專利名稱：癌癥疾病改善抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌癥疾病改善抗體(CDMAB)的分離和制備以及這些CDMAB在治療和診斷過程中的應(yīng)用，選擇性地與一種或多種化療試劑組合應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步涉及運(yùn)用本發(fā)明的CDMAB進(jìn)行的結(jié)合實(shí)驗(yàn)。
背景技術(shù)：
每個(gè)患有癌癥的個(gè)體是獨(dú)特的，正如人的身份有所不同，其所患癌癥不同于其它癌癥。盡管如此，當(dāng)前治療采用相同的方法治療患有同類癌癥處于同樣階段的所有病人。這些病人中至少有30％在一線治療(first line treatment)中失敗，由此造成更多輪次的治療，增加了治療失敗、癌癥轉(zhuǎn)移和最終死亡的可能性。治療的最佳方法是針對特定個(gè)體制定專門化療法。當(dāng)前唯一的專門化的療法是外科手術(shù)?；熀头暖煵荒茚槍Σ∪诉M(jìn)行設(shè)計(jì)，而手術(shù)本身在大多數(shù)病例中不足以治愈癌癥。
伴隨著單克隆抗體的出現(xiàn)，開發(fā)用于專門化治療的方法的可能性變得更加現(xiàn)實(shí)，因?yàn)楦骺贵w可以導(dǎo)向單個(gè)抗原決定簇。進(jìn)一步地，制備導(dǎo)向一群抗原決定簇的抗體組合成為可能，這些抗原決定簇唯一地定義了特定個(gè)體的癌癥。
在認(rèn)識到癌細(xì)胞和正常細(xì)胞之間的顯著差異在于癌細(xì)胞含有轉(zhuǎn)化細(xì)胞所特有的抗原后，科學(xué)界長期認(rèn)為可以設(shè)計(jì)單克隆抗體通過與這些癌抗原專一性的結(jié)合專一地作用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞；由此產(chǎn)生信念認(rèn)為單克隆抗體可以作為“魔術(shù)子彈”去除癌細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明公開的方法分離出的單克隆抗體已經(jīng)顯示能夠以有利于病人的方式改善癌癥疾病的進(jìn)程，例如通過降低腫瘤負(fù)荷。這些單克隆抗體在此被稱作癌癥疾病改善抗體(CDMAB)或“抗癌”抗體。
當(dāng)前，癌癥病人的治療選擇通常很少。統(tǒng)一而嚴(yán)格的癌癥治療方法在整體存活和發(fā)病率方面有所改善。然而，對于特定個(gè)體，這些改善了的統(tǒng)計(jì)數(shù)字和他們個(gè)人情況的改善沒有必然關(guān)聯(lián)。
因此，如果采用方法學(xué)使得操作者能夠在同組病人中獨(dú)立于其他病人治療每一例癌癥，該方法學(xué)將允許針對每個(gè)人進(jìn)行獨(dú)特設(shè)計(jì)的治療。理想地，這樣的治療過程將提高治愈率，產(chǎn)生更好的效果，由此滿足長期需要。
歷史上，多克隆抗體在人癌癥的治療中已取得了有限的成功。已經(jīng)采用人血漿對淋巴瘤和白血病進(jìn)行了治療，但是幾乎沒有長期的緩解或應(yīng)答。此外，該方法缺乏可重復(fù)性，和化療相比沒有額外的益處。已經(jīng)采用人全血、黑猩猩血清、人血漿和馬血清對實(shí)體瘤如乳腺癌、黑素瘤和腎細(xì)胞癌進(jìn)行了治療，相應(yīng)產(chǎn)生了無法預(yù)測和無效的結(jié)果。
已經(jīng)進(jìn)行了很多用單克隆抗體治療實(shí)體瘤的臨床實(shí)驗(yàn)。在20世紀(jì)80年代針對人乳腺癌進(jìn)行了至少4次臨床實(shí)驗(yàn)，用針對特定抗原或基于組織選擇性的抗體在至少47名病人中只產(chǎn)生了1名應(yīng)答者。直到1998年才使用人源化抗Her 2抗體結(jié)合順鉑進(jìn)行了成功的臨床實(shí)驗(yàn)。在該實(shí)驗(yàn)中對37名病人的應(yīng)答進(jìn)行了觀察，其中大約四分之一有部分應(yīng)答率，另一半具有較慢或穩(wěn)定的疾病進(jìn)程。
研究結(jié)直腸癌的臨床實(shí)驗(yàn)采用了針對糖蛋白和糖脂靶點(diǎn)的抗體。諸如對腺癌有一定專一性的17-1A抗體，已經(jīng)進(jìn)入了二期臨床，在60名病人中只有1名產(chǎn)生了部分應(yīng)答。在其它實(shí)驗(yàn)中，在附加使用環(huán)磷酰胺的方法中，17-1A的使用在52名病人中只產(chǎn)生了一個(gè)完全應(yīng)答和兩個(gè)微弱應(yīng)答。其它使用17-1A的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的效果相似。起初被批準(zhǔn)用來成像的人源化鼠單克隆抗體的使用同樣不能引起腫瘤的消退。迄今為止還沒有能夠有效治療結(jié)直腸癌的抗體。同樣的，對于肺癌、腦癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌的治療效果均不能令人滿意。用抗GD3單克隆抗體治療黑素瘤已經(jīng)取得了有限的成功。因此，可以看出盡管有成功的小動物實(shí)驗(yàn)，這些實(shí)驗(yàn)是人臨床試驗(yàn)的前提，已測試的抗體大部分還是無效的。
現(xiàn)有專利美國專利號5,750,102公開了一種用MHC基因轉(zhuǎn)染病人腫瘤細(xì)胞的過程，MHC基因可以從病人的細(xì)胞或組織克隆。隨后用這些轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對病人進(jìn)行預(yù)防接種。
美國專利號4,861,581公開的過程包括的步驟有獲取對哺乳動物腫瘤和正常細(xì)胞的一種細(xì)胞內(nèi)組分而非胞外組分具有專一性的單克隆抗體；標(biāo)記單克隆抗體；將標(biāo)記后的抗體與接受治療的哺乳動物組織進(jìn)行接觸以殺死腫瘤細(xì)胞；以及通過測定標(biāo)記抗體與降解的腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)組分的結(jié)合確定療效。在制備針對人胞內(nèi)抗原的抗體時(shí)，專利權(quán)人認(rèn)識到惡性細(xì)胞代表了這類抗原的便捷來源。
美國專利號5,171,665提供了一種全新抗體及該抗體的制備方法。特別地，該專利對一種單克隆抗體的形成進(jìn)行了揭示，該單克隆抗體可以和人腫瘤相關(guān)蛋白抗原發(fā)生很強(qiáng)地結(jié)合，例如結(jié)腸癌和肺癌，但和正常細(xì)胞的結(jié)合程度小得多。
美國專利號5,484,596提供了一種癌癥治療的方法，該方法包括從癌癥患者體內(nèi)手術(shù)去除腫瘤組織；處理腫瘤組織獲得腫瘤細(xì)胞；照射腫瘤細(xì)胞，使其可以存活但不再是致瘤的；以及采用這些細(xì)胞為病人制備疫苗，該疫苗能夠抑制原發(fā)瘤的復(fù)發(fā)并同時(shí)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。該專利對與腫瘤細(xì)胞表面抗原反應(yīng)的單克隆抗體的開發(fā)進(jìn)行了指導(dǎo)。如第4列第45行及其以后所述，專利權(quán)人用內(nèi)源性腫瘤細(xì)胞開發(fā)單克隆抗體，在人腫瘤形成中形成有活性的專一免疫療法。
美國專利號5,693,763提供了以人癌癥為特征的糖蛋白抗原，且其不依賴于其來源的上皮組織。
美國專利號5,783,186提出了誘導(dǎo)Her2表達(dá)細(xì)胞凋亡的抗Her2抗體，生成抗體的雜交瘤細(xì)胞系，用抗體和含有所述抗體的藥物組合物治療癌癥的方法。
美國專利號5,849,876描述了新的雜交瘤細(xì)胞系，該細(xì)胞系可生成從腫瘤和非腫瘤組織源中純化出的粘蛋白抗原的單克隆抗體。
美國專利號5,869,268提出了人淋巴細(xì)胞的生成方法，該淋巴細(xì)胞產(chǎn)生專一針對目標(biāo)抗原的抗體，生產(chǎn)單克隆抗體的方法以及用這種方法生產(chǎn)的單克隆抗體。該專利特別提到一種抗-HD人單克隆抗體的制備，該抗體可用于癌癥的診斷和治療。
美國專利號5,869,045涉及與人體癌癥細(xì)胞反應(yīng)的抗體、抗體片段、抗體偶聯(lián)物和單鏈免疫毒素。這些抗體的功能機(jī)制是雙重的，分子與人癌表面上的細(xì)胞膜抗原反應(yīng)，進(jìn)一步地抗體在結(jié)合之后能夠內(nèi)化進(jìn)癌細(xì)胞，使它們特別適于形成抗體-藥物和抗體-毒素偶聯(lián)物。在特定濃度下未修飾的抗體同樣具有明顯的細(xì)胞毒性。
美國專利號5,780,033公開了自身抗體在腫瘤治療和預(yù)防中的應(yīng)用。但是，該抗體是源自老年哺乳動物的抗細(xì)胞核自身抗體。在該例中，自身抗體據(jù)稱是免疫系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的一類天然抗體。因?yàn)樽陨砜贵w來自“老年哺乳動物”，因此不要求自身抗體真正來自接受治療的病人。此外該專利公開了老年哺乳動物中的天然和單克隆抗核自身抗體，以及制備單克隆抗核自身抗體的雜交瘤細(xì)胞系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明者此前已被授予名為“個(gè)性化的病人專一性抗癌抗體(Individualized Patient Specific Anti-Cancer Antibodies)”的美國專利6,180,357。該專利提出了個(gè)性化定制的用于治療癌癥疾病的抗癌抗體的選擇方法。
本申請使用‘357專利中制備病人專一性抗癌抗體的方法分離雜交瘤細(xì)胞系，這些細(xì)胞系編碼癌癥疾病改善單克隆抗體。這些抗體可以專一性地針對一種腫瘤制備，由此使得癌癥治療的專門化成為可能。在本申請全文中，具有殺死細(xì)胞(細(xì)胞毒性的)或抑制細(xì)胞生長(抑制細(xì)胞生長的)性質(zhì)的抗癌抗體在此后將被稱作細(xì)胞毒性的。這些抗體可用于幫助癌癥的定級和診斷，也可用于腫瘤轉(zhuǎn)移的治療。
個(gè)性化抗癌治療的前景將給病人的管理方式帶來改變?？赡艹霈F(xiàn)的臨床情景是在腫瘤出現(xiàn)時(shí)獲取并儲存腫瘤樣品。通過這個(gè)樣品，可以用一組既存的癌癥疾病改善抗體檢測腫瘤的類型。病人將會按常規(guī)定級但是適用的抗體可以用于對病人進(jìn)一步的定級?？梢杂么嬖诘目贵w立即對病人進(jìn)行治療，一組腫瘤專一抗體可以使用在此概述的方法或通過噬菌體表面展示文庫結(jié)合在此記載的篩選方法制備。將生成的所有抗體加入抗癌抗體文庫，因?yàn)槠渌[瘤可能與正在接受治療的腫瘤存在部分相同的抗原決定簇。根據(jù)本方法生產(chǎn)的抗體可用于治療任意數(shù)量病人的癌癥疾病，如果這些病人的癌癥可以與這些抗體結(jié)合。
除了抗癌抗體，病人可以選擇接受目前推薦的治療方法作為多重模式治療策略的一部分。通過本方法分離的抗體對于非癌癥細(xì)胞相對無毒，這使得抗體組合物可以在高劑量下獨(dú)立使用或與傳統(tǒng)治療結(jié)合使用。高的治療指數(shù)還允許在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行再治療，由此應(yīng)當(dāng)可以降低對治療產(chǎn)生抗性的細(xì)胞出現(xiàn)的可能性。
此外，將標(biāo)準(zhǔn)化療模式如放射核與本發(fā)明的CDMAB偶聯(lián)由此關(guān)注所述化療的應(yīng)用在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
如果病人的治療起始階段或轉(zhuǎn)移發(fā)展難以控制，可以重復(fù)生成腫瘤專一性抗體的過程以進(jìn)行再治療。此外，抗癌抗體可以與患者的血紅細(xì)胞偶聯(lián)并重新注射入患者體內(nèi)用于轉(zhuǎn)移的治療。對于轉(zhuǎn)移型癌癥幾乎還沒有有效的療法且轉(zhuǎn)移通常意味著很不理想的治療效果并導(dǎo)致死亡。但是，轉(zhuǎn)移型癌癥通常高度血管化，通過血紅細(xì)胞傳遞抗癌抗體可以在腫瘤位點(diǎn)聚集抗體。甚至在轉(zhuǎn)移前，很多癌癥細(xì)胞的存活依賴于宿主血液的供應(yīng)，與血紅細(xì)胞偶聯(lián)的抗癌抗體也可以有效對抗原發(fā)腫瘤?？蛇x擇地，抗體也可以和其它造血細(xì)胞偶聯(lián)，例如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞等。
抗體分為五類，每一類抗體均由重鏈賦予其相關(guān)功能。通常認(rèn)為裸抗體殺死癌細(xì)胞是由抗體依賴的細(xì)胞毒性或補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性介導(dǎo)的。例如鼠的IgM和IgG2a抗體可以通過與補(bǔ)體系統(tǒng)C-1組分的結(jié)合激活人體的補(bǔ)體，由此激活經(jīng)典的補(bǔ)體激活通路并引起腫瘤的退化。對于人抗體而言，最有效的補(bǔ)體激活抗體通常是IgM和IgG1。鼠的IgG2a和IgG3同型抗體可以有效地募集具有Fc受體的細(xì)胞毒細(xì)胞，這些受體將導(dǎo)致細(xì)胞被單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和某些淋巴細(xì)胞殺死。人的IgG1和IgG3同型抗體介導(dǎo)ADCC。
通過抗體介導(dǎo)殺死癌癥的另一種可能的機(jī)制可能是通過使用能夠催化細(xì)胞膜以及其相關(guān)糖蛋白或糖脂內(nèi)多種化學(xué)鍵的水解的因此被稱作催化抗體的抗體。
抗體介導(dǎo)殺死癌細(xì)胞的另外兩種機(jī)制被更為廣泛地接受。第一種機(jī)制是使用抗體作為疫苗，誘導(dǎo)身體針對腫瘤細(xì)胞上的推定癌癥抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)。第二種機(jī)制是使用抗體靶向生長受體并干擾受體功能或下調(diào)受體的表達(dá)由此有效地造成受體功能喪失。
因此，本發(fā)明的目的是利用通過從特定個(gè)體衍生出的細(xì)胞中制備癌癥疾病改善抗體的方法，來分離雜交瘤細(xì)胞系以及相應(yīng)的由所述雜交瘤細(xì)胞系編碼的分離出的單克隆抗體和其抗原結(jié)合片段，該疾病改善抗體對癌癥細(xì)胞有細(xì)胞毒性而同時(shí)對非癌癥細(xì)胞相對無毒。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是對癌癥疾病改善抗體及其抗原結(jié)合片段進(jìn)行指導(dǎo)。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是制備癌癥疾病改善抗體，該抗體的細(xì)胞毒性通過抗體依賴細(xì)胞毒性介導(dǎo)。
本發(fā)明的另一目的是制備癌癥疾病改善抗體，該抗體的細(xì)胞毒性通過補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性介導(dǎo)。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的是制備癌癥疾病改善抗體，該抗體的細(xì)胞毒性作為其催化細(xì)胞化學(xué)鍵水解能力的一種功能。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是制備癌癥疾病改善抗體用于癌癥診斷、預(yù)后和監(jiān)測的結(jié)合實(shí)驗(yàn)。
本發(fā)明的其它目的和優(yōu)勢通過以下說明將是顯而易見的，該說明通過本發(fā)明的圖解和例證、特定具體實(shí)施方案進(jìn)行。


圖1包含10A304.7抗體、同型對照抗體、抗EGFR抗體對數(shù)種癌細(xì)胞系和非癌細(xì)胞系的代表性FACS直方圖。
實(shí)施例1雜交瘤制備——雜交瘤細(xì)胞系10A304.7
根據(jù)布達(dá)佩斯條約，雜交瘤細(xì)胞系10A304.7在2002年11月26日保藏于美國典型菌種保藏中心(American Type Culture Collection)，弗吉尼亞馬納薩斯大學(xué)大街10801，20110-2209，其保藏號為PTA-5065。根據(jù)37CFR1.808，保藏者保證在專利授權(quán)后將永久取消被保藏材料在公眾使用方面的所有限制。
為了制備產(chǎn)生抗癌抗體的雜交瘤，在冷PBS中制備來自于HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞系的SCID小鼠中生長的結(jié)腸瘤單細(xì)胞懸浮液。溫和振蕩IMMUNEASYTM(Qiagen，Venlo，荷蘭)佐劑備用。在微離心管中將100微升IMMUNEASYTM小鼠佐劑加入1千萬個(gè)HT-29細(xì)胞中并混合且在室溫放置15分鐘。通過向8-9周大的BALB/c小鼠肌肉注射100微升含有2.5百萬個(gè)細(xì)胞的抗原-佐劑使小鼠免疫。在初始免疫兩周后用新鮮制備的含有2.5百萬個(gè)細(xì)胞的250微升抗原-佐劑通過腹膜內(nèi)注射激活免疫后的小鼠。在最后一次免疫至少兩天后使用脾進(jìn)行融合。通過融合分離出的脾細(xì)胞和NSO-1骨髓瘤細(xì)胞制備雜交瘤。對融合物的上清液進(jìn)行雜交瘤亞克隆檢測。
為了確定通過雜交瘤細(xì)胞分泌出的抗體是否是IgG或IgM同型抗體，進(jìn)行了ELISA實(shí)驗(yàn)。將含有濃度為2.4μg/ml的羊抗鼠IgG+IgM(H+L)的包被緩沖液(0.1M碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液，pH 9.2-9.6)在4℃按100μl/孔加入ELISA板中過夜。用洗滌緩沖液(PBS+0.05％Tween)將ELISA板洗3次。將封閉緩沖液(含有5％牛奶的洗滌緩沖液)按100μl/孔于室溫加入板中1小時(shí)并隨后用洗滌緩沖液洗滌三次。加入100μl/孔的雜交瘤細(xì)胞上清并將板在室溫培養(yǎng)1小時(shí)。用洗滌緩沖液洗滌板3次后，按100μl/孔加入羊抗鼠IgG或IgM山葵過氧化物結(jié)合酶的1/5000稀釋液(稀釋于含有1％牛血清蛋白的PBS)。將板在室溫培養(yǎng)1小時(shí)后，用洗滌緩沖液將板洗滌3次。100μl/孔的TMB溶液在室溫放置1-3分鐘。通過加入100μl/孔的2M H2SO4中止顯色反應(yīng)并用Perkin-Elmer HTS7000平板讀取器讀取該板在450nm的吸收值。如表1中所示10A304.7雜交瘤分泌的基本為IgG同型抗體。

在一輪限制性稀釋后，在細(xì)胞ELISA實(shí)驗(yàn)中檢測雜交瘤上清液中與靶細(xì)胞結(jié)合的抗體。測試使用3種結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29、SW1116和SW620。在使用前先將板中細(xì)胞固定。用含有MgCl2和CaCl2的PBS在室溫將板洗滌3次。將100μl含有2％多聚甲醛的PBS加入每孔中在室溫放置10分鐘后棄去。再次用含有MgCl2和CaCl2的PBS在室溫將板洗滌3次。用100μl/孔含有5％牛奶的洗滌緩沖液(PBS+0.05％Tween)在室溫進(jìn)行1小時(shí)的封閉。用洗滌緩沖液將板洗滌3次并在室溫將雜交瘤細(xì)胞上清以100μl/孔加入板中1小時(shí)。用洗滌緩沖液將板洗滌3次后按100μl/孔加入山葵過氧化物酶偶聯(lián)羊抗鼠IgG或IgM抗體的1/5000稀釋液(稀釋于含有1％牛血清蛋白的PBS)。在室溫放置1小時(shí)后用洗滌緩沖液將板洗滌3次并于室溫加入100μl/孔的TMB放置1-3分鐘。通過加入100μl/孔的2M H2SO4中止反應(yīng)并用Perkin-Elmer HTS7000平板讀取器讀取板在450nm的吸收值。在表1中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果用減去背景值后與IgG同型對照(3BD-27)相比的倍數(shù)值表示。來自10A304.7雜交瘤細(xì)胞的抗體在背景以上在HT-29、SW1116和SW620細(xì)胞中的結(jié)合分別增強(qiáng)了22.8倍、13.1倍和23.9倍。這些結(jié)果意味著抗體與抗原結(jié)合，該抗原在一些癌細(xì)胞中的表達(dá)比在其它細(xì)胞中多。
與抗體結(jié)合測試相關(guān)聯(lián)，用同樣的結(jié)腸腺癌細(xì)胞系對雜交瘤上清液的細(xì)胞毒效應(yīng)進(jìn)行了測試HT-29、SW1116和SW620?；?死細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)據(jù)自Molecular Probes(Eu，OR)。根據(jù)廠商說明書及下述變化進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在試驗(yàn)前以事先確定的合適的細(xì)胞密度將細(xì)胞分板。2天后，將雜交瘤微量滴定板中的100μl上清液轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)板中并在5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天。將作為陽性對照的孔吸空后加入100μl的疊氮化鈉和/或環(huán)己酰亞胺。因?yàn)橐阎?BD-27單克隆抗體不會和HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞結(jié)合，因此同樣加入該抗體作為同型對照?？笶GFR抗體(C225)同樣用于實(shí)驗(yàn)作為參照。在處理5天后，通過傾倒和吸干將板清空。用多通道洗瓶將含有MgCl2和CaCl2的室溫DPBS分配至各孔中，輕敲3次，通過傾倒和吸干將盤清空。在各孔中加入50μl稀釋于含有MgCl2和CaCl2的DPBS中的熒光活/死染料，并于37℃在5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30分鐘。在Perkin-Elmer HTS7000熒光平板讀取器中讀板，數(shù)據(jù)用Microsoft Excel進(jìn)行分析。結(jié)果制成表1。10A304.7雜交瘤在SW1116細(xì)胞中產(chǎn)生了11％的專一性細(xì)胞毒性，與抗EGRF抗體C225所獲得的結(jié)果相似。10A304.7和SW1116細(xì)胞的強(qiáng)結(jié)合意味著該水平的抗體結(jié)合足以介導(dǎo)該抗體對這些癌癥細(xì)胞的細(xì)胞毒性。盡管在細(xì)胞ELISA實(shí)驗(yàn)中10A304.7抗體與HT-29及SW620癌細(xì)胞有強(qiáng)結(jié)合，結(jié)合并沒有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性。該結(jié)果暗示抗體結(jié)合本身不足以介導(dǎo)10A304.7對HT-29和SW620細(xì)胞的細(xì)胞毒性。如表1中所列，3BD-27抗體，10A304.7抗體的同型抗體，此前已知不和HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞結(jié)合，在該癌細(xì)胞系中不產(chǎn)生細(xì)胞毒性。已知的非專一性細(xì)胞毒試劑疊氮化鈉和環(huán)己烯亞胺產(chǎn)生了預(yù)期的細(xì)胞毒性。作為對比，十分明確的抗癌抗體C225在SW1116癌細(xì)胞中產(chǎn)生了13％的細(xì)胞毒性。表1的結(jié)果意味著10A304.7與癌細(xì)胞的結(jié)合可能是產(chǎn)生細(xì)胞毒性的重要步驟但其本身不足以介導(dǎo)該事件的發(fā)生。
實(shí)施例2抗體制備在CL-1000燒瓶(BD Biosciences，Oakville，ON)中培養(yǎng)雜交瘤，每周進(jìn)行兩次收集和再接種，用Protein G Sepharose 4 Fast Flow(AmershamBiosciences，Baie d′Urfé，QC)的標(biāo)準(zhǔn)抗體純化步驟制備10A304.7單克隆抗體。使用人源化的、嵌合的或鼠的單克隆抗體在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中將10A304.7與一些陽性對照(抗Fas(EOS9.1，IgM，kappa，20mg/ml，eBioscience，San Diego，CA)、抗Her2/neu(IgG1，kappa，10mg/ml，Inter Medico，Markham，ON)、抗EGFR(C225，IgG1，kappa，5mg/ml，Cedarlane，Hobby，ON)、環(huán)己酰亞胺(100mM，Sigma，Oakville，ON)和NaN3(0.1％，Sigma，Oakville，ON))和陰性對照(107.3(抗TNP，IgG1，kappa，20mg/ml，BD Biosciences，Oakville，ON)、MPC-11(抗原特異性未知，IgG2b，kappa，20mg/ml)、IgG緩沖液(2％)對照組進(jìn)行了比較(表2)。對乳腺癌(MB-231、MCF-7)、結(jié)腸癌(Caco-2、DLD-1、Lovo、HT-29、SW1116、SW620)、卵巢癌(OVCAR)、胰腺癌(BxPC-3)、前列腺癌(PC-3)和非癌(CCD 27sk、Hs888Lu)細(xì)胞系進(jìn)行了測試(均來自ATCC，Manassas，VA)。活/死細(xì)胞毒性試驗(yàn)據(jù)自Molecular Probes(Eugene，OR)。根據(jù)生產(chǎn)商說明書和下述變化進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

在實(shí)驗(yàn)前以事先確定的合適的細(xì)胞密度將細(xì)胞分板。2天后，將100μl純化的抗體稀釋在培養(yǎng)基中并隨后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)板中并在5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天。通過傾倒和吸干將板清空。用多通道洗瓶將含有MgCl2和CaCl2的室溫DPBS分配至各孔中，輕敲3次，通過傾倒和吸干將板清空。在各孔中加入50μl稀釋于含有MgCl2和CaCl2的DPBS中的熒光活/死染料并于37℃在5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30分鐘。在Perkin-Elmer HTS7000熒光平板讀取器中讀取板的讀數(shù)，數(shù)據(jù)用Microsoft Excel進(jìn)行分析并將結(jié)果制成表2。數(shù)據(jù)代表了4個(gè)實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)的平均值并用以下方式定性表示4/4實(shí)驗(yàn)在背景以上均具有15％的細(xì)胞毒性(++++)，2/4實(shí)驗(yàn)在背景以上具有15％的細(xì)胞毒性(+++)，至少2/4實(shí)驗(yàn)在背景以上具有10-15％的細(xì)胞毒性(++)，以及至少2/4實(shí)驗(yàn)在背景以上具有8-10％的細(xì)胞毒性(+)。表2中未標(biāo)記的細(xì)胞代表細(xì)胞毒性結(jié)果不一致或效應(yīng)低于下限值。10A304.7抗體產(chǎn)生的細(xì)胞毒效應(yīng)是已被充分描述的抗EGFR抗體C225的35％，C225在SW1116結(jié)腸細(xì)胞系中誘導(dǎo)了31％的細(xì)胞毒性。兩個(gè)抗體對該細(xì)胞系的效應(yīng)與表1中的結(jié)果一致。此外，10A304.7和C225相比對其它癌細(xì)胞具有顯著高的細(xì)胞毒性，包括乳腺癌細(xì)胞系MDA MB231(111％)和MCF-7(850％)、前列腺癌細(xì)胞系PC-3(375％)、和卵巢癌細(xì)胞系OVCAR(667％)。重要地，10A304.7對一些非癌細(xì)胞如CCD 27sk或Hs888Lu不產(chǎn)生細(xì)胞毒性，意味著該抗體對各種癌細(xì)胞具有專一性?；瘜W(xué)細(xì)胞毒試劑產(chǎn)生了預(yù)期的細(xì)胞毒性，而考慮到生物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的局限性，其它一些用作對照的抗體也呈現(xiàn)了預(yù)期的行為。
制備用于FACS的細(xì)胞時(shí)，首先用DPBS(不含Ca++和Mg++)洗滌單層細(xì)胞。隨后在37℃使用細(xì)胞消化液(Invitrogen)將細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)板上解離。在經(jīng)過離心和收集后，用含有MgCl2、CaClC2和25％胎牛血清的Dulbecco’s磷酸鹽緩沖液(洗滌培養(yǎng)基)在4℃將細(xì)胞重懸并計(jì)數(shù)、分至合適的細(xì)胞密度、離心沉淀細(xì)胞并以20μg/ml將細(xì)胞重懸于含有10A304.7或?qū)φ湛贵w(同型對照、抗EGFR或抗Fas)的染色培養(yǎng)基中(含有MgCl2、CaCl2和2％胎牛血清的DPBS)，在冰上放置30分鐘。在加入Alexa Fluor 488-偶聯(lián)二級抗體之前，用洗滌培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次。隨后將染色培養(yǎng)基中的Alexa Fluor 488-偶聯(lián)抗體加入20分鐘。最后一次洗滌細(xì)胞并將其重懸于含有1μg/ml的碘化丙啶的染色培養(yǎng)基中。使用CellQuest軟件(BD Biosciences)在FACScan上運(yùn)行樣品進(jìn)行細(xì)胞的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)。通過調(diào)節(jié)FSC和SSC檢測儀的電壓和振幅增益設(shè)置細(xì)胞的前散射光(FSC)和側(cè)散射光(SSC)。運(yùn)行用純的同型對照抗體及隨后用Alexa Fluor 488-偶聯(lián)二級抗體染色的細(xì)胞對3個(gè)熒光通道(FL1、FL2和FL3)的檢測儀進(jìn)行校準(zhǔn)使得細(xì)胞具有均一的峰且熒光強(qiáng)度的中值大約為1-5個(gè)單位。通過FSC選通和碘化丙啶排除獲得活細(xì)胞。對于每個(gè)樣品，大約獲得10,000個(gè)活細(xì)胞用于分析，分析結(jié)果在表3中呈現(xiàn)。

表3中列出了超過同型對照的平均熒光強(qiáng)度增加倍數(shù)且定性地表示如下小于3到5(+)；5到25(++)；25到50(+++)；50以上(++++)。圖1中列出了10A304.7抗體的代表性直方圖，結(jié)合特征的證據(jù)包括在某些情況下的雙峰圖。10A304.7與所有細(xì)胞系非特異性結(jié)合，包括與非癌細(xì)胞CCD-27sk和Hs888.Lu的高度結(jié)合，但是在不同細(xì)胞系之間結(jié)合程度有所不同。因此10A304.7以不同水平與細(xì)胞系選擇性地結(jié)合。表2和3的結(jié)果意味著10A304.7與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合對抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性是必需的但其還不足以誘發(fā)該事件。
本說明書中提及的所有專利和公開物對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員具有說明性。所有的專利和公開物在此以相同程度被引為參考，就如同各獨(dú)立的公開物被專門且個(gè)別地說明在此引作參考一樣。
應(yīng)當(dāng)明白的是盡管說明了本發(fā)明的特定形式，發(fā)明不限于在此描述和顯示的特定形式或各部分的排列。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，顯然可以在不背離本發(fā)明的范圍的情況下進(jìn)行各種修改，并且不應(yīng)當(dāng)認(rèn)為本發(fā)明限于本說明書中顯示和描述的內(nèi)容。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易地認(rèn)識到當(dāng)前發(fā)明非常適于實(shí)現(xiàn)目標(biāo)并獲得所述的及發(fā)明本身所固有的結(jié)果和益處。在此描述的任何寡核苷酸、肽、多肽、生物學(xué)相關(guān)化合物、方法、步驟和技術(shù)是當(dāng)前優(yōu)選具體實(shí)施方案的代表，可以被效仿而不應(yīng)對范圍發(fā)生限制。遵照本發(fā)明的精神和所附權(quán)利要求書的范圍定義，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對發(fā)明進(jìn)行修改和其它使用。雖然本發(fā)明結(jié)合特定的優(yōu)選具體實(shí)施例進(jìn)行了說明，應(yīng)當(dāng)明白權(quán)利要求的發(fā)明不應(yīng)不恰當(dāng)?shù)厥艿竭@些特定具體實(shí)施方案的限制。事實(shí)上，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的對實(shí)現(xiàn)此發(fā)明的上述模式的各種修改都應(yīng)該包含在隨后的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種保藏于ATCC的保藏號為PTA-5065的克隆所編碼的分離出的單克隆抗體。
2.如權(quán)利要求1中的抗體，所述抗體是人源化抗體。
3.如權(quán)利要求1中的抗體，所述抗體是嵌合抗體。
4.一種保藏于ATCC保藏號為PTA-5065的分離出的克隆。
5.一種確定選自人腫瘤的組織樣品中存在癌細(xì)胞的結(jié)合實(shí)驗(yàn)，包括提供所述人腫瘤的組織樣品；提供保藏于ATCC保藏號為PTA-5065的克隆編碼的分離出的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段；將所述分離出的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段與所述組織樣品接觸；以及確定所述分離出的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段與所述組織樣品的結(jié)合；由此說明在所述組織樣品中所述癌細(xì)胞的存在。
6.如權(quán)利要求5中的結(jié)合實(shí)驗(yàn)，其中人腫瘤組織樣品獲取自源于組織的腫瘤，所述組織選自結(jié)腸、卵巢、肺和乳腺組織。
7.一種在選自人腫瘤的組織樣品中分離或篩選癌細(xì)胞的方法，包括提供所述人腫瘤的組織樣品；提供保藏于ATCC保藏號為PTA-5065的克隆編碼的分離出的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段；將所述分離出的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段與所述組織樣品接觸；以及確定所述分離出的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段與所述組織樣品的結(jié)合；由此所述癌細(xì)胞通過所述結(jié)合得到分離且其在所述組織樣品中的存在得以確定。
8.如權(quán)利要求7中的方法，其中人腫瘤組織樣品獲取自源于組織的腫瘤，所述組織選自結(jié)腸、卵巢、肺和乳腺組織。
9.如權(quán)利要求1中的分離出的單克隆抗體的抗原結(jié)合片段。
10.如權(quán)利要求2中的人源化抗體的抗原結(jié)合片段。
11.如權(quán)利要求3中的嵌合抗體的抗原結(jié)合片段。
12.如權(quán)利要求1、2、3、9、10或11任一項(xiàng)中的分離出的抗體或抗原結(jié)合片段與選自細(xì)胞毒成份、酶、發(fā)射性化合物和造血細(xì)胞的物質(zhì)偶聯(lián)。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用一種全新篩選方式來制備病人癌癥疾病改善抗體的方法。該方法使用癌癥細(xì)胞毒性作為指標(biāo)分離抗癌抗體，使得制備用于治療和診斷目的的抗癌抗體成為可能?？贵w可用于幫助進(jìn)行癌癥的定級和診斷，還可用于治療原發(fā)腫瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移?？拱┛贵w可以與毒素、酶、放射性化合物和造血細(xì)胞偶聯(lián)。
文檔編號A61P35/00GK1802387SQ200480015677
公開日2006年7月12日 申請日期2004年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月14日
發(fā)明者戴維·S·F·揚(yáng), 蘇珊·E·哈恩 申請人:阿里烏斯研究公司