專利名稱：冠狀動脈疾病的預測的制作方法
背景技術：
1.發(fā)明領域本發(fā)明涉及一種癥狀發(fā)生前的分析，用于可能發(fā)生冠狀動脈疾病及相關血管病個體的早期鑒定。本發(fā)明描述了基因特異性、蛋白特異性和表位特異性的探針及分子遺傳學和生物化學分析。
2.背景描述冠狀動脈疾病動脈粥樣硬化(或動脈硬化)是用來描述動脈的腔逐漸變窄和硬化的術語。這一疾病過程可能發(fā)生在人體全身的任何動脈。例如，供應大腦的動脈粥樣硬化會引起中風。外周動脈受阻塞時會發(fā)生壞疽。而向心肌供應氧和營養(yǎng)物質(zhì)的動脈受到影響時則發(fā)生冠狀動脈疾病。
冠狀動脈疾病是一種多因素的疾病，它會引起動脈粥樣斑的沉積和供應心肌的動脈的管腔逐漸狹窄。這種斑是由炎癥和免疫細胞的混合物、纖維組織、脂肪類物質(zhì)如低密度脂類(LDL)和它的修飾物及α-脂蛋白組成的。腔變窄或阻塞導致向心肌輸送氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的能力下降，產(chǎn)生心肌梗塞、心絞痛、陣發(fā)性心絞痛和突發(fā)性缺血死亡如心力衰竭。盡管閉塞通常是緩慢進行的，當一部分已經(jīng)形成的動脈粥樣斑脫落并沉積在動脈血管某處造成暫時阻塞時，或更多情況下，當血栓形成發(fā)生在動脈管腔內(nèi)部時，血液供應會突然中斷。在這種情況下根據(jù)阻塞處遠端肌肉血管的血流量，部分心肌組織死亡，引起心肌衰竭并常常導致個體死亡。
盡管存在多種理論，動脈粥樣斑形成的原因和機制還不十分清楚。一種關于動脈粥樣硬化發(fā)病機制的理論涉及如下過程(1)內(nèi)皮細胞功能障礙和/或受損傷，(2)單核細胞募集及巨噬細胞形成，(3)脂類沉淀及修飾，(4)血管平滑肌細胞增生，(5)細胞外基質(zhì)合成。根據(jù)這一理論，動脈粥樣硬化很可能始于某種形式的損傷，可能來自機械壓力或化學應激。機體如何對這種損傷做出應答，決定了是否而且有多么迅速這一損傷惡化為動脈粥樣硬化損傷。動脈粥樣化依次引起動脈腔變窄，而且危及依賴血液中的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的心臟組織。
盡管近期在心血管治療方面的進展已經(jīng)提高了冠狀動脈病病人的預期壽命，這主要是通過降低脂質(zhì)水平手段的提高，損傷發(fā)生后的控制，血液供應的外科手術恢復，異常心臟節(jié)律的抑制和再次梗塞的阻止而實現(xiàn)的。然而，在用早期診斷早期阻止疾病的發(fā)生方面進展甚微。
治療冠狀動脈疾病的一個關鍵問題是合適的診斷方法。通常，這種疾病的最初標志是由心肌缺血和心肌梗塞引起的突發(fā)性死亡。在死于冠狀動脈疾病的人中約有半數(shù)是突然死亡，此外，對于40％-60％確診為患有冠狀動脈疾病的病人而言，心肌梗塞是該病的最初表現(xiàn)。不幸的是，約有40％的這類初發(fā)事件沒有被病人注意到。由于各種各樣的原因，病人對病癥的覺察與冠狀動脈疾病的總數(shù)并不十分相關。(Anderson&Kin，美國心臟學雜志123(5)1312-1323(1992))。
盡管動脈粥樣硬化的病因仍然未知，但疾病易感性的合適診斷可以給病人提供充裕的時間以降低他們發(fā)生冠狀動脈疾病的風險。一種降低冠狀動脈疾病發(fā)病風險的措施是改變病人的生活方式，例如戒煙、鍛煉、減肥和壓力緩釋。其他方法包括藥物介入和使用阿斯匹林來治療高血壓、血膽固醇過高及糖尿病。最后，遺傳學的治療方法有望治療那些罕見的導致心血管病家族史的遺傳性狀(例如，改變載脂蛋白的代謝)。
鑒別高患病風險個體的能力使內(nèi)科醫(yī)生集中防治措施于那些可獲得最大益處的人，并將大大激勵有患病風險的人遵循這樣的措施。
冠狀動脈疾病和炎癥反應的相互關系已經(jīng)積累了證據(jù)表明冠狀動脈疾病和相關的血管病可能始于對動脈內(nèi)皮中某種損傷形式的應答。損傷可能是輕微的，也可能涉及全部內(nèi)皮細胞剝落。損傷的病灶位點引起對血漿組分的滲透性增強，使得血小板和單核細胞粘附在內(nèi)皮或內(nèi)皮下膜的結(jié)締組織上。從激活的血小板或單核細胞釋放的炎癥因子又引起平滑肌細胞從血管中層遷移至血管內(nèi)膜，隨后這些細胞增生。平滑肌細胞合成細胞外基質(zhì)組分導致膠原、彈性纖維和蛋白多糖的積聚。單核細胞也進入內(nèi)膜，轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉毎?，積累脂類物質(zhì)，促進損傷加劇。短暫的或短期存在的損傷事件隨后伴隨著內(nèi)皮細胞的再生、內(nèi)皮功能的恢復和損傷的治愈。然而，異常的炎癥性事件可能引起動脈粥樣斑的發(fā)生。
多年來，流行病學的研究表明個體的遺傳特性是冠狀動脈疾病發(fā)生的一個重要風險因子。心臟病家族史與增加的個體發(fā)生冠狀動脈疾病的風險密切相關。脂類和膽固醇代謝歷來被認為對冠狀動脈疾病有主要的遺傳學影響。例如在家族性的血膽固醇過高中，低密度脂類(LDL)細胞受體缺陷與高水平的血漿低密度脂類及動脈粥化病的早現(xiàn)有關系(Brown和Goldstein，科學191(4223)150-4(1976))現(xiàn)在普遍認為炎癥是動脈粥化病致病過程中的一個重要因素(Munro，Lab Invest.，58249-261(1998)；Badimon等，循環(huán)，873-16(1993)；Liuzzo等N.E.J.M，331(7)417-24(1994)；Alexander，N.E.J.M，331(7)468-9(1994))。排列在血管上的內(nèi)皮細胞受損傷導致炎癥性細胞因子包括IL-1(白細胞介素-1)，TNFα(腫瘤壞死因子α)的積聚，和前列腺素類化合物及生長因子如前列腺素I2(PGI2)、血小板衍生生長因子(PDGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、粒細胞-單核細胞刺激因子(GM-CSF)的釋放。這些因子引起聚集在血管壁內(nèi)的炎癥細胞例如單核細胞的積聚及調(diào)節(jié)。而后單核細胞釋放其它的炎癥介質(zhì)，包括IL-1、TNF、前列腺素E2(PGE2)、bFGF、轉(zhuǎn)化生長因子α及β(TGFα、TGFβ)，所有這些炎癥介質(zhì)募集更多的炎癥細胞到損傷部位，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的行為并引起動脈粥樣化斑的積聚。
幾種炎癥反應的產(chǎn)物，包括IL-1β已經(jīng)在動脈粥樣硬化損傷或冠狀動脈病態(tài)的內(nèi)皮上鑒定出來(Galea，et al.，Ath.Thromb.Vasc.生物學，161000-6(1996))。同樣地，在冠狀動脈疾病患者中測定了血清IL-1β的滴度(Haselai，et al.，心臟學，7624-8(1996))。盡管歷來認為炎癥因子的出現(xiàn)是對損傷或單核細胞激活的應答，同樣也可能是異常的炎癥反應引發(fā)了冠狀動脈疾病或增大了患病可能性。這樣，在這類炎癥反應中出現(xiàn)的細胞因子IL-1和TNF可能部分地決定個體患冠狀動脈疾病的風險。
IL-1基因簇的遺傳學IL-1基因簇位于2號染色體的長臂上(2q13)，在430Kb的區(qū)域內(nèi)(Nicklin等，染色體，19382-4(1994))，它至少包含了IL-1α(IL-1 A)、IL-1β(IL-1B)和IL-1受體拮抗劑(IL-1RN)的基因。激動劑分子IL-1α和IL-1β具有強促炎活性且位于多種炎癥級聯(lián)放大反應的首端。通常通過誘導其它細胞因子如白細胞介素-6和白細胞介素-8，它們的作用致使進入損傷組織的細胞因子激活及再生，導致局部產(chǎn)生血管活性劑，腦發(fā)燒反應和肝的急性期反應。所有這三種IL-1分子都與I型和II型IL-1受體結(jié)合，但僅有I型受體將信號轉(zhuǎn)化至細胞內(nèi)。相反地，II型受體作為一種誘騙受體從細胞膜剝落。因此受體拮抗劑和II型受體在反應中都是抗炎的。
在多種自身免疫病和炎癥性疾病包括類風濕性關節(jié)炎、腸炎、牛皮癬等病的發(fā)病機制中，不合適的IL-1產(chǎn)生是一個重要因素。此外，在IL-1的產(chǎn)率方面存在穩(wěn)定的個體內(nèi)差異，某些變異是由IL-1基因座的遺傳學差異造成的。因而，IL-1基因有理由成為決定炎癥性疾病部分遺傳學可能性的候選者，大多數(shù)炎癥都具有多基因成分的、多因素的病因?qū)W。事實上，IL-1基因的某些等位基因過量表現(xiàn)的證據(jù)正逐漸增加。
遺傳學診斷遺傳學的傳統(tǒng)診斷方法依賴于鑒別異常的基因產(chǎn)物(如鐮刀細胞貧血)或異常的表型(如精神發(fā)育遲緩)。這些方法對發(fā)病晚且表型不易鑒別的遺傳病的使用受到限制，如阿爾茨海默病。現(xiàn)在遺傳學檢測手段的發(fā)展使鑒別表明有發(fā)生疾病可能性的基因突變成為可能，甚至當疾病是多基因源性的。隨著對多因素疾病遺傳學基礎的不斷了解，可以用分子生物學手段診斷的疾病的數(shù)量會不斷增加(參見美國專利號4,582,788；4,666,828；4,801,531；5,110,920)。
遺傳檢測(也稱作遺傳掃描，遺傳分型或分子診斷)可被廣義地定義為在可分析的范圍內(nèi)檢測病人的核酸以決定病人是否帶有引起病態(tài)或與引起病態(tài)的突變相連的突變(或等位基因或多態(tài)性)。連鎖是指基因組上排列緊密的基因序列趨向于一起遺傳的現(xiàn)象。由于共同遺傳的某種選擇性優(yōu)勢，兩段序列也會連鎖。
遺傳病易感性的早期檢測為醫(yī)療介入提供了最佳時機。早期遺傳學診斷通過預測及在臨床可測的病癥發(fā)生前早期介入為病人提供預后方案。在多個成功治愈具有相似病癥病人的例子中，熟練的遺傳學檢測方法能夠區(qū)分具有細微或無法測定差別的每個病人，并能提出更加適合于個體的治療方案。早期介入將來甚至可能涉及基因治療這樣的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種新方法，用于發(fā)生冠狀動脈疾病及相關血管病易感性的早期檢測。還提供了早期檢測所述易感性的試劑盒及鑒別其他與該病相關的等位基因的方法。
一般地，預測冠狀動脈疾病增加的風險率的方法包括檢測選自由IL-1RN等位基因2和IL-1B等位基因2組成的組的等位基因的至少一個拷貝的存在。具有一或多個這些等位基因意味著冠狀動脈疾病的風險率增加?？梢酝ㄟ^分析IL-1區(qū)的DNA直接檢測等位基因，或通過分析RNA或DNA的蛋白產(chǎn)物間接檢測。
在另一個實施方案中，本發(fā)明可描述如下從病人體內(nèi)分離核酸，鑒別呈現(xiàn)在IL-1基因蔟上的一或多個等位基因，將一或多個等位基因與對照樣品相比較。對照樣品包括IL-1基因簇上已知與冠狀動脈疾病相關的至少一個等位基因。在優(yōu)選的實施方案中，對照樣品包括IL-1RN(VNTR)等位基因2和/或IL-1B(-511)等位基因2。鑒別的來自病人體內(nèi)的等位基因與對照樣品的相似性表明了病人對冠狀動脈疾病的易感性。
本發(fā)明的另一個實施方案是檢測預示冠狀動脈疾病的等位基因的試劑盒。試劑盒一般包括至少一條與IL-1基因家族的DNA互補的寡核苷酸，和一個對照樣品。正如上面提到的，對照樣品是一個已知與冠狀動脈疾病有關的等位基因。試劑盒也可以包括DNA制樣工具，DNA純化工具，和PCR試劑。此外，寡核苷酸可以帶有可檢測的標記。
本發(fā)明的另一個實施方案提供了一種鑒別與冠狀動脈疾病相關的等位基因的方法。該方法包括收集第一組沒有冠狀動脈疾病的病人群組，收集第二組有冠狀動脈疾病的病人群組(由血管學證據(jù)決定)，鑒別第一和第二群組中IL-1等位基因的存在。與第一群組相比，在第二群組中過量存在的等位基因被認為與冠狀動脈疾病有關。
本發(fā)明其余的實施方案和有益效果在下文敘及，而且從本發(fā)明的描述看它們是明顯的或者可以從發(fā)明的實施中得知。
優(yōu)選實施方案詳述正如本文廣泛而具體描述的，本發(fā)明提供了預測病人發(fā)生冠狀動脈疾病易感性的方法及診斷試劑盒，寡核苷酸探針和這些方法中用到的其他試劑。本發(fā)明還提供了一種鑒別與冠狀動脈疾病相關的遺傳標記的方法。
本文所用的短語冠狀動脈疾病是指本領域的熟練人員普遍認可的、與供應心臟的大血管或中等血管中動脈粥樣化沉積有關的疾病或狀態(tài)。這樣，冠狀動脈疾病的意思是指以冠狀動脈粥樣化的病理學為基礎的臨床綜合癥(包括但不局限于心絞痛，心肌梗塞，陣發(fā)性心絞痛和突發(fā)性缺血死亡)。
術語標記描述在個體間變化的DNA區(qū)域。例如，本文描述了來自IL-1RN的“VNRT”標記。一個給定標記上的不同序列變體稱為等位基因或多態(tài)性?！癡NRT”標記具有至少5個不同的等位基因，其中的3個罕見。不同的等位基因可能只有一個堿基的變化，包括取代，插入或缺失，也可能有一個影響多個堿基的變化，包括取代，插入，缺失，重復，倒位和其組合。等位基因可以在人體DNA上直接檢測或者用RNA或蛋白質(zhì)間接檢測。
本文所用的檢測等位基因的方法被不同地描述為基因分型，測定或鑒別等位基因或多態(tài)性，或任何類似的短語。實際測定的等位基因可能是一個引發(fā)疾病的突變，或是一個與引發(fā)疾病的突變相連的突變。
本文所用的術語IL-1基因簇或IL-1基因座，包括所有位于或鄰近第二號染色體上2q13區(qū)的核酸，至少包括IL-1A，IL-1B和IL-1RN基因及任何其他相連的序列。
術語IL-1RN(VNRT)等位基因2描述了IL-1RN基因的VNTR標記的第二個等位基因。這個等位基因的特征是具有兩個VNTR重復的拷貝，用本文描述的引物擴增時產(chǎn)生一個240堿基對的產(chǎn)物。
術語IL-1B(-511)等位基因2描述了IL-1B基因的-511標記的第二個等位基因。這個等位基因帶有一個Bsu36I位點，用本文描述的引物擴增并用Bsu36I消化后產(chǎn)生190堿基對和114堿基對的片段。
患病的可能性或傾向或易感性，意思是某些等位基因被發(fā)現(xiàn)與某種特定的疾病狀態(tài)有關。與健康人相比它們在患者中過量顯現(xiàn)。因此，這種等位基因的出現(xiàn)表明個體有患病的危險。
本發(fā)明涉及通過對病人IL-1基因座DNA的基因分型分析預測病人患冠狀動脈疾病的傾向或易感性的方法。將病人的基因型與包含一或多個已知與疾病狀態(tài)關聯(lián)或相關的IL-1等位基因變體的對照樣品相比較。對照樣品可以包含IL-1RN等位基因2和/或IL-1B等位基因2及與它們相連的等位基因，或按照本文描述的方法鑒別出的其他基因。對照樣品中的等位基因可以是基因組的形式，或是克隆自IL-1基因簇的DNA序列，或是適于進行分析的終產(chǎn)物。例如，在分析涉及單克隆檢測特異性表位時，對照樣品可以包含所述等位基因的相應表位或蛋白。
測定特定標記存在的技術可以是以雜交，片段大小或序列為基礎的核酸技術，例如限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)或核酸測序。
這些技術也可以包括分析前擴增核酸的步驟。擴增技術對本領域的熟練人員而言是已知的，包括克隆，聚合酶鏈反應(PCR)，特異等位基因的PCR(PASA)，聚合酶鏈連接，巢式聚合酶鏈反應等。擴增產(chǎn)物可以用多種方法分析，包括片段大小分析，限制性內(nèi)切酶消化后片段大小分析，檢測反應產(chǎn)物中特殊標記的寡核苷酸引物，等位基因特異性的寡核苷酸(ASO)雜交，序列測定等等。
此外，如果一個特定的等位基因產(chǎn)生了帶有一個氨基酸變體的蛋白，等位基因檢測技術可以是以蛋白質(zhì)為基礎的。例如，氨基酸變體的特異性表位可以用單克隆抗體檢測。
本發(fā)明還提供了一種鑒別其他有發(fā)生冠狀動脈疾病可能性的IL-1等位基因的方法。將患病病人與未患病病人中存在的IL-1等位基因相比較，以決定是否患病病人中某一等位基因過量顯現(xiàn)。等位基因可以是已經(jīng)存在的已知的IL-1等位基因，或者其他的標記可以用任何本領域已知的技術鑒別，包括那些基因鄰近區(qū)域的DNA的序列測定。
本發(fā)明的另一個實施方案提供了檢測病人冠狀動脈疾病易感性的診斷試劑盒。試劑盒可在癥狀發(fā)生前或產(chǎn)前使用。診斷試劑盒可以包括一或多個能夠與來自IL-1基因簇的核酸雜交的寡核苷酸。用所提供的寡核苷酸，許多分析方式對基因分型是有用的。最常見的方式涉及核酸結(jié)合在諸如濾膜，玻璃珠或微量滴定板等物質(zhì)上。涉及的技術包括斑點印跡法，RNA印跡法，DNA印跡法，PCR，F(xiàn)RLP等等。
寡核苷酸可以是各種天然的或合成的組分，例如合成的寡核苷酸，限制性酶切片段，cDNAs，合成的PNA(蛋白核酸)等。分析也可采用標記的寡核苷酸使分析易于鑒別?？墒褂玫臉擞浀睦影ǚ派湫詷擞?，酶，熒光化合物，鏈霉抗生物素蛋白，抗生物素蛋白，生物素，磁組分，金屬結(jié)合組分，抗原或抗體組分等等。
試劑盒也可以包括DNA制樣工具，例如AmpliCardTM(Sheffield大學，Sheffield，英國S10 2JF)，在Tarlow JW等人的皮膚病學調(diào)查，103387-389(1994)中也有記載，這篇文獻引入本文作參考。其他合適的DNA制樣工具包括DNA純化工具和PCR試劑，例如10倍的反應緩沖液，熱穩(wěn)定性的聚合酶，和/或脫氧核苷三磷酸。
下面的例子描述了本發(fā)明的實施方案，但不應視為限制本發(fā)明的范圍。
實施例1單血管冠狀動脈疾病的標記本研究的目的是檢測帶有冠狀動脈疾病早期表現(xiàn)形式，即單血管冠狀動脈疾病的病人是否在下列基因中更可能具有特異的等位基因IL-1A(-889標記)，IL-1B(-511和+3953標記)，IL-1RN(VNTR標記)或TNFα(-308標記)。多血管病通常在涉及多種使數(shù)據(jù)解釋復雜化的因子的疾病后期表現(xiàn)出來。因而，表現(xiàn)出胸部疼痛癥狀的病人由心臟學家評價，有不止一條冠狀動脈明顯粥樣硬化血管學證據(jù)的病人從分析中排除出去。
病人群組用傳統(tǒng)技術堿性股或臂動脈的血管造影。在被檢查的病人中，85人在血管學上沒有明顯的腔不規(guī)則，被分為血管學上具有正常冠狀動脈的對照組。目測時如果心外膜的三條冠狀血管之一帶有引起腔直徑50％縮減的心外膜狹窄，則病人被分為單血管病組。58個病人患有單血管病。多血管病的病人被排除。對照組和單血管病組具有可比的平均年齡，分別為57.6±10.4歲和56.4±9.4歲。對照組中男性與女性的比例是1∶1.7，疾病組中的比例是2.6∶1。
一般方法涉及核酸技術的反應及操作除說明的之外，大體按照薩姆布魯克等人在分子克隆實驗手冊，冷泉港實驗室出版(1989)中描述的那樣操作。聚合酶鏈反應(PCR)一般按照PCR方案方法和應用指南，學術出版社，圣地亞哥，CA(1990)描述的那樣進行。基因分型方法學按照美國專利4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659；5,272,057和Mcdowell等人在關節(jié)炎與風濕病，38(2)221-8(1995)中描述的那樣操作。
DNA的制備用改良的鹽析方法(NucleaonIITM，Scotlab，英國)從全血中提取DNA。
IL-1RN的基因分型分析Tarlow等人，人類遺傳學，91403-4(1993)先前描述過與IL-1RN相關的等位基因。PCR反應中用的酶來自Promaga(英國)。熱循環(huán)儀是MJ Research DNA Engine或Biometre。用ABI合成儀合成下列引物5’CTCAGCAACACTCCTAT3’ (SEQ ID No.1)5’TCCTGGTCTGCAGGTAA3’ (SEQ ID No.2)在鎂離子終濃度為1.75毫摩爾，循環(huán)流程96℃1分鐘1個循環(huán)；(94℃1分鐘，60℃1分鐘，70℃1分鐘)30個循環(huán)；70℃2分鐘1個循環(huán)的條件下進行PCR擴增。PCR擴增后不同的等位基因在用溴化乙錠染色的2％的瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外光下顯影并鑒別。每次實驗都做不帶DNA的陰性對照。
IL-1RN基因的第二個內(nèi)含子包含一個可變數(shù)串聯(lián)重復區(qū)(VNTR)，產(chǎn)生的5個等位基因如下等位基因1包含4個串聯(lián)重復，表現(xiàn)為412個堿基對的PCR產(chǎn)物；等位基因2包含2個串聯(lián)重復，表現(xiàn)為240個堿基對的PCR產(chǎn)物；等位基因3包含3個串聯(lián)重復，表現(xiàn)為326個堿基對的PCR產(chǎn)物；等位基因4包含5個串聯(lián)重復，表現(xiàn)為498個堿基對的PCR產(chǎn)物；等位基因5包含6個串聯(lián)重復，表現(xiàn)為584個堿基對的PCR產(chǎn)物；IL-1B(-511)的基因分型分析diGiovine在人類分子遺傳學，1(6)450(1992)中描述了IL-1B的-511標記。IL-1B-511堿基處單堿基變化(C/T)標記基于等位基因1(C)的AvaI位點和等位基因2(T)的Bsu36I位點被鑒別。在95℃2分鐘1個循環(huán)，(95℃1分鐘，53℃1分鐘，74℃1分鐘)35個循環(huán)；74℃4分鐘1個循環(huán)的條件下進行PCR。PCR產(chǎn)物分析是用限制性內(nèi)切酶AvaI和Bsu36I在37℃消化8小時，再用8％的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析片段大小。下列引物用ABI DNA合成儀合成(Clark等，Nucl.Acids.Res.，147897-7914(1986)[印刷錯誤刊登在Nucl.Acids.Res.，15(2)868，(1987)]；GENBANK X04500)5’TGGCATTGATCTGGTTCATA3’(-702/-682) (SEQ IDNo3)5’GTTTAGGAATCTTCCCACTT3’(-417/-397) (SEQ IDNo4)結(jié)果IL-1A(-899標記)，IL-1B(+3953標記)，或TNF α(-308標記)基因上不同等位基因的頻率在對照組與疾病組之間并無顯著差別。然而，IL-1RN基因VNTR標記的等位基因2在單血管病病人中明顯過量顯現(xiàn)，相對對照組為41％比22％。據(jù)估計，帶有至少一個等位基因2拷貝的人患單血管冠狀動脈疾病的可能性是等位基因2陰性的人的2.44倍(概率＝2.44，p＝0.003，95％置信區(qū)間＝1.35-4.43)。
此外，帶有兩個拷貝的人，即IL-1RN等位基因2是純合子的人患單血管冠狀動脈疾病的可能性是等位基因2陰性的人的5.36倍(概率＝5.36，p＝0.005，95％置信區(qū)間＝1.6-17.97)。
與對照組的38％相比，IL-1B基因-511標記等位基因2一個拷貝的攜帶情況在單血管冠狀動脈疾病中增至52％。據(jù)估計，帶有至少一個等位基因2拷貝的人患單血管冠狀動脈疾病的可能性是等位基因2陰性的人的1.74倍。這一結(jié)果并不十分顯著，但小量的樣本限制了研究。
這些發(fā)現(xiàn)表明IL-1RN的等位基因2是冠狀動脈粥樣硬化易感性的標志。根據(jù)該疾病相關等位基因的一個(雜合子)或兩個(純合子)拷貝，這個等位基因與2.4至5.4倍的冠狀動脈疾病增加風險相關。相對于其他常見的風險因子，該等位基因?qū)跔顒用}疾病風險的影響見表1。
此外，發(fā)現(xiàn)IL-1B基因的一個等位基因與單血管冠狀動脈疾病有關，這個等位基因與1.74倍的冠狀動脈疾病增長風險相關。
表1<
實施例2多血管冠狀動脈疾病的標記本研究的目的是檢測帶有冠狀動脈粥樣硬化晚期形式或彌散形式的病人，即多血管冠狀動脈疾病的病人是否更有可能在IL-1或TNFα基因簇的基因上具有特異的等位基因。
病人群組除了目測時不止一條心外膜冠狀血管帶有引起腔直徑＞50％縮減的心外膜狹窄的病人被分為患多血管冠狀動脈疾病之外，按照例1對病人群組進行檢測。在被檢查的病人中，86人被分為血管學上具有正常冠狀動脈的對照組，315人被發(fā)現(xiàn)患有多血管冠狀動脈疾病。對照組和多血管疾病組具有可比的平均年齡，分別為57.6±10.4歲和60.8±1.13歲。對照組中男性與女性的比例為1∶1.7，疾病組中的比例為2.6∶1。
一般方法反應和方法同實施例1。
結(jié)果對照組和疾病組病人在IL-1A(-899標記)，IL-1B(+3953標記)，IL-1RN(VNTR標記)基因不同等位基因的頻率上無顯著差別。然而，IL-1B基因-511標記的Bsu36I等位基因(等位基因2)一個拷貝的攜帶情況在多血管病病人中增加，相對于對照為54％比38％。據(jù)估計，帶有至少一個-511標記等位基因2拷貝的人患多血管冠狀動脈疾病的可能性是等位基因2陰性的人的1.92倍。(概率＝1.92，p＝0.009，95％置信區(qū)間＝1.17-3.16)。-511標記至少在這一群體中未表現(xiàn)出劑量效應。
總之，IL-1B的一個等位基因被發(fā)現(xiàn)與多血管冠狀動脈疾病相關。這個等位基因與1.92倍的冠狀動脈疾病增長風險率相關。
單血管與多血管冠狀動脈疾病分別顯示出與IL-1基因簇的不同基因有關。IL-1R.A.以產(chǎn)生單血管病表型的方式調(diào)節(jié)IL-1β的作用，可能是它們之間真正的生物學差別。此外，可能事實上兩個基因作為一個整體與冠狀動脈疾病相關，而這里觀察到的聯(lián)系是表現(xiàn)出冠狀動脈疾病的特定基因總數(shù)作用的結(jié)果。無論是何種解釋，IL-1的生物學與冠狀動脈疾病之間已建立起緊密的聯(lián)系。
通過研究說明書及實施本文公開的發(fā)明，本發(fā)明的其它實施方案及用途對本領域的熟練人員是顯而易見的。本文引用的全部文獻引入本文作參考。就后文權利要求表示的本發(fā)明的真實范圍和精神而言，說明書和實施例僅應被視作示范性的。
權利要求
1.一種檢測病人對冠狀動脈疾病易感性的方法，所述的方法包括a.測定病人IL-1基因座的第一個等位基因；和b.將該第一個等位基因與第二個等位基因作比較，i.其中已知第二個等位基因與冠狀動脈疾病有關；ii.其中第一個等位基因與第二個等位基因的相似性表明對冠狀動脈疾病的易感性。
2.權利要求1所述的方法，其中第二個等位基因選自由IL-1RN(VNTR)等位基因2和IL-1B(-511)等位基因2組成的組。
3.權利要求2所述的方法，其中測定第一個等位基因的方法包括核酸的限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析。
4.權利要求2所述的方法，其中測定第一個等位基因的方法包括核酸的PCR擴增。
5.權利要求2所述的方法，其中測定第一個等位基因的方法包括蛋白質(zhì)的表位檢測。
6.權利要求4所述的方法，其中PCR擴增是用選自下列一組的PCR引物進行5’CTCAGCAACACTCCTAT3’ (SEQ ID No.1)；5’TCCTGGTCTGCAGGTAA3’ (SEQ ID No.2)；5’TGGCATTGATCTGGTTCATC3’(SEQ ID No.3)；5’GTTTAGGAATCTTCCCACTT3’(SEQ ID No.4)；
7.檢測病人對冠狀動脈疾病的易感性的方法，所述的方法包括a.從病人體內(nèi)分離DNA；b.分析所述DNA以測定第一個等位基因；c.將所述的第一個等位基因與預示冠狀動脈疾病的第二個等位基因相比較，其中所述的第一個等位基因與所述的第二個等位基因的相似性表明對冠狀動脈疾病的易感性。
8.權利要求7所述的方法，其中所述的第二個等位基因來自IL-1基因座。
9.權利要求8所述的方法，其中所述的第二個等位基因是IL-1RN(VNTR)等位基因2和IL-1B(-511)等位基因2。
10.權利要求8所述的方法，其中所述的分析是用包含下列步驟的方法進行a.在聚合酶鏈反應中擴增DNA以產(chǎn)生擴增產(chǎn)物；b.大小分級分離擴增產(chǎn)物。
11.權利要求10所述的方法，其中聚合酶鏈反應是用選自下列一組的一或多條寡核苷酸進行5’CTCAGCAACACTCCTAT3’ (SEQ ID No.1)；5’TCCTGGTCTGCAGGTAA3’ (SEQ ID No.2)；5’TGGCATTGATCTGGTTCATC3’(SEQ ID No.3)；5’GTTTAGGAATCTTCCCACTT3’(SEQ ID No.4)；
12.權利要求11所述的方法，其中所述的一或多條寡核苷酸具有可檢測的標記。
13.權利要求11所述的方法，其中所述的第二個等位基因是IL-1RN(VNTR)等位基因2或IL-1B(-511)等位基因2。
14.預測冠狀動脈疾病的試劑盒，所述的試劑盒包括a.至少一條與IL-1基因簇中的DNA序列互補的寡核苷酸；b.一個對照樣品，其中所述的對照樣品是至少一個已知與冠狀動脈疾病相關的等位基因。
15.權利要求14所述的試劑盒，還包括DNA制樣工具，DNA純化工具和PCR反應緩沖液。
16.權利要求14所述的試劑盒，其中至少一條寡核苷酸選自下列一組5’CTCAGCAACACTCCTAT3’ (SEQ ID No.1)；5’TCCTGGTCTGCAGGTAA3’ (SEQ ID No.2)；5’TGGCATTGATCTGGTTCATC3’(SEQ ID No.3)；5’GTTTAGGAATCTTCCCACTT3’(SEQ ID No.4)；
17.權利要求14所述的試劑盒，其中至少一條寡核苷酸還包含一個可檢測的標記。
18.權利要求16所述的試劑盒，其中所述的至少一條已知與冠狀動脈疾病相關的等位基因是IL-1RN(VNTR)等位基因2或IL-1B(-511)等位基因2。
19.權利要求18所述的試劑盒，還包括DNA制樣工具，DNA純化工具和PCR反應緩沖液。
20.一種檢測病人對冠狀動脈疾病易感性的方法，所述的方法包括a.對病人IL-1基因座的核酸進行分型以確定基因型；b.將所述的基因型與對照樣品相比較，i.其中所述的對照樣品包含一個與冠狀動脈疾病相關的IL-1等位基因，ii.其中所述基因型與所述對照樣品的相似性表明對冠狀動脈疾病增加的易感性。
21.權利要求20所述的方法，其中所述的與冠狀動脈疾病相關的IL-1等位基因是IL-1RN(VNTR)等位基因2或1L-1B(-511)等位基因2。
22.權利要求20所述的方法，其中所述的冠狀動脈疾病是單血管冠狀動脈疾病，所述的IL-1等位基因是IL-1RN(VNTR)等位基因2。
23.權利要求20所述的方法，其中所述的冠狀動脈疾病是多血管冠狀動脈疾病，所述的IL-1等位基因是IL-1B(-511)等位基因2。
24.一種預測對冠狀動脈疾病增加的易感性的方法，所述的方法包括檢測選自IL-1RN(VNTR)等位基因2或IL-1B(-511)等位基因2的等位基因的至少一個拷貝的存在，其中檢測到所述的等位基因表明對冠狀動脈疾病的易感性增加。
25.一種鑒定與冠狀動脈疾病相關的等位基因的方法，所述的方法包括a.收集沒有冠狀動脈疾病的第一個病人群組；b.收集患有冠狀動脈疾病的第二個病人群組；c.從第一個和第二個群組中檢測IL-1基因簇的一個等位基因；d.鑒別相對于第一個群組在第二個群組中過量顯現(xiàn)的所述的等位基因，其中所述的等位基因與冠狀動脈疾病相關。
全文摘要
本發(fā)明公開了一些方法和鑒定手段以預測病人患炎癥性疾病如冠狀動脈疾病及相關血管病的風險。這些方法包括從病人體內(nèi)獲取生物樣本并檢測與冠狀動脈疾病相關的某一特定等位基因的存在與否。等位基因檢測表明了發(fā)生冠狀動脈疾病的可能性。此外提供了檢測冠狀動脈疾病的試劑盒,以及鑒別其它與冠狀動脈疾病相關的等位基因的工具。
文檔編號C07K14/545GK1255948SQ98804915
公開日2000年6月7日 申請日期1998年3月9日 優(yōu)先權日1997年3月10日
發(fā)明者希拉·E·弗朗西斯, 戴維·C·克羅斯曼, 戈登·W·杜夫 申請人:醫(yī)療科學系統(tǒng)有限公司