專利名稱：一種直接產(chǎn)生妥布霉素的工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于抗生素制藥領(lǐng)域，涉及一種直接產(chǎn)生妥布霉素的工程菌及 其應(yīng)用，具體地說，本發(fā)明是利用分子生物學(xué)操作技術(shù)，阻斷黑暗鏈霉菌
(iYrep,CM7/c" ^/ e6i^r/^)生物合成基因""，獲得直接產(chǎn)生妥布霉 素的基因工程菌株，可以在抗生素制藥中應(yīng)用。
背景技術(shù)：
黑暗鏈霉菌(^re/^咖/c" "/7e^rar/M)是1967年美國禮萊公司的 研究人員從土壤中分離得到的，該菌株能產(chǎn)生一組抗生素，其中2、 4、 5， 為主組分。組分2為安普霉素(Apramycin， Am)，組分4為6" -O-氨甲酰 卡那霉素B (6" -O-Carbamoylkanamycin B, CKB),組分5，為6" -O-氨 甲酰i+霉素(6" -0-Carbamoyltobramycin， CTB )。組分4、 5，經(jīng)高溫 水解后分別形成卡那霉素B和妥布霉素。
妥布霉素是一種廣譜高效的抗生素，在體外對多種細菌有抗菌活性， 特別是某些對慶大霉素耐藥的銅綠假單孢菌有效，而且妥布霉素的耳、腎 毒性相對較低，是臨床上廣泛應(yīng)用的抗菌藥。
多年來科研工作人員對黑暗鏈霉菌的研究主要集中于常規(guī)誘變育種和 優(yōu)化生產(chǎn)工藝等方面取得一些進展。二十世紀(jì)八十年代興起的鏈霉菌基因 工程研究，已在抗生素生物合成基因的克隆、產(chǎn)量提高、組分改善及雜合 抗生素生產(chǎn)等方面取得長足的進步。在分子水平，李天伯等克隆到一段 50Kb區(qū)域，證明其中含有參與妥布霉素合成的dTDP-葡萄糖-4，6-脫水酶。 Madan Kumar Kharel等利用同源雜交的方法克隆到一段13. 8Kb氨甲酰妥 布霉素生物合成基因簇，證明了其中Am丄/Zw^的基因功能，推斷出氨 甲酰妥布霉素的生物合成途徑。
目前，妥布霉素的生產(chǎn)方法是從黑暗鏈霉菌發(fā)酵液中分離得到氨甲酰 妥布霉素，再經(jīng)堿性條件下高溫水解獲取妥布霉素。該方法的缺點是雜質(zhì) 多，產(chǎn)品收率低，生產(chǎn)成本高。
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使得利用基因工程的方法改造抗生素組 分成為可能。Madan Kumar Kharel等克隆到黑暗鏈霉菌中妥布霉素部分合 成基因簇，Blastn發(fā)現(xiàn)其中基因TacA為氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶，可能與6"位氨 甲?；铣捎嘘P(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過對tod失活的方法，獲得能直接產(chǎn)生妥布霉素的 工程菌，該菌株已于2008年3月20日在中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC No.2409。
本發(fā)明通過框架內(nèi)刪除失活的方法阻斷黑暗鏈霉菌中to"基因，主要 包括以下幾個步驟
A、 to"基因阻斷質(zhì)粒的構(gòu)建；
B、 阻斷質(zhì)粒轉(zhuǎn)化黑暗鏈霉菌；
C、 轉(zhuǎn)化子的篩選；
D、 新組分妥布霉素的鑒定。
框架內(nèi)刪除失活的方法為PCR分別獲得m"基因上下游分子量不低 于500bp兩個片段，將兩者同時連接到pIJ2925中，再往片段的一端連入 在黑暗鏈霉菌中能表達的抗生素抗性基因如紅霉素抗性基因利用 5g/II酶切將三個基因片段連到穿梭載體pHZ132中。
其中轉(zhuǎn)化是以A co//ET12657 (pUZ8002 )介導(dǎo)的結(jié)合轉(zhuǎn)移方法。篩選 為先篩選紅霉素抗性(wmR)菌株，無藥傳代后再從中篩選到紅霉素敏感 Un/)菌株，從中篩選到產(chǎn)新組分的轉(zhuǎn)化子。鑒定為發(fā)酵濾液釆用薄層 層析TLC、新組分釆用MS分析和HPLC-ELSD。
本發(fā)明既簡化了生產(chǎn)工藝、又降低了生產(chǎn)成本，同時也更便于進行產(chǎn) 品的質(zhì)量控制。
本發(fā)明所述菌株已于2008年3月20日在中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心(北京巿朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院微生物研究所)登 記保藏，其分類命名為黑暗鏈霉菌(Streptomyces tenebrarius)，保藏編 號為CGMCC No. 2409。


圖l是/"d基因雙交換原理及酶切位點示意圖 圖2是基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)物組分TLC分析
l為妥布霉素標(biāo)準(zhǔn)品，2為黑暗鏈霉菌H6(pSPU303-3), 3為野生型菌 株黑暗鏈霉菌H6。 A為氨甲酰妥布霉素，B為妥布霉素，C為安普霉素。
圖3是妥布霉素標(biāo)準(zhǔn)品和新組分的HPLC-ELSD圖譜
A為妥布霉素標(biāo)準(zhǔn)品，B為新組分
圖4是新組分的質(zhì)譜分析圖譜具體實施方式
實施例1:
本發(fā)明主要包括以下主要步驟
1.構(gòu)建似d基因阻斷質(zhì)粒
根據(jù)Madan Kumar Kharel等發(fā)表的妥布霉素生物合成基因簇序列 (GenBank Accession Number AJ579650),分別在tod基因上下游i反計兩 對引物，以黑暗鏈霉菌總DM為模板進行PCR擴增獲得兩個片段PCR1-2 和PCR3-4。將兩片段連接產(chǎn)物命名為^tod，其刪除了 to"基因5'端111 個堿基、內(nèi)部260個堿i和3，端88個堿基。將"""連到載體pIJ2925 中獲得pSPU301。再往pSPU301中的位點連入紅霉素抗性基因 (pXZl經(jīng)^7"I酶切回收約1.6Kb大小片段)獲得重組質(zhì)粒pSPU302,最 后利用5g/TI酶切將Atoc^+m^連接到載體pHZl"中釦mffl位點，獲得
阻斷質(zhì)粒pSP詣3。
2. 阻斷質(zhì)粒pSPU303轉(zhuǎn)化黑暗鏈霉菌H6
將阻斷質(zhì)粒pSPU303轉(zhuǎn)入￡ co/y ET12567 (pUZ8002)中，得到供體菌 & co// ET12567 (pUZ8002， pSPU303)。然后通過結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)化黑暗 鏈霉菌H6孢子，28t:培養(yǎng)20h后用紅霉素和吡啶酸(終濃度分別為100y g/mL和50Mg/mL)水溶液覆蓋，28。C繼續(xù)培養(yǎng)5-6天長出轉(zhuǎn)化子，將所獲 得的ermR轉(zhuǎn)化子在含有紅霉素(200 pg/mL)和PPA (5 0 ja g/mL)的R2YE培 養(yǎng)基上42。C分區(qū)劃線培養(yǎng)，48h長出菌落，因為阻斷質(zhì)粒不能在42i:復(fù)制， 只能通過同源交換整合到染色體上之后結(jié)合子才能生長，表現(xiàn)出對紅霉素 抗性。證明結(jié)合子發(fā)生了單交換整合。隨機挑起一株命名為黑暗鏈霉菌 H6(pSP詣3)。
3. 篩選雙交換菌株與發(fā)酵產(chǎn)物檢測
將ermR轉(zhuǎn)化子在無藥合V平板上連續(xù)傳三代后，挑取單菌落分別點種 到無藥合V平板和含藥合V (紅霉素100 m g/mL)平板，從544株中篩選獲得 32個ermS菌株。分別命名為黑暗鏈霉菌H6 (pSPU303-1)至H6 (pSPU303-32). 對該32個菌株進行發(fā)酵，過濾收集發(fā)酵液，濾液通過硅膠GFw薄層層析、 生物顯影發(fā)現(xiàn)，所有菌株均能正常產(chǎn)生安普霉素，但黑暗鏈霉菌 H6(pSPU303-3)不再產(chǎn)生6"-0-氨甲酰妥布霉素，而產(chǎn)生一個Rf值與妥布 霉素的Rf值相近的新組分。
4. 新組分鑒定
提取發(fā)酵液中新組分有如下幾個步驟
A、 粗提
發(fā)酵液稀釋后分別酸化、堿化除蛋白后，用732樹脂靜態(tài)吸附6~8 小時。而后用6倍量的3%氨水進行解吸，當(dāng)流出液達pH 9. 0以上時，串 聯(lián)到相當(dāng)732樹脂1/5體積的711樹脂柱上，收集樹脫液，濃縮為原體積 的1/8~1/10。
B、 分離
濃縮液(pH7. 0~7.5)上D151樹脂進行動態(tài)吸附。洗滌后分別用 0. 15mol/L和0. 3mol/L的氨水進行洗脫，洗脫流速1/100 ~ l/150/分，以 磷鎢酸控制終點，收集0. 3mol/L的氨水洗脫液。硫酸調(diào)pH至7. 0-7.5， D152動態(tài)吸附，無鹽水洗滌后分別用0. lmol/L和0. 15mol/L的氨水進行 洗脫，洗脫流速1/100 ~1/150/分，以磷鎢酸控制終點，收集0. 15mol/L 的氨水洗脫液。
C、 精制、結(jié)晶
把0. 15mol/L的氨水洗脫液進行濃縮，用硫酸調(diào)至pH5.5 6.0,然后 上已處理好的732樹脂柱動態(tài)吸附，無鹽水洗滌。再用3%氨水進行洗脫， 收集解吸液2-3倍量。之后濃縮至10萬單位/亳升，加入O. 5。/。(w/v)活 性炭，50 6(TC攪拌脫色1小時，抽濾得脫色液。脫色液濃縮至20萬單位
/毫升，得到濃縮液。
在攪拌下，緩慢向濃縮液中滴加入io倍量的乙醇進行結(jié)晶，此過程需
要3~4小時，之后用離心機分離，85%乙醇溶液淋洗即得濕成品。
將得到的濕成品真空干燥，真空度500mmHg以上，溫度6(TC,干燥6 小時，即得成品。
成品用于HPLC-ELSD分析(圖3)和質(zhì)譜(圖4 )。液相條件流動相 0. 2mol/L三氟乙酸溶液甲醇(95: 5 ),流速為1. OmL/min,檢測器為SofTA 200sELSD,漂移管溫度為105°C,霧化管溫度為4(TC,色譜柱Dikma C18 (5 jam, 200 x 4. 6mm)。
實施例2:利用妥布霉素基因工程菌生產(chǎn)妥布霉素
本發(fā)明提供的妥布霉素基因工程菌可直接用于生產(chǎn)，菌種經(jīng)發(fā)酵后提 取妥布霉素，作為抗菌藥物。、
1. 妥布霉素基因工程菌的搖瓶發(fā)酵
種子培養(yǎng)基生黃豆粉10g，葡萄糖10g,蛋白胨3g,酵母粉lg, 玉米粉5g， CaC03(輕質(zhì))lg，加自來水至1L。
發(fā)酵培養(yǎng)基可溶性淀粉20，生黃豆粉20g,葡萄糖10g, NH,C15g, CaC03(輕質(zhì))5g, MgS04 4g， FeS04 0. 05g, ZnS04 0. 03g, MnCl2 0. 3g, 豆油0. 6mL/40mL，加自來水至1L。
將實例1中步驟3獲得的基因工程菌黑暗鏈霉菌H6(pSPU303-3)進行
搖瓶發(fā)酵。發(fā)酵前先用稀釋平板法分離出產(chǎn)孢豐富的單菌落轉(zhuǎn)接于合成v 號斜面，37。C培養(yǎng)7天，挖塊接種于種子培養(yǎng)基(裝量為20mL/250mL三角 瓶)，37。C搖床培養(yǎng)18h(轉(zhuǎn)速為180rpm，偏心距4.0cm)。按10%接種量轉(zhuǎn) 種于發(fā)酵培養(yǎng)基(裝量為40mL/250mL三角瓶)，3rC搖床培養(yǎng)UQ h(轉(zhuǎn)速 為180rpm,偏心距4. Ocm)。
2. 囊II產(chǎn)物的HPLC-ELSD分析
l)樣品提取純化按實甸1中步驟4中離子交換法提取發(fā)酵液中的妥 布霉素齦分，省略了傳統(tǒng)工藝中高溫堿性水解步驟，提高了回收率，降低 了生產(chǎn)威本。
2) HPLC-ELSD分析條件:Dikma Cw反向柱(5 m m, 200 x 4. 6mm),柱溫 25°C，流動相為0. 2mol/L三氟乙酸溶液甲醇(95: 5 )，流速為1. OmL/min, 進體積20yl，檢測器為SofTA 200s ELSD,漂移管溫度為10VC,霧化管 溫度為40°C。
3)標(biāo)準(zhǔn)品妥布霉素標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品檢定所。
HPLC-ELSD分析結(jié)果如圖3所示，表明基因工程菌直接產(chǎn)生妥布霉素。
權(quán)利要求
1、一種直接產(chǎn)生妥布霉素的工程菌，其特征是通過框架內(nèi)刪除失活的方法阻斷黑暗鏈霉菌中tacA基因，主要包括以下步驟A、tacA基因阻斷質(zhì)粒的構(gòu)建；B、阻斷質(zhì)粒轉(zhuǎn)化黑暗鏈霉菌；C、轉(zhuǎn)化子的篩選；D、新組分妥布霉素的鑒定。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種直接產(chǎn)生妥布霉素的工程菌，其特征 是所述的框架內(nèi)刪除失活的方法為，PCR分別獲得""基因上下游分子 量不低于500bp兩個片段，將兩者同時連接到pIJ2925中，再往片段的一端連入在黑暗鏈霉菌中能表達的抗生素抗性基因如紅霉素抗性基因 er;z必利用5WI1酶切將三個基因片段連到穿梭載體pHZ132中。一
3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種直接產(chǎn)生妥布霉素的工程菌，其特征 是所述的轉(zhuǎn)化是以A "/yET12657 (pUZ8002 )介導(dǎo)的結(jié)合轉(zhuǎn)移方法。
4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種直接產(chǎn)生妥布霉素的工程菌，其特征 是所述的篩選為先篩選紅霉素抗性菌株，無藥傳代后再從中篩選到紅霉 素敏感菌株，從中篩選到產(chǎn)新組分的轉(zhuǎn)化子。-
5、根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種直接產(chǎn)生妥布霉素的工程菌，其特征 是所述的鑒定為發(fā)酵濾液釆用薄層層析TLC、新組分采用HPLC-ELSD分 析和MS分析。
6、 一種直接產(chǎn)生妥布霉素的工程菌在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種直接產(chǎn)生妥布霉素的工程菌及其應(yīng)用，主要是對妥布霉素產(chǎn)生菌中氨甲酰轉(zhuǎn)移酶基因?qū)嵤┝似茐?，菌種不再產(chǎn)生氨甲酰妥布霉素，而是產(chǎn)生妥布霉素。本發(fā)明通過框架內(nèi)刪除失活的方法阻斷黑暗鏈霉菌中tacA基因，包括構(gòu)建tacA基因阻斷質(zhì)粒、阻斷質(zhì)粒pSPU303轉(zhuǎn)化黑暗鏈霉菌H6、篩選雙交換菌株與發(fā)酵產(chǎn)物檢測、新組分鑒定。框架內(nèi)刪除失活的方法為PCR分別獲得tacA基因上下游分子量不低于500bp兩個片段，將兩者同時連接到pIJ2925中，再往片段的一端連入在黑暗鏈霉菌中能表達的抗生素抗性基因如紅霉素抗性基因ermE，利用BglII酶切將三個基因片段連到穿梭載體pHZ132中。本發(fā)明可以簡化生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn)成本，便于進行產(chǎn)品的質(zhì)量控制。
文檔編號A61K31/702GK101392229SQ20081001147
公開日2009年3月25日 申請日期2008年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月20日
發(fā)明者余永紅, 侯曦凡, 夏煥章, 鑫 隋 申請人:沈陽藥科大學(xué)