專利名稱：防治冠狀動脈支架置入術后再狹窄的藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及到一種藥物組合物，特別涉及到一種防治冠狀動脈支架置入術后再狹
窄的藥物組合物及其制備方法。
背景技術：
冠狀動脈性心臟病(CHD)簡稱冠心病，是指因冠狀動脈狹窄、供血不足而引起的 心肌機能障礙和(或)器質性病變，故又稱缺血性心肌病(IHD)。目前我國冠心病的發(fā)病率 為6 7%，全國有近八千萬患者，近年發(fā)病率呈快速增長趨勢，每年死于各種冠心病的人 數(shù)超過100萬。冠狀動脈支架置入術(ICS)的產(chǎn)生成功挽救了眾多冠心病患者的生命，我 國一些大醫(yī)院，支架的使用率達到60% 90%，個別醫(yī)院甚至高達100%。而ICS術后的再 狹窄是其最大的不足，影響了其遠期療效。再狹窄主要是由于支架置入時損傷了血管內皮 細胞并引發(fā)機體免疫反應而導致血管平滑肌迅速增殖和血栓的形成，同時支架的置入并沒 有改善患者病理生理狀態(tài)，原有的病因仍然存在，增加了血栓形成的危險性，因此ICS術后 必須長期服用藥物防治再狹窄。 目前臨床預防以抗凝藥和血小板抑制藥聯(lián)合應用為主，但這只能起到抗凝、抑制 血小板集聚而防止血栓形成，對血管內皮損傷、血管平滑肌增殖作用較小。因此當前臨床尚 無有效防治ICS術后再狹窄的藥物可使用。而且術后防治再狹窄藥多為進口，其價格昂貴， 多為國產(chǎn)藥品的幾倍。支架后患者每年服用國產(chǎn)防治再狹窄藥物費用在l萬元以上，進口 藥在3萬以上，給患者家庭及社會造成較大負擔。 目前我國中藥具有溶栓抗凝作用的藥物研發(fā)剛起步，制劑以水丸和注射劑為主， 膠囊劑比較少。中藥制劑一般具有療效較好、毒副作用較小，受到專家和患者的普遍好評， 但是中藥制劑的制備工藝低下，生物利用度較低，因而達到一定療效所服劑量比較大，臨床 服用不方便，所以臨床迫切需要一種療效確切，安全性好，服用劑量小，方便的藥物問世。
水蛭3 5重量份

發(fā)明內容
本發(fā)明目的在于提供一種治療冠狀動脈支架置入術后再狹窄的藥物組合物；本發(fā) 明的另一個目的在于提供一種治療冠狀動脈支架術后再狹窄的藥物組合物的制備方法。
本發(fā)明藥物組合物原料藥組成為
黑豆400 1500重量份葛根70 200重量份
本發(fā)明藥物組合物原料藥組成優(yōu)選為
黑豆800 1000重量份葛根90 150重量份
本發(fā)明藥物組合物原料藥組成還可以優(yōu)選為
黑豆900重量份葛根100重量份水蛭4. 5重量份，
本發(fā)明藥物組合物原料藥組成還可以優(yōu)選為
黑豆1000重量份葛根150重量份水蛭3重量份。
本發(fā)明藥物組合物原料藥組成還可以優(yōu)選為
水蛭3 5重量份
黑豆850重量份葛根130重量份水蛭4重量份。
本發(fā)明藥物組合物原料藥組成還可以優(yōu)選為
黑豆950重量份葛根140重量份水蛭3. 5重量份。
本發(fā)明藥物組合物原料藥組成還可以優(yōu)選為
黑豆900重量份葛根120重量份水蛭4重量份。
本發(fā)明藥物組合物原料藥組成還可以優(yōu)選為
黑豆850重量份葛根130重量份水蛭4重量份。 本發(fā)明上述藥物組合物的原料藥，經(jīng)常規(guī)工藝提取有效組分后，加入常規(guī)輔料制成腸溶型片劑、膠囊劑、丸劑、膜劑和口服液體制劑。 本發(fā)明藥物組合物制備方法包括如下步驟(本發(fā)明所述的重量份/體積份對應關系是g/ml) 黑豆的制備 A、選取上述重量份的黑豆，蒸餾水清洗干凈，20 3(TC浸泡1 3小時后，120 14(TC高壓蒸煮滅菌0. 5 1. 5小時，冷卻到30 40。C，干燥為豆渣；
B、按以下比例配置各種培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基(體積份分數(shù))蛋白胨O. 5%，牛肉膏0. 5%，NaCl 0. 5%，瓊脂2%，pH值控制在7. 2 7. 4，總體積為1000體積份； 種子培養(yǎng)基(體積分數(shù))葡萄糖l^，蛋白胨l^，NaCl 0. 5%，pH值控制在7. 2 7.4，總體積為5000體積份； 固體培養(yǎng)基步驟A制備獲得的所有豆渣，加入一定量ra值為7. 0 8. 0的水，使固體培養(yǎng)基的含水量為65 75%， 115 125t:滅菌15 30min待用；
C、將1. 5 3. 0體積份納豆枯草芽孢桿菌(106個/ml)接種到步驟B配置的斜面培養(yǎng)基中，28 35t:培養(yǎng)12 20h，取一環(huán)的活化菌種，接入步驟B配置的種子培養(yǎng)基中，28 35°C ， 200r/min搖瓶培養(yǎng)12 20h ; D、取10X的上述種子培養(yǎng)液接種于步驟B所配置的固體培養(yǎng)基中，28 35t:培養(yǎng)90 120h，間時拍打，使其均勻生長。固體發(fā)酵培養(yǎng)物中按l : 12 18的體積加入0. 9%的生理鹽水，4。C浸提20 30h， 5000r/min，離心8 15min，取上清液，先加入硫酸銨使飽和度至20 % ，離心除去雜蛋白，再加入硫酸銨使飽和度至60 % ，攪拌溶解后冷處靜置過夜，離心收集沉淀，沉淀用1Ommol/L p朋.4的硫酸緩沖液溶解，后經(jīng)硫酸銨鹽析分離，進行Superdex75凝膠層析，收集活性部分進行SP S印harose Fast Flow離子交換層析，采用梯度洗脫方法進行洗脫，最后得到高純度的納豆激酶回收液，經(jīng)噴霧干燥后得高純度納豆激酶干粉； 葛根的制備 E、選取上述重量份的葛根粉碎機粉碎，過篩，制成葛根粉，60-80%的(體積份數(shù))乙醇溶液浸泡，使固液比為1 : 10-14，70-85t:加熱回流提取110-130min，回收乙醇后，濃縮得到葛根總黃酮組分的干粉；
水蛭的制備 F、選取上述重量份的水蛭粉碎過8目-40目的藥篩，45_55%的乙醇浸泡30-50min，所得的水蛭浸泡物，7-9倍量60-80%的乙醇55_70°C回流提取2_3次，每次l-2h，回收乙醇后得水蛭素等組分的干粉；
藥物組合的制備 H、將黑豆、葛根和水蛭分別提取所得的各組分干粉混合均勻，備用。 上述黑豆、葛根和水蛭分別提取所得的各組分干粉混合可以按常規(guī)的制劑工藝制
成藥劑學可接受的任意常規(guī)劑型，包括膠囊劑、片劑、顆粒劑、凝膠劑、緩釋劑、口服液。
為使上述劑型能夠實現(xiàn)，需在制備這些劑型時加入藥學可接受的輔料，例如填充
劑、崩解劑、潤滑劑、助懸劑、粘合劑、甜味劑、矯味劑、防腐劑、基質等。填充劑包括淀粉、預
膠化淀粉、乳糖、甘露醇、甲殼素、微晶纖維素、蔗糖等；崩解劑包括淀粉、預膠化淀粉、微
晶纖維素、羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、低取代羥丙纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉
等；潤滑劑包括硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉、滑石粉、二氧化硅等；助懸劑包括聚乙烯吡
咯烷酮、微晶纖維素、蔗糖、瓊脂、羥丙基甲基纖維素等；粘合劑包括，淀粉漿、聚乙烯吡咯烷
酮、羥丙基甲基纖維素等；甜味劑包括糖精鈉、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矯味
劑包括甜味劑及各種香精；防腐劑包括尼泊金類、苯甲酸、苯甲酸鈉、山梨酸及其鹽類、
苯扎溴銨、醋酸氯乙定、桉葉油等；基質包括PEG6000， PEG4000，蟲蠟等。為使上述劑型能
夠實現(xiàn)中藥藥劑學，需在制備這些劑型時加入藥學可接受的其它輔料(范碧亭《中藥藥劑
學》，上?？茖W出版社1997年12月第1版中各劑型記載的輔料)。 本發(fā)明藥物組合物制備方法中黑豆也可以采用如下方法(液體發(fā)酵)制備 1、精選800 1000重量份黑豆，蒸餾水清洗干凈，20-30 °C浸泡l_3h后，
120-14(TC高壓蒸煮滅菌0. 5-1.5h，冷卻到30-4(TC，干燥為豆渣，作為配置各種培養(yǎng)基的
原料； 2、按以下比例配置各種培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基(體積份分數(shù))蛋白胨0.5X，牛肉膏0.5X，NaCl 0.5%，瓊脂2%，pH值控制在7. 0-7. 4，總體積為1000體積份； 種子培養(yǎng)基(體積分數(shù))葡萄糖1%，蛋白胨1%， NaCl 0.5X，pH值控制在7. 0-7. 4，總體積為5000體積份； 基礎發(fā)酵培養(yǎng)基麥芽糖2%，蛋白胨2%， NaCl 0.5%(或者0^12 0.5%)，pH7. 0-7. 4，總體積為10000體積份； 3、將2體積份納豆枯草芽孢桿菌(106個/ml)接種到步驟2配置的斜面培養(yǎng)基中，30-37t:培養(yǎng)14-24h。取一環(huán)活化菌種，接入步驟2配置的液體種子培養(yǎng)基中，30-37°C ，200r/min搖瓶培養(yǎng)14_24h ;取2體積分數(shù)的種子液加入到步驟2配置的基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中，30-37°C ， 200r/min搖瓶培養(yǎng)3d，收集發(fā)酵液5000r/min離心10min，收集上清液。
4、收集的上清液中加入硫酸銨使飽和度至20%，離心除去雜蛋白，再加入硫酸銨使飽和度至60%，攪拌溶解后冷處靜置過夜，離心收集沉淀，沉淀用1Ommol/L pH6. 4的硫酸緩沖液溶解，后經(jīng)硫酸銨鹽析分離，進行Superdex75凝膠層析，收集活性部分進行SPS印harose Fast Flow離子交換層析，采用梯度洗脫方法進行洗脫，最后得到高純度的納豆激酶回收液，經(jīng)噴霧干燥后得高純度納豆激酶干粉；
本發(fā)明藥物組合物制備方法中葛根也可以采用如下方法制備
葛根50_70%的乙醇回流提取，固液比為lg/25ml，600-800W微波間歇輻射2-4次，每次30-50s ;大孔樹脂吸附后，60-80%乙醇洗脫，洗脫液回收乙醇，濃縮干燥得高純度葛根總黃酮。 本發(fā)明藥物組合物制備方法優(yōu)選如為 1、精選1000重量份黑豆，蒸餾水清洗干凈，25t:浸泡2h后，12(TC高壓蒸煮滅菌
lh，冷卻到37t:，干燥為豆渣; 2、按以下比例配置各種培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基(體積分數(shù))蛋白胨O. 5%，牛肉膏0. 5%，NaCl 0. 5X，瓊脂2X，pH值控制在7. 2-7. 4，總體積為1000體積份； 種子培養(yǎng)基(體積分數(shù))葡萄糖1%，蛋白胨1%， NaCl 0.5X，pH值控制在7. 2-7. 4，總體積為5000體積份； 固體培養(yǎng)基步驟1制備獲得的所有豆渣，加入一定量K1值為8. 0的水，使固體培養(yǎng)基的含水量為70X，12rC滅菌20min待用。 3、將2體積份納豆枯草芽孢桿菌(1(f個/ml)接種到步驟2配置的斜面培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)14h。取一環(huán)活化菌種，接入步驟2配置的種子培養(yǎng)基中，3(TC，200r/min搖瓶培養(yǎng)14h。 4、取10^的上述種子培養(yǎng)液接種于步驟2所配置的固體培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)96h，間時拍打，使其均勻生長。固體發(fā)酵培養(yǎng)物中按l : 15的體積加入0.9%的生理鹽水，4t:浸提24h，5000r/min，離心10min，取上清夜，先加入硫酸銨使飽和度至20%，離心除去雜蛋白，再加入硫酸銨使飽和度至60 % ，攪拌溶解后冷處靜置過夜，離心收集沉淀，沉淀用1Ommol/L p朋.4的硫酸緩沖液溶解，后經(jīng)硫酸銨鹽析分離，進行Superdex75凝膠層析，收集活性部分進行SP S印haroseFast Flow離子交換層析，采用梯度洗脫方法進行洗脫，最后得到高純度的納豆激酶回收液，經(jīng)噴霧干燥后得高純度納豆激酶干粉；
5、精選葛根150重量份，粉碎機粉碎，過80目篩，制成葛根粉，65%的(體積分數(shù))乙醇溶液浸泡，使固液比為1 : 12，8(TC加熱回流提取120min，回收乙醇后，濃縮得到葛根總黃酮組分的干粉。 6、精選3重量份的水蛭，粉碎過8目-40目的藥篩，50%的乙醇浸泡40min，所得的水蛭浸泡物，8倍量85%的乙醇60°C回流提取2次，每次1. 5h，回收乙醇后得水蛭素等組分的干粉。 7、將黑豆、葛根和水蛭分別提取所得的各組分干粉混合均勻，備用。
本發(fā)明藥物組合物制備方法還可以優(yōu)選如下步驟 1、精選900重量份黑豆，蒸餾水清洗干凈，25t:浸泡2h后，115t:高壓蒸煮滅菌lh，
冷卻到37t:，干燥為豆渣； 2、按以下比例配置各種培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基(體積分數(shù))蛋白胨O. 5%，牛肉膏0. 5%，NaCl 0. 5X，瓊脂2X，pH值控制在7. 2-7. 4，總體積為1000體積份； 種子培養(yǎng)基(體積分數(shù))葡萄糖1%，蛋白胨1%， NaCl 0.5X，pH值控制在7. 2-7. 4，總體積為5000體積份； 固體培養(yǎng)基步驟1制備獲得的所有豆渣，加入一定量K1值為8. 0的水，使固體培養(yǎng)基的含水量為70X，12rC滅菌20min待用。 3、將2體積份納豆枯草芽孢桿菌(1(f個/ml)接種到步驟2配置的斜面培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)14h。取一環(huán)活化菌種，接入步驟2配置的種子培養(yǎng)基中，3(TC，200r/min搖瓶培養(yǎng)14h。 4、取10^的上述種子培養(yǎng)液接種于步驟2所配置的固體培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)96h，間時拍打，使其均勻生長。固體發(fā)酵培養(yǎng)物中按l : 15的體積加入0.9%的生理鹽水，4t:浸提24h，5000r/min，離心10min，取上清夜，先加入硫酸銨使飽和度至20%，離心除去雜蛋白，再加入硫酸銨使飽和度至60 % ，攪拌溶解后冷處靜置過夜，離心收集沉淀，沉淀用1Ommol/L p朋.4的硫酸緩沖液溶解，后經(jīng)硫酸銨鹽析分離，進行Superdex75凝膠層析，收集活性部分進行SP S印haroseFast Flow離子交換層析，采用梯度洗脫方法進行洗脫，最后得到高純度的納豆激酶回收液，經(jīng)噴霧干燥后得高純度納豆激酶干粉；
5、精選葛根120重量份，粉碎機粉碎，過80目篩，制成葛根粉，70%的(體積分數(shù))乙醇溶液浸泡，使固液比為1 : 12，8(TC加熱回流提取120min，回收乙醇后，濃縮得到葛根總黃酮組分的干粉。 6、精選4重量份的水蛭，粉碎過8目-40目的藥篩，55%的乙醇浸泡40min，所得的水蛭浸泡物，9倍量90%的乙醇60°C回流提取2次，每次1. 5h，回收乙醇后得水蛭素等組分的干粉。 7、將黑豆、葛根和水蛭分別提取所得的各組分干粉混合均勻，備用。
本發(fā)明藥物組合物制備方法還可以優(yōu)選如下步驟 1、精選900重量份黑豆，蒸餾水清洗干凈，25t:浸泡2h后，12(rC高壓蒸煮滅菌lh，
冷卻到37t:，干燥為豆渣； 2、按以下比例配置各種培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基(體積分數(shù))蛋白胨0.5X，牛肉膏0.5X，NaCl 0.5X，瓊脂2X，pH值控制在7. 2-7. 4，總體積為1000體積份； 種子培養(yǎng)基(體積分數(shù))葡萄糖1%，蛋白胨1%， NaCl 0.5X，pH值控制在7. 2-7. 4，總體積為5000體積份； 固體培養(yǎng)基步驟1制備獲得的所有豆渣，加入一定量K1值為8. 0的水，使固體培養(yǎng)基的含水量為70X，12rC滅菌20min待用。 3、將2體積份納豆枯草芽孢桿菌(1(f個/ml)接種到步驟2配置的斜面培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)14h。取一環(huán)活化菌種，接入步驟2配置的種子培養(yǎng)基中，3(TC，200r/min搖瓶培養(yǎng)14h。 4、取10^的上述種子培養(yǎng)液接種于步驟2所配置的固體培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)96h，間時拍打，使其均勻生長。固體發(fā)酵培養(yǎng)物中按l : 15的體積加入0.9%的生理鹽水，4t:浸提24h，5000r/min，離心10min，取上清夜，先加入硫酸銨使飽和度至20%，離心除去雜蛋白，再加入硫酸銨使飽和度至60 % ，攪拌溶解后冷處靜置過夜，離心收集沉淀，沉淀用1Ommol/L p朋.4的硫酸緩沖液溶解，后經(jīng)硫酸銨鹽析分離，進行Superdex75凝膠層析，收集活性部分進行SP S印haroseFast Flow離子交換層析，采用梯度洗脫方法進行洗脫，最后得到高純度的納豆激酶回收液，經(jīng)噴霧干燥后得高純度納豆激酶干粉；
5、精選葛根100重量份，粉碎機粉碎，過80目篩，制成葛根粉，72%的(體積分數(shù))乙醇溶液浸泡，使固液比為1 : 12，8(TC加熱回流提取120min，回收乙醇后，濃縮得到葛根總黃酮組分的干粉。
6、精選4. 5重量份的水蛭，粉碎過8目-40目的藥篩，55%的乙醇浸泡40min，所得的水蛭浸泡物，9倍量80%的乙醇60°C回流提取2次，每次1. 5h，回收乙醇后得水蛭素等組分的干粉。 7、將黑豆、葛根和水蛭分別提取所得的各組分干粉混合均勻，備用。
本發(fā)明藥物組合物制備方法還可以優(yōu)選如下步驟 1、精選950重量份黑豆，蒸餾水清洗干凈，25t:浸泡2h后，12(TC高壓蒸煮滅菌lh，
冷卻到37t:，干燥為豆渣； 2、按以下比例配置各種培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基(體積分數(shù))蛋白胨0.5X，牛肉膏0.5X，NaCl 0.5X，瓊脂2X，pH值控制在7. 2-7. 4，總體積為1000體積份； 種子培養(yǎng)基(體積分數(shù))葡萄糖1%，蛋白胨1%， NaCl 0.5X，pH值控制在7. 2-7. 4，總體積為5000體積份； 固體培養(yǎng)基步驟1制備獲得的所有豆渣，加入一定量K1值為8. 0的水，使固體培養(yǎng)基的含水量為70X，12rC滅菌20min待用。 3、將2體積份納豆枯草芽孢桿菌(1(f個/ml)接種到步驟2配置的斜面培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)14h。取一環(huán)活化菌種，接入步驟2配置的種子培養(yǎng)基中，3(TC，200r/min搖瓶培養(yǎng)14h。 4、取10^的上述種子培養(yǎng)液接種于步驟2所配置的固體培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)96h，間時拍打，使其均勻生長。固體發(fā)酵培養(yǎng)物中按l : 15的體積加入0.9%的生理鹽水，4t:浸提24h，5000r/min，離心10min，取上清夜，先加入硫酸銨使飽和度至20%，離心除去雜蛋白，再加入硫酸銨使飽和度至60 % ，攪拌溶解后冷處靜置過夜，離心收集沉淀，沉淀用1Ommol/L p朋.4的硫酸緩沖液溶解，后經(jīng)硫酸銨鹽析分離，進行Superdex75凝膠層析，收集活性部分進行SP S印haroseFast Flow離子交換層析，采用梯度洗脫方法進行洗脫，最后得到高純度的納豆激酶回收液，經(jīng)噴霧干燥后得高純度納豆激酶干粉；
5、精選葛根140重量份，粉碎機粉碎，過80目篩，制成葛根粉，72%的(體積分數(shù))乙醇溶液浸泡，使固液比為1 : 12，8(TC加熱回流提取120min，回收乙醇后，濃縮得到葛根總黃酮組分的干粉。 6、精選3. 5重量份的水蛭，粉碎過8目-40目的藥篩，55%的乙醇浸泡40min，所得的水蛭浸泡物，9倍量80%的乙醇60°C回流提取2次，每次1. 5h，回收乙醇后得水蛭素等組分的干粉。 7、將黑豆、葛根和水蛭分別提取所得的各組分干粉混合均勻，備用。
本發(fā)明藥物組合物制備方法還可以優(yōu)選如下步驟 1、精選850重量份黑豆，蒸餾水清洗干凈，25t:浸泡2h后，115t:高壓蒸煮滅菌lh，
冷卻到37t:，干燥為豆渣； 2、按以下比例配置各種培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基(體積分數(shù))蛋白胨O. 5%，牛肉膏0. 5%，NaCl 0. 5X，瓊脂2X，pH值控制在7. 2-7. 4，總體積為1000體積份； 種子培養(yǎng)基(體積分數(shù))葡萄糖1%，蛋白胨1%， NaCl 0.5X，pH值控制在7. 2-7. 4，總體積為5000體積份；
9
固體培養(yǎng)基步驟1制備獲得的所有豆渣，加入一定量K1值為8. 0的水，使固體培養(yǎng)基的含水量為70X，12rC滅菌20min待用。 3、將2體積份納豆枯草芽孢桿菌(1(f個/ml)接種到步驟2配置的斜面培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)14h。取一環(huán)活化菌種，接入步驟2配置的種子培養(yǎng)基中，3(TC，200r/min搖瓶培養(yǎng)14h。 4、取10^的上述種子培養(yǎng)液接種于步驟2所配置的固體培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)96h，間時拍打，使其均勻生長。固體發(fā)酵培養(yǎng)物中按l : 15的體積加入0.9%的生理鹽水，4t:浸提24h，5000r/min，離心10min，取上清夜，先加入硫酸銨使飽和度至20%，離心除去雜蛋白，再加入硫酸銨使飽和度至60 % ，攪拌溶解后冷處靜置過夜，離心收集沉淀，沉淀用1Ommol/L p朋.4的硫酸緩沖液溶解，后經(jīng)硫酸銨鹽析分離，進行Superdex75凝膠層析，收集活性部分進行SP S印haroseFast Flow離子交換層析，采用梯度洗脫方法進行洗脫，最后得到高純度的納豆激酶回收液，經(jīng)噴霧干燥后得高純度納豆激酶干粉；
5、精選葛根130重量份，粉碎機粉碎，過80目篩，制成葛根粉，70%的(體積分數(shù))乙醇溶液浸泡，使固液比為1 : 12，8(TC加熱回流提取120min，回收乙醇后，濃縮得到葛根總黃酮組分的干粉。 6、精選4重量份的水蛭，粉碎過8目-40目的藥篩，55X的乙醇浸泡40min，所得的水蛭浸泡物，9倍量90%的乙醇60°C回流提取2次，每次1. 5h，回收乙醇后得水蛭素等組分的干粉。 7、將黑豆、葛根和水蛭分別提取所得的各組分干粉混合均勻，備用。 本發(fā)明所述的具有溶栓抗凝、抑制血管平滑肌增殖作用藥物組合物，可以采用原
料藥提取物來投料制備而成，所述原料藥組成為 黑豆提取物280 350重量份葛根提取物72 120重量份水蛭提取物1 2. 5重量份。 本發(fā)明以黑豆、葛根和水蛭提取組分為主，具有明顯的溶栓抗凝、抑制血管平滑肌增殖作用，可以有效抑制和逆轉冠脈支架置入術后再狹窄動物模型的血管狹窄狀態(tài)，療效確切，價格適中，作用迅速、時間持久，毒副作用小，并且本發(fā)明工藝簡單、成本低廉，能耗低，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。小樣本臨床研究顯示其治療冠狀動脈支架置入術后再狹窄的長期效應優(yōu)于阿司匹林、尿激酶、鏈激酶，基本不存在副作用，非常適合患者的長期服用。
下述實驗例和實施例用于進一步說明但不限于本發(fā)明。
實驗例1藥理試驗
1、試驗方法 取2月齡的烏克坦小型豬27只，隨機分為正常組(9只)、陰性對照組(9只)和治療組(9只)，三組均在GLP實驗室飼養(yǎng)，其中正常組正常飼料飼養(yǎng)，其余兩組高膽固醇、高脂肪飼料飼養(yǎng)，飼養(yǎng)時間為310± 12d。經(jīng)形態(tài)學顯示，兩組小型豬冠狀動脈管徑小于正常小型豬管徑70%為冠狀動脈狹窄動物模型造膜成功。根據(jù)冠脈狹窄情況對陰性對照組和治療組進行支架置入術治療，術前及術中接受常規(guī)同等處置。術后，治療組接受實施例1方法制備得到的本發(fā)明藥物組合物灌胃，其它兩組等體積蒸餾水灌胃，治療IO周，發(fā)現(xiàn)治療前后
①治療前后對模型豬血液高凝狀態(tài)的改善情況陰性對照組的CT2. 2±0. 27min、PT11. 1±0. 38s、 APTT27. 5±0. 37s、 TT14. 2±0. 12s，治療組的CT3. 3±0. 23min、PT12. 4±0. 24s、APTT33. 8±0. 15s、TT17. 2±0. 24s， P < 0. 05 ; ②治療前后對模型豬血脂的調節(jié)作用陰性對照組的血膽固醇為9. 7±0. 29rnmo1/L，甘油三酯為2. 5 ±0. 24mmol/L，治療組的血膽固醇為4. 7 ± 0. 29mmol/L甘油三酯為1. 4±0. 09mmol/L， P < 0. 05 ; ③治療前后對模型豬血液粘稠度的改善情況陰性對照組的低切全血黏度10. 49±0. 31高切全血黏度7. 36±0. 21中切全血黏度7. 1±0. 33血液黏度1. 9±0. 23治療組的低切全血黏度8. 09±0. 31高切全血黏度4. 29±0. 41中切全血黏度4. 9±0. 26血液黏度1. 1±0. 72， P < 0. 05 ; ④治療前后對模型豬體重增長速度的影響陰性對照組的體重增加了3. 2±0. 32kg，治療組的體重增加了 1. 8±0. 41kg， P < 0. 05 ; ⑤治療前后對模型豬冠狀動脈管徑的影響陰性對照組模型豬的冠狀動脈管徑是1. 1±0. 37cm，治療組模型豬的冠脈動脈管徑是正常的1. 7±0. 52cm，P < 0. 05，光鏡下冠狀動脈血管管徑均未見血管平滑肌層的增殖。
實驗例2藥理實驗 取2月齡的烏克坦小型豬18只，隨機分為陽對照組(9只)和治療組(只)，兩組均在GLP實驗室飼養(yǎng)，高膽固醇、高脂肪飲食飼養(yǎng)，飼養(yǎng)時間為310 ± 12d，經(jīng)形態(tài)學顯示，兩組小型豬冠狀動脈管徑小于正常小型豬管徑70%為冠狀動脈狹窄動物模型造膜成功。根據(jù)冠脈狹窄情況，兩組進行支架置入術治療，術前及術中接受常規(guī)同等處置。術后，治療組接受實施例1方法制備得到的本發(fā)明藥物組合物灌胃，陽性對照組接受常量阿司匹林灌胃，灌胃IO周，發(fā)現(xiàn)治療前后 ①治療前后對模型豬血液高凝狀態(tài)的改善情況陽性對照組的CT3. 2±0. 21min、PT12. 1±0. 34s、 APTT37. 5±0. 56s、 TT17. 2±0. 17s， 治療組的CT3. 3±0. 23min、PT12. 4±0. 24s、APTT33. 8±0. 15s、TT16. 8±0. 24s ; ②治療前后對模型豬血脂的調節(jié)作用陽性對照組的血膽固醇為4. 9±0. 35mmo1/L，甘油三酯為1. 6 ±0. 17mmol/L，治療組的血膽固醇為4. 7 ± 0. 29mmol/L甘油三酯為1. 4±0. 09mmol/L ; ③治療前后對模型豬血液粘稠度的改善情況陽性對照組的低切全血黏度8. 45±0. 29高切全血黏度4. 63±0. 37中切全血黏度5. 1±0. 46血液黏度1. 2±0. 07 ;治療組的低切全血黏度8. 09±0. 31高切全血黏度4. 29±0. 41中切全血黏度4. 9±0. 26血液黏度1. 1±0. 72 ; ④治療前后對模型豬體重增長速度的影響治療5周后，陽性對照組的體重增加了 2. 6±0. 32kg，治療組的體重增加了 1.8±0. 41kg; ⑤治療前后對模型豬冠狀動脈管徑的影響陽性對照組模型豬的冠狀動脈管徑是1. 5±0. 45cm，治療組模型豬的冠脈動脈管徑是正常的1. 7±0. 52cm，光鏡下冠狀動脈血管管徑均未見血管平滑肌層的增殖。 通過上述實驗結果可知，本發(fā)明藥物組合物在改善冠狀動脈支架置入術后再狹窄方面優(yōu)于經(jīng)典治療的阿司匹林，且毒副作用少，價格相對低廉，更適于患者長期服用。
實驗例3毒性試驗研究 健康Beagle犬72只，6_8月齡，體重9. 2±0. 9kg，雌雄各半，在清潔實驗室飼養(yǎng)，室溫控制在22±1.『C，濕度60±8%，隨機分為4組高劑量組(正常人體服藥劑量的20倍)、中劑量組(正常人體服藥劑量的10倍)、低劑量組(正常人體服藥劑量的5倍)和空白組。除空白組蒸餾水灌胃以外，其他組本發(fā)明藥物組合灌胃，連續(xù)灌胃9個月，發(fā)現(xiàn)犬的一般生命體征平穩(wěn)，包括體重、攝食、體溫、行為活動、外觀體征、二便及其他系統(tǒng)的功能均正常，且心電圖、血常規(guī)、尿常規(guī)、凝血試驗及其他生化指標均正常，尸解結果顯示機體重要臟器未見毒性反應。 SD雄性大鼠急性毒性試驗結果表明，實驗例1方法制備的本發(fā)明藥物組合物灌胃，因無法測出LD5。，故進行了最大耐受量的測定，本發(fā)明藥物組合物對大鼠灌胃的最大耐受量為105. 2生藥/kg，已遠遠超過臨床用量的50倍，動物未發(fā)生不良反應及死亡，且一般狀況(二便、呼吸、飲食、自主活動等情況)良好。 急性及長期毒性實驗研究顯示，本發(fā)明無毒副作用，長期服用安全。
實驗例4臨床研究
1、方法 該試驗研究選取具有冠心病癥狀、平板運動試驗陽性、核素心肌顯像心肌缺血、冠脈造影顯示血管狹窄< 75X，且排除低血壓、EF < 30%、心率< 50次/min及伴有II度或III度房室傳導阻滯的冠心病患者40例，隨機分為兩組，每組20例，分別記作A組陽性對照組和B組治療組，兩組治療前一般資料沒有明顯差異。兩組冠狀動脈支架置入術術前3天及術后2個月均接受噻氯匹啶(250mg/次，2次/天)的治療，其中A組加服腸溶阿司匹林(300mg/次，1次/天)，B組加服本發(fā)明藥物組合物(1粒/次，兩次/天)；術中均靜脈注射肝素鈉8000-10000U。
2、結果 治療結束1個月后復查，患者胸悶、胸痛癥狀緩解率A組為62%， B組為84X，兩組差異顯著，提示本發(fā)明藥物防止冠狀動脈支架置入術后再狹窄引起心肌缺血的效果優(yōu)于腸溶阿司匹林。治療結束6個月后，兩組患者進行活動平板運動試驗，A組有4例患者為陽性，B組有2例患者為陽性，兩組之間差異顯著，提示本發(fā)明預防冠狀動脈支架置入術后再狹窄引起心肌缺血的效果優(yōu)于阿司匹林；兩組患者進行超聲心動圖檢測左室射血分數(shù)，A組治療前后為43. 3±3. 1% /51. 7±5. 2X，B組治療前后為42. 9±3. 6% /56. 4±4. 7%，兩組之間差異不顯著，提示本發(fā)明增加心臟射血功能方面略優(yōu)于阿司匹林；兩組患者進行冠狀動脈造影顯示冠狀動脈支架置入術后再狹窄(為靶血管直徑狹窄> 50% )的發(fā)生率，A組為10%， B組為5%，兩組之間差異顯著，提示本發(fā)明預防冠狀動脈支架置入術后再狹窄的作用顯著優(yōu)于阿司匹林。
實驗例5臨床實驗
1、實驗總結 需行冠狀動脈支架術的冠心病患者54例，男女各半，年齡在38-62歲，平均年齡48. 5歲；其中不穩(wěn)定型心絞痛24例，急性心肌梗塞30例，不同程度的伴有糖尿病和/或高血脂。 臨床方法冠狀動脈支架置入術后，服用噻氯匹啶(0.25g/次，2次/日)及本發(fā)明藥物組合(1粒/次，2次/日)6個月， 療效評價癥狀改善率100%，54例患者冠狀動脈支架置入術后經(jīng)本發(fā)明治療均未發(fā)現(xiàn)冠脈再狹窄及心絞痛、心肌梗塞等心臟事件發(fā)生。
2、臨床個案 1、康XX男46歲。主訴高血脂病史6年，冠心病病史3年，間斷性胸悶、胸痛4年，運動后心絞痛發(fā)作持續(xù)4min。心電圖(靜息、動態(tài)或負荷試驗)顯示ST段壓低、T波倒置；放射性核素心肌顯影(靜息或負荷試驗)；冠狀動脈造影顯示，單支冠脈狹窄達61%，病變長度13.6cm。冠狀動脈支架置入術后，服用抵克力得(0.25g/次，2次/日)2個月及本發(fā)明藥物組合(1粒/次，2次/日)6個月，癥狀完全緩解，超聲心動圖復查未見再狹窄改變。 2、姜XX女58歲。主訴糖尿病病史12年，胸悶憋氣、胸痛3年，急性心絞痛發(fā)作4次，胸骨中下段壓榨性絞痛，持續(xù)10min，服用硝酸甘油不緩解。冠狀動脈造影顯示，雙支冠脈狹窄，其中一支血管狹窄達76%，病變長度15. 4cm，冠狀動脈支架置入術后，服用噻氯匹啶(0. 25g/次，2次/日)及本發(fā)明藥物組合(1粒/次，2次/日)9個月，治療過程中無臨床再狹窄癥狀及其他心臟事件出現(xiàn)，且心電圖及超聲心動圖檢查未見心肌缺血改變。
下述實施例均能實現(xiàn)上述實驗例的效果。
具體實施例方式實施例1 :腸溶片劑的制備 黑豆8000g 葛根1500g 水蛭35g 1、精選8000g黑豆，蒸餾水清洗干凈，25t:浸泡2h后，(110-13(TC ) 125。C高壓蒸煮滅菌lh，冷卻到37t:，干燥為豆渣；
2、按以下比例配置各種培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基(體積分數(shù))蛋白胨0.5X，牛肉膏0.5X，NaCl 0.5X，瓊脂2X，pH值控制在7. 2-7. 4，總體積為10000ml ; 種子培養(yǎng)基(體積分數(shù))葡萄糖1%，蛋白胨1%， NaCl 0.5X，pH值控制在7. 2-7. 4，總體積為50000ml ; 固體培養(yǎng)基步驟1制備獲得的所有豆渣，加入一定量ra值為8. 0的水，使固體培養(yǎng)基的含水量為70X，12rC滅菌20min待用。 3、將20ml納豆枯草芽孢桿菌(購自中國醫(yī)學科學院微生物研究所，HL986,106個/ml)接種到步驟2配置的斜面培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)14h。取一環(huán)活化菌種，接入步驟2配置的種子培養(yǎng)基中，3(TC，200r/min搖瓶培養(yǎng)14h，制得培養(yǎng)液； 4、取10^的上述種子培養(yǎng)液接種于步驟2所配置的固體培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)96h，間時拍打，使其均勻生長。固體發(fā)酵培養(yǎng)物中按l : 15的體積加入0.9%的生理鹽水，4t:浸提24h，5000r/min，離心10min，取上清夜，先加入硫酸銨使飽和度至20%，離心除去雜蛋白，再加入硫酸銨使飽和度至60 % ，攪拌溶解后冷處靜置過夜，離心收集沉淀，沉淀用1Ommol/L p朋.4的硫酸緩沖液溶解，后經(jīng)硫酸銨鹽析分離，進行Superdex75凝膠層析，收集活性部分進行SP S印haroseFast Flow離子交換層析，采用梯度洗脫方法進行洗脫，最后得到高純度的納豆激酶回收液，經(jīng)噴霧干燥后得高純度納豆激酶干粉；
5、精選葛根1500g，粉碎機粉碎，過80目篩，制成葛根粉，75%的(體積分數(shù))乙醇溶液浸泡，使固液比為l : 12，8(TC加熱回流提取120min，回收乙醇后，濃縮得到葛根總黃酮組分的干粉。 6、精選35g的水蛭，粉碎過8目-40目的藥篩，54%的乙醇浸泡40min，所得的水蛭浸泡物，9倍量72%的乙醇60°C回流提取2次，每次1. 5h，回收乙醇后得水蛭素等組分的干粉。 7、將黑豆、葛根和水蛭分別提取所得的各組分干粉混合均勻，添加腸溶型輔料，包裹制成片劑。 實施例2 :腸溶膠囊的制備 黑豆8000g 葛根900g 水蛭50g 1、精選8000g黑豆，蒸餾水清洗干凈，25t:浸泡2h后，ll(rC高壓蒸煮滅菌lh，冷卻
到37t:，干燥為豆渣； 2、按以下比例配置各種培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基(體積分數(shù))蛋白胨0.5X，牛肉膏0.5X，NaCl 0.5X，瓊脂2X，pH值控制在7. 2-7. 4，總體積為10000ml ; 種子培養(yǎng)基(體積分數(shù))葡萄糖1%，蛋白胨1%， NaCl 0.5X，pH值控制在7. 2-7. 4，總體積為50000ml ;固體培養(yǎng)基步驟i制備獲得的所有豆渣，加入一定量ra值為8. 0的水，使固體培
養(yǎng)基的含水量為70X，12rC滅菌20min待用。 3、將20ml納豆枯草芽孢桿菌(購自中國醫(yī)學科學院微生物研究所，HL986,106個/ml)接種到步驟2配置的斜面培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)14h。取一環(huán)活化菌種，接入步驟2配置的種子培養(yǎng)基中，30°C ， 200r/min搖瓶培養(yǎng)14h。 4、取10^的上述種子培養(yǎng)液接種于步驟2所配置的固體培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)96h，間時拍打，使其均勻生長。固體發(fā)酵培養(yǎng)物中按l : 15的體積加入0.9%的生理鹽水，4t:浸提24h，5000r/min，離心10min，取上清夜，先加入硫酸銨使飽和度至20%，離心除去雜蛋白，再加入硫酸銨使飽和度至60 % ，攪拌溶解后冷處靜置過夜，離心收集沉淀，沉淀用1Ommol/L p朋.4的硫酸緩沖液溶解，后經(jīng)硫酸銨鹽析分離，進行Superdex75凝膠層析，收集活性部分進行SP S印haroseFast Flow離子交換層析，采用梯度洗脫方法進行洗脫，最后得到高純度的納豆激酶回收液，經(jīng)噴霧干燥后得高純度納豆激酶干粉；
5、精選葛根900g，粉碎機粉碎，過80目篩，制成葛根粉，75%的(體積分數(shù))乙醇溶液浸泡，使固液比為l : 12，8(TC加熱回流提取120min，回收乙醇后，濃縮得到葛根總黃酮組分的干粉。 6、精選水蛭50g，粉碎過8目-40目的藥篩，50%的乙醇浸泡40min，所得的水蛭浸泡物，8倍量80%的乙醇60°C回流提取2次，每次1. 5h，回收乙醇后得水蛭素等組分的干粉。 7、將黑豆、葛根和水蛭分別提取所得的各組分干粉混合均勻，添加淀粉和其它輔
料，裝腸溶型膠囊，拋光即成。
實施例3:丸劑 黑豆10000g 葛根1500g 水蛭30g 1、精選10000g黑豆，蒸餾水清洗干凈，25t:浸泡2h后，12(TC高壓蒸煮滅菌lh，冷卻到37t:，干燥為豆渣；
2、按以下比例配置各種培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基(體積分數(shù))蛋白胨0.5X，牛肉膏0.5X，NaCl 0.5X，瓊脂2X，pH 值控制在7. 2-7. 4，總體積為10000ml ; 種子培養(yǎng)基(體積分數(shù))葡萄糖1%，蛋白胨1%， NaCl 0.5X，pH值控制在 7. 2-7. 4，總體積為50000ml ;固體培養(yǎng)基步驟1制備獲得的所有豆渣，加入一定量Kl值為 8.0的水，使固體培養(yǎng)基的含水量為70X，12rC滅菌20min待用。 3、將20ml納豆枯草芽孢桿菌(購自中國醫(yī)學科學院微生物研究所，HL986,106個 /ml)接種到步驟2配置的斜面培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)14h。取一環(huán)活化菌種，接入步驟2配置 的種子培養(yǎng)基中，30°C ， 200r/min搖瓶培養(yǎng)14h。 4、取10^的上述種子培養(yǎng)液接種于步驟2所配置的固體培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)96h， 間時拍打，使其均勻生長。固體發(fā)酵培養(yǎng)物中按l : 15的體積加入0.9%的生理鹽水， 4t:浸提24h，5000r/min，離心10min，取上清夜，先加入硫酸銨使飽和度至20%，離心除去 雜蛋白，再加入硫酸銨使飽和度至60 % ，攪拌溶解后冷處靜置過夜，離心收集沉淀，沉淀用 10mmol/LpH6. 4的硫酸緩沖液溶解，后經(jīng)硫酸銨鹽析分離，進行Superdex75凝膠層析，收集 活性部分進行SP S印haroseFast Flow離子交換層析，采用梯度洗脫方法進行洗脫，最后得 到高純度的納豆激酶回收液，經(jīng)噴霧干燥后得高純度納豆激酶干粉； 5、精選葛根1500g，粉碎機粉碎，過80目篩，制成葛根粉，65%的(體積分數(shù))乙醇 溶液浸泡，使固液比為l : 12，8(TC加熱回流提取120min，回收乙醇后，濃縮得到葛根總黃 酮組分的干粉。 6、精選30g的水蛭，粉碎過8目-40目的藥篩，50%的乙醇浸泡40min，所得的水蛭 浸泡物，8倍量85%的乙醇60°C回流提取2次，每次1. 5h，回收乙醇后得水蛭素等組分的干 粉。 7、將黑豆、葛根和水蛭分別提取所得的各組分干粉混合均勻后，添加腸溶劑進行
包裹，按照常規(guī)方法制成腸溶型丸劑。 實施例4:腸溶膜劑 黑豆9000g 葛根1200g 水蛭40g 1、精選9000g黑豆，蒸餾水清洗干凈，25t:浸泡2h后，115t:高壓蒸煮滅菌lh，冷卻
到37t:，干燥為豆渣； 2、按以下比例配置各種培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基(體積分數(shù))蛋白胨0.5X，牛肉膏0.5X，NaCl 0.5X，瓊脂2X，pH 值控制在7. 2-7. 4，總體積為10000ml ; 種子培養(yǎng)基(體積分數(shù))葡萄糖1%，蛋白胨1%， NaCl 0.5X，pH值控制在 7. 2-7. 4，總體積為50000ml ; 固體培養(yǎng)基步驟1制備獲得的所有豆渣，加入一定量ra值為8. 0的水，使固體培 養(yǎng)基的含水量為70X，12rC滅菌20min待用。 3、將20ml納豆枯草芽孢桿菌(購自中國醫(yī)學科學院微生物研究所，HL986,106個 /ml)接種到步驟2配置的斜面培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)14h。取一環(huán)活化菌種，接入步驟2配置 的種子培養(yǎng)基中，30°C ， 200r/min搖瓶培養(yǎng)14h。 4、取10^的上述種子培養(yǎng)液接種于步驟2所配置的固體培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)96h，間時拍打，使其均勻生長。固體發(fā)酵培養(yǎng)物中按l : 15的體積加入0.9%的生理鹽水， 4t:浸提24h，5000r/min，離心10min，取上清夜，先加入硫酸銨使飽和度至20%，離心除去 雜蛋白，再加入硫酸銨使飽和度至60 % ，攪拌溶解后冷處靜置過夜，離心收集沉淀，沉淀用 10mmol/LpH6. 4的硫酸緩沖液溶解，后經(jīng)硫酸銨鹽析分離，進行Superdex75凝膠層析，收集 活性部分進行SP S印haroseFast Flow離子交換層析，采用梯度洗脫方法進行洗脫，最后得 到高純度的納豆激酶回收液，經(jīng)噴霧干燥后得高純度納豆激酶干粉； 5、精選葛根1200g，粉碎機粉碎，過80目篩，制成葛根粉，70%的(體積分數(shù))乙醇 溶液浸泡，使固液比為l : 12，8(TC加熱回流提取120min，回收乙醇后，濃縮得到葛根總黃 酮組分的干粉。 6、精選40g的水蛭，粉碎過8目-40目的藥篩，55%的乙醇浸泡40min，所得的水蛭 浸泡物，9倍量90%的乙醇60°C回流提取2次，每次1. 5h，回收乙醇后得水蛭素等組分的干 粉。 7、將黑豆、葛根和水蛭分別提取所得的各組分干粉混合均勻后制成顆粒，添加腸
溶劑進行包裹，按照常規(guī)方法制成腸溶型膜劑。 實施例5:口服液 黑豆9000g 葛根1000g 水蛭40g 1、精選9000g黑豆，蒸餾水清洗干凈，25t:浸泡2h后，12(rC高壓蒸煮滅菌lh，冷卻
到37t:，干燥為豆渣； 2、按以下比例配置各種培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基(體積分數(shù))蛋白胨0.5X，牛肉膏0.5X，NaCl 0.5X，瓊脂2X，pH 值控制在7. 2-7. 4，總體積為10000ml ; 種子培養(yǎng)基(體積分數(shù))葡萄糖1%，蛋白胨1%， NaCl 0.5X，pH值控制在 7. 2-7. 4，總體積為50000ml ; 固體培養(yǎng)基步驟1制備獲得的所有豆渣，加入一定量ra值為8. 0的水，使固體培 養(yǎng)基的含水量為70X，12rC滅菌20min待用。 3、將20ml納豆枯草芽孢桿菌(購自中國醫(yī)學科學院微生物研究所，HL986,106個 /ml)接種到步驟2配置的斜面培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)14h。取一環(huán)活化菌種，接入步驟2配置 的種子培養(yǎng)基中，30°C ， 200r/min搖瓶培養(yǎng)14h。 4、取10^的上述種子培養(yǎng)液接種于步驟2所配置的固體培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)96h， 間時拍打，使其均勻生長。固體發(fā)酵培養(yǎng)物中按l : 15的體積加入0.9%的生理鹽水， 4t:浸提24h，5000r/min，離心10min，取上清夜，先加入硫酸銨使飽和度至20%，離心除去 雜蛋白，再加入硫酸銨使飽和度至60 % ，攪拌溶解后冷處靜置過夜，離心收集沉淀，沉淀用 1Ommol/L p朋.4的硫酸緩沖液溶解，后經(jīng)硫酸銨鹽析分離，進行Superdex75凝膠層析，收 集活性部分進行SP S印haroseFast Flow離子交換層析，采用梯度洗脫方法進行洗脫，最后 得到高純度的納豆激酶回收液，經(jīng)噴霧干燥后得高純度納豆激酶干粉；
5、精選葛根1000g，粉碎機粉碎，過80目篩，制成葛根粉，60%的(體積分數(shù))乙醇 回流提取，固液比為lg/25ml，700W微波間歇輻射3次，每次40s ;大孔樹脂吸附后，70%乙 醇洗脫，洗脫液回收乙醇，濃縮干燥。6、精選40g水蛭，粉碎過8目-40目的藥篩，55%的乙醇浸泡40min，所得的水蛭浸泡物，9倍量80%的乙醇60°C回流提取2次，每次1. 5h，回收乙醇后得水蛭素等組分的干 粉。 7、將黑豆、葛根和水蛭分別提取所得的各組分干粉混合均勻后，添加200ml蜂蜜
和800ml蒸餾滅菌水，按照常規(guī)方法制成口服液體制劑。 實施例6:口服液 黑豆13000g 葛根1500g 水蛭40g 1、精選13000g黑豆，蒸餾水清洗干凈，25t:浸泡2h后，12(TC高壓蒸煮滅菌lh，冷
卻到37t:，干燥為豆渣； 2、按以下比例配置各種培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基(體積分數(shù))蛋白胨0.5X，牛肉膏0.5X，NaCl 0.5X，瓊脂2X，pH 值控制在7. 2-7. 4，總體積為10000ml ; 種子培養(yǎng)基(體積分數(shù))葡萄糖1%，蛋白胨1%， NaCl 0.5X，pH值控制在 7. 2-7. 4，總體積為50000ml ; 固體培養(yǎng)基步驟1制備獲得的所有豆渣，加入一定量K1值為8. 0的水，使固體培 養(yǎng)基的含水量為70X，12rC滅菌20min待用。 3、將20ml納豆枯草芽孢桿菌(購自中國醫(yī)學科學院微生物研究所，HL986,106個 /ml)接種到步驟2配置的斜面培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)14h。取一環(huán)活化菌種，接入步驟2配置 的種子培養(yǎng)基中，30°C ， 200r/min搖瓶培養(yǎng)14h。 4、取10^的上述種子培養(yǎng)液接種于步驟2所配置的固體培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)96h， 間時拍打，使其均勻生長。固體發(fā)酵培養(yǎng)物中按l : 15的體積加入0.9%的生理鹽水， 4t:浸提24h，5000r/min，離心10min，取上清夜，先加入硫酸銨使飽和度至20%，離心除去 雜蛋白，再加入硫酸銨使飽和度至60 % ，攪拌溶解后冷處靜置過夜，離心收集沉淀，沉淀用 1Ommol/L p朋.4的硫酸緩沖液溶解，后經(jīng)硫酸銨鹽析分離，進行Superdex75凝膠層析，收 集活性部分進行SP S印haroseFast Flow離子交換層析，采用梯度洗脫方法進行洗脫，最后 得到高純度的納豆激酶回收液，經(jīng)噴霧干燥后得高純度納豆激酶干粉；
5、精選葛根1500g，粉碎機粉碎，過80目篩，制成葛根粉，60%的(體積分數(shù))乙醇 回流提取，固液比為lg/25ml，700W微波間歇輻射3次，每次40s ;大孔樹脂吸附后，70%乙 醇洗脫，洗脫液回收乙醇，濃縮干燥。 6、精選40g水蛭，粉碎過8目-40目的藥篩，55%的乙醇浸泡40min，所得的水蛭 浸泡物，9倍量80%的乙醇60°C回流提取2次，每次1. 5h，回收乙醇后得水蛭素等組分的干 粉。 7、將黑豆、葛根和水蛭分別提取所得的各組分干粉混合均勻后，添加200ml蜂蜜 和800ml蒸餾滅菌水，按照常規(guī)方法制成口服液體制劑。
1權利要求
一種防治冠狀動脈支架置入術后再狹窄的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物的原料藥組成為黑豆400～1500重量份 葛根70～200重量份 水蛭3～5重量份。
2. 如權利要求1所述的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物的原料藥組成為 黑豆800 1000重量份葛根90 150重量份水蛭3 5重量份。
3. 如權利要求1所述的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物的原料藥組成為 黑豆900重量份葛根100重量份水蛭4.5重量份。
4. 如權利要求1所述的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物的原料藥組成為 黑豆1250重量份葛根130重量份水蛭4重量份。
5. 如權利要求1所述的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物的原料藥組成為 黑豆950重量份葛根140重量份水蛭3.5重量份。
6. 如權利要求1所述的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物的原料藥組成為 黑豆600重量份葛根120重量份水蛭4重量份。
7. 如權利要求1所述的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物的原料藥組成為 黑豆850重量份葛根130重量份水蛭4重量份。
8. 如權利要求l-7任一所述的藥物組合物，其特征在于取原料藥經(jīng)常規(guī)工藝提取有效 組分后，加入常規(guī)輔料制成腸溶型片劑、膠囊劑、丸劑、膜劑或口服液體制劑。
9. 如權利要求l-7任一所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟黑豆的制備A、 精選黑豆，蒸餾水清洗干凈，20-3(TC浸泡l-3小時后，120-14(TC高壓蒸煮滅菌 0. 5-1. 5h，冷卻到30-40。C，干燥為豆渣;B、 按以下比例配置各種培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基蛋白胨O. 5%，牛肉膏0. 5%， NaCL 0. 5%，瓊脂2%， pH值控制在 7. 2-7. 4，總體積為1000體積份；種子培養(yǎng)基葡萄糖1%，蛋白胨1%， NaCL 0.5%， pH值控制在7.2-7.4，總體積為5000體積份;固體培養(yǎng)基步驟A制備獲得的所有豆渣，加入K1值為8. 0的水，使固體培養(yǎng)基的含水 量為70X，12rC滅菌20min待用；C、 將106個/ml的2體積份納豆枯草芽孢桿菌接種到步驟B配置的斜面培養(yǎng)基中，30°C 培養(yǎng)14h;取該斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)活化菌種，接入步驟B配置的種子培養(yǎng)基中，3(TC，200r/ min搖瓶培養(yǎng)14h，制得種子培養(yǎng)液；D、 取10X的步驟C種子培養(yǎng)液接種于步驟B所配置的固體培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)96h， 間時拍打，使其均勻生長；固體發(fā)酵培養(yǎng)物中按l : 15的體積加入0.9X的生理鹽水，4t: 浸提24h， 5000r/min，離心10min，取上清夜，先加入硫酸銨使飽和度至20 % ，離心除去雜 蛋白，再加入硫酸銨使飽和度至60%，攪拌溶解后冷處靜置過夜，離心收集沉淀，沉淀用 10mmol/LpH6. 4的硫酸緩沖液溶解，后經(jīng)硫酸銨鹽析分離，進行凝膠層析，收集活性部分進 行離子交換層析，采用梯度洗脫方法進行洗脫，最后得到高純度的納豆激酶回收液，經(jīng)噴霧 干燥后得高純度納豆激酶干粉；葛根的制備E、 葛根粉碎機粉碎，過篩，制成葛根粉，60-80 %的乙醇溶液浸泡，使固液比為 1 : 10-14， 70-85t:加熱回流提取110-130min，回收乙醇后，濃縮得到干粉;水蛭的制備F、 水蛭粉碎過8目-40目的藥篩，45-55X的乙醇浸泡30-50min，所得的水蛭浸泡物用 7-9倍量60-80%的乙醇55-7(TC回流提取1_3次，每次l_2h，回收乙醇后得干粉；G、 將黑豆、葛根和水蛭分別提取所得的各組分干粉混合均勻，備用。
10. 如權利要求9所述的制備方法，其特征在于該方法中黑豆采用如下方法制備A、 取黑豆，蒸餾水清洗干凈，20-30。C浸泡l-3h后，120-140。C高壓蒸煮滅菌0. 5_1. 5h， 冷卻到30-4(TC，干燥為豆渣，作為配置各種培養(yǎng)基的原料；B、 按以下比例配置各種培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基蛋白胨0. 5 % ，牛肉膏0. 5 % ， NaClO. 5 % ，瓊脂2 % ， pH值控制在7. 0_7. 4， 總體積為1000體積份；種子培養(yǎng)基葡萄糖1%，蛋白胨1%， NaCl 0.5%， pH值控制在7.0-7.4，總體積為 5000體積份；基礎發(fā)酵培養(yǎng)基麥芽糖2%，蛋白胨2%，NaCl 0. 5%或CaCl20. 5%，pH7. 0-7. 4，總體 積為10000體積份；C、 將1(f個/ml 2體積份納豆枯草芽孢桿菌接種到步驟B配置的斜面培養(yǎng)基中， 30-37。C培養(yǎng)14-24h;取一環(huán)活化菌種，接入步驟B配置的液體種子培養(yǎng)基中，30-37t:， 200r/min搖瓶培養(yǎng)14_24h ;取2體積的種子培養(yǎng)液加入到步驟B配置的基礎發(fā)酵培養(yǎng)基 中，30-37°C，200r/min搖瓶培養(yǎng)3d，收集發(fā)酵液5000r/min離心10min，收集上清液；D、 收集的上清液中加入硫酸銨使飽和度至20X，離心除去雜蛋白，再加入硫酸銨使飽 和度至60%，攪拌溶解后冷處靜置過夜，離心收集沉淀，沉淀用10mmol/LpH6. 4的硫酸緩沖 液溶解，后經(jīng)硫酸銨鹽析分離，進行凝膠層析，收集活性部分進行離子交換層析，采用梯度 洗脫方法進行洗脫，最后得到高純度的納豆激酶回收液，經(jīng)噴霧干燥后得高純度納豆激酶 干粉。
11. 如權利要求9所述的制備方法，其特征在于該方法中葛根采用如下方法制備 葛根50-70%的乙醇回流提取，固液比為lg/25ml， 600-800W微波間歇輻射2_4次，每次30-50s ;大孔樹脂吸附后，60-80%乙醇洗脫，洗脫液回收乙醇，濃縮干燥得高純度葛根總黃酮。
12. 如權利要求l-7任一所述的藥物組合物在制備具有溶栓、抗凝或抑制血管平滑肌 增殖作用的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種防治冠狀動脈支架置入術后再狹窄的藥物組合物及其制備方法，該藥物組合物以黑豆、葛根和水蛭為原料，該組合物的制備方法為黑豆高溫蒸煮，接種納豆枯草芽孢桿菌發(fā)酵后，逆流提取得納豆激酶干粉；葛根80℃乙醇回流提取后，濃縮干燥得葛根總黃酮干粉；水蛭乙醇回流提取后回收乙醇得到水蛭素，將三個組分混合裝緩釋膠囊即得本品。本發(fā)明有明顯溶栓抗凝、抑制血管平滑肌增殖的作用，可以有效的防治冠脈支架置入術后的再狹窄，且價格低廉，作用迅速、時間持久，毒副作用小，工藝簡單、成本低廉，能耗低，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號A61K36/48GK101766674SQ20081024112
公開日2010年7月7日 申請日期2008年12月30日 優(yōu)先權日2008年12月30日
發(fā)明者鄭鵬 申請人:鄭鵬