專利名稱：：納米大小的乳酸菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及納米大小的乳酸菌，其具有增強由抗原呈遞細胞產(chǎn)生干擾素-a的能力的作用。
背景技術(shù)：
：根據(jù)最新研究，已知幼稚T細胞(以下簡稱ThO細胞)依據(jù)其功能可分化為I型T細胞(以下簡稱Thl細胞)和II型T細胞(以下簡稱Th2細胞)。由Thl細胞的免疫應(yīng)答誘導(dǎo)細胞免疫，導(dǎo)致由巨噬細胞和淋巴細胞之類的單核細胞發(fā)生吞噬作用。而由Th2細胞的免疫應(yīng)答誘導(dǎo)體液免疫，從而發(fā)生由抗體殺滅細菌。Thl細胞因子抑制Th2，反之，Th2細胞因子抑制Thl。這兩種細胞因子協(xié)同作用而維持整體免疫平衡。干擾素-a(IFN-a)是由被病毒、胞內(nèi)寄生性細菌(例如結(jié)核桿菌、沙門氏菌、李斯特菌或麻風分枝桿菌)或胞內(nèi)寄生性真菌(例如隱球菌)感染的樹突細胞(抗原呈遞細胞)分泌的細胞因子。而白介素-12(IL-12)是由抗原呈遞細胞(例如樹突細胞或巨噬細胞)分泌的細胞因子，并且已知是激活直接攻擊癌細胞的自然殺傷細胞(NK細胞)、LAK細胞(LAK細胞)或殺傷性T細胞(CTL細胞)，且增強IFN-Y產(chǎn)生的極強的免疫激活劑。這些IFN-ct和IL-12都是誘導(dǎo)Thl細胞的細胞因子，但發(fā)現(xiàn)抗原呈遞細胞所表達的受體(TLR:Toll-樣受體)不同(當細胞因子為IL-12時，表達的受體是TLRl,TLR3，TLR5和TLR9;當細胞因子為IFN-a時，表達的受體是TLR7和TLR9)。據(jù)報道，增強抗原呈遞細胞產(chǎn)生千擾素-a的乳酸菌及其成分包括短乳桿菌細胞粉末(見專利文獻1:特開平6-206826號公報)、屬于腸球菌屬的乳酸菌及其加工產(chǎn)品(見專利文獻2:特開平8-259450號公報)和短乳桿菌FERMBP-4693的成分提取物(見專利文獻3:特開平9-188627號公報)等。通常選擇IFN-oc產(chǎn)生能力高的菌林，而沒有必要將低活性菌林改造成高活性菌抹，更沒有必要進行這樣的嘗試。雖然短乳桿菌細胞粉末已商品化許多年，但是仍迫切需要增強乳酸菌的IFN-cc產(chǎn)生能力。至今乳酸菌通常以發(fā)酵奶或酸奶的形式攝入。由口攝取的抗原通過覆蓋在淋巴集結(jié)上的M細胞的吞噬作用被攝取。著眼于多大尺寸的抗原可通過淋巴集結(jié)攝取，至今已對顆粒尺寸(粒度)與其被攝取到淋巴集結(jié)的相關(guān)性進行了大量研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當粒度超過10Mm時，由M細胞的吞噬作用顯著下降(見非專利文獻1);還發(fā)現(xiàn)，當顆粒材料是聚乳酸時，可通過淋巴集結(jié)的顆粒的最大尺寸為10jjni(見非專利文獻2);當顆粒材料為聚苯乙烯時，可通過淋巴集結(jié)的顆粒的最大尺寸為15nm(見非專利文獻3);當顆粒材料為可生物降解的聚乳酸時，可通過淋巴集結(jié)的顆粒的最大尺寸為21Mm(見非專利文獻4)。由這些結(jié)果得知，可通過淋巴集結(jié)的粒度最大可達約20"m。根據(jù)將抗原致敏的可生物降解的聚乳酸珠口服施用給大鼠的實驗，由Th2誘導(dǎo)而產(chǎn)生抗原特異性抗體的百分率最高的粒度在所產(chǎn)生抗體為IgG時為4jLim,在所產(chǎn)生抗體為IgA時為7ym。由此得知，優(yōu)于Th2誘導(dǎo)的粒度為約3|am-7jam(見非專利文獻4)。然而，優(yōu)于Thl誘導(dǎo)的粒度至今未有報道。專利文獻l:特開平6-206826號公報專利文獻2:特開平8-259450號公報專利文獻3:特開平9-188627號公報非專利文獻1:TabataY，IkedaY.，Adv.Polym.Sci.，94,107-141，1990非專利文獻2:EidridgeJ.H.，etal.，J.ControlledRel.，11，205-214，1990非專利文獻3:EidridgeJ.H.,etal.,Molec.Immun.，28，287-294,1991非專利文獻4:TabataY.，etai.，Vaccine14，1677-1685，1996
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的問題鑒于上述情況，本發(fā)明旨在提供具有優(yōu)于Thl誘導(dǎo)的粒度、優(yōu)良的INF-a產(chǎn)生能力，以及優(yōu)良的在水中的分散能力的乳酸菌。解決問題的方法本發(fā)明人從京都的"酸莖漬"、長野的"t丄S漬"、格魯吉亞共和國的Mariami和Matsoni-like、蒙古的馬奶酒以及各種發(fā)酵乳制品中分離有益長壽的乳酸菌，并分析了乳酸菌的尺寸與由抗原呈遞細胞產(chǎn)生IL-12和IFN-a的能力的相關(guān)性。結(jié)果，如圖1A所示，當乳酸菌的尺寸減小至1Mm以下時，由乳酸菌刺激而抗原呈遞細胞產(chǎn)生IL-12的能力升高(見參照實施例1)。另一方面，如圖1B所示，當乳酸菌的尺寸減小至1Mm以下時，IFN-ct產(chǎn)生能力也升高(見參照實施例1)。但是，某些菌抹在IL-12產(chǎn)生能力和IFN-a產(chǎn)生能力之間呈負相關(guān)性。例如，像EF、KH1和KH3之類的菌林，其IL-12產(chǎn)生能力高，IFN-a產(chǎn)生能力低；相反，像LL12和ML4之類的菌林則IL-12產(chǎn)生能力低，IFN-a產(chǎn)生能力高。另一方面，發(fā)現(xiàn)菌林SNK具有IL-12產(chǎn)生能力和IFN-a產(chǎn)生能力都相對高的特征。無法從現(xiàn)有技術(shù)推知上述發(fā)現(xiàn)(日本專利申請NO.2007-30324)，推測可能是由抗原呈遞細胞表達的受體對乳酸菌的識別不同所致。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，粒度接近9jam的乳酸菌(如短乳桿菌FERMBP-4693(如表1和圖1A、圖1B、圖2所示"LBR"))的IFN-a產(chǎn)生能力比粒度約lym的乳酸菌顯著低。粒度分布最頻值降低，且阻止細胞本身發(fā)生再凝集的條件。在研究過程中，本發(fā)明人著眼于乳酸菌的表面帶有正(+)電荷，發(fā)現(xiàn)可通過將培養(yǎng)過程和加工過程的pH控制在中性區(qū)，從而使乳酸菌細胞的粒度分布最頻值(以下可簡稱為粒度)降到ljnm以下。已知乳酸菌的形態(tài)一般會隨著各培養(yǎng)條件的變化而變化，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員尚不知，還可通過控制培養(yǎng)過程和加工過程的pH來將乳酸菌的尺寸調(diào)至1jam以下。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，所述細胞可顯著增強由抗原呈遞細胞產(chǎn)生IFN-a的能力。如上所述，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，即使對于粒度大于l.Oym普通的乳酸菌細胞，也可通過在中性pH進行培養(yǎng)及加工處理，而將其粒度調(diào)至1.Ojjm以下；且此乳酸菌可增強由抗原呈遞細胞產(chǎn)生IFN-a的能力，并可提高免疫增強活性，從而完成了本發(fā)明。最近，濃縮的乳酸菌死細胞干粉已逐漸商品化，其旨在通過少量干粉攝入大量乳酸菌。但即使這樣的干粉中的乳酸菌本身的粒度為1.OMm以下，也由于其僅是將濃縮的細胞經(jīng)干燥得到的粉末，當將其加入水中時，所述乳酸菌顆粒會互相吸附而聚集成塊(見參照實施例2)。事實上，在通常的培養(yǎng)條件下存在粒度為1.Qum以下的乳酸菌的可能性低(參見表1)。具體而言，本發(fā)明提供(1)納米大小的乳酸菌細胞，其中所述細胞的粒度分布最頻值(amodevalue)不大于ljam。(2)(l)的細胞，其中所述細胞可通過在乳酸菌的培養(yǎng)過程和加工過程中將培養(yǎng)基的pH控制在中性區(qū)而獲得。(3)(2)的細胞，其中所述細胞可通過將所述培養(yǎng)基的pH控制在5-8而獲得。(4)(2)或(3)的細胞，其中在乳酸菌的培養(yǎng)過程中向培養(yǎng)6基中加入葡萄糖。(5)(1)的細胞，其中所述細胞可通過向含有將pH控制在中性區(qū)的培養(yǎng)基及細胞的培養(yǎng)物中添加和分散分散劑或賦形劑后使生成的分散物經(jīng)冷凍干燥或噴霧干燥而獲得。(6)(1)-(5)中任一項的細胞，其中所述乳酸菌為乳酸乳桿菌。(7)(6)的細胞，其中所述乳酸乳桿菌是短乳桿菌。(8)(7)的細胞，其中所述短乳桿菌是FERMBP-4693菌林。(9)具有免疫增強活性的組合物，其包含(l)-(8)中任一項的細胞。(10)食品、飲料、飼料、化妝品或藥品，其含有(1)-(8)中任一項的細胞或(9)的組合物。(11)生產(chǎn)(l)的細胞的方法，其中在所述乳酸菌的培養(yǎng)過程和加工過程中，將培養(yǎng)基的pH控制在中性區(qū)。(12)(ll)的方法，其中將所述培養(yǎng)基的pH控制在5-8。(13)(ll)的方法，其包括向含有將pH控制在中性區(qū)的培養(yǎng)基及細胞的培養(yǎng)物中添加和分散分散劑或賦形劑后使生成的分散物經(jīng)冷凍干燥或噴霧干燥。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，即使對于粒度大于1.Gjam普通的乳酸菌細胞，也可通過在pH中性區(qū)培養(yǎng)和加工而將其粒度調(diào)至1.0jum以下。因為如上所述獲得的納米大小的乳酸菌細胞可增強由抗原呈遞細胞產(chǎn)生IFN-a的能力，且可提高免疫增強活性，所述細胞被認為是非常有用的細胞。附圖簡述示乳酸菌細胞粒度與IL-12和IFN-ct產(chǎn)生能力的相關(guān)性的坐標圖。[圖2]示由乳酸菌刺激所致的IL-12產(chǎn)生能力與IFN-ct產(chǎn)生能力的相關(guān)性的坐標圖。比較細胞粒度的坐標圖。示乳酸菌粉末的粒度分布(A:頻率％，B:累積量％)的坐標圖。示納米大小的乳酸菌"LABRE"的細胞粒度與其IFN-a產(chǎn)生能力的相關(guān)性的坐標圖。實施方式以下進一步詳細說明本發(fā)明。本發(fā)明的納米大小的乳酸菌細胞的粒度分布最頻值(粒度)不大于1/im。本發(fā)明所述的"粒度分布最頻值"是指示細菌粒度的指數(shù)，且指當測量細胞粒度時，在顆粒分布中相對頻率最高的粒度。可用作本發(fā)明的"納米大小的乳酸菌細胞"的乳酸菌細胞的具體例子包括乳桿菌(如嗜酸乳桿菌、加氏乳桿菌、馬里乳桿菌、植物乳桿菌、布赫納乳軒菌、干酷乳軒菌、約氏乳軒菌(Zac/^^3c/"w51y'o力/^o///)、雞乳桿菌(L3"幽c/"m6^/7//a環(huán))、謹?shù)矸廴闂U菌(^ac^^c/Z/wsa/z^/ororiA)、4豆享L軒菌、鼠李糖乳軒菌(Zacfo6a"7/i/sr力a/zw70Si^)、高力口索酸奶享L軒菌、富寸干酷乳軒菌(Za"(762c///w5>/7araca5"e/)和巻曲乳桿菌)、鏈球菌(如嗜熱鏈球菌)、乳球菌(如乳酸乳球菌)、腸球菌(如糞腸球菌和屎腸球菌)以及雙歧桿菌(如兩歧雙歧桿菌、長雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、短雙歧桿菌和鏈狀雙歧桿菌)等。本發(fā)明的納米大小的乳酸菌細胞可為活細胞或死細胞的形式?；罴毎稍谄渲瞥僧a(chǎn)品后的運輸或展示過程中發(fā)生形態(tài)變化，因此優(yōu)選不再發(fā)生形態(tài)變化的死細胞。已知在培養(yǎng)過程中生長條件惡化的壓力下乳酸菌發(fā)生形態(tài)變化。因此，本發(fā)明調(diào)控培養(yǎng)和加工條件以使乳酸菌在增殖時仍保持形狀均一，并且產(chǎn)生具有上述粒度分布最頻值的納米大小的乳酸菌。具體而言，如上所述著眼于乳酸菌表面帶有正電荷(+)，可通過將培養(yǎng)過程和加工過程的pH控制在中性區(qū)以使膜穩(wěn)定，從而有可能避免分裂細胞仍融合在一起的雙細胞形態(tài)或細胞之間的再吸附。所述"將pH控制在中性區(qū)"的方法可為例如用乳酸之類的酸或氫氧化鈉之類的堿來進行中和。應(yīng)注意的是，本發(fā)明所述"在培養(yǎng)過程和加工過程中將培養(yǎng)基的pH控制在中性區(qū)"，不僅是指在培養(yǎng)過程中將pH控制在中性區(qū)，還指在培養(yǎng)過程完成之后的細胞滅菌、洗滌和濃縮等過程(加工過程)中將pH控制在中性區(qū)。培養(yǎng)過程和加工過程的pH可優(yōu)選為5-8，更優(yōu)選為5.5-7.5。因為葡萄糖的能量利用率最高，優(yōu)選將葡萄糖作為培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的能量來源，優(yōu)選將其在培養(yǎng)基中的含量調(diào)至約5wt%-10wt%?？赏ㄟ^將葡萄糖耗盡的時間點作為培養(yǎng)終點，從而可避免細胞發(fā)生在營養(yǎng)喪失的壓力下發(fā)生的細胞形態(tài)變化。此外，本發(fā)明所述的"納米大小的乳酸菌細胞"優(yōu)選采取經(jīng)分散加工的形式。對分散加工的方法無特定限制。可為例如，于濕條件下用約150kgf/cm2(1.5Mpa)的勻漿器分散所述細菌培養(yǎng)基的方法。在這種情況下，優(yōu)選在培養(yǎng)基中預(yù)先添加已知的分散劑或賦形劑。所述分散劑或賦形劑可有效阻止細胞的再凝集。所述分散劑或賦形劑的添加量隨著細胞的性質(zhì)而不同，但優(yōu)選為細胞重量的1-100倍，更優(yōu)選為細胞重量的2-20倍。優(yōu)選的分散劑或賦形劑可為海藻糖、糊精和脫脂奶等。當需要最終獲得本發(fā)明的"納米大小的乳酸菌細胞"粉末時，在用已知的分散劑或賦形劑等處理細胞后優(yōu)選進行冷凍干燥或噴霧干燥以使細胞不發(fā)生再凝集。這種處理可能獲得在水中的分散能力優(yōu)良的細胞粉末。上述本發(fā)明的納米大小的乳酸菌細胞的粒度已降到不大于1.Ojam的納米級。當通過上述方法將這些細胞制成干粉且在生理消化液中再懸浮時，所述細胞仍保持粒度為1.OMm以下。應(yīng)注意的是，本文所用的"生理消化液"是指通過本領(lǐng)域已知方法制備的人造胃液或人造腸液。本發(fā)明的納米大小的乳酸菌細胞可直接用作產(chǎn)品。但為了提高它們的風味和/或口感或為了使其形成所需形狀等目的，通常通過添加或混合各種成分及進一步混合一種或多種香料來制成最終產(chǎn)品。待添加或混合的所述成分可為例如，各種碳水化合物、乳化劑、甜味劑、酸味劑、水果提取物等。更具體而言，可為例如糖(如葡萄糖、蔗糖、果糖和蜂蜜)、糖醇(如山梨糖醇、木糖醇、赤蘚糖醇、乳糖醇和異麥芽酮糖醇(paratinit))以及乳化劑(如蔗糖脂肪酸酯、甘油脂肪酸脂和卵磷脂)。還可通過混合一種或多種維生素(如維生素A、維生素B、維生素C和維生素E)、草藥提取物(herbextract)、谷類成分、蔬菜成分和牛奶成分等來獲得風味和口感優(yōu)良的Thl誘導(dǎo)劑。所述的香料可為例如，酸奶香料、漿果香料、橙香料、花梨香料、紫蘇香料、柑桔香料、蘋果香料、薄荷香料、葡萄香料、梨香料、乳蛋糕乳脂香料(custardcreamflavor)、桃香料、甜瓜香料、香蕉香料、熱帶水果香料、草藥香料、紅茶香料和咖啡香料之類的香料。它們可單獨使用或組合使用。對各香料的添加量無特定限制，但是從風味的角度考慮，可優(yōu)選添加各香料約G.05wt%-0.5wt%，尤其優(yōu)選約0.lwt%-0.3wt°/。?？蓪⑸鲜霰景l(fā)明的納米大小的乳酸菌細胞制成任意形式，如固體形式或液體形式。具體而言，可通過藥物或食品生產(chǎn)領(lǐng)域已知的方法將它們與可藥用鹽、賦形劑、防腐劑、色素、矯味劑等一起制成各種形式的產(chǎn)品，如飲料、顆粒、片劑和膠嚢。此外，本發(fā)明的納米大小的乳酸菌細胞也可被用于保健食品。所述"保健食品，，是指用于保健或保持和促進健康的與普通食物相比具有一定積極意義的食品。它們的形式可以是液體、半固體或固體。具體例子包括，點心(如餅干、米餅、果凍、甜豆果凍、酸奶酪、蒸或烤的沾有豆醬的面包)、降溫飲品、營養(yǎng)飲料和湯。此外，本發(fā)明的納米大小的乳酸菌細胞也可以各種產(chǎn)品形式用于外用護膚劑，如洗液(美容液)、美容霜、乳液、美容液、化妝品套裝、皮膚牛奶(乳化原液)、化妝膠、粉末、唇霜、唇骨、深層美容化妝品(undermakeupcosmetics)、基礎(chǔ)化妝品(foundations)、防曬化妝品、洗澡水添加劑、身體洗發(fā)水(bodyshampoo)、浴液、香皂、清潔泡沫、軟骨、皮膚粘合貼片、膠凍制劑和氣霧制劑。應(yīng)注意的是，也可根據(jù)需要將在化妝品、準藥品和藥物(如以下將例示的)中普遍采用的各種成分和添加劑與本發(fā)明的納米大小的乳酸菌細胞適宜混合。具體而言，可適宜混合下列物質(zhì)濕潤劑，如甘油、礦脂、尿素、透明質(zhì)酸和肝素；紫外線吸收劑或散射劑，如PABA衍生物(對氨基苯甲酸、"ESCALOL507"(ISPJapanLtd.)等)、肉桂酸衍生物(新肝素(neoheparin)、"PARS0LMCX"(DSMNutritionJapanK丄)、"SUNGUARDB"(ShiseidoCo.,Ltd.)等)、水楊酸衍生物(如水楊酸辛酯)、二苯甲酮衍生物("ASL-24"、"ASL-24S"(ShonanChemicalServices、Inc.)等)、二苯曱酰甲烷衍生物("PARS0LA"、"PARS0LDAM"(DSMNutritionJapanK.K.)等)、雜環(huán)衍生物("TINUVIN"系列等)和氧化鈦；金屬清除劑，如依地酸二鈉、依地酸三鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、酒ii石酸、酒石酸鈉、乳酸、蘋果酸、多聚磷酸鈉、偏磷酸鈉和葡萄糖酸；皮脂抑制劑，如水楊酸、硫磺、咖啡因和丹寧；殺菌消毒劑，如苯扎氯銨、氯節(jié)乙胺和葡萄糖酸氯己定；消炎藥，如鹽酸苯海拉明、氨曱環(huán)酸、愈創(chuàng)藍油烴、甘菊環(huán)、尿嚢素、扁柏酚、甘草酸及其鹽、甘草酸衍生物和甘草次酸；維生素，如維生素A、維生素B(Bl、B2、B6、B12、B15)、葉酸、煙酸、泛酸、生物素、維生素C、維生素D(D2、D3)、維生素E、泛醌和維生素K(K1、K2、K3、K4);氨基酸及其衍生物，如天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、賴氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸、脯氨酸、精氨酸和吡咯烷酮羧酸；皮膚美白劑，如視黃醇、維生素E、磷酸抗壞血酸鎂、維生素C糖苷、熊果芬、曲酸、鞣花酸和胎盤提取物；抗氧化劑，如丁基羥甲苯、丁基羥基茴香醚和沒食子酸丙酯；收斂劑，如氯化鋅、硫酸鋅、酚鋅、氧化鋅和硫酸鋁鉀；糖類，如葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、赤蘚糖醇、甘露糖醇、木糖醇和乳糖醇；各種植物提取物，如甘草、甘菊、馬栗樹、草莓鸛、芍藥根、榲摔、黃芩、黃柏皮、黃連莖、魚腥草和二葉銀杏；以及油成分、表面活性劑、增稠劑、醇類、粉末成分和色素等。實施例將通過下列參照實施例和實施例說明本發(fā)明，但需知本發(fā)明不應(yīng)只限于下列實施例。應(yīng)注意，各乳酸菌的粒度是通過粒度分布分析儀("SALD-3100,"ShimadzuCorporation)測量的。此外，可用商品化的ELISA試劑盒檢測由經(jīng)各乳酸菌刺激的巨噬細胞產(chǎn)生的IL-12和IFN-ot。參照實施例1如表1所示，從京都的"酸莖漬"，長野的"t/^S漬"、格魯吉亞共和國的Mariami和Matsoni-1ike、蒙古的馬奶酒以及各種發(fā)酵乳制品中分離有益長壽的乳酸菌，并在MRS培養(yǎng)基中于36.5°C培養(yǎng)48h,培養(yǎng)期間不調(diào)PH。在培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)物在80。C加熱10分鐘以進行滅菌處理。然后用PBS洗滌細胞，并將細胞濃度調(diào)至10mg/ml。應(yīng)注意的是，表中的縮略語"LBR"指短乳桿菌菌林FERMBP-4693。[細胞粒度與IL-12和IFN-a產(chǎn)生能力的相關(guān)性]乳酸菌細胞粒度與IL-12和IFN-ct產(chǎn)生能力的相關(guān)性分別示于圖1A和圖1B。已證實，當乳酸菌的尺寸(粒度)小于約1pm(見表1、圖1A和圖IB)時，兩種細胞因子IL-12和IFN-cc的產(chǎn)生能力均顯著提高。但是，如圖2所示，發(fā)現(xiàn)一些菌林在IL-12產(chǎn)生能力和IFN-a產(chǎn)生能力之間呈負相關(guān)性。例如，觀察到這樣的特征，即EF、KH1和KH3之類的菌林的IL-12產(chǎn)生能力高，而IFN-a產(chǎn)生能力低，相反，LL12和ML4之類的菌抹的IL-12產(chǎn)生能力低，而IFN-a產(chǎn)生能力高；而SNK則IL-12產(chǎn)生能力和IFN-a產(chǎn)生能力都相對高。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實施例1[納米大小的乳酸菌EF的制備]用已知的添加有5wt。/。葡萄糖的營養(yǎng)培養(yǎng)基在36.5°C培養(yǎng)乳酸菌菌林——糞腸球菌EF,而且在培養(yǎng)期間用20wt。/。的氫氧化鈉水溶液將pH控制在6.5。將葡萄糖耗盡的時間點作為培養(yǎng)終點(培養(yǎng)過程)。在培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)物在80。C加熱IO分鐘以進行滅菌處理，然后用PBS洗滌細胞，并將其細胞濃度調(diào)至10mg/ml(加工過程)。在加工過程中，使pH保持在6.5。測量了在參照實施例1和實施例1中制備的乳酸菌EF細胞的粒度。結(jié)果如圖3所示。如圖3所示，與通過非中和培養(yǎng)的細胞粒度為1.215jam，即大于1.Opm相比，通過中和培養(yǎng)的細胞粒度為0.701Mm，即小于1.0|am。參照實施例2按照實施例1的方法培養(yǎng)乳酸菌菌林——糞腸球菌EF。所述乳酸菌本身的尺寸為0.6Mm(圖4A)，且可選擇性地誘導(dǎo)細胞因子的2mm以下的顆粒的累積分布值為99%(圖4B)。從培養(yǎng)物中濃縮細胞，并在不添加任何賦形劑的情況下將濃縮物噴霧干燥成粉末。將如上所述制備的粉末再分散于水中。結(jié)果如圖4A所示，粒度分布平緩上升到100ym。如圖4B所示，通過淋巴集結(jié)的達到20Mm的顆粒的粒度累積分布為約50%，誘導(dǎo)Th2細胞的3jim-7Mm的顆粒的粒度累積分布為約14%,且誘導(dǎo)Thl細胞的2jum以下的顆粒的粒度累積分布不過1%。從而表明，決不能認為所述誘導(dǎo)Thl應(yīng)答和Th2應(yīng)答的顆粒的混合是生理上優(yōu)選的情況。考慮到體內(nèi)的消化活性，所述粉末也經(jīng)用本領(lǐng)域已知技術(shù)制備的人造胃液和人造腸液處理。即使如此，誘導(dǎo)Thl細胞的2pm以下的顆粒的累積分布也頂多升至10%(圖4)。這樣的累積粒度分布導(dǎo)致了有懸念的結(jié)果，即所期待的乳酸菌本身的功能是否未得到充分展現(xiàn)(頂多約10%)。實施例2[納米大小的乳酸菌一一短乳桿菌的制備]用已知的添加有5wt。/。葡萄糖的營養(yǎng)培養(yǎng)基在36.5°C培養(yǎng)乳酸菌菌林短乳桿菌BP-4693,且在培養(yǎng)期間用20wt。/。的氫氧化鈉水溶液將pH控制在6.5。將葡萄糖耗盡的時間點作為培養(yǎng)終點(培養(yǎng)步驟)。在培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)物在80°C加熱10分鐘以進行滅菌處理，然后用PBS洗滌細胞，添加4倍于所述細胞重量的糊精作為賦形劑。在混合器中分散混合物后，將分散物經(jīng)冷凍干燥制成樣品。將所述樣品在PBS中再懸浮，使其細胞濃度達到10mg/ml(加工步驟)。在加工步驟中，使pH保持在6.5。[細胞粒度和IFN-a產(chǎn)生能力的比較]測量了在參照實施例1和實施例2中制備的短乳桿菌BP-4693的細胞粒度和IFN-a產(chǎn)生能力，結(jié)果如圖5所示。如圖5所示，與在非中和培養(yǎng)(用"LBR"表示)時，細胞粒度和IFN-cc產(chǎn)生能力分別為8.8Mm和16.8pg/ml相比，在中和培養(yǎng)(用"NANO-LBR"表示)時，細胞粒度降到0.7|am，即小于1.0ym,且IFN-ct產(chǎn)生能力為92.9pg/ml，即與非中和培養(yǎng)時相比，產(chǎn)生能力增強了5.5倍。上述結(jié)果證實，可通過將培養(yǎng)過程和加工過程的pH控制在中性區(qū)來將細胞粒度降至1.Qym以下，可通過添加約4倍于細胞重量的賦形劑，并使混合物經(jīng)分散處理，然后冷凍干燥所得分散物來獲得分散能力優(yōu)良的細胞粉末，并且利用所得粉末，巨噬細胞可有效產(chǎn)生干擾素a。權(quán)利要求1.納米大小的乳酸菌細胞，其中所述細胞的粒度分布最頻值不大于1μm。2.權(quán)利要求1的細胞，其中所述細胞可通過將乳酸菌培養(yǎng)過程和加工過程的培養(yǎng)基的pH控制在中性區(qū)而獲得。3.權(quán)利要求2的細胞，其中所述細胞可通過將所述培養(yǎng)基的pH控制在5-8而獲得。4.權(quán)利要求2或3的細胞，其中在乳酸菌的培養(yǎng)過程中向培養(yǎng)基中加入葡萄糖。5.權(quán)利要求l的細胞，其中所述細胞可通過向含有將pH控制在中性區(qū)的培養(yǎng)基及細胞的培養(yǎng)物中添加和分散分散劑或賦形劑后使生成的分散物經(jīng)冷凍干燥或噴霧干燥而獲得。6.權(quán)利要求1-5中任一項的細胞，其中所述乳酸菌為乳酸乳桿菌。7.權(quán)利要求6的細胞，其中所述乳酸乳桿菌是短乳桿菌。8.權(quán)利要求7的細胞，其中所述短乳桿菌是FERMBP-4693菌林。9.具有免疫增強活性的組合物，其包含權(quán)利要求1-8中任一項的細胞。10.食品、飲料、飼料、化妝品或藥品，其含有權(quán)利要求l-8中任一項的細胞或權(quán)利要求9的組合物。11.生產(chǎn)權(quán)利要求1的細胞的方法，其中在所述乳酸菌的培養(yǎng)過程和加工過程中，將培養(yǎng)基的pH控制在中性區(qū)。12.權(quán)利要求ll的方法，其中將所述培養(yǎng)基的pH控制在5-8。13.權(quán)利要求ll的方法，其包括向含有將pH控制在中性區(qū)的培養(yǎng)基及細胞的培養(yǎng)物中添加和分散分散劑或賦形劑后使生成的分散物經(jīng)冷凍干燥或噴霧干燥。全文摘要通過在乳酸菌的培養(yǎng)過程和加工過程中將培養(yǎng)基的pH控制在中性區(qū)(如約5-8)而獲得的乳酸菌細胞的粒度分布最頻值(粒度)為1μm以下。具有如此小粒度的納米大小的乳酸菌細胞具有優(yōu)良的IFN-α產(chǎn)生能力，且在水中的分散能力優(yōu)良。文檔編號A61K9/19GK101686998SQ20088000560公開日2010年3月31日申請日期2008年6月26日優(yōu)先權(quán)日2008年6月26日發(fā)明者菅辰彥,長谷川秀夫申請人:信和藥品株式公司;有限公司生物研;菲營利活動法人日本補助品臨床研究會;宇宙食品株式公司