繼之以血清饑餓過夜。細(xì)胞或者用50ng/mlPDGF處理2、5、10或30分鐘，或者不進(jìn)行處理。細(xì)胞在4%低聚甲醛PBS溶液中固定、用0.Triton的PBS溶液滲透，并用在包含1%BSA的PBS中用FITC-鬼筆環(huán)肽(Sigma)染色30分鐘。用ProlongAntifade封固劑(Invitrogen)固定蓋片，并用Nikon熒光顯微鏡獲得圖像。分析各蓋片上的約400個(gè)細(xì)胞，計(jì)算顯示出肌動(dòng)蛋白環(huán)形成的細(xì)胞的百分比，并線性地呈現(xiàn)。PDGF結(jié)合和內(nèi)化作用實(shí)驗(yàn)根據(jù)生產(chǎn)商的說明，在使用Iodo-gen碘化管(Pierce)碘化之前使用Bo1ton-Hunter試劑(Pierce)標(biāo)記PDGF。將細(xì)胞接種入24孔板，并使其在補(bǔ)充有胎牛血清的DMEM中生長(zhǎng)至80%匯合。在包含20mMH印es(pH7.4)和0.1%BSA的冷DMEM中洗滌細(xì)胞兩次。在增加量的天然PDGF存在的情況下，用5ng/ml的125I_PDGF在孔中進(jìn)行溫育，一式三份。在25°C使結(jié)合進(jìn)行1小時(shí)。然后，在冷PBS中洗滌細(xì)胞，并使其溶解在0.5MNaOH中。使用LS6500閃爍計(jì)數(shù)器(BeckmanCoulter)測(cè)定樣品的放射性含量，并使用PRISM軟件(GraphPad)分析數(shù)據(jù)。對(duì)于內(nèi)化作用實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞被接種入24孔板，使其生長(zhǎng)至80%匯合，并饑餓過夜。在4°C，用在DMEM/0.1%BSA/50mMHepespH7.4中的5ng/ml125I_PDGF溫育細(xì)胞90分鐘。通過用冰冷的PBS(pH7.4)洗滌除去未結(jié)合的配體。預(yù)加熱的DMEM/0.1%BSA/50mMIfepes被添加至所述細(xì)胞并在37°C溫育所示的時(shí)間。用包含PBS(pH3)和0.BSA的冰冷酸性緩沖液收集細(xì)胞表面結(jié)合配體10分鐘。通過用0.5MNa0H溶解收集內(nèi)化的配體。通過用10%三氯乙酸(TCA)沉淀培養(yǎng)基并對(duì)上清液進(jìn)行TCA可溶組分計(jì)數(shù)測(cè)定降解的125I-PDGF的量。通過液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定細(xì)胞表面結(jié)合的、內(nèi)化的和釋放的放射性。表面結(jié)合的、細(xì)胞內(nèi)的和降解的PDGF的量被表示為在冰上溫育90分鐘之后總細(xì)胞結(jié)合放射性的百分比(t=0分鐘)。每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行三次，結(jié)果表示為平均值士SE。實(shí)施例22:PDGF誘導(dǎo)的PDGF受體活化受到D4結(jié)構(gòu)域中突變的影響。圖21A中給出的氨基酸序列比對(duì)表明，在PDGFR的EF環(huán)中的Arg385和Glu390可介導(dǎo)同型D4相互作用，其類似于在Kit的Arg381和Glu386之間負(fù)責(zé)介導(dǎo)在相鄰Kit受體之間的同型D4相互作用的鹽橋。為研究是否PDGFR0采用相似的機(jī)理，Arg385和Glu390各自單獨(dú)地(R385A、E390A)或組合地(R385E390/AA)被丙氨酸殘基置換。在環(huán)區(qū)中另外的保守Lys387殘基也被丙氨酸殘基置換(R385K387E390/AAA)，以檢驗(yàn)其在調(diào)控PDGF誘導(dǎo)的PDGFR0活化中的潛在作用。野生型和突變體PDGFR0在來源于PDGFRa和PDGFR0缺陷的小鼠胚的成纖維細(xì)胞(MEF)中穩(wěn)定地表達(dá)(Soriano,P.(1994)GenesDev.8，1888-1896；Soriano,P.(1997)Development124，2691—2700；禾口Andrews，A.等(1999)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.40,2683-2689)。表達(dá)野生型或突變體PDGFR0的MEF-其在表達(dá)水平方面相當(dāng)——用于如下所述的實(shí)驗(yàn)。來自未刺激的或PDGF刺激的細(xì)胞的溶解產(chǎn)物用抗PDGFR抗體進(jìn)行免疫沉淀，接下來用抗磷酸酪氨酸抗體進(jìn)行免疫印跡。接著剝?nèi)ツぃ⒂每筆DGFR抗體再印跡以用于定量PDGFR表達(dá)。在圖22A中給出的實(shí)驗(yàn)表明，PDGFR0的PDGF誘導(dǎo)的酪氨酸自磷酸化在表達(dá)PDGFR0的E390A、R385A、(R385E390/AA)和(R385K387E390/AAA)突變體的細(xì)胞中受到強(qiáng)烈損害；酪氨酸自磷酸化的程度和動(dòng)力學(xué)分別被降低和漸弱。這些實(shí)驗(yàn)表明，D4的EF環(huán)中的Arg385和Glu390在PDGFRA的PDGF誘導(dǎo)的刺激中起重要作用，這表明與在Kit結(jié)構(gòu)中鑒定的那些類似的鹽橋?qū)σ泊嬖谟诨罨腜DGFR和其它III型RTK中。在配體-受體復(fù)合物內(nèi)相鄰受體的D4結(jié)構(gòu)域之間的直接相互作用可代表用于配體誘導(dǎo)的III型RTK活化的共同機(jī)理。已經(jīng)一致地和可再現(xiàn)地觀察到，與表達(dá)R385A、(R385E390/AA)或(R385K387E390/AAA)突變體的細(xì)胞相比，PDGF誘導(dǎo)的受體自磷酸化在表達(dá)E390A的細(xì)胞中受到更強(qiáng)烈的影響。盡管造成這些突變體之間的差異的精確機(jī)理尚不清楚，但可能的是，在D4界面處的局部正表面電荷可引起靜電推斥，以在配體刺激之前保持相鄰受體的D4分開。而Arg385被丙氨酸殘基置換將阻止鹽橋形成，該變化也可降低D4-D4界面中的凈正電荷，導(dǎo)致對(duì)PDGFR活化的抑制較弱。為了檢驗(yàn)PDGFR的D4結(jié)構(gòu)域中的突變是否可能影響突變體PDGFR0的細(xì)胞膜表達(dá)和配體結(jié)合親和性，接下來對(duì)表達(dá)野生型或突變體PDGFR0的細(xì)胞進(jìn)行定量PDGF結(jié)合實(shí)驗(yàn)。在存在濃度增加的天然PDGF的情況下，在4°C下，表達(dá)野生型、R385A、E390A或(R385E390/AA)PDGFRA突變體的細(xì)胞與包含125I_PDGF的緩沖液一起溫育90分鐘。使用閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)量細(xì)胞結(jié)合放射性。通過用Prism4進(jìn)行曲線擬合分析野生型和突變體PDGFR3的置換曲線的EC50值(圖22B)。在轉(zhuǎn)染的MEF中表達(dá)的野生型和突變體PDGFR0的量也通過用抗PDGFR的抗體或抗標(biāo)簽抗體進(jìn)行總細(xì)胞溶解產(chǎn)物的免疫印跡而進(jìn)行比較(圖22A和C)。合起來，這些實(shí)驗(yàn)表明，相似量的野生型或突變體PDGFR0被表達(dá)于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞表面上。而且,對(duì)于表達(dá)野生型(3.7nM)、R385A(6.0nM)、E390A(2.8nM)或RE/AA(3.OnM)突變體的細(xì)胞獲得相似的IC50值(置換50%的125I-PDGF結(jié)合的PDGF濃度)。通過比較野生型和突變體受體的體外酪氨酸激酶活性，突變體PDGFR0的固有酪氨酸激酶活性是否受到不利地影響也被檢驗(yàn)。在該實(shí)驗(yàn)中，用抗PDGFR抗體對(duì)來自血清饑餓細(xì)胞的細(xì)胞溶解產(chǎn)物進(jìn)行免疫沉淀，并且使固定的PDGFR在存在ImMATP和10mM氯化鎂的情況下進(jìn)行體外激酶分析。在溫育之后，通過采用抗磷酸酪氨酸抗體的免疫印跡分析樣品。在圖22C中給115出的實(shí)驗(yàn)表明，R385A、E390A或RE/AA突變不影響PDGFR的固有酪氨酸激酶活性。總而言之，這些實(shí)驗(yàn)表明在D4中影響PDGF誘導(dǎo)的PDGFR0刺激的突變不改變PDTOR0在細(xì)胞表面上的表達(dá)、不影響PDreRP的配體結(jié)合親和性且不改變突變體PDGFR0的固有酪氨酸激酶活性。實(shí)施例23:PDGF受體D4點(diǎn)突變體在PDGF刺激的細(xì)胞的表面上以無活性二聚體的形式表達(dá)因?yàn)槭荏w二聚化已經(jīng)被認(rèn)為是受體酪氨酸激酶活化的關(guān)鍵機(jī)理，所以我們研究了突變體PDGFR0響應(yīng)PDGF刺激的酪氨酸自磷酸化減少是否由受體二聚化缺陷所引起?；瘜W(xué)交聯(lián)劑早先已經(jīng)用來監(jiān)測(cè)和追蹤幾種細(xì)胞膜受體(包括野生型和各種EGF受體突變體)在活細(xì)胞的細(xì)胞表面上的配體誘導(dǎo)二聚化(Cochet，C.等(1988)JBiolChem263,3290-3295)。在該實(shí)驗(yàn)中，表達(dá)野生型PDGFR0或E390A突變體的細(xì)胞被血清饑餓過夜，繼之以在4°C進(jìn)行PDGF溫育90分鐘。若干次洗滌被用來除去非結(jié)合的PDGF，并且用在PBS中的0.5mM辛二酸二琥珀酰亞胺酯(DSS)在25°C溫育細(xì)胞30分鐘。使來自未刺激的或PDGF刺激的細(xì)胞的細(xì)胞溶解產(chǎn)物用抗PDGFR抗體進(jìn)行免疫沉淀，繼之以SDS-PAGE，并采用抗標(biāo)記抗體進(jìn)行免疫印跡以監(jiān)控PDGFR二聚化的狀態(tài)，或者采用抗磷酸酪氨酸抗體的免疫印跡以監(jiān)控PDGFR活化的狀態(tài)(圖23)。在圖23中描繪的實(shí)驗(yàn)表明，在未刺激的細(xì)胞的溶解產(chǎn)物中，在SDS凝膠上遷移的具有相當(dāng)于PDGFR單體的180kDa的表觀分子量的帶在來自表達(dá)野生型PDGFR0或E390A突變體的細(xì)胞的溶解產(chǎn)物中檢測(cè)到。在PDGF刺激后，在SDS凝膠上遷移的具有相當(dāng)于PDGFR二聚體的360kDa的表觀分子量的另外的帶在表達(dá)野生型PDGFR0和E390A突變體的細(xì)胞中都檢測(cè)到。然而，采用抗磷酸酪氨酸抗體的樣品免疫印跡表明，盡管相當(dāng)于野生型PDGFR的二聚體的帶是強(qiáng)酪氨酸磷酸化的，但是檢測(cè)到相應(yīng)于E390A突變體二聚體的帶的酪氨酸磷酸化非常弱(圖23)。該實(shí)驗(yàn)表明，E390A突變體的配體誘導(dǎo)酪氨酸自磷酸化的削弱不是由配體誘導(dǎo)的受體二聚化缺陷所引起的。該實(shí)驗(yàn)也表明，共價(jià)交聯(lián)的野生型PDGFR0以活性二聚體的形式展示在PDGF刺激的細(xì)胞的細(xì)胞表面上，而E390A突變體以無活性二聚體的形式展示在PDGF刺激的細(xì)胞的表面上。上述數(shù)據(jù)表明，PDGFR中的D4同型相互作用不是受體二聚化所必需的，并且PDGF誘導(dǎo)的受體二聚是活化酪氨酸激酶必需的，但不足以活化酪氨酸激酶。實(shí)施例24在表達(dá)D4PDGF-受體突變體的細(xì)胞中細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的刺激削弱PDGFRD4突變對(duì)響應(yīng)PDGF刺激的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的影響被檢驗(yàn)。采用抗磷脂酶Cy(^lPLCy)抗體對(duì)來自未刺激的或PDGF刺激的表達(dá)WT或PDGFRD4突變體的細(xì)胞的溶解產(chǎn)物進(jìn)行免疫沉淀，接下來進(jìn)行SDS-PAGE，并用抗PLCY或抗Tyr抗體進(jìn)行免疫印跡。在圖24A中給出的實(shí)驗(yàn)表明，在表達(dá)R385A、E390A、RE/AA或RKE/AAA的PDGFR突變體的細(xì)胞中，PLCY的酪氨酸磷酸化受到嚴(yán)重?fù)p害。在表達(dá)PDGFRD4突變體的細(xì)胞中觀察到另外的PDGF誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答的刺激削弱。在圖24B中給出的實(shí)驗(yàn)表明，與在表達(dá)WTPDGFR的MEF中通過PDGF誘導(dǎo)的相似應(yīng)答相比，在表達(dá)R385A、E390A、R385E390/AA或R385K387E390/AAAPDGFR突變體的細(xì)胞中MAP-激酶應(yīng)答和Akt刺激受到強(qiáng)烈損害。總的說來，為在表達(dá)E390A、R385E390/AA(即RE/AA)或R385K387E390/AAA(即RKE/AAA)PDGFR突變體的細(xì)胞中達(dá)到相似的MAP-激酶應(yīng)答和Akt刺激水平，需要大約10倍高的PDGF濃度。培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的PDGF刺激的標(biāo)志之一是在PDGF-刺激的細(xì)胞的背面上通常形成膜皺褶和圓形肌動(dòng)蛋白環(huán)結(jié)構(gòu)。在圖25中給出的實(shí)驗(yàn)表明，肌動(dòng)蛋白環(huán)形成的PDGF刺激在表達(dá)PDGFRD4突變體的MEF中受到損害。盡管大約83%的表達(dá)WTPDGFR的MEF表現(xiàn)出圓形肌動(dòng)蛋白環(huán)形成，但是僅僅5%的PDGFRD4突變體細(xì)胞在用50ng/ml的PDGF刺激2分鐘之后顯示出相似的圓形肌動(dòng)蛋白環(huán)形成。而且，在2-5分鐘的PDGF刺激之后在表達(dá)WTPDGFR的MEF中達(dá)到峰值的瞬時(shí)圓形肌動(dòng)蛋白環(huán)形成在表達(dá)R385A、E390A或RE/AAPDGFR突變體的細(xì)胞中被微弱地檢測(cè)到。實(shí)施例25:D4PDGF受體突變體的內(nèi)化作用和降解減少PDGFRD4突變對(duì)PDGF內(nèi)化作用、PDGFR降解和PDGFR泛素化的影響也被檢驗(yàn)。在4°C用5ng/ml的1251標(biāo)記的PDGF處理表達(dá)WTPDGFR或PDGFRD4突變體的MEF90分鐘，繼之以用PBS(pH7.4)短暫清洗以除去培養(yǎng)基中的過量配體。將預(yù)標(biāo)記的細(xì)胞溫?zé)嶂?7°C，以最長(zhǎng)4小時(shí)的各種時(shí)間長(zhǎng)度開始配體-受體復(fù)合物的胞吞作用。細(xì)胞表面結(jié)合的、細(xì)胞內(nèi)的和在培養(yǎng)基中的降解的125I_PDGF被收集、使用閃爍計(jì)數(shù)器定量、并作為在4°C溫育90分鐘(t=0)之后總細(xì)胞結(jié)合125IPDGF放射性的百分比(平均值士SD)給出。在圖26A中給出的實(shí)驗(yàn)表明，結(jié)合于表達(dá)WTPDGFR的MEF的1251標(biāo)記的PDGF的內(nèi)化作用動(dòng)力學(xué)比結(jié)合于表達(dá)E390A、R385A或R385E390/AAPDGFR突變體的細(xì)胞的1251標(biāo)記的PDGF的內(nèi)化作用動(dòng)力學(xué)快得多。在30分鐘之后，約75-80%的125I_PDGF被從細(xì)胞表面除去并在表達(dá)WT受體的細(xì)胞內(nèi)部累積，這與在表達(dá)突變體的細(xì)胞中的50%以下的比率形成對(duì)比。125I-PDGF的低分子量降解產(chǎn)物在30分鐘之后變成可檢測(cè)的。降解的125I_PDGF的釋放在E390A突變體細(xì)胞中比在WT中慢得多(圖26A)。PDGF內(nèi)化作用和降解減少被反映在PDGFRD4突變體的降解減少。表達(dá)WT或R385A、E390A或R385E390/AAPDGFR突變體的細(xì)胞首先與放線菌酮溫育30分鐘，以防止在降解實(shí)驗(yàn)期間新的PDGFR分子的生物合成。采用抗PDGFR抗體使未刺激的或PDGF刺激的細(xì)胞的溶解產(chǎn)物進(jìn)行免疫沉淀，繼之以SDS-PAGE，并采用針對(duì)連接于WT或PDGFRD4突變體的C-末端的標(biāo)簽的抗體進(jìn)行免疫印跡。圖26B中給出的實(shí)驗(yàn)表明，R385A、E390A或R385E390/AAPDGFR突變體的降解動(dòng)力學(xué)被大大削弱；盡管一半的WTPDGFR在PDGF刺激的1.5小時(shí)內(nèi)被降解，PDGFRD4突變體的半衰期延長(zhǎng)至大約4至6小時(shí)。在圖26C中給出的實(shí)驗(yàn)表明，在相似條件下，相比于WTPDGFR，E390APDGFR的PDGF誘導(dǎo)的泛素化刺激也被大大降低。總的說來，這些實(shí)驗(yàn)表明PDGFR內(nèi)化和泛素介導(dǎo)的PDGFR降解受到PDGFR的D4中突變的損害。實(shí)施例22-25的討論III型RTK的全部成員-包括PDGFRa、PDGFR3、CSF1R、Flt3和Kit-的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域由五個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域組成，其中前三個(gè)用作二聚配體分子的結(jié)合位點(diǎn)，二聚配體分子在結(jié)合后刺激受體二聚經(jīng)和活化。由于III型RTKs的分子結(jié)構(gòu)、配體結(jié)合特征和受體二聚化的機(jī)理是高度保守的，由刺激之前和之后Kit的完整胞外域的晶體結(jié)構(gòu)所揭示的SCF誘導(dǎo)的Kit活化的機(jī)理代表全部III型RTK的一般性活化機(jī)理。而且，在它們的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中包含Ig樣結(jié)構(gòu)域的RTK的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示出III型和IV型RTK的共同進(jìn)化起源一個(gè)包括VEGFR1(Fltl)、VEGFR2(KDR)和VEGFR3(Flt4)的家族。而且，VEGF和PDGF都屬于同一半胱氨酸節(jié)家族同型二聚化生長(zhǎng)因子，共享相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、大小和受體結(jié)合策略。因此，由它的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域X-射線結(jié)構(gòu)分析(在本文首次披露的)所揭示的Kit活117化的顯著特征也可適用于V型RTK的配體誘導(dǎo)活化。Kit的結(jié)構(gòu)分析已經(jīng)表明，在兩個(gè)相鄰D4結(jié)構(gòu)域的Glu386和Arg381之間形成的一對(duì)鹽橋負(fù)責(zé)介導(dǎo)對(duì)于SCF誘導(dǎo)的Kit活化必需的同型D4相互作用。III型RTK的氨基酸序列的比較表明，相同序列基序存在于PDGFRa、PDGFR0和CSF1R的D4的EF環(huán)中(圖21)，這提供了證據(jù)證明相似的鹽橋也III型RTK的D4之間形成。實(shí)際上，在PDGFR0的D4結(jié)構(gòu)域中Arg385或Asp390被丙氨酸置換已經(jīng)影響PDGFR^活化的PDGF刺激，導(dǎo)致在表達(dá)WTPDGFRA的細(xì)胞中由PDGF刺激的多種細(xì)胞應(yīng)答受損。由Kit結(jié)構(gòu)的分析揭示的配體誘導(dǎo)的Kit活化的機(jī)理適用于全部III型RTK的活化。與負(fù)責(zé)D4同型相互作用的序列基序相同的序列基序也在RTK的VEGFR家族(IV型)的全部三個(gè)成員的膜近側(cè)第七Ig樣結(jié)構(gòu)域(D7)的EF環(huán)中被鑒定。盡管負(fù)責(zé)在Kit和其它III型RTK中介導(dǎo)同型D4相互作用的保守序列基序位于IV型RTK的D7結(jié)構(gòu)域中，VEGFR的D7可能在介導(dǎo)IV型RTK的膜近側(cè)區(qū)之間的同型相互作用中起相似的作用。實(shí)際上，VEGFR2的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的電子顯微鏡分析已經(jīng)在VEGF結(jié)合的VEGFR2二聚體中顯示出D7之間的直接接觸(Ruch，C.等(2007)NatStructMolBiol14,249-250)0在膜近側(cè)Ig樣結(jié)構(gòu)域之間的直接接觸代表III型和IV型RTK都使用的一般機(jī)理。研究各種受體突變體或使用特異性結(jié)合Kit(Blechman等(1995)Cell80，103-113)，PDGF受體(Miyazawa,K.等(1998)J.Biol.Chem.273,25495-25502)和其它III型RTK的單個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體的研究已經(jīng)揭示，即使當(dāng)Kit由單價(jià)SCF配體刺激時(shí)，D4也在介導(dǎo)受體二聚化中起作用(Lev,S.等(1992)JBiolChem267，15970-15977)。然而，使用SCF結(jié)合的微量量熱學(xué)和SCF化學(xué)計(jì)量法對(duì)由前三個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域(D1-D3)或全部五個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域(D1-D5)組成的Kit的純化細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的定量分析已經(jīng)表明，D4和D5對(duì)于Kit二聚化的SCF刺激不是必需的。換句話說，這些報(bào)道已經(jīng)表明，Kit二聚化主要由結(jié)合Kit的SCF的二聚性質(zhì)驅(qū)動(dòng)(Lemmon,M.A.等(1997)J.Biol.Chem.272，6311-6317.)。然而，在本文中描述的工作表明，對(duì)于兩個(gè)受體的膜近側(cè)區(qū)以使它們的胞質(zhì)域之間的相互作用能導(dǎo)致酪氨酸激酶活化的距離和取向進(jìn)行精確定位而言，在相鄰受體之間的同型D4(以及同型D5)相互作用是必需的，而不是在受體二聚化中起作用。因此，本發(fā)明的成分(例如單克隆抗體)通過阻止在III型RTK的膜近側(cè)區(qū)之間的關(guān)鍵同型相互作用而對(duì)受體活化發(fā)揮它們的抑制作用，而不是干擾受體二聚化，其中所述同型相互作用對(duì)于胞質(zhì)域以酪氨酸激酶活化必需的距離和取向定位而言是不可缺少的。在本文給出的實(shí)驗(yàn)表明，PDGFRA、Kit及其他III型RTK的二聚化完全由配體結(jié)合驅(qū)動(dòng)，并且配體結(jié)合的唯一作用是交聯(lián)兩個(gè)受體分子，以增加它們?cè)诩?xì)胞膜中的局部濃度。負(fù)責(zé)介導(dǎo)同型D4相互作用的兩個(gè)鹽橋(具有包埋表面積為360人2的界面)太弱以致不能在沒有配體介導(dǎo)的受體二聚化支持的情況下支持受體相互作用，在Kit的情況下，配體介導(dǎo)的受體二聚化由各種強(qiáng)相互作用介導(dǎo)的，對(duì)于各SCF原聚體具有2060人2的總包埋表面積。在每細(xì)胞表達(dá)20，000個(gè)受體的未刺激細(xì)胞的細(xì)胞膜中受體的表觀濃度估計(jì)為大約l-3iiM(Klein，P.等(2004)ProcNatlAcadSciUSA101,929-934；Chandrasekhar,S.(1943)ReviewsofModernPhysics15，1)。在結(jié)合二聚配體(如SCF)時(shí)，兩個(gè)占據(jù)的受體以75人的距離保持在一起。在這些條件下，使用平均距離，以至最近鄰域的平均距離法計(jì)算的細(xì)胞膜中的表觀受體濃度提高超過兩個(gè)數(shù)量級(jí)，達(dá)到4-6X10_4M。該計(jì)算表明，即使解離常數(shù)在10_4-10_5M范圍內(nèi)的弱相互作用(如由兩個(gè)鹽橋介導(dǎo)的那些)也可介導(dǎo)在兩個(gè)相鄰受體的膜近側(cè)區(qū)之間的結(jié)合和直接接觸。細(xì)胞膜內(nèi)的高局部濃度連同連接D4和D5到其余受體分子的接頭的靈活性使得將受體的膜近側(cè)區(qū)以能夠進(jìn)行相鄰胞質(zhì)域之間的相互作用的精確定向和距離(在Kit情況下為15人)定位的同型D4以及同型D5的移動(dòng)和形成成為可能。最后，通過應(yīng)用化學(xué)交聯(lián)劑以在未刺激的或PDGF刺激的細(xì)胞上共價(jià)交聯(lián)WT或突變體受體，本發(fā)明已經(jīng)證明，E390APDGFR0突變體發(fā)生與PDGF誘導(dǎo)的WT受體二聚化類似的PDGF誘導(dǎo)的二聚化。然而，與在PDGF刺激的細(xì)胞的細(xì)胞表面上以活化的形式表達(dá)WTPDGFR^不同，E390A突變體在PDGF刺激的細(xì)胞上以無活性二聚體的形式表達(dá)。該實(shí)驗(yàn)表明，同型D4-D4相互作用對(duì)于PDGFR0二聚化不是必需的，并且PDGFR0二聚是活化受體必需的，但對(duì)于活化受體不是足夠的。實(shí)施例26:D4-D4界面的破壞克服致癌KIT活化穩(wěn)定表達(dá)野生型(WT)KIT、其中D5的Ala502和Tyr503被重復(fù)的致癌KIT突變體(D5-重復(fù)序列突變體)或其中D5的Ala502和Tyr503(D5重復(fù)序列)被重復(fù)的KIT突變體以及其中D4的Glu386由Ala殘基置換的另外的點(diǎn)突變(D5-重復(fù)序列/E386A突變體)的鼠3T3細(xì)胞用1、5或lOng/ml的SCF在37°C刺激5分鐘。使未刺激的或SCF刺激的細(xì)胞的溶解產(chǎn)物與抗KIT抗體進(jìn)行免疫沉淀，繼之以SDS-PAGE，并且采用抗KIT或抗磷酸酪氨酸(抗pY)抗體進(jìn)行免疫印跡。在圖27中給出的實(shí)驗(yàn)證明，野生型KIT的SCF刺激導(dǎo)致由響應(yīng)SCF刺激的KIT酪氨酸自磷酸化增強(qiáng)揭示的KIT活化增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)也表明，KIT的致癌D5-重復(fù)序列突變體被組成型地酪氨酸自磷酸化(即，它在SCF刺激不存在的情況下被活化)。相比之下，在D4中攜帶另外的點(diǎn)突變(其在正常受體蛋白的背景下表現(xiàn)出削弱KIT的SCF活化)的D5-重復(fù)序列/E386A突變體阻斷由該致癌D5-重復(fù)序列突變介導(dǎo)的組成型酪氨酸自磷酸化。該實(shí)驗(yàn)為D4-D4同型相互作用在介導(dǎo)通過D5中的致癌突變和據(jù)推測(cè)通過該KIT分子的不同部分中的其它致癌突變產(chǎn)生的KIT活化方面的重要性提供了遺傳確認(rèn)。而且，該實(shí)驗(yàn)對(duì)這樣的觀點(diǎn)提供了進(jìn)一步的確認(rèn)通過由本發(fā)明的成分(例如抗體、或其抗原結(jié)合部分、小分子或肽類分子)的藥理學(xué)干預(yù)破壞D4-D4界面將阻斷D5中的致癌突變、KIT分子的其它部分中和在致癌III型和IV型RTK中的致癌突變的活性。實(shí)施例27針對(duì)相應(yīng)于參與介導(dǎo)D4同型相互作用的KIT特征基序的合成肽的抗體識(shí)別完整的KIT蛋白質(zhì)在這個(gè)實(shí)施例中，針對(duì)三個(gè)不同的KIT抗原產(chǎn)生兔多克隆抗體1.人KIT的全長(zhǎng)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(氨基酸1-510)。2.由氨基酸308-411組成的KITIg樣結(jié)構(gòu)域4(D4)(KIT-D4)3.相應(yīng)于氨基酸375-391的17-聚體肽，其包括結(jié)合于KLH的KITD4的特征基序(SELHLTRLKGTEGGTYT)。以兩周間隔，用三個(gè)抗原的每一種免疫兔子，并分析測(cè)試血。給出的結(jié)果來自在第三次免疫之后收集的血清樣品。表達(dá)野生型人KIT的3T3細(xì)胞的溶解產(chǎn)物與包含下列抗體之一的30u1血清一起溫育1.抗KIT抗體，其針對(duì)全長(zhǎng)KIT細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。2.抗D4抗體，其針對(duì)KIT-D4，和3.抗肽抗體，其針對(duì)對(duì)應(yīng)于KITD4的氨基酸375-391的肽。表達(dá)野生型KIT的3T3細(xì)胞的溶解產(chǎn)物與各種抗體一起，連同A蛋白瓊脂糖在4°C溫育2小時(shí)，然后用包含20mMH印es、150mMNaCl、0.1%TritonX_100和5%丙三醇的洗滌緩沖液洗滌三次。在SDS-PAGE上分離免疫沉淀物，將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上并與如圖28所描述的各抗體進(jìn)行免疫印跡分析。在圖28中給出的數(shù)據(jù)表明，各抗體，包括針對(duì)對(duì)于將KIT二聚物定位在活化構(gòu)型中必需的D4的同型相互作用區(qū)的抗肽抗體，在所述實(shí)驗(yàn)的免疫沉淀和免疫印跡步驟中識(shí)別完整的天然KIT。值得注意的是，該實(shí)驗(yàn)表明，抗肽抗體識(shí)別野生型KIT與針對(duì)KIT的完整細(xì)胞外區(qū)或D4區(qū)的抗體一樣有效。等同方案本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到或能夠僅使用常規(guī)試驗(yàn)確定在本文描述的本發(fā)明的具體實(shí)施方式的許多等同方案。這樣的等同方案意圖被以下權(quán)利要求包括在內(nèi)。權(quán)利要求結(jié)合人受體酪氨酸激酶胞外域的成分，其中所述成分將所述受體酪氨酸激酶的胞外域鎖定在非活性狀態(tài)，從而拮抗受體酪氨酸激酶的活性。2.權(quán)利要求1的成分，其中所述成分結(jié)合人受體酪氨酸激酶的Ig樣結(jié)構(gòu)域。3.權(quán)利要求2的成分，其中所述Ig樣結(jié)構(gòu)域不負(fù)責(zé)配體與受體酪氨酸激酶的結(jié)合。4.權(quán)利要求2的成分，其中所述Ig樣結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)配體與受體酪氨酸激酶的結(jié)合。5.權(quán)利要求1的成分，其中所述成分不阻斷受體酪氨酸激酶與受體酪氨酸激酶配體之間的相互作用。6.權(quán)利要求1的成分，其中所述成分阻斷受體酪氨酸激酶與受體酪氨酸激酶配體之間的相互作用。7.權(quán)利要求1的成分，其中所述成分不阻止受體酪氨酸激酶的二聚化。8.權(quán)利要求1的成分，其中所述成分阻止受體酪氨酸激酶的二聚化。9.權(quán)利要求1的成分，其中所述成分阻止來自所述受體酪氨酸激酶的各原聚體的胞外域的膜近側(cè)區(qū)之間的相互作用。10.權(quán)利要求9的成分，其中所述相互作用是同型的。11.權(quán)利要求9的成分，其中所述相互作用是異型的。12.權(quán)利要求9的成分，其中所述胞外域的膜近側(cè)區(qū)選自III型受體酪氨酸激酶的D4結(jié)構(gòu)域、III型受體酪氨酸激酶的D5結(jié)構(gòu)域、III型受體酪氨酸激酶的D3-D4鉸鏈區(qū)、III型受體酪氨酸激酶的D4-D5鉸鏈區(qū)、V型受體酪氨酸激酶的D6-D7鉸鏈區(qū)和V型受體酪氨酸激酶的D7結(jié)構(gòu)域。13.權(quán)利要求9的成分，其中所述成分使得來自受體酪氨酸激酶的各原聚體的胞外域的膜近側(cè)區(qū)分隔大于20人的距離。14.權(quán)利要求1的成分，其中所述受體酪氨酸激酶是III型受體酪氨酸激酶。15.權(quán)利要求14的成分，其中所述III型受體酪氨酸激酶選自Kit、PDGFRa、PDGFR3、CSF1R和Flk2。16.權(quán)利要求2的成分，其中所述Ig樣結(jié)構(gòu)域是III型受體酪氨酸激酶的D4結(jié)構(gòu)域。17.權(quán)利要求16的成分，其中所述成分結(jié)合D4相互作用位點(diǎn)的以下共有序列uyyyycAWG，其中L是亮氨酸，R是精氨酸，G是甘氨酸選自蘇氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、天門冬酰胺或賴氨酸；X2選自亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸；x3選自賴氨酸、組氨酸、天門冬酰胺和精氨酸；X4選自甘氨酸、纈氨酸、丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸；X5選自蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸；x6選自谷氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺；以及x7選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸、賴氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和蘇氨酸。18.權(quán)利要求2的成分，其中所述Ig樣結(jié)構(gòu)域是III型受體酪氨酸激酶的D5結(jié)構(gòu)域。19.權(quán)利要求14的成分，其中所述III型受體酪氨酸激酶是人Kit受體，并且其中所述成分結(jié)合人Kit受體的氨基酸殘基309-413。20.權(quán)利要求14的成分，其中所述III型受體酪氨酸激酶是人Kit受體，并且其中所述成分結(jié)合人Kit受體的氨基酸殘基410-519。21.權(quán)利要求14的成分，其中所述III型受體酪氨酸激酶是人Kit受體，并且其中所述成分結(jié)合人Kit受體的氨基酸殘基381arg和386G1u。22.權(quán)利要求14的成分，其中所述III型受體酪氨酸激酶是人Kit受體，并且其中所述縣成分結(jié)合人Kit受體的氨基酸殘基418Tyr和5°5ASn。23.權(quán)利要求14的成分，其中所述III型受體酪氨酸激酶是人Kit受體，并且其中所述成分結(jié)合人Kit受體的突變D5結(jié)構(gòu)域，其中所述突變D5結(jié)構(gòu)域含有在選自Thr417、Tyr418、Asp419、Leu421、Arg420、Tyr503和Ala502的氨基酸殘基上的點(diǎn)突變。24.權(quán)利要求14的成分，其中所述III型受體酪氨酸激酶是人Kit受體，并且其中所述成分結(jié)合選自表4中所列的氨基酸殘基的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。25.權(quán)利要求24的成分，其中所述成分結(jié)合選自K218、S220、Y221、L222、F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、1371和Y373的至少一個(gè)氨基酸殘基。26.權(quán)利要求24的成分，其中所述成分結(jié)合選自Y350、R353、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386和T390的至少一個(gè)氨基酸殘基。27.權(quán)利要求14的成分，其中所述III型受體酪氨酸激酶是PDGFRa或PDGFR3。28.權(quán)利要求27的成分，其中所述III型受體酪氨酸激酶是PDGFR0，并且其中所述成分結(jié)合人PDGFR0的氨基酸殘基385Arg和39°G1u。29.權(quán)利要求1的成分，其中所述成分結(jié)合受體酪氨酸激酶上的構(gòu)象表位。30.權(quán)利要求14的成分，其中所述成分結(jié)合III型受體酪氨酸激酶上的構(gòu)象表位。31.權(quán)利要求30的成分，其中所述構(gòu)象表位由受體酪氨酸激酶的D4和/或D5結(jié)構(gòu)域中的兩個(gè)或多個(gè)殘基組成。32.權(quán)利要求30的成分，其中所述構(gòu)象表位由受體酪氨酸激酶的D2-D3、D3-D4和/或D4-D5鉸鏈區(qū)中的兩個(gè)或多個(gè)殘基組成。33.權(quán)利要求30的成分，其中所述構(gòu)象表位由選自E33、P34、D72、E76、N77、K78、Q79、K158、D159、N250、S251、Q252、T253、K254、L255、N260、W262、H264、G265、E344、N352、R353、F355、T356、D357、Y362、S365、E366、N367、N370和G466的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸組成。34.權(quán)利要求30的成分，其中所述III型受體酪氨酸激酶是人Kit受體，并且其中所述構(gòu)象表位由選自表4中所列的氨基酸殘基的兩個(gè)或多個(gè)殘基組成。35.權(quán)利要求34的成分，其中所述構(gòu)象表位由選自Y125、H180、R181、K203、V204、R205、P206、V238、S239、S240、H263、G265、D266、F267、N268和Y269的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸組成。36.權(quán)利要求34的成分，其中所述構(gòu)象表位由選自P206、F208、V238和S239的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸組成。37.權(quán)利要求34的成分，其中所述構(gòu)象表位由選自K127、A207、F208和T295的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸組成。38.權(quán)利要求34的成分，其中所述構(gòu)象表位由選自L222、A339、F340、K342、E368、S369、N370、1371和Y373的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸組成。39.權(quán)利要求34的成分，其中所述構(gòu)象表位由選自L222、L223、E306、V308、F312、E338、F340和1371的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸組成。40.權(quán)利要求34的成分，其中所述構(gòu)象表位由選自R224、V308、K310、G311、F340、P341和D398的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸組成。41.權(quán)利要求34的成分，其中所述構(gòu)象表位由選自K218、A219、S220、N367、E368禾口S369的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸組成。42.權(quán)利要求34的成分，其中所述構(gòu)象表位由選自K218、A220、E368和S369的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸組成。43.權(quán)利要求34的成分，其中所述構(gòu)象表位由選自G384、T385、T411、K412、E414和K471的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸組成。44.權(quán)利要求34的成分，其中所述構(gòu)象表位由選自Y408、F433、G470、K471和L472的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸組成。45.權(quán)利要求34的成分，其中所述構(gòu)象表位由選自F324、V325、N326和N410的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸組成。46.權(quán)利要求34的成分，其中所述構(gòu)象表位由選自D327、N410、T411、K412*V497的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸組成。47.權(quán)利要求34的成分，其中所述構(gòu)象表位由選自G384、G387、V409和K471的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸組成。48.權(quán)利要求34的成分，其中所述構(gòu)象表位由選自L382、G387、V407和V409的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸組成。49.權(quán)利要求34的成分，其中所述構(gòu)象表位由選自Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206、F208、V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268和Y269的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸組成。50.權(quán)利要求34的成分，其中所述構(gòu)象表位由選自P206、F208、V238和S239的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸組成。51.權(quán)利要求34的成分，其中所述構(gòu)象表位由選自K218、S220、Y221、L222、F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、1371和Y373的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸組成。52.權(quán)利要求34的成分，其中所述構(gòu)象表位由選自G384、G387、G388、Y408、V409、T411、F433、F469、G470和K471的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸組成。53.權(quán)利要求34的成分，其中所述構(gòu)象表位由選自D327、T411、K412、E414、A431、G432和K471的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸組成。54.權(quán)利要求34的成分，其中所述構(gòu)象表位由選自Y350、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386和T390的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸組成。55.權(quán)利要求34的成分，其中所述構(gòu)象表位由選自Y350、R353和F355的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸組成。56.權(quán)利要求30的成分，其中所述III型受體酪氨酸激酶是人Kit受體，并且其中所述構(gòu)象表位由選自表5中所列肽的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成。57.權(quán)利要求30的成分，其中所述構(gòu)象表位由選自第一肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸和選自第二肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸組成，其中所述第一和第二肽選自表5中所列的肽。58.權(quán)利要求57的成分，其中所述第一肽是Ala219-LeU222，而所述第二肽是Thr304-Val308o59.權(quán)利要求57的成分，其中所述第一肽是Asp309-Gly311，而所述第二肽是Arg224-Gly226060.權(quán)利要求57的成分，其中所述第一肽是Thr303-Glu306，而所述第二肽是Ala219-Leu222。61.權(quán)利要求57的成分，其中所述第一肽是Asn367-Asn370，而所述第二肽是Ser217-Tyr221062.權(quán)利要求57的成分，其中所述第一肽是Ala339-Pr0343，而所述第二肽是Asn396-Val399。63.權(quán)利要求57的成分，其中所述第一肽是Ala339-Pr0343，而所述第二肽是Glu368-Arg372。64.權(quán)利要求57的成分，其中所述第一肽是Lys358-Tyr362，而所述第二肽是Val374-His378065.權(quán)利要求57的成分，其中所述第一肽是Asp357-Glu360，而所述第二肽是Leu377-Thr380o66.權(quán)利要求57的成分，其中所述第一肽是Met351-Glu360，而所述第二肽是His378-Thr389067.權(quán)利要求57的成分，其中所述第一肽是His378-Thr389，而所述第二肽是Val323-Asp332。68.權(quán)利要求57的成分，其中所述第一肽是Val409-Ile415，而所述第二肽是Ala493-Thr500o69.權(quán)利要求57的成分，其中所述第一肽是Val409-Ile415，而所述第二肽是Ala431-Thr437070.權(quán)利要求57的成分，其中所述第一肽是Val409-Ile415，而所述第二肽是Phe469-Val473071.權(quán)利要求57的成分，其中所述第一肽是Val409-Ile415，而所述第二肽是Val325-Asn330o72.權(quán)利要求57的成分，其中所述第一肽是Val409-Ile415，而所述第二肽是Arg381-Gly387073.權(quán)利要求57的成分，其中所述第一肽是Gly466-Leu472，而所述第二肽是Gly384-Gly388074.權(quán)利要求57的成分，其中所述第一肽是Val325-Glu329，并且所述第二肽是Tyr494-Lys499。75.權(quán)利要求57的成分，其中所述第一肽是Thr411-LeU416，并且所述第二肽是Val497-Ala502o76.權(quán)利要求57的成分，其中所述第一肽是Ile415-LeU421，而所述第二肽是Ala502-Ala507。77.權(quán)利要求57的成分，其中所述第一肽是Ala502-Ala507，而所述第二肽是Lys484-Thr488。78.權(quán)利要求57的成分，其中所述第一肽是Ala502-Ala507，而所述第二肽是Gly445-Cys450o79.權(quán)利要求1的成分，其中所述受體酪氨酸激酶是VEGF受體家族的成員。80.權(quán)利要求79的成分，其中所述VEGF受體家族的成員選自VEGFR-I(Fltl)、VEGFR-2(Flkl)和VEGFR-3(Flt4)。81.權(quán)利要求79的成分，其中所述成分結(jié)合所述VEGF受體家族成員的D7結(jié)構(gòu)域。82.權(quán)利要求81的成分，其中所述成分結(jié)合所述VEGF受體家族成員的D7結(jié)構(gòu)域的以下共有序列=IX1RVX2X3EDX4G(SEQIDNO:1)，其中I是異亮氨酸，R是精氨酸，E是谷氨酸，D是天冬氨酸，G是甘氨酸A1選自谷氨酸、精氨酸和谷氨酰胺；X2選自精氨酸和蘇氨酸；X3選自谷氨酸和賴氨酸；以及X4選自谷氨酸和丙氨酸。83.權(quán)利要求1的成分，其中所述成分阻斷配體誘導(dǎo)的受體酪氨酸激酶的酪氨酸自磷酸化。84.權(quán)利要求1的成分，其中所述成分阻斷配體誘導(dǎo)的受體酪氨酸激酶的內(nèi)化。85.權(quán)利要求1的成分，其中所述成分是分離的抗體或其抗原結(jié)合部分。86.權(quán)利要求85的成分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分選自人抗體、人源化抗體、雙特異性抗體和嵌合抗體。87.權(quán)利要求86的成分，其中所述所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含選自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE恒定區(qū)的重鏈恒定區(qū)。88.權(quán)利要求87的成分，其中所述抗體重鏈恒定區(qū)是IgGl。89.權(quán)利要求85的成分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分選自Fab片段、F(ab')2片段、單鏈Fv片段、SMIP、親和體、高親合性多聚體、納米體和單結(jié)構(gòu)域抗體。90.權(quán)利要求85的成分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分以選自IxlO-7M或更低、更優(yōu)選5x10_8M或更低、更優(yōu)選1X10_8M或更低、更優(yōu)選5X10_9M或更低的Kd結(jié)合受體酪氨酸激酶的Ig樣結(jié)構(gòu)域。91.產(chǎn)生權(quán)利要求85至權(quán)利要求90中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分的雜交瘤。92.權(quán)利要求1的成分，其中所述成分是小分子。93.權(quán)利要求92的成分，其中所述成分結(jié)合選自表4中所列的氨基酸殘基的至少一個(gè)氨基酸殘基。94.權(quán)利要求92的成分，其中所述成分結(jié)合選自K218、S220、Y221、L222、F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、1371和Y373的至少一個(gè)氨基酸殘基。95.權(quán)利要求92的成分，其中所述成分結(jié)合選自Y350、R353、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386和T390的至少一個(gè)氨基酸殘基。96.權(quán)利要求1的成分，其中所述成分是肽類分子。97.權(quán)利要求96的成分，其中所述肽類分子基于受體酪氨酸激酶的Ig樣結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)。98.權(quán)利要求97的成分，其中所述肽類分子基于人Kit受體的D4結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)。99.權(quán)利要求96的成分，其中所述肽類分子包含結(jié)構(gòu)=LX1RX2X3X4X5X6X7G,其中L是亮氨酸，R是精氨酸，G是甘氨酸A1選自蘇氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、天門冬酰胺或賴氨酸；X2選自亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸；X3選自賴氨酸、組氨酸、天門冬酰胺和精氨酸；X4選自甘氨酸、纈氨酸、丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸；X5選自蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸；X6選自谷氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺；并且&選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸、賴氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和蘇氨酸。100.權(quán)利要求98的成分，其中所述肽類分子包含與人Kit受體的氨基酸殘基309-413至少80%相同的結(jié)構(gòu)。101.權(quán)利要求97的成分，其中所述肽類分子基于人Kit受體的D5結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)。102.權(quán)利要求101的成分，其中所述肽類分子包含與人Kit受體的氨基酸殘基410-519至少80%相同的結(jié)構(gòu)。103.權(quán)利要求96的成分，其中所述肽類分子包含至少一個(gè)D-氨基酸殘基。104.權(quán)利要求1的成分，其中所述成分是adnectin。105.結(jié)合人Kit受體的Ig樣結(jié)構(gòu)域或鉸鏈區(qū)上的構(gòu)象表位的成分，其中所述成分將人Kit受體的胞外域鎖定在非活性狀態(tài)，從而拮抗人Kit受體的活性，并且其中所述構(gòu)象表位由選自表4中所列的氨基酸殘基的兩個(gè)或多個(gè)殘基組成。106.結(jié)合人Kit受體的氨基酸殘基309-413和/或410-519、從而將人Kit受體的胞外域鎖定在非活性狀態(tài)并拮抗人Kit受體的活性的成分。107.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1至權(quán)利要求106中任一項(xiàng)所述的成分和藥學(xué)上可接受的載體。108.治療或預(yù)防對(duì)象中受體酪氨酸激酶相關(guān)疾病的方法，所述方法包括向所述對(duì)象施用有效量的權(quán)利要求1至權(quán)利要求106中任一項(xiàng)所述的成分，從而治療或預(yù)防所述疾病。109.權(quán)利要求108的方法，其中所述受體酪氨酸激酶相關(guān)疾病選自癌癥、年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、動(dòng)脈粥樣硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病和疼痛相關(guān)疾病。110.權(quán)利要求109的方法，其中所述癌癥選自GIST、AML和SCLC。111.結(jié)合人III型受體酪氨酸激酶的D2-D3、D3-D4和/或D4-D5鉸鏈區(qū)的成分，其中所述成分將所述受體酪氨酸激酶的胞外域鎖定在非活性狀態(tài)，從而拮抗受體酪氨酸激酶的活性。112.權(quán)利要求111的成分，其中所述III型受體酪氨酸激酶選自Kit、PDGFRa、PDGFR旦、CSF1R禾口Flk2。113.權(quán)利要求112的成分，其中所述III型受體酪氨酸激酶是人Kit受體。114.權(quán)利要求111的成分，其中所述成分選自分離的抗體或其抗原結(jié)合部分、小分子、肽類分子和adnectin。115.藥物組合物，其包含權(quán)利要求111至權(quán)利要求114中任一項(xiàng)所述的成分和藥學(xué)上可接受的載體。116.治療或預(yù)防對(duì)象中受體酪氨酸激酶相關(guān)疾病的方法，所述方法包括向所述對(duì)象施用有效量的權(quán)利要求111至權(quán)利要求114中任一項(xiàng)所述的成分，從而治療或預(yù)防所述疾病。117.權(quán)利要求116的方法，其中所述受體酪氨酸激酶相關(guān)疾病選自癌癥、年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、動(dòng)脈粥樣硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病和疼痛相關(guān)疾病。118.權(quán)利要求116的方法，其中所述癌癥選自GIST、AML和SCLC。119.用于鑒定結(jié)合受體酪氨酸激酶的Ig樣結(jié)構(gòu)域并將所述受體酪氨酸激酶的胞外域鎖定在非活性狀態(tài)的成分的方法，所述方法包括使受體酪氨酸激酶與候選成分接觸；同時(shí)或順序使所述受體酪氨酸激酶與該受體酪氨酸激酶的配體接觸；以及確定所述成分是否影響配體誘導(dǎo)的二聚體受體酪氨酸激酶的Ig樣結(jié)構(gòu)域之間的定位、定向和/或距離，從而鑒定結(jié)合受體酪氨酸激酶的Ig樣結(jié)構(gòu)域并將受體酪氨酸激酶的胞外域鎖定在非活性狀態(tài)的成分。120.用于鑒定將III型受體酪氨酸激酶的胞外域鎖定在非活性狀態(tài)的成分的方法，所述方法包括使III型受體酪氨酸激酶與候選成分接觸；同時(shí)或順序使所述受體酪氨酸激酶與該受體酪氨酸激酶的配體接觸；以及確定所述成分是否影響配體誘導(dǎo)的二聚體受體酪氨酸激酶的D4-D4或D5-D5結(jié)構(gòu)域之間的定位、定向和/或距離，從而鑒定將III型受體酪氨酸激酶的胞外域鎖定在非活性狀態(tài)的成分。121.結(jié)合人Kit受體的Ig樣結(jié)構(gòu)域或鉸鏈區(qū)上的構(gòu)象表位的分離抗體或其抗原結(jié)合成分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合成分將人Kit受體的胞外域鎖定在非活性狀態(tài)，從而拮抗人Kit受體的活性，并且其中所述構(gòu)象表位由選自表4中所列的氨基酸殘基的兩個(gè)或多個(gè)殘基組成。122.結(jié)合人Kit受體的氨基酸殘基309-413和/或410-519、從而將人Kit受體的胞外域鎖定在非活性狀態(tài)并拮抗人Kit受體的活性的分離抗體或其抗原結(jié)合成分。123.結(jié)合人Kit受體的選自K218、S220、Y221、L222、F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、1371和Y373的至少一個(gè)氨基酸殘基、從而將人Kit受體的胞外域鎖定在非活性狀態(tài)并拮抗人Kit受體的活性的分離抗體或其抗原結(jié)合成分。124.結(jié)合人Kit受體的選自Y350、R353、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386和T390的至少一個(gè)氨基酸殘基、從而將人Kit受體的胞外域鎖定在非活性狀態(tài)并拮抗人Kit受體的活性的分離抗體或其抗原結(jié)合成分。125.包含選自下組的結(jié)構(gòu)的肽類分子YHRKVRPVSSHGDFNY(SEQIDNO:71)、PFVS(SEQIDNO:72)、KAFT(SEQIDNO:73)、LAFKESNIY(SEQIDNO:74)、LLEVFEFI(SEQIDNO75)、RVKGFPD(SEQIDNO76)、KASNES(SEQIDNO77)、KAES(SEQIDNO78)、GTTKEK(SEQIDNO79)、YFGKL(SEQIDNO80)、FVNN(SEQIDNO81)、DNTKV(SEQIDNO82)、GGVK(SEQIDNO83)、LGVV(SEQIDNO84)、YGHRKVRPFVSSSHGDFNY(SEQIDNO85)、PFVS(SEQIDNO72)、KSYLFPKNESNIY(SEQIDNO86)、GGGYVTFFGK(SEQIDN087)、DTKEAGK(SEQIDNO88)、YFKLTRLET(SEQIDNO89)、YRF,ASYLTLEVV(SEQIDNO5)、DKGREG(SEQIDNO6)、TTLEASYL(SEQIDNO:11)、NESNSKASY(SEQIDNO15)、AFPKPNSDV(SEQIDNO18)、AFPKPESNIR(SEQIDNO20),KWEDYVSELH(SEQIDNO:28)、DKWELHLT(SEQIDNO:31)、MNRTFTDKWEHLTRLKGTEGGT(SEQIDNO33)、VNTKPEIAYNDVGKT(SEQIDNO37)、VNTKPEIAGFPEPT(SEQIDNO:39)、VNTKPEIFGKLV(SEQIDNO:41)、VNTKPEIVNDGEN(SEQIDNO:43)、VNTKPEIRLKGTEG(SEQIDNO:45)、GPPFGKLGTEGG(SEQIDNO:48)、VNDGEYNDVGK(SEQIDNO:51)、TKPEILVGKTSA(SEQIDNO:63)、ILTYDRLAYFNFA(SEQIDN066)、AYFNFAKHNGT(SEQIDNO68)和AYFNFAGTEQRC(SEQIDNO:70)。126.由選自下組的結(jié)構(gòu)組成的肽類分子YHRKVRPVSSHGDFNY(SEQIDNO71)、PFVS(SEQIDNO72)、KAFT(SEQIDNO73)、LAFKESNIY(SEQIDNO74)、LLEVFEFI(SEQIDNO75)、RVKGFPD(SEQIDNO76)、KASNES(SEQIDNO77)、KAES(SE0IDNO78)、GTTKEK(SEQIDNO79)、YFGKL(SEQIDNO80)、FVNN(SEQIDNO81)、DNTKV(SEQIDNO82)、GGVK(SEQIDNO83)、LGVV(SEQIDNO84)、YGHRKVRPFVSSSHGDFNY(SEQIDNO85)、PFVS(SEQIDNO72)、KSYLFPKNESNIY(SEQIDNO86)、GGGYVTFFGK(SEQIDN087)、DTKEAGK(SEQIDNO:88)、YFKLTRLET(SEQIDNO:89)、YRF，EWDKGFIN(SEQIDNO:2)、ASYL(SEQIDNO:3)、TLEW(SEQIDNO4).ASYLTLEVV(SEQIDNO:5)、DKG，REG，DKGREG(SEQIDNO6)、VVSVSKASYLL(SEQIDNO7)、VTTTLEVVD(SEQIDNO8)、REGEEFTVTCTI(SEQIDNO9)、TTLE(SEQIDNO10)、TTLEASYL(SEQIDNO:11)、KSENESNIR(SEQIDNO12)、NESN(SEQIDNO:13)、SKASY(SEQIDNO:14)、NESNSKASY(SEQIDNO:15)、AFPKP(SEQIDNO:16)、NSDV(SEQIDNO:17)、AFPKPNSDV(SEQIDNO:18)、ESNIR(SEQIDN0:19)、AFPKPESNIR(SEQIDNO:20)、DKWEDYPKSE(SEQIDNO:21)、IRYVSELHL(SEQIDNO:22)、LTRLKGTEGGT(SEQIDNO:23)、GENVDLIVEYE(SEQIDNO24).MNRTFTDKWE(SEQIDNO:25)、KWEDY(SEQIDNO:26)、VSELH(SEQIDNO:27)、KWEDYVSELH(SEQIDNO:28)、DKWE(SEQIDNO:29)、LHLT(SEQIDNO:30)、DKWELHLT(SEQIDNO:31)、HLTRLKGTEGGT(SEQIDNO32)、MNRTFTDKWE(SEQIDNO:25)、HLTRLKGTEGGT(SEQIDNO32).MNRTFTDKWEHLTRLKGTEGGT(SEQIDNO:33)、VFVNDGENVD(SEQIDNO:34)、VNTKPEI(SEQIDNO:35)、AYNDVGKT(SEQIDNO:36)、VNTKPEIAYNDVGKT(SEQIDNO37)、AGFPEPT(SEQIDNO38)、VNTKPEIAGFPEPT(SEQIDNO39)、FGKLV(SEQIDNO40)、VNTKPEIFGKLV(SEQIDNO41)、VNDGEN(SEQIDNO42)、VNTKPEIVNDGEN(SEQIDNO43)、RLKGTEG(SEQIDNO44)、VNTKPEIRLKGTEG(SEQIDNO:45)、GPPFGKL(SEQIDNO:46)、GTEGG(SEQIDNO:47)、GPPFGKLGTEGG(SEQIDNO:48)、VNDGE(SEQIDNO49)、YNDVGK(SEQIDNO50)、VNDGEYNDVGK(SEQIDNO:51)、TKPEILTYDRL(SEQIDNO:52)、DRLVNGMLQC(SEQIDNO:53)、GKTSAYFNFAFK(SEQIDNO:54),CPGTEQRCSAS(SEQIDNO:55)、CSASVLPVDVQ(SEQIDNO:56)、DSSAFKHNGT(SEQIDNO57)、GTVECKAYND(SEQIDNO58)、LNSSGPPFGKL(SEQIDNO59)、FAFKGNNKEQI(SEQIDNO60)、TKPEIL(SEQIDNO61)、VGKTSA(SEQIDNO62)、TKPEILVGKTSA(SEQIDNO63)、ILTYDRL(SEQIDNO:64)、AYFNFA(SEQIDNO:65)、ILTYDRLAYFNFA(SEQIDNO:66)、KHNGT(SEQIDNO:67)、AYFNFAKHNGT(SEQIDNO:68)、GTEQRC(SEQIDNO69)和AYFNFAGTEQRC(SEQIDNO:70)。全文摘要本發(fā)明提供了結(jié)合人受體酪氨酸激酶(例如人KitRTK或PDGFRRTK)的Ig樣結(jié)構(gòu)域(例如D4或D5)或V型受體酪氨酸激酶的D7結(jié)構(gòu)域的成分，其中所述成分將受體酪氨酸激酶的胞外域鎖定在非活性狀態(tài)，從而拮抗受體酪氨酸激酶的活性。文檔編號(hào)A61K39/00GK101801407SQ200880019071公開日2010年8月11日申請(qǐng)日期2008年6月5日優(yōu)先權(quán)日2007年6月5日發(fā)明者I·拉克斯,J·施萊辛格,Y·奧帕湯斯基,楊艷,湯澤悟申請(qǐng)人:耶魯大學(xué)