專利名稱：：用于預(yù)防和治療癌癥疾病的包括黃水枝提取物或從其分離的化合物的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及癌細(xì)胞特異的失巢凋亡誘導(dǎo)劑，其包括黃水枝(77"re/to提取物；從其分離的黃水枝酸(tiarellicacid)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽；并且涉及包括其的抗癌組合物或功能性保健食品。
背景技術(shù)：
：整聯(lián)蛋白和胞外基質(zhì)(ECM)之間的相互作用介導(dǎo)細(xì)胞黏著，并且整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞黏著調(diào)節(jié)各種信號(hào)分子的活性和定位，并且因此調(diào)節(jié)細(xì)胞功能或行為(Thiery,J.P.Epithelial-mesenchymaltransitionsintumourprogression.NatRevCancer,2,pp.442-54,2002;Brakebusch,C.andFassler，R.，TheIntegrin-actinconnection,aneternalloveaffair.,EMBOJ,22,pp.2324-33,2003)。當(dāng)整聯(lián)蛋白在黏著斑上與胞外基質(zhì)(ECM)細(xì)胞外相互作用時(shí)，整聯(lián)蛋白亞單位的細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)尾區(qū)募集各種黏著斑分子，其包括銜接蛋白如樁蛋白和pl30Cas，以及信號(hào)分子如黏著斑激酶(FAK)禾口c-Src(DeMali，K.A.etal.,K.Integrinsignalingtotheactincytoskeleton，CurrOpinCellBiol"15,pp.572-82,2003;Carragher,N.O.andFrame,M.C,,Focaladhesionandactindynamics:aplacewherekinasesandproteasesmeettopromoteinvasion,TrendsCellBiol,14，pp.241-9，2004)。細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子的募集導(dǎo)致它們的激活，這導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的再組織，以及隨后細(xì)胞形狀的改變(Juliano,R.L.etal.，Integrinregulationofcellsignalingandmotility,BiochemSocTrans,32,pp.443-6，2004)。因?yàn)轲ぶ呱系恼?lián)蛋白通過蛋白質(zhì)復(fù)合物(在其胞質(zhì)尾區(qū)上)被連接到肌動(dòng)蛋白纖絲上，所以黏著斑分子低效的裝配或者肌動(dòng)蛋白纖絲的異常再組織可引起細(xì)胞圓形化并且伴隨著黏著斑的減少，這導(dǎo)致細(xì)胞隨后與基膜分離(Hirohashi,S.andKanai，Y"Celladhesionsystemandhumancancermorphogenesis,CancerSci,94,pp.575-81,2003)。換句話說，因?yàn)檎５纳掀ぜ?xì)胞在富含ECM的基膜上形成單層，所以它們可通過有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)來自ECM的細(xì)胞外信號(hào)而存活。然而，黏著斑的減少導(dǎo)致失巢凋亡，這導(dǎo)致細(xì)胞與基膜分離，從而細(xì)胞死亡。由于多點(diǎn)突變和基因組不穩(wěn)定性造成的癌細(xì)胞，通過細(xì)胞-ECM相互作用和細(xì)胞-細(xì)胞接觸的異常改變，可被允許從原發(fā)腫瘤傳播。在轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的微環(huán)境中，從癌細(xì)胞或鄰近的成纖維細(xì)胞、白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞分泌的生長因子和細(xì)胞因子在細(xì)胞接觸、黏著、遷移和侵入中起重要的作用(Stamenkovic,I.Extracellularmatrixremodelling:theroleofmatrixmetalloproteinases,JPathol,200,pp.448-64,2003)。轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞穿過基膜和基質(zhì)區(qū)域進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)(內(nèi)滲)，并且在循環(huán)中存活。然后，它們通過外滲離開該循環(huán)。在該事件期間，整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的癌細(xì)胞與ECM的黏著可關(guān)鍵性地影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能(Liotta,L.A.，etal.,Biochemicalinteractionsoftumorcellswiththebasementmembrane,AnnuRevBiochem,55,pp.1037-57,1986)。在傳播的癌細(xì)胞之中，只有幸免于失巢凋亡的細(xì)胞可經(jīng)由血液和淋巴管行進(jìn)到遠(yuǎn)端部位，并且最終附著到一個(gè)部位并且作為轉(zhuǎn)移腫瘤增殖(Thiery，J.P.,Epithelial-mesenchymaltransitionsintumourprogression,NatRevCancer,2,pp.442-54,2002)。因此，在篩選抗腫瘤發(fā)生或轉(zhuǎn)移試劑時(shí)，發(fā)現(xiàn)對(duì)正常細(xì)胞沒有任何作用的使腫瘤發(fā)生細(xì)胞失巢凋亡的試劑將是有用的。TM4SF5(或L6H)是腫瘤相關(guān)抗原L6的同系物，并且與L6、IL-TMP和L6D形成4-跨膜L6超家族(Wright,M.D.etal.,TheL6membraneproteins-anewfourtransmembranesuperfamily,ProteinSci,9,pp.1594-600，2000)。TM4SF5在胰腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳頭部癌(乳頭腺癌，papillavatericarcinoma)和軟組織肉瘤以及非內(nèi)分泌的肺和ACTH(促腎上腺皮質(zhì)激素)-陰性支氣管類癌瘤中高度表達(dá)(Pascual-LeTallec,L.etal.,Identificationofgenesassociatedwiththecorticotrophphenotypeinbronchiacarcinoidtumors,JClinEndocrinolMetab,87,pp.5015-22，2002)。在目前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)TM4SF5在肝癌組織中過量表達(dá)，并且TM4SF5引起肌動(dòng)蛋白再組織以及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)，這導(dǎo)致接觸抑制喪失和致癌性增生(LeeS-Aetal.，TM4SF5-mediatedtransmodulationbetweencytosolicp27KiplandRhoGTPasesandepithelial-mesenchymaltransitioncauselossofcontactinhibition,CancerCell,2007)。TM4SF5在成纖維細(xì)胞中的超表達(dá)導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白再組織和黏著斑轉(zhuǎn)換(focaladhesionturnover)(Lee,S.Y.etal"Focaladhesionandactinorganizationbyacross-talkofTM4SF5withintegrina2areregulatedbyserumtreatment,ExpCellRes,312,pp.2983-99,2006)。TM4SF蛋白(被稱為四次跨膜蛋白(tetraspanin或者tetraspan))是一組具有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的、大約25-50kDa的疏水性蛋白，并且具有具有兩個(gè)胞外環(huán)和兩個(gè)短的胞質(zhì)尾區(qū)(Stipp,C.S.etal.,Functionaldomainsintetraspaninproteins,TrendsBiochemSci,28,pp,106-12,2003)。TM4SF通過與細(xì)胞黏著分子如整聯(lián)蛋白形成復(fù)合物而形成四次跨膜蛋白網(wǎng)結(jié)構(gòu)，以協(xié)作性地在細(xì)胞黏著禾口運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮它們的作用(Berditchevski,F,Complexesoftetraspaninswithintegrins:morethanmeetstheeye,JCellSci,114,pp.4143-51,2001)。技術(shù)問題本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供失巢凋亡誘導(dǎo)劑，其包括黃水枝(77"w/top0/ya)提取物、從其分離的黃水枝酸(tiarellicacid)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其對(duì)表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原L6或其同系物的癌細(xì)胞具有特異性。本發(fā)明的另一目標(biāo)是提供用于治療和預(yù)防癌癥疾病的藥物組合物以及用于預(yù)防和改善癌癥疾病的功能性保健食品，其包括所述失巢凋亡誘導(dǎo)劑。圖1顯示TM4SF5-裸親代(nullparental)SNU449細(xì)胞(下文被稱為'P')、穩(wěn)定對(duì)照SNU449細(xì)胞(下文被稱為'Cp')、穩(wěn)定TM4SF5-超表達(dá)SNU449Tp細(xì)胞(下文被稱為'Tp')和SNU449T16細(xì)胞(下文被稱為'T16')的TM4SF5表達(dá)；圖2顯示黃水枝酸(TA)處理對(duì)P、Cp、Tp和T16細(xì)胞的TM4SF5表達(dá)的影響；圖3是顯示SNU449Cp和SNU449Tp細(xì)胞生長的變化的顯微鏡照片，這取決于黃水枝酸(TA)的濃度；圖4是顯示SNU449Cp和SNU449Tp細(xì)胞數(shù)目的圖，這取決于黃水枝酸(TA)的濃度和時(shí)間；圖5顯示各種細(xì)胞系中的TM4SF5表達(dá)；圖6顯示在黃水枝酸(TA)處理后，TM4SF5存在或不存在下不同細(xì)胞系的數(shù)目的圖；圖7是在黃水枝酸(TA)處理后，在TM4SF5-裸細(xì)胞(SNU638和SNU668)中黏著斑分子的表達(dá)和激活的顯微鏡照片；圖8顯示免疫印跡測(cè)定的結(jié)果，其中在用不同濃度的黃水枝酸(TA)處理的細(xì)胞系中檢測(cè)了黏著斑分子的表達(dá)和激活；圖9顯示免疫印跡測(cè)定的結(jié)果，其中黏著斑分子的表達(dá)和激活在用黃水枝酸(TA)處理不同時(shí)間段的細(xì)胞系中進(jìn)行檢測(cè)；圖IO顯示在黃水枝酸(TA)處理后，pl30Cas磷酸化水平以及pl30Cas、FAK和樁蛋白之間的物理締合(物理關(guān)聯(lián)，physicalassociation);圖11顯示在黃水枝酸(TA)處理后，在SNU449細(xì)胞系中黏著斑分子的表達(dá)和激活；圖12顯示在黃水枝酸(TA)處理后，TM4SF5存在或不存在下不同細(xì)胞系中黏著斑分子的表達(dá)和激活；圖13是在黃水枝酸(TA)處理后，通過對(duì)pY397FAK(黏著斑激酶)和pY118樁蛋白進(jìn)行免疫染色分析黏著斑形成的結(jié)果；圖14顯示在黃水枝酸(TA)處理后，整聯(lián)蛋白a5和pY397FAK之間的解離；圖15顯示在黃水枝酸(TA)處理后，激動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維形成的降低；圖16是顯示在黃水枝酸(TA)處理后，在SNU449細(xì)胞系中黏著程度的圖；圖17顯示在黃水枝酸(TA)處理不同時(shí)間段后，漂浮SNU449Cp和SNU449Tp細(xì)胞的數(shù)目的圖18是在黃水枝酸(TA)處理不同時(shí)間段后，細(xì)胞存活和死亡相關(guān)的信號(hào)分子的蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果；圖19是在黃水枝酸(TA)處理后，分析細(xì)胞的DNA含量的結(jié)果；圖20顯示通過在SNU449T16細(xì)胞中過量表達(dá)野生型FAK、樁蛋白或pl30Cas，抑制TA介導(dǎo)的作用的程度；圖21是分析DNA含量的結(jié)果，其中黏著斑分子的超表達(dá)抑制了黃水枝酸(TA)-介導(dǎo)的細(xì)胞死亡；圖22顯示在黃水枝酸(TA)給藥后，注射有TM4SF5表達(dá)細(xì)胞系的小鼠的體重和腫瘤體積上的變化；圖23顯示在黃水枝酸(TA)給藥后，TM4SF5介導(dǎo)的腫瘤組織中細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)；和圖24顯示在黃水枝酸(TA)給藥后，TM4SF5介導(dǎo)的腫瘤組織中的胱天蛋白酶-3的激活。
發(fā)明內(nèi)容—方面，本發(fā)明涉及失巢凋亡誘導(dǎo)劑，其包括黃水枝(77"^//"提取物、從其分離的黃水枝酸(tiarellicacid)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其對(duì)表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原L6或其同系物的癌細(xì)胞具有特異性。如本文所用，黃水枝D.Don，也被稱為用于治療哮喘的醫(yī)用藥草，是屬于虎耳草科家族的多年生草本植物。它只存在于韓國UlhmgIsland的山頂。本發(fā)明的黃水枝提取物是來自黃水枝的粗制提取物或極性溶劑可溶性提取物。粗制提取物包括在如此溶劑中可溶的提取物，所述溶劑選自包括凈化水在內(nèi)的水、Cl-C4低級(jí)醇和其混合物，優(yōu)選地為甲醇可溶性提取物。此夕卜，極性溶劑可溶性提取物包括在如此溶劑中可溶的提取物，所述溶劑選自水、甲醇、乙醇、丁醇和其混合物，優(yōu)選地為丁醇。本發(fā)明的黃水枝提取物可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法制備。例如，收集黃水枝的整個(gè)植物，在暗處干燥，然后磨碎。然后，黃水枝粉末與2至20倍體積的極性溶劑混合，所述極性溶劑例如水，d-C4低級(jí)醇如甲醇、乙醇和丁醇，或其混合比大約1:0.1至1:10的混合溶劑，優(yōu)選地為甲醇，并且在20至50。C的溫度范圍內(nèi)通過熱水提取、冷水提取、用冷水的回流提取或者超聲提取兩次至五次，優(yōu)選地兩次至三次，提取10小時(shí)至48天，優(yōu)選地20至30小時(shí)。產(chǎn)物按照常規(guī)方法被過濾、濃縮并且干燥以獲得粗制提取物。此外，粗制提取物在蒸餾水中懸浮，并且然后與1至100倍，優(yōu)選1至5倍體積的極性溶劑混合，所述極性溶劑如水、乙醇、甲醇和丁醇，并且提取一至十次，優(yōu)選一至五次，以獲得極性溶劑可溶性提取物。另夕卜，可進(jìn)行常規(guī)的分餾過程(HarborneJ.B.,Aguidetomoderntechniquesofplantanalysis.3,pp6-7，1998)。從本發(fā)明的黃水枝提取物分離的黃水枝酸化合物[3,23-二羥基-20(29)-羽扇烯-27-酸]由下式(I)表示。如本文所用，術(shù)語"藥學(xué)上可接受的鹽"是指源自藥學(xué)上或生理學(xué)上可接受的無機(jī)酸和有機(jī)酸和堿的那些鹽。合適的酸的實(shí)例包括鹽酸、溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、反丁烯二酸、順丁烯二酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水楊酸、琥珀酸、對(duì)甲苯硫酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。源自合適堿的鹽的實(shí)例可包括堿金屬如鈉，和堿土金屬如鎂和銨。本發(fā)明的黃水枝提取物、從其分離的黃水枝酸化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽特異性地影響表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原L6或其同系物的癌細(xì)胞以誘導(dǎo)癌細(xì)胞的失巢凋亡。如本文所用，術(shù)語"腫瘤相關(guān)抗原L6或其同系物"指這樣的蛋白，其形成跨膜L6超家族，誘導(dǎo)不受控制的細(xì)胞生長并且在各種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。腫瘤相關(guān)抗原L6或其同系物包括L6、TM4SF5(或L6H;跨膜4次的L6家族成員5)、IL-TMP和L6D，優(yōu)選為TM4SF5。如本文所用，術(shù)語"失巢凋亡(anoikis)"指由細(xì)胞與胞外基質(zhì)附著減少或者細(xì)胞與胞外基質(zhì)不適當(dāng)?shù)酿ぶ鸬奶囟ㄐ问降募?xì)胞凋亡。為了方便起見，失巢凋亡在本發(fā)明中可被描述為細(xì)胞死亡或細(xì)胞凋亡。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，其尋找抑制由于腫瘤相關(guān)抗原L6的同系物TM4SF5誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖的化合物，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)黃水枝酸(3,23-二羥基-20(29)-羽扇烯-27-酸)在表達(dá)TM4SF5的細(xì)胞系中誘導(dǎo)失巢凋亡。當(dāng)TM4SF5-表達(dá)細(xì)胞系用黃水枝酸(TA)處理時(shí)，黏著斑分子的磷酸化被抑制，這導(dǎo)致細(xì)胞附著減少。因此，細(xì)胞增殖被抑制，導(dǎo)致失巢凋亡。此外，TA給藥在裸鼠中抑制了TM4SF5-介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生。這些觀察表明黃水枝酸(TA)可被開發(fā)為針對(duì)TM4SF5-陽性腫瘤發(fā)生的推定治療劑。已知表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原L6或其同系物的癌細(xì)胞引起了肝癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭或頸癌、皮膚或眼睛黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、大腸癌、小腸癌、直腸癌、肛門癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金病、食管癌、小腸癌、惡性淋巴瘤、膀胱癌、膽囊癌、內(nèi)分泌腺癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、泌尿系統(tǒng)癌(urinarycancer)、陰莖癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴細(xì)胞淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎細(xì)胞癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、脊柱腫瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、或垂體腺瘤，優(yōu)選為肝癌、胰腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳頭狀癌、軟組織肉瘤、非內(nèi)分泌肺腫瘤、或ACTH-陰性支氣管類癌瘤。另一方面，本發(fā)明提供用于預(yù)防和治療癌癥疾病的藥物組合物，其包括作為活性成分的失巢凋亡誘導(dǎo)劑，所述失巢凋亡誘導(dǎo)劑包含黃水枝提取物、從其分離的黃水枝酸化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其對(duì)表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原L6或其同系物的癌細(xì)胞具有特異性。本發(fā)明的用于預(yù)防和治療癌癥疾病的組合物，基于該組合物的總重量，包括按重量計(jì)O.l至50%的失巢凋亡誘導(dǎo)劑，其包含黃水枝提取物、從其分離的黃水枝酸化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。本發(fā)明的藥物組合物可進(jìn)一步包括在藥物組合物制備中通常使用的合適的載體、賦形劑和稀釋劑。按照常規(guī)方法，本發(fā)明的藥物組合物可被配制成口服制劑，如粉末、顆粒、片劑、膠囊、懸浮液、乳液、糖漿和氣溶膠；外用制劑；栓劑；或無菌可注射溶液。在組合物中包含的載體、賦形劑或稀釋劑，舉例來說，可為乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯橡膠(acaciarubber)、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯垸酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。這樣的制劑可采用通常使用的稀釋劑或賦形劑進(jìn)行制備，如填料、補(bǔ)充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑和表面活性劑。用于口服給藥的固體制劑的實(shí)例包括片劑、丸劑、粉末、顆粒和膠囊，并且固體制劑可通過將該化合物與至少一種賦形劑如淀粉、碳酸鈣、蔗糖、乳糖和明膠混合而制備。此外，除了賦形劑外，可以使用潤滑劑如硬脂酸鎂和滑石。用于口服給藥的液體制劑的實(shí)例包括懸浮液、內(nèi)服的液體、乳液和糖漿，并且除了一般的稀釋劑如水和液體石蠟外，可包含各種賦形劑如濕潤劑、增甜劑、香料和防腐劑。腸胃外給藥的制劑的實(shí)例包括無菌水溶液、非水溶劑、懸浮液、乳液、凍干劑和栓劑。作為非水溶劑和懸浮液，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油、可注射酯如油酸乙酯或類似物。作為栓劑基質(zhì)，可以使用witepsol、聚乙二醇(macrogol)、吐溫61(tween61)、可可脂、月桂油脂(lauricbutter)、甘油明膠或類似物。本發(fā)明藥物組合物的有效劑量可根據(jù)患者的健康狀況和體重、疾病的嚴(yán)重性、藥物劑型、給藥途徑和給藥時(shí)間而確定，并且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)?shù)剡x擇。然而，為了起到更好的功效，本發(fā)明的組合物可以日劑量0.0001至100mg/kg，優(yōu)選地0.001至10mg/kg給藥一次或幾次。該劑量并不意欲限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的藥物組合物可經(jīng)由各種途徑被施用給哺乳動(dòng)物如大鼠、小鼠、家畜和人。考慮所有的給藥方式，例如，給藥可以口服、直腸地或者通過靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、硬腦膜內(nèi)(intraepiduml)或腦室內(nèi)注射而進(jìn)行。在仍然另一方面，本發(fā)明涉及用于治療和預(yù)防由表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原L6或其同系物的癌細(xì)胞引起的癌癥疾病的方法，所述方法包括下列步驟向患有癌癥的對(duì)象施用失巢凋亡誘導(dǎo)劑，所述失巢凋亡誘導(dǎo)劑包含黃水枝提取物、從其分離的黃水枝酸化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其對(duì)表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原L6或其同系物的癌細(xì)胞具有特異性，或者施用包括所述失巢凋亡誘導(dǎo)劑的藥物組合物，用于治療和預(yù)防癌癥疾病。按照本發(fā)明的癌細(xì)胞特異的失巢凋亡誘導(dǎo)劑或藥物組合物，其功效、給藥方法和劑量與上述相同。在本發(fā)明的方法中，術(shù)語"對(duì)象(subject)"包括哺乳動(dòng)物如人、猴子、小鼠、豬、牛和兔，但不限于此。在仍然是另一方面，本發(fā)明提供功能性保健食品，其包括作為活性成分的失巢凋亡誘導(dǎo)劑，所述失巢凋亡誘導(dǎo)劑包含黃水枝提取物、從其分離的黃水枝酸化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其對(duì)表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原L6或其同系物的癌細(xì)胞具有特異性。包括癌細(xì)胞特異的失巢凋亡誘導(dǎo)劑作為活性成分的食品包括但不限于各種食品、飲料、口香糖、茶、復(fù)合維生素和健身食品(healthimprovingfood)。癌細(xì)胞特異的失巢凋亡誘導(dǎo)劑_—其包括黃水枝提取物、從其分離的黃水枝酸化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽一一基于食品的總重，可按重量計(jì)包含有0.01至15%的量，并且基于100ml保健飲料組合物，加入量可為0.02至5g，優(yōu)選為0.3至1g。本發(fā)明的功能性保健食品可以為片劑、膠囊、丸劑、液體制劑或類似形式。本發(fā)明的保健飲料組合物不限于任何特定的組合物，只要它是以指出的比例包含上述化合物為基本成分的液體，象普通的飲料，并且可包含各種增甜劑或天然碳水化合物為附加成分。上述天然碳水化合物的實(shí)例可包括單糖如葡萄糖和果糖，二糖如麥芽糖和蔗糖，多糖如糊精和環(huán)糊精，以及糖醇如木糖醇、山梨糖醇和赤蘚糖醇。作為除了上述那些之外的增甜劑，可有利地使用天然增甜劑(奇甜蛋白(thaumatine)、甜葉菊提取物(如新蛇菊苷A)、甘草皂苷)，和合成增甜劑(糖精、天冬甜精)。每100ml本發(fā)明的組合物，所述天然碳水化合物的比例一般地為大約1至20g，優(yōu)選地大約5至12g。除了上述之外，本發(fā)明的功能性保健食品可包含各種營養(yǎng)素、維生素、礦物(電解質(zhì))、香料如合成香料和天然香料、著色物質(zhì)和高效增鮮味劑(奶酪、巧克力)、果膠酸和其鹽、褐藻酸和其鹽、有機(jī)酸、保護(hù)膠增稠劑、pH控制劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、甘油、醇和碳酸飲料應(yīng)用的碳酸化試劑。此外，本發(fā)明的功能性保健食品可包含天然果汁和果漿，以提供果汁飲料和植物飲料。這些成分可單獨(dú)地或組合地使用。這些添加劑的比例不是那么關(guān)鍵，但是每100份按重量計(jì)本發(fā)明的化合物，可一般選自按重量計(jì)0至大約20份的范圍。在下文中，本發(fā)明將參考實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)實(shí)施例更詳細(xì)描述。然而，這些實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)實(shí)施例僅是為了例證性目的，本發(fā)明沒有意欲被這些實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)實(shí)施例所限制。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1.黃水枝粗制提取物的制備在韓國UlhmgIsland收集黃水枝的整個(gè)植物，并且其Ukg被干燥、粉碎并且與5L甲醇混合?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?4小時(shí)，并且真空下過濾以回收上清液。重復(fù)該過程兩次以收集上清液。然后，上清液在減壓下濃縮以得到100.5g黃水枝的甲醇粗制提取物。實(shí)施例2.極性溶劑可溶性黃水枝提取物的制備將在實(shí)施例1中得到的黃水枝粗制提取物懸浮在1L蒸餾水中。1L丁醇加入其中，并且混合以分成丁醇可溶性部分和水可溶性部分，接著過濾和在減壓下濃縮以去除溶劑。最后，得到80.0g丁醇可溶性黃水枝提取物，以用作下列實(shí)驗(yàn)中的樣品。實(shí)施例3.從黃水枝提取物分離黃水枝酸3.29kg黃水枝在室溫下用64L甲醇提取四次，進(jìn)行7天，接著在減壓下濃縮以得到3.52kg甲醇提取物。將3.52kg甲醇提取物懸浮在IOL水中，然后用30L己院重復(fù)提取三次以得到651g己垸可溶性部分。濾液用30L乙酸乙酯重復(fù)提取三次以得到510g乙酸乙酯可溶性提取物。此外，乙酸乙酯提取之后，40L剩余的懸浮液放入DiaionHP-20中，并且用80L水洗脫。水可溶性部分被凍干以得到1.4kg，然后用80L50。/。的甲醇洗脫。50%甲醇可溶性部分被凍干以得到792g。最后，DiaionHP-20柱用甲醇洗脫以得到158g甲醇可溶性部分。黃水枝提取物的各個(gè)部分經(jīng)歷薄層層析。結(jié)果，己烷可溶性部分被發(fā)現(xiàn)包含大量黃水枝酸。330g，一半量的己烷可溶性部分被加入到4kg硅膠中，然后用己烷-乙酸乙酯(10:l，13.2L;5:1,16.8L;2:1,24L)、氯仿-甲醇(9:1,36L)、氯仿-甲醇-水(7:3:0.1,20L)和12L甲醇依次進(jìn)行洗脫以產(chǎn)生9個(gè)部分。通過進(jìn)行薄層層析，黃水枝酸被發(fā)現(xiàn)在部分6和7中。包含黃水枝酸的兩個(gè)部分被放在一起，應(yīng)用到2kg硅膠中，接著用氯仿-甲醇(20:l，18.9L;7:1,9L;3:1，4L)和9L甲醇洗脫產(chǎn)生11個(gè)部分。其中，黃水枝酸被發(fā)現(xiàn)在部分4、5和6中。這些部分被應(yīng)用到硅膠柱中，并且經(jīng)歷溶劑再結(jié)晶以得到2g黃水枝酸。此外，330g己烷可溶性部分通過上述方法進(jìn)行分離，得到2g黃水枝酸。具有下列物理性質(zhì)的總共4g黃水枝酸被分離和純化(下文被稱為TA)。針狀體(MeOH);mp254-256C;23D+94灘啶，c0.14);IR(KBr,cm-l):3491(OH),1689(CO),1645(C=C),1450,1388，1262,1222,1044;HRMSm/z472.3552(M+，CalcdforC30H48O4:472.3553);EIMS(rel.int.)m/z:472[M]十(61),454[M-H20]+(34),436[M-2H20]+(62),424(42),396(26),205(75),187(71),175(87),173(100);13C-NMR(150MHz,吡啶-d5):13.0(C-24),17.4(C-25),17.5(C-26),18.7(C-6),18.8(C-28),19,4(C-30)，21.3(C-ll),25.8(C-15),26.7(C-12),27.9(C-2),30,1(C-21),37,7(C-10),38.2(C-7),38.3(C-16),39.2(C-l),39.6(C-13),40.4(C-22),40.8(C-8),42.9(C-4),43.0(C-17),48.1(C-19)，49.2(C-5),51.4(C-18),51.6(C-9),60.4(C-14),68.2(C-23),73.6(C-3),110.2(C-29),150.9(C-20)，178,3(C-27);1H-NMR(600MHz,吡啶陽d5):1.05,1.71(2H,m,每個(gè)，H-l),1.82,1.91(2H,m,每個(gè)，H-2),4.02(1H,dd,J=4.7,11.6Hz,H-3),1.51(1H,dd,J=1.5,12.0Hz,H-5),1.48,1.65(2H,m,每個(gè)，H-6),1.87,2.06(2H,m，每個(gè)，H-7),2.02(1H,dd,J=1.7,12.7Hz,H-9),1,32,1.64(2H,m,每個(gè)，H-ll),1.87,2.60(2H,m，每個(gè)，H-12),1.88(1H，m,H-13),1.67，2.28(2H,m,每個(gè)，H-15),1,70,1.78(2H,m,每個(gè)，H-16),1.81(IH，m，H-18)，2.60(1H，m,H-19),1.36,1.97(2H,m，每個(gè)，H-21)，1.16,1.40(2H,m,每個(gè)，H-22),3,57,4.07(2H,d,J=10.4,每個(gè)，H-23)，1.04(3H，s，H-24),1.01(3H,s,H-25),1.21(3H,s,H-26),0.90(1H,s,H-28).4.76,4.96(2H,s,每個(gè)，H-29),1.86(3H,d,J=6.4Hz,H-30).對(duì)比實(shí)施例1.細(xì)胞培養(yǎng)病毒感染后，混合穩(wěn)定克隆(對(duì)照SNU449Cp禾PTM4SF5-表達(dá)的SNU449Tp細(xì)胞克隆)和單細(xì)胞衍生的穩(wěn)定克隆(singlecell-drivenstableclones)(TM4SF5-表達(dá)的SNU449T16)通過用具有空pLNCX和帶有TM4SF5的pLNCX的反轉(zhuǎn)錄病毒感染SNU449肝臟細(xì)胞(韓國細(xì)胞銀行(KoreanCellBank),首爾，韓國)。親代和對(duì)照細(xì)胞(Cp)在37°C和5%(302下分別被保持在不含或含有200嗎/mlG418(A.G.ScientificInc.,SanDiego,CA)的RPMI-1640/10%FBS/0.25Hg/ml慶大霉素(Calbiochem,SanDiego,CA)中。內(nèi)源表達(dá)TM4SF5的細(xì)胞和內(nèi)源不表達(dá)TM4SF5的細(xì)胞(韓國細(xì)胞銀行)被保持在含有10%FBS的DMEM-H或RPMI-1640培養(yǎng)基(JBIInc.,Daegu,Korea)中。對(duì)比實(shí)施例2.細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的制備和蛋白質(zhì)印跡在不同實(shí)驗(yàn)條件下，來自細(xì)胞的全細(xì)胞溶胞產(chǎn)物如文獻(xiàn)(Lee,S.Y.etal.,Focaladhesionandactinorganizationbyacross-talkofTM4SF5withintegrina2areregulatedbyserumtreatment,ExpCellRes,312,pp.2983-99,2006)中所述制備。例如，細(xì)胞與對(duì)照GFP、野生型黏著斑激酶(FAK)、樁蛋白、pl30CaseDNA—起經(jīng)歷電穿孔(950pF,250V)。電穿孔后一天，細(xì)胞用TA(20nM)處理所指出的時(shí)間。正常培養(yǎng)的或者用不同濃度TA處理指出時(shí)間段的細(xì)胞采用RIPA緩沖液進(jìn)行收獲。來自裸鼠的對(duì)照或腫瘤組織在手術(shù)后立刻用液N2冷凍。液N2中的組織用研缽和研杵勻漿，并且用含有O.P/。SDS的RIPA緩沖液進(jìn)行提取。溶胞產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)印跡通過利用針對(duì)二氧磷基(phosph)-Y397、Y407、Y577、Y861、Y925FAK(BioSourceInternational,Inc.,Camarillo,CA)、二氧磷基-Y楊Src、c-Src、pl51NK4B、pl61NK4A(SantaCruzBiotech.,SantaCruz,CA)、FAK、pl30Cas、樁蛋白、pY"8樁蛋白、活性胱天蛋白酶-3(Capase-3)(BDTransduct,Lab"SanJose,CA)、a-微管蛋白(Sigma,StLouis,MO)、二氧磷基-S473、或T3Q8Akt、Akt、二氧磷基-Erkl/2、Erk1/2(CellSignalingTech.,Danvers,MA)、禾PTM4SF5(自制)的抗體進(jìn)行。對(duì)比實(shí)施例3.免疫熒光顯微術(shù)細(xì)胞用DMSO或20TA處理24小時(shí)。然后，細(xì)胞在預(yù)包被有10昭/ml纖連蛋白的蓋玻片上鋪板并且在DMSO或20TA存在下溫育2小時(shí)。接著，如文獻(xiàn)(Lee,S.Y.etal.，F(xiàn)ocaladhesionandactinorganizationbyacross-talkofTM4SF5withintegrina2areregulatedbyserumtreatment,ExpCellRes,312,pp.2983-99,2006)中所述，利用pY，F(xiàn)AK、pY118樁蛋白和肌動(dòng)蛋白進(jìn)行免疫熒光染色。安裝好的樣品通過熒光顯微鏡(BX51，Olympus,Japan)顯現(xiàn)。對(duì)比實(shí)施例4.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的準(zhǔn)備4-5周齡的雌性裸鼠(BALB/cAnNCrjBgi-nu)購買自O(shè)rient.Co.Ltd.(Seongnam，韓國)。小鼠被安置在可控溫度和濕度下的特定無病原體的室中。所有動(dòng)物程序按照SeoulNationalUniversityLaboratoryAnimalMaintenanceManual中的程序和IRB協(xié)議進(jìn)行。5-6周齡的小鼠皮下注射5xio6個(gè)活的SNU449Cp或SNU449T16細(xì)胞。腫瘤體積用卡尺進(jìn)行測(cè)量并且采用下列數(shù)學(xué)式1進(jìn)行計(jì)算。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到200mm3時(shí)，小鼠每隔一天腹膜內(nèi)注射3mg/kg或30mg/kg(體重)的黃水枝酸(TA)，進(jìn)行30天。(寬度x長度2)/2寬度最小直徑(mm)長度最大直徑(mm)實(shí)驗(yàn)實(shí)施例l.對(duì)TM4SF5-表達(dá)細(xì)胞生長的抑制作用為了測(cè)量在實(shí)施例3中得到的黃水枝酸(TA)對(duì)TM4SF5-表達(dá)細(xì)胞生長的抑制作用，如文獻(xiàn)(Lee,S.Y.etal.,Focaladhesionandactinorganizationbyacross-talkofTM4SF5withintegrina2areregulatedbyserumtreatment,ExpCellRes,312,pp.2983-99,2006)中所述進(jìn)行下列步驟。通過對(duì)比實(shí)施例1的方法培養(yǎng)的TM4SF5-裸親代SNU449(下文被稱為T')、穩(wěn)定對(duì)照SNU449(下文被稱為'Cp')、穩(wěn)定TM4SF5-超表達(dá)SNU449Tp(下文被稱為Tp')和SNU449T16(下文被稱為'T16')用不同濃度(0、0.1、5、20pM)的黃水枝酸(TA)處理，并且測(cè)定對(duì)細(xì)胞生長的抑制作用。結(jié)果分別顯示在圖l至4中。如圖1禾B2所示，發(fā)現(xiàn)黃水枝酸(TA)對(duì)TM4SF5-表達(dá)細(xì)胞的生長呈現(xiàn)出抑制作用，而對(duì)TM4SF5的表達(dá)水平?jīng)]有影響(參見圖1和2)。此夕卜，如圖3和4所示，當(dāng)TM4SF5裸SNU449Cp細(xì)胞用20pM黃水枝酸(TA)處理3天時(shí)，沒有觀察到抑制作用。另一方面，當(dāng)TM4SF5-表達(dá)SNU449Tp細(xì)胞用黃水枝酸(TA)處理3天時(shí)，在5pM的低濃度下觀察到抑制作用，并且在20^M濃度下觀察到降低的細(xì)胞密度和圓形的細(xì)胞(參見圖3)。如圖4所示，TA處理減少了TM4SF5-表達(dá)細(xì)胞的數(shù)目，這表明抑制作用是由于細(xì)胞凋亡(參見圖4)。接下來，為了證實(shí)黃水枝酸(TA)對(duì)TM4SF5具有特異性，黃水枝酸(TA)的細(xì)胞毒性采用具有內(nèi)源TM4SF5表達(dá)的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。RT-PCR采用下面表1中描述的引物組在包括94°C30秒、55。C30秒和72。C30秒的30個(gè)循環(huán)在內(nèi)的條件下進(jìn)行。結(jié)果顯示在圖5中(參見圖5)。不同的細(xì)胞系采用5或20pM濃度的黃水枝酸(TA)進(jìn)行處理。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>結(jié)果，發(fā)現(xiàn)包括Hek293和COS7成纖維細(xì)胞、MDA-MB-453乳腺上皮細(xì)胞、SNU638和SNU668胃上皮細(xì)胞、以及SNU398肝上皮細(xì)胞在內(nèi)的TM4SF5-裸細(xì)胞隨著時(shí)間而增殖。因此，可以看出，這些細(xì)胞沒有受到黃水枝酸(TA)的影響。然而，具有內(nèi)源TM4SF5表達(dá)的細(xì)胞在TA處理后顯示出生長抑制，這導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)目的最終減少(參見圖6和7)。因此，可以看出，上述結(jié)果與那些異常表達(dá)TM4SF5的SNU449Tp有關(guān)。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2.黃水枝酸(TA)-介導(dǎo)的黏著斑分子激活的抑制為了檢測(cè)哪個(gè)信號(hào)分子受到黃水枝酸(TA)影響，如文獻(xiàn)(Lee,S.Y.etal.，F(xiàn)ocaladhesionandactinorganizationbyacross-talkofTM4SF5withintegrina2areregulatedbyserumtreatment,ExpCellRes,312,pp.2983-99，2006)中所述進(jìn)行下列過程。SNU449細(xì)胞系用黃水枝酸(TA)以劑量(0、1、5、20pM)和時(shí)間(0、8、16、24、36小時(shí))依賴性方式進(jìn)行處理。SNU449Cp和SNU449T16細(xì)胞系用不同濃度(0、1、5、20^M)的黃水枝酸(TA)處理24小時(shí)，然后進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)。如圖8所示，在用20^MTA處理的TM4SF5-表達(dá)SNU449T16細(xì)胞中，觀察到降低的黏著斑激酶(FAK)和樁蛋白磷酸化以及pl30Cas蛋白水平，而在不表達(dá)TM4SF5的SNU449Cp細(xì)胞中沒有觀察到作用(參見圖8)。同樣，在用20TA處理的SNU449T16細(xì)胞中，F(xiàn)AK和樁蛋白的磷酸化以及pl30Cas的蛋白水平以時(shí)間依賴性方式顯著下降(參見圖9)。此外，可以看出，黃水枝酸(TA)處理降低了pl30Cas的磷酸化以及黏著斑激酶(FAK)、pl30Cas和樁蛋白之間的物理締合(參見圖10)。而且，黃水枝酸(TA)的TM4SF5-依賴性抑制作用在TM4SF5-表達(dá)SNU449Tp細(xì)胞系中被觀察到(參見圖11)。這些觀察表明在TM4SF5-表達(dá)細(xì)胞中，黃水枝酸(TA)處理僅僅影響了黏著斑分子的磷酸化和復(fù)合形成(complexformation)。此外，黃水枝酸(TA)-介導(dǎo)的對(duì)黏著斑分子激活的作用在表達(dá)內(nèi)源TM4SF5的細(xì)胞中以及裸細(xì)胞系中進(jìn)行檢測(cè)。有趣的是，TA處理對(duì)黏著斑分子激活的抑制作用也在內(nèi)源表達(dá)但不缺少TM4SF5的細(xì)胞中觀察到(參見圖12)。然而，如上述結(jié)果所示(參見圖11)，發(fā)現(xiàn)黃水枝酸(TA)處理在SNU449Cp和SNU449Tp中稍微增加了pErk1/2。因?yàn)辄S水枝酸(TA)抑制黏著斑分子激活和復(fù)合形成，所以黏著斑形成將很可能受到TA處理影響。本發(fā)明人因此通過對(duì)Tyr397-磷酸化FAK(pY，F(xiàn)AK)或Tyrll8-磷酸化樁蛋白(pY118樁蛋白)進(jìn)行免疫染色，分析在TA-處理和未處理的細(xì)胞中的黏著斑形成。盡管TA處理沒有影響TM4SF5-裸細(xì)胞中黏著斑形成，但是TA處理后在TM4SF5-表達(dá)細(xì)胞中的黏著斑消失。從對(duì)pY，F(xiàn)AK或pY^樁蛋白的免疫染色的結(jié)果，在TM4SF5-表達(dá)細(xì)胞中觀察到黏著斑分子的分解(參見圖13)。TA-介導(dǎo)的黏著斑消失表示涉及TM4SF5-表達(dá)細(xì)胞中整聯(lián)蛋白a5和pY397FAK之間的解離，這與整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的黏著斑分子如pY397FAK的募集相一致(Lee,S.Y.etal.,Focaladhesionandactinorganizationbyacross-talkofTM4SF5withintegrina2areregulatedbyserumtreatment,ExpCellRes,312，pp.2983-99,2006)(參見圖14)。此夕卜，因?yàn)轲ぶ呓?jīng)由應(yīng)力纖維相互連接(Kaverina,I.etal.，Regulationofsubstrateadhesiondynamicsduringcellmotility,IntJBiochemCellBiol,34，pp.746-61,2002)，所以本發(fā)明人也對(duì)TA-處理和未處理的細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白染色。如圖15所示，發(fā)現(xiàn)TM4SF5-表達(dá)細(xì)胞在TA處理后顯示出帶有少量(insignificant)應(yīng)力纖維的異常肌動(dòng)蛋白組構(gòu)，而TM4SF5-裸細(xì)胞沒有(參見圖15)。在TA處理的TM4SF5-表達(dá)細(xì)胞中，黏著斑和肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維形成的損失可有助于TA處理后圓形細(xì)胞數(shù)目的增加。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3.黃水枝酸(TA)-介導(dǎo)的TM4SF5-表達(dá)細(xì)胞的失巢凋亡誘導(dǎo)TA處理導(dǎo)致黏著斑分子的失活和分解，可能有助于圓形形態(tài)。因此，可以認(rèn)為TA處理誘導(dǎo)TM4SF5-表達(dá)細(xì)胞的失巢凋亡。為了檢測(cè)TA處理是否影響了細(xì)胞黏著，在TA介導(dǎo)的細(xì)胞死亡分析之前進(jìn)行下列過程，如文獻(xiàn)(Yang,X.etal.,Palmitoylationsupportsassemblyandfunctionofintegrin-tetraspanincomplexes,JCellBiol,167，pp.1231-40,2004)中所述。細(xì)胞用20(iMTA處理24小時(shí)，漂浮細(xì)胞被收集并且被重新接種在預(yù)包被有纖連蛋白的盤中1小時(shí)，然后測(cè)定黏著程度。如圖16所示，TM4SF5-裸細(xì)胞(SNU449P、SNU449Cp)的黏著沒有受到TA處理的影響，而用TA預(yù)處理的TM4SF5-表達(dá)細(xì)胞(SNU449Tp、SNU449T16)顯示出明顯降低的黏著(參見圖16)。接著，當(dāng)漂浮細(xì)胞在TA或DMSO處理后進(jìn)行分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)TA處理增加了漂浮的表達(dá)TM4SF5的SNU449Tp細(xì)胞的數(shù)量，但是沒有影響不表達(dá)TM4SF5的SNU449Cp細(xì)胞(參見圖17)。按照該結(jié)果，TM4SF5-表達(dá)SNU449T16細(xì)胞的TA處理還導(dǎo)致Akt失活以及胱天蛋白酶-3激活(參見圖18)。此外，20pMTA處理24小時(shí)后，細(xì)胞DNA含量的分析產(chǎn)生大量的表達(dá)TM4SF5的SNU449Tp和SNU449T16的sub-Gl群體，但不表達(dá)TM4SF5的SNU449Cp細(xì)胞的群體則沒有(參見圖19)。因此，這些觀察表明TA只引起TM4SF5-表達(dá)細(xì)胞的失巢凋亡。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例4.黃水枝酸(TA)-介導(dǎo)的對(duì)黏著斑分子超表達(dá)的作用為了評(píng)測(cè)黏著斑分子如黏著斑激酶(FAK)、樁蛋白和pl30Cas的超表達(dá)是否將抑制TA處理的作用，如文獻(xiàn)(Lee,S.Y.etal.，F(xiàn)ocaladhesionandactinorganizationbyacross-talkofTM4SF5withintegrina2areregulatedbyserumtreatment,ExpCellRes,312,pp.2983-99，2006)中所述進(jìn)行下列過程。為了研究這一點(diǎn)，各個(gè)cDNA經(jīng)由電穿孔引入到SNU449T16細(xì)胞中。l天后，細(xì)胞用20^MTA處理24小時(shí)以獲得溶胞產(chǎn)物。用引入有對(duì)照質(zhì)粒(對(duì)于GFP)的SNU449T16細(xì)胞的TA處理表明黏著斑分子的時(shí)間依賴性失活和胱天蛋白酶-3的激活，這支持了TA-介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。然而，引入有野生型黏著斑激酶(FAK)、樁蛋白或pl30Cas的SNU449T16細(xì)胞導(dǎo)致一定程度的抑制TA介導(dǎo)的作用(參見圖20)。此外，黏著斑分子的過量表達(dá)也抑制了TA介導(dǎo)的sub-Gl群體的增加(參見圖21)。因此，TA-介導(dǎo)的對(duì)TM4SF5-表達(dá)細(xì)胞的作用可通過黏著斑分子的過量表達(dá)被削弱至一定程度。另一方面，在各個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下沒有觀察到Erid/2激活的變化，由此了解在這種實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中TA-介導(dǎo)的對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例5.黃水枝酸(TA)對(duì)裸鼠中TM4SF5-介導(dǎo)的腫瘤形成的作用為了評(píng)測(cè)黃水枝酸(TA)給藥是否可干擾裸鼠中TM4SF5介導(dǎo)的腫瘤形成，如文獻(xiàn)(LeeS-Aetal.,TM4SF5-mediatedtransmodulationbetweencytosolicp27KiplandRhoGTPasesandepithelial-mesenchymaltransitioncauselossofcontactinhibition,CancerCell,200乃中所述進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)。如前所報(bào)道，注射有TM4SF5-表達(dá)SNU449T16細(xì)胞的裸鼠形成了明顯的腫瘤，而注射TM4SF5-裸SNU449Cp細(xì)胞沒有形成腫瘤。當(dāng)黃水枝酸(TA)每隔一天腹膜內(nèi)給予己有腫瘤(200mm3的計(jì)算腫瘤體積)的小鼠30天時(shí)，TM4SF5-介導(dǎo)的腫瘤形成被減少。如圖22所示，黃水枝酸(TA)以3或30mg/kg體重給藥分別將腫瘤體積減少至46.0%或22.1%，而體重正常增加，這表明沒有顯著的毒副作用(參見圖22)。利用注射有SNU449Cp細(xì)胞的斑點(diǎn)周圍的對(duì)照組織和注射SNU449Tp的小鼠的腫瘤組織的蛋白質(zhì)印跡分析揭示TM4SF5-介導(dǎo)的腫瘤組織呈現(xiàn)出Akt激活以及胱天蛋白酶-3失活，這表明腫瘤形成的信號(hào)活動(dòng)。然而，TA給藥降低了Akt激活，增加了pl5INK4B或pl6INK4ACKI(細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑)水平，并且提高了胱天蛋白酶-3激活，這表明TA導(dǎo)致TM4SF5-介導(dǎo)的腫瘤的生長抑制和細(xì)胞凋亡(參見圖23)?；钚噪滋斓鞍酌?3的免疫組織化學(xué)染色在從己經(jīng)用TA處理的小鼠中獲得的TM4SF5-介導(dǎo)的腫瘤組織中為陽性(參見圖24)。因此，TA特異性地干擾了裸鼠中TM4SF5-介導(dǎo)的腫瘤形成，這大概是通過提高細(xì)胞凋亡進(jìn)行的。這些結(jié)果表明TA可進(jìn)一步被開發(fā)為TM4SF5-陽性腫瘤潛在的治療試劑。包括本發(fā)明的提取物或化合物的藥物制劑的實(shí)施例將被描述。然而，這些實(shí)施例僅是為了例證性目的，并且本發(fā)明沒有意欲被這些實(shí)施例限制。制備實(shí)施例1.粉末的制備黃水枝粗制提取物300mg乳糖100mg滑石10mg這些成分被混合并填充入氣密性囊中以制備粉末試劑。制備實(shí)施例2.片劑的制備黃水枝酸50mg玉米淀粉100mg乳糖100mg硬脂酸鎂2mg這些成分的混合物采用一般的壓片方法被制備成片劑。制備實(shí)施例3.膠囊的制備黃水枝粗制提取物50mg玉米淀粉lOOmg乳糖100mg硬脂酸鎂2mg這些成分的混合物按照一般方法被填充到明膠膠囊中，以便得到膠囊劑。制備實(shí)施例4.可注射制劑的制備黃水枝酸50mg無菌蒸餾水適量pH調(diào)節(jié)劑適量按照一般方法，包含上述成分的可注射制劑被制備成(2ml)安瓿。制備實(shí)施例5.液體制劑的制備黃水枝粗制提取物100mg高果糖漿10g甘露糖醇5g凈化水適量按照一般方法，將每種成分溶解在凈化水中。向上述成分中加入適量的檸檬香料，并且混合。然后，加入凈化水至100ml的體積，填充入棕色瓶中，并且滅菌以制備液體制劑。制備實(shí)施例6.保健食品的制備黃水枝酸1000mg維生素混合物適量醋酸維生素A70嗎維生素E1.0mg維生素0.13mg維生素B20.15mg維生素B60.5mg維生素B120.2嗎維生素c10mg生物素10嗎煙酰胺1.7mg葉酸50昭泛酸鈣0.5mg礦質(zhì)混合物適量硫酸鐵1.75mg氧化鋅0.82mg碳酸鎂25.3mg磷酸二氫鉀15mg磷酸氫二鉀55mg檸酸酸鉀90mg碳酸釣100mg氯化鎂24.8mg維生素和礦質(zhì)混合物的組合物按照各個(gè)合適成分的優(yōu)選組合，但是任選地，可以被改變。上述成分按照常規(guī)保健食品生產(chǎn)方法進(jìn)行混合以制備進(jìn)一步用作保健食品組合物的顆粒。制備實(shí)施例7.保健飲料的制備黃水枝粗制提取物1000mg檸檬酸1000mg寡糖100g李子濃縮物(pulmconcentrate)2g?；撬?g凈化水被填充至900ml上述成分按照常規(guī)保健飲料生產(chǎn)方法進(jìn)行混合，并且混合物在85。C下伴隨攪拌加熱一小時(shí)。溶液被過濾并且儲(chǔ)存在密封且無菌的2L容器中。容器然后被儲(chǔ)存在冰箱中，以進(jìn)一步被用作保健飲料組合物。飲料組合物按照各個(gè)成分的優(yōu)選組合，但不總限于此，并且可考慮到需求階級(jí)、需求國家、使用目的、地方和國家的優(yōu)選等進(jìn)行改變。工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的黃水枝提取物、從其分離的黃水枝酸化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽呈現(xiàn)出降低癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的作用，由此被用作用于預(yù)防和治療癌癥疾病的藥物組合物和功能性保健食品。權(quán)利要求1.失巢凋亡誘導(dǎo)劑，其包括黃水枝提取物、從其分離的黃水枝酸化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，所述失巢凋亡誘導(dǎo)劑對(duì)表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原L6或其同系物的癌細(xì)胞具有特異性。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的失巢凋亡誘導(dǎo)劑，其中所述提取物是粗制提取物或極性溶劑可溶性提取物。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的失巢凋亡誘導(dǎo)劑，其中所述粗制提取物是在包括凈化水在內(nèi)的水、Cl-C4低級(jí)醇或其混合物中可溶的提取物。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的失巢凋亡誘導(dǎo)劑，其中所述極性溶劑可溶性提取物是在選自水、甲醇、乙醇、丁醇和其混合物的溶劑中可溶的提取物。5.根據(jù)權(quán)利要求l所述的失巢凋亡誘導(dǎo)劑，其中所述腫瘤相關(guān)抗原L6或其同系物是L6、TM4SF5、IL-TMP或L6D。6.根據(jù)權(quán)利要求l所述的失巢凋亡誘導(dǎo)劑，其中所述癌細(xì)胞是選自下列的任何一種肝癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭或頸癌、皮膚或眼睛黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、大腸癌、小腸癌、直腸癌、肛門癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金病、食管癌、小腸癌、惡性淋巴瘤、膀胱癌、膽囊癌、內(nèi)分泌腺癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、泌尿系統(tǒng)癌、陰莖癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴細(xì)胞淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎細(xì)胞癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、脊柱腫瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤和垂體腺瘤。7.用于治療和預(yù)防癌癥疾病的藥物組合物，其包括權(quán)利要求l的癌細(xì)胞特異的失巢凋亡誘導(dǎo)劑。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其中基于所述組合物的總重量，所述癌細(xì)胞特異的失巢凋亡誘導(dǎo)劑按重量計(jì)被包含的量為O.l~50%。9.用于預(yù)防和改善癌癥疾病的功能性保健食品，其包括權(quán)利要求l的癌細(xì)胞特異的失巢凋亡誘導(dǎo)劑作為活性成分。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的功能性保健食品，其中所述功能性保健食品是片劑、膠囊、丸劑或液體。11.治療癌癥疾病的方法，其通過將權(quán)利要求l的癌細(xì)胞特異的失巢凋亡誘導(dǎo)劑施用給患有癌癥的哺乳動(dòng)物進(jìn)行。12.權(quán)利要求l的癌細(xì)胞特異的失巢凋亡誘導(dǎo)劑在制備癌癥疾病治療試劑中的應(yīng)用。13.權(quán)利要求l的癌細(xì)胞特異的失巢凋亡誘導(dǎo)劑在癌癥疾病治療中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及失巢凋亡誘導(dǎo)劑，其包括黃水枝提取物、從其分離的黃水枝酸化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，所述失巢凋亡誘導(dǎo)劑對(duì)表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原L6或其同系物的癌細(xì)胞具有特異性。本發(fā)明的黃水枝提取物、從其分離的黃水枝酸化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽導(dǎo)致細(xì)胞附著減少以降低癌細(xì)胞增生，并且在表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原L6或其同系物的癌細(xì)胞中呈現(xiàn)出誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的作用，因此被用于治療和預(yù)防由于腫瘤相關(guān)抗原L6或其同系物的癌癥。文檔編號(hào)A61P35/00GK101678058SQ200780053134公開日2010年3月24日申請(qǐng)日期2007年11月30日優(yōu)先權(quán)日2007年5月26日發(fā)明者吳世湸,安境燮,崔洙龍,崔順子,李昊宰,李正源,李炯圭,李相龜,李重求,金斗英,金正姬,金秀賢,金銀娥申請(qǐng)人:韓國生命工學(xué)研究院