專利名稱：一種新的抗乙肝病毒藥物組合--拉米夫定與原兒茶酸的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于乙肝病毒治療的新的藥物組合——拉米夫定和原兒茶 酸，包括該藥物組合的配方比例及其和實驗療效。通過該藥物組合單用與聯(lián)合 作用于乙肝病毒實驗研究，證實該藥物組合對乙肝病毒的治療效果好于拉米夫 定與原兒茶酸的單獨使用。
背景技術：
乙型肝炎病毒(HBV)的急性和慢性感染是造成肝細胞壞死，肝細胞炎癥， 以及原發(fā)性肝細胞癌(HCC)的重要原因。乙型肝炎病毒(HBV)的急性和慢性 感染是造成肝細胞壞死，肝細胞炎癥，以及原發(fā)性肝細胞癌(HCC)的重要原因。 大約0. 5%急性感染的病例最后將導致致命的急性肝炎。慢性感染同樣可以造成 嚴重的后果其中約L/4的病人最終發(fā)展為慢性肝病，包括慢性肝炎、肝纖維 化、肝硬化和肝癌。慢性乙型肝炎是臨床常見病，我國現(xiàn)有慢性乙肝病人超過 3000萬，每年因肝病死亡人數(shù)約30萬。全世界每年死于HBV導致的肝癌患者 數(shù)量超過100萬。根據(jù)估計，全世界范圍內的HBV攜帶者數(shù)量已達4億，我國 大約有1億2千萬的HBV攜帶者。病毒性肝炎每年帶給我國的直接經(jīng)濟損失至 少500億元，對人民健康和國家經(jīng)濟危害嚴重。乙型肝炎病毒以及其導致的肝 細胞疾病越來越成為中國乃至世界矚目的問題，對HBV的預防和其引發(fā)的肝細 胞疾病的治療成為當今世界難題之一 。近年來，西醫(yī)、中醫(yī)在治療慢性病毒性乙型肝炎上都取得了重要進展。西 醫(yī)以抗病毒療法為主，根本目標是清除或永久抑制乙型肝炎病毒復制，降低其 致病性和傳染性，消除或減輕肝臟的炎癥和壞死。干擾素(IFN—a)曾是惟一獲準用于抗HBV的藥物，它的作用機制是增強HBV抗原在肝細胞表面的表達，抑制 病毒RNA前基因組的包裝，它還是CD8+細胞的細胞毒作用的重要媒介。但其臨床 療效不令人滿意，即使是經(jīng)過嚴格選取的患者接受標準療程后也僅有約30% 40%持續(xù)應答。此外，IFN—a的不良反應比較明顯，包括感冒樣癥候、發(fā)熱、 肌痛、輕微骨髓抑制、情緒改變，如抑郁等。故尋找另外的抗病毒途徑顯得迫 切和重要。近年來第二代核苷類似物的應用為乙型肝炎(乙肝)治療開辟了新的 前景，已在世界范圍獲準治療慢性乙肝的拉米夫定(lamivudine)就是這類藥物 的代表。拉米夫定(2,3-雙脫氧-3-硫代胞嘧啶，簡稱3TC)作為第一個獲FDA批準的 口服抗病毒核苷類似物藥物，其問世推動了慢性乙型肝炎治療的進程。其作用 機理是藥物在細胞內經(jīng)磷酸化后，與脫氧胞嘧啶核苷競爭，進入合成中的DNA 鏈、使其不能繼續(xù)延伸而終止復制。其次，3TC還可競爭性地抑制HBV DNA聚合 酶。3TC對宿主細胞的DNA而言是一種相對較弱的抑制劑，并不使宿主細胞DNA 鏈終止。1999年國家藥品監(jiān)督管理局(SAD)批準拉米夫定在中國上市，國內肝病 專家遵照SAD批準文件，制定了《2000年拉米夫定臨床應用指導意見》及《2001 年拉米夫定臨床應用專家共識》用以指導臨床醫(yī)生用藥。由此可見國內肝病專 家對拉米夫定治療慢性乙型肝炎的重視和認可。作為新一代核苷類抗病毒藥物， 拉米夫定以其口服方便、高效而備受歡迎，它可迅速改善臨床癥狀，基本無不 良反應，但停藥后癥狀易復發(fā)，長期用藥會引起病毒針對該藥的耐受。文獻報 道持續(xù)用該藥達9個月即可出現(xiàn)特異性的病毒DNA聚合酶區(qū)YMDD基序變異，用藥l 年時耐藥發(fā)生率約14%，變異株對該藥敏感性大大降低，使得該藥的應用受到 了限制。中藥抗乙肝病毒的研究以抗病毒、保肝護肝、提高免疫力和抗纖維化為主， 一直受到國內醫(yī)學界的重視。經(jīng)過多年的實踐，取得了一定的成果。許多清熱 解毒藥、清熱利濕藥等研究證明有抗病毒的作用。多種中藥有效成分如五味子素、齊墩果酸等在保護肝細胞、改善肝功能、降低轉氨酶等方面有顯著的作用。豬苓多糖、冬蟲夏草等可提高巨噬細胞吞噬功能，促進T淋巴細胞E玫瑰花結形 成和轉化，激發(fā)多種與免疫和抗炎反應的生物活性因子的產(chǎn)生，顯著誘導干擾 素產(chǎn)生，有利于乙肝病毒的清除。原兒茶酸對于心肌缺血和心肌梗死具有一定 的保護作用，而且還有一定的抗乙型肝炎病毒的作用。據(jù)對木瓜的脂溶性部分 中6種三萜類化臺物抗HBV效果進行對比，發(fā)現(xiàn)原兒茶酸對于HBeAg的抑制率要高 于對HBsAg的抑制率，且其作用機制不同于其他幾種化合物和目前廣泛使用的核 苷類似物。進一步考察發(fā)現(xiàn)，原兒茶酸濃度為70Pg/mL時對H印G2. 2. 15細胞中HBV DNA的抑制率高達46. 54%。且葉下珠、丹參、五味子等抗HBV中藥提取物中均含 有原兒茶酸，證明了其用于治療乙肝的潛在價值。盡管中藥制劑在乙肝的輔助 治療、恢復肝功、調整免疫功能以及抗肝纖維化方面都取得了進展甚至于突破， 但是在解決乙肝的根本問題，即抗病毒治療方面尚無重大進展。對于乙型肝炎病的治療，無論西藥還是中藥，目前尚無一種完全有效的藥 物抑制、殺滅病毒。尋找新的藥物或藥物組合以提高藥物療效，防止停藥后復 發(fā)，減小給藥劑量，克服由于長期用藥而帶來的藥物毒性積累以及減少病毒的 耐藥性，是目前慢性乙型肝炎治療亟待解決的問題。發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種具有顯著療效且安全無毒副作用的抗乙肝病毒的 新的藥物組合，以使乙肝患者的抗原轉陰率顯著提高，治療效果好。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的。本發(fā)明的中西藥配伍組成為拉米夫定和原兒茶酸(1: 50 1: 100, w/fr)，拉米夫定用量0.05 5 Pg，原兒茶酸用量5 500 Pg，最佳中西藥配伍組成為，拉米夫定原兒茶酸為l: 70 1: 90 (為質量比)。本發(fā)明的藥物組合綜合了拉米夫定和原兒茶酸在治療乙型肝炎病的優(yōu)勢， 發(fā)揮優(yōu)勢互補，能夠提高藥物療效，防止停藥后復發(fā)，使藥物劑量最小化，減 少藥物毒性積累以及減少出現(xiàn)病毒耐藥危險。本發(fā)明的效果是用下列HBsAg、 HBeAg和HBV DNA的熒光定量PCR檢測方法 進行評價的。主要步驟是(1) 細胞培養(yǎng)H印G2. 2. 15細胞用含10%胎牛血清、380 ug/mL G418、 100 ug/mL青霉素、 100 ug/mL鏈霉素的DMEM液，用5呢NaHC03調PH值至7. 2。將H印G2. 2. 15細胞 消化，配制成lX105個細胞/mL接種細胞培養(yǎng)板，24孔板每孔400uL 37°C， 5 XC02培養(yǎng)24h，棄培養(yǎng)上清液，換用含不同藥物濃度的培養(yǎng)液。每2天換用含 同等藥物濃度的新鮮培養(yǎng)液；實驗共進行8d，第8天末檢測藥物對細胞的毒性 并收集培養(yǎng)上清液，-2(TC保存；由同一人同批試劑盒進行HBsAg、 HBeAg和HBV DNA的熒光定量PCR檢測。(2) HBsAg檢測1. 取包被微孔反應條，固定于塑料框架上，加標本50化/孔，陰、性對照 50叱(或1滴)/孔各兩孔，同時留一孔不加作空白對照，隨即加入測HBsAg酶結 合物50叱(或一滴)/孔，空白對照不加。2. 置37t:烘箱孵育0.5小時，以保證最大包被量。3. 小心移去孔內液體，拍干；用蒸餾水將洗滌液作l: 20倍稀釋，注滿各 孔，停留30秒后棄去，如此反復洗滌6次，每次均拍干。避免孔間交叉污染。4. 加底物液50叱(或一滴)/孔，隨即加顯色液50ML (或一滴)/孔，37 'C顯色10分鐘。5. 加終止液50ML (或一滴)/孔，終止反應。6. 立即用450nm波長空白校零點，分別測定陰陽性對照及標本的OD值； 當有異常值出現(xiàn)時，應采用雙波長測定，參考波長為630 nm。(3) HBeAg檢測1.取包被微孔反應條，固定于塑料框架上，加標本50叱/孔，陰、性對照 (或1滴)/孔各兩孔，同時留一孔不加作空白對照，隨即加入測HBsAg酶結合物50PL (或一滴)/孔，空白對照不加。2. 置37匸烘箱孵育0.5小時，以保證最大包被量。3. 小心移去孔內液體，拍干；用蒸餾水將洗滌液作l: 20倍稀釋，注滿各 孔，停留30秒后棄去，如此反復洗滌6次，每次均拍干。避免孔間交叉污染。4. 加底物液50叱(或一滴)/孔，隨即加顯色液50叱(或一滴)/孔，37 "C顯色10分鐘。5. 加終止液50叱(或一滴)/孔，終止反應。6. 立即用450nm波長空白校零點，分別測定陰陽性對照及標本的OD值； 當有異常值出現(xiàn)時，應采用雙波長測定，參考波長為630nm。(4) HBV DNA的熒光定量PCR測定 用深圳市匹基生物工程股份有限公司生產(chǎn)的乙型肝炎病毒(HBV)核酸擴增 (PCR)熒光定量檢測試劑盒測定HBV的DNA量。1. 培養(yǎng)液樣品的處理取培養(yǎng)液100叱，加到0.5mLEP管中，加入IOO叱 DNA提取液1，振蕩混勻，13 OOOrpm離心10min，棄上清(離心時注意固定離 心管方向，盡可能棄上清但不碰沉淀)，再加入25PL DNA提取液2，振蕩混勻， 2000rpm離心10sec， IO(TC干浴或沸水浴10min， 13， OOOrpm離心10min，保 留上清備用(如樣本裂解產(chǎn)物當天不使用，則要保存在一2(TC)。2. 擴增前的準備從試劑盒中取出HBV PCR反應液、Taq酶及UNG，室溫 融化并振蕩混勻后，2000rpm離心10sec。設所需要的PCR反應管數(shù)為(n二樣本 數(shù)+2管陽性對照+ 1管強陽性對照+ 1管臨界陽性對照+4管陽性工作標準 品)，每個測試反應體系的配制是，PCR反應液17. 8叱，Taq酶0. 2uL，UNG 0. 計算好各試劑的用量，加入一適當體積離心管中，充分混勻，2000rpm離心 10sec，向設定的幾個PCR管中分別加入上述混合液18叱。3. 加樣若樣品及對照裂解產(chǎn)物保存在一2(TC，使用前置室溫解凍以 13000rpm離心5min。陽性工作標準品使用前置室溫解凍，振蕩混勻，2000rpm離心10sec。向所設定的n個PCR反應管中分別加入處理過的樣品，陽性對照，強陽性對照和臨界陽性對照上清液以及陽性工作標準品各2化(其中陰性 對照作2管)，蓋緊管蓋，將PCR反應管轉移到PCR儀，記錄樣品的排放順序。4. 反應條件設置在熒光定量PCR儀上設置的擴增條件為37°C， 5min， 94°C， lmin， 95°C， 5sec， 60°C， 30sec, 50個循環(huán)，反應體系為加叱。熒光 信號收集設定為Fam熒光素。將陽性工作標準品設為STAN并輸入拷貝數(shù)，待測 樣本和對照品設為UNKN，開機進行擴增。5. 結果分析取3 — 15個循環(huán)的熒光信號作為檢測儀進行結果分析時基線。 閾值設定設定原則以閾值線剛好超過正常陽性對照品擴增曲線(無規(guī)則的噪音線)的最高點，且"值=40.0為準。本發(fā)明基于一種新的抗乙肝病毒藥物組合。該藥物組合能明顯提高拉米夫 定對乙肝病毒抗原的抑制效果，顯著降低拉米夫定單一用藥時的毒副作用。
具體實施方式
下面結合實施例對本發(fā)明進一步說明。 實施例一HBsAg檢測(按步驟(2)中的操作)原兒茶酸5(￥g/mL時對HBsAg抑制 率為27. 3%;拉米夫定0. 5Pg/mL時對HBsAg抑制率為30. 8%;原兒茶酸50Pg/mL 聯(lián)合拉米夫定0. 5ixg/rnL時對HBsAg抑制率為50. 4%。實施例二HBeAg檢測(按步驟(3)中的操作)原兒茶酸5Pg/mL時對HBeAg抑制率 為17. 6%;拉米夫定0. 05Pg/mL時對HBeAg抑制率為11. 0%;原兒茶酸5Pg/mL 聯(lián)合拉米夫定0. 05Pg/mL時對HBeAg抑制率為34. 3%。實施例三HBVDNA的熒光定量PCR測定(按步驟(4)中的操作)原兒茶酸5(￥g/mL 時對HBV DNA抑制率為16. 9%;拉米夫定0. 05M<g/mL時對HBV DNA抑制率為53. 5%; 原兒茶酸5(￥g/mL聯(lián)合拉米夫定0. 05Pg/mL時對HBV DNA抑制率為61. 4%。
權利要求
1、一種新的抗乙肝病毒的藥物組合，其特征在于中西藥配伍組成拉米夫定/原兒茶酸的質量比為1∶50～1∶100，且通常拉米夫定用量0.05～5μg，原兒茶酸用量5～500μg。
2、 根據(jù)權利要求1所述的一種新的抗乙肝病毒的藥物組合，其特征在于最佳中西藥配伍組成為拉米夫定/原兒茶酸的質量比為1: 70 1: 90。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種具有更顯著療效且安全無毒副作用的抗乙肝病毒藥物組合，以使乙肝患者的抗原轉陰率顯著提高。以HepG2.2.15細胞為靶細胞，在細胞生長液中加入適當濃度配制的拉米夫定、原兒茶酸以及拉米夫定和原兒茶酸的配伍制劑。常規(guī)培養(yǎng)并采用ELISA法檢測該細胞分泌的HBsAg和HBeAg，并用熒光定量PCR測定HBV DNA的含量，以計算抑制率的方法判定藥物抗HBV的作用，以確定藥物組合的抗乙肝病毒的療效及配比。其配比為拉米夫定/原兒茶酸為1∶50～1∶100(為質量比)，且通常拉米夫定用量0.05～5μg，原兒茶酸用量5～500μg。該藥物組合能明顯提高拉米夫定對乙肝病毒抗原的抑制效果，顯著降低拉米夫定單一用藥時的毒副作用。
文檔編號A61K31/506GK101224209SQ20081004679
公開日2008年7月23日 申請日期2008年1月25日 優(yōu)先權日2008年1月25日
發(fā)明者吳建國, 張曉雷, 朱文婷, 王恒松, 勇 陳, 韓鳳梅 申請人:湖北大學