專利名稱：用于治療或預防白斑綜合癥病毒的組合物和方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于治療或預防白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus) 的組合物和方法。
背景技術：
由于沒有遭受任何嚴重的疾病，世界蝦工業(yè)得以發(fā)展直到20世紀90年代 初期。在20世紀80年代后期和90年代初期，弧菌病(Vibriosis)是威脅到蝦的 養(yǎng)殖產率的主要疾病。然而，在90年代提出了新的致命的病毒，例如黃頭病 毒、白斑綜合癥病毒、Taura綜合癥病毒等，它們對蝦養(yǎng)殖產率產生非常壞的 影響。
特別是，從包括韓國和日本在內的亞洲各國到中美洲和南美洲的廣為傳 播的蝦的白斑綜合癥病毒，其經濟危害性極其嚴重。白斑綜合癥病毒是一種 宿主為各種甲殼類的雙鏈DNA病毒，其屬于附^ ovfms種屬MwaWnWae族 (van Hulten M.C,W等，J. Gen. Virol., 81, pp307-316, 2000)。該病毒體相當大 (80-120 nm x 250-380 nm)和具有3個表皮，以及其形狀為桿狀或橢圓形。在例 如蟲下、龍蟲下、螃蟹等的節(jié)肢動物感染白斑綜合癥病毒之后，在蝦的外殼(例 如腮、間皮、甲殼、附肢、表皮等)上出現(xiàn)白斑，并且被感染的節(jié)肢動物表 現(xiàn)為無精打采、行動減緩和食物消耗的突然減少。感染之后的3 5天，被感 染的節(jié)肢動物死去(J.M. Vlak等，XII International Congress of Virology, Paris, 2002)。
根據科學家發(fā)現(xiàn)的病毒和區(qū)域，該白斑綜合癥病毒還被稱作wssv (白斑
綜合癥病毒)、WSV (白斑病毒)、WSBV (白斑桿狀病毒)、CBV (中國桿狀病 毒)、HHNBV (皮下的和造血的壞死性桿狀病毒)、PV-PJ (日本對蟲下的桿狀病 毒)、PRDV (對4下桿狀病毒)、PAV(對奸急性病毒敗血癥)、SEMBV(系統(tǒng)的外 胚層和中胚層的桿狀病毒)等等。但是，這些病毒都被鑒定為同樣的病毒。 有很多對降低白斑綜合癥病毒的危害的研究和進展，最新的研究和進展聚焦于節(jié)肢動物的免疫-刺激。通常使用的是脂多糖、葡聚糖、巖藻依聚糖等 等，但是它們的效果不足以充分降低這種病毒的危害。此外，報道了殼聚 糖、皂角苷、乳鐵傳遞蛋白、右旋糖苷、菊粉等具有一定程度的藥效
(Newman S.Ci, Fifth Ecuadorian Aquaculture Conference, Oct pp28-30， 1999)。
從很久以前就開始試驗使用植物提取物作為抗病毒藥物，和在最近系統(tǒng) 地研究了一些植物提取物的藥效。報道了一些植物提取物具有對蝦的白斑綜 合癥病毒的抗病毒效果。例如，研究了鱷嘴花(C/^ac^^w "Mto氾) (Direkbusarakom S.,等，F(xiàn)ish Pathology, 33(4)， pp410-404, 1998)和某些泰國的常 規(guī)植物(Direkbusarakom S.,等，F(xiàn)ish Pathology, 31(4)， pp209-213， 1996)和葉下珠 /77y〃aw^zus禾中屬植物(Direkbusarakom S.，等,Diseases in Asian Aquaculture II. Manila, pp81-88, 1995)。在南韓，還報道了歐亞甘草根、川芎(C"Ww附 o#">w/e)、花生、蕎麥、刺松藻(Co&"w ^Y^7e)和紫菜類對白斑綜合癥 病毒具有一定程度的抑制效果。但是，需要一種對白斑綜合癥病毒具有更好 的治療或預防效果的組合物。
公開
技術問題
因此，本發(fā)明的目的在于提供在治療或預防白斑綜合癥病毒中有用的組 合物和方法。
技術方案
為了達到該目的，本發(fā)明提供一種用于治療或預防諸如蝦、龍蝦、螃蟹 等的節(jié)肢動物的白斑綜合癥病毒的組合物，其包括作為有效成分的牡蒿 (^ tem^'fl ^pom'ca)提取物。更優(yōu)選地，本發(fā)明提供用于治療或預防節(jié)肢 動物的白斑綜合癥病毒的組合物，其包括作為有效成分的牡蒿提取物和三白 草(iS(Wwms Cem/s)提取物。
本發(fā)明還提供一種用于治療或預防諸如蝦、龍蝦、螃蟹等的節(jié)肢動物的 白斑綜合癥病毒的方法，其使用牡蒿提取物，和更優(yōu)選地，使用牡蒿提取物 和三白草提取物二者。
更優(yōu)選地，本發(fā)明提供組合物和方法，其中的牡蒿提取物和三白草提取
5物的混合重量比為7:3至lj3:7。
優(yōu)選地，本發(fā)明提供組合物和方法，其中牡蒿提取物和三白草提取物被 一聚合物包覆，和更優(yōu)選地提供組合物和方法，其中牡蒿提取物和三白草提 取物先被制成顆粒，然后再用一聚合物包覆。
更優(yōu)選地，本發(fā)明提供組合物和方法，其中牡蒿提取物和三白草提取物 被制成顆粒，然后首先用一親水性聚合物包覆，其次再用一非親水性聚合物
更優(yōu)選地，本發(fā)明提供用于治療或預防白斑綜合癥病毒的方法，其中牡 蒿提取物和三白草提取物的供給總量為300—700 g/每噸普通飼料。
在下文中，將更為詳細地描述根據本發(fā)明的用于治療或預防白斑綜合癥 病毒的組合物和方法。
本發(fā)明是基于一個令人驚訝的事實，即在治療或預防諸如蝦、龍蝦、螃 蟹等的節(jié)肢動物的白斑綜合癥病毒中，牡蒿提取物，優(yōu)選地是牡蒿提取物和 三白草提取物的混合物是有用的。出于這個令人驚訝的事實，本發(fā)明提供一 種用于治療或預防白斑綜合癥病毒的組合物，其包括牡蒿提取物，優(yōu)選地包 括牡蒿提取物和三白草提取物二者，作為有效成分。本發(fā)明還提供一種用于 治療或預防白斑綜合癥病毒的方法，其使用牡蒿提取物，優(yōu)選地一起使用牡 蒿提取物和三白草提取物二者。
本發(fā)明還基于這樣一個事實，即在治療或預防白斑綜合癥病毒中，牡蒿 提取物比同為艾屬的其它植物更為有用。
本發(fā)明還基于這樣令人驚訝的事實，即牡蒿提取物和三白草提取物的混 合可協(xié)同增效治療或預防白斑綜合癥病毒。根據本發(fā)明的牡蒿提取物和三白 草提取物的混合物比單獨使用牡蒿提取物或牡蒿提取物顯示出協(xié)同增強的效 應。優(yōu)選地，牡蒿提取物和三白草提取物的混合重量比為7:3到3:7，和優(yōu)選 為6:4至U 4:6。
本發(fā)明的牡蒿提取物和/或三白草提取物可以根據本領域眾所周知的提取 方法來制得。例如，按照如下方法制備植物提取物將大約1-15倍體積的溶 劑(例如水、乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、丙酮、乙酸乙酯或它們的混合物) 加到牡蒿和/或三白草中，然后通過冷水浸漬法、熱提取法、回流-冷卻提取 法等方法制備植物提取物。然后，使用具有適宜孔徑大小(例如，具有10um孔徑的濾紙)的濾紙來過濾該植物提取物，并在真空、減壓蒸餾或通過在適
當溫度(例如，約30-70。C)的噴霧干燥來濃縮該濾液以得到牡蒿提取物或三
白草提取物。
更為優(yōu)選的是在包覆之前將植物提取物造粒。使用本領域中常規(guī)使用的 稀釋劑(例如，麥芽糊精、乳糖、微晶的纖維素、蔗糖、甘露醇和淀粉)或 普通蝦飼料和該提取物混合，然后根據諸如干法造粒法、濕法造粒法、簡單 混合法等等的本領域眾所周知的方法將其制備成顆粒。在與普通飼料的混合 效果、容易處理以及后續(xù)的包覆過程的方面中這種造粒是更為合適的。
此外，這種造粒對于隨后的過程以向已制得的顆粒中添加大約0.1-5%虔 于顆粒的總重量)潤滑劑(例如，二氧化硅和硬脂酸鎂)也是更為合適的。
本發(fā)明還提供了令人驚訝的事實，即用聚合物包覆牡蒿提取物和三白草 提取物可極大地改善蝦的采食率(intake rate)。這種改善被認為是通過包覆 的聚合物阻隔了牡蒿提取物和三白草提取物的氣味而達到的，但是本發(fā)明不 被局限于這種假定。
如上所述，優(yōu)選地，將本發(fā)明的牡蒿提取物和三白草提取物制成易于包 覆過程的顆粒，然后再用一聚合物包覆。當顧及幾個方面時，優(yōu)選的是用親 水性聚合物第一次包覆該提取物，然后再用非親水性聚合物第二次包覆該第 一次包覆過的提取物。當僅使用親水性聚合物來包覆時，由于親水性聚合物 很容易溶解在水里，所以很難阻隔該植物提取物的氣味。當僅使用非親水性 聚合物時，必需使用大量的非親水性聚合物來阻隔該提取物的氣味或味道， 并且這種大量的非親水性聚合物是很難在水中溶解的，其可能會引起功效的 降低。此外，認為第一包覆本身是表現(xiàn)出阻隔不良氣味的效果，而認為使用 了非親水性聚合物的第二包覆是改善了該提取物的穩(wěn)定性以及改善了對不良 氣味的阻隔效果。
本發(fā)明的親水性聚合物是指即使大量被用于包覆時仍能很容易地被溶解 于水中的那些聚合物。這種親水性聚合物包括但不局限于羥甲基纖維素、 羥乙基纖維素、羥乙甲基纖維素、羥丙甲基纖維素、羥丙乙基纖維素、羧甲 基纖維素、羥丙基纖維素、纖維素衍生物、藻酸鈉、褐藻酸、大豆蛋白、小 麥蛋白、角叉膠、黃芪膠、瓊脂、阿拉伯膠、瓜爾膠、黃原膠、橡膠、膠 質、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲酯衍生物、聚乙烯吡咯垸酮、聚環(huán)氧烷、聚
7環(huán)氧烷衍生物、聚垸撐基二醇、聚乙烯-聚丙烯聚合物、聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧 丙垸聚合物、玉米蛋白、二乙基胺基乙酸酯、胺基垸基甲基丙烯酸酯共聚 物、環(huán)糊精、殼多糖、殼聚糖和明膠。更為優(yōu)選的是羥甲基纖維素、羥乙基 纖維素、羥乙甲基纖維素、羥丙甲基纖維素、羥丙乙基纖維素、羧甲基纖維 素、羥丙基纖維素、纖維素衍生物、藻酸鈉、褐藻酸、聚乙烯醇和聚乙烯吡 咯烷酮。
本發(fā)明的非親水性聚合物是指很難被溶解在水中或非常緩慢地被溶解在 水中的聚合物，所以這些聚合物可以防止提取物在短時間內被溶解到水中。 這種非親水性聚合物包括但不局限于甲基纖維素、乙基纖維素、蟲漆、聚 醋酸乙烯酯、聚-L-賴氨酸、鄰苯二甲酸羥丙甲基纖維素、高粘度的纖維素衍 生物、乙酸琥珀酸羥丙甲基纖維素、乙酸鄰苯二甲酸纖維素、玉米蛋白提取 物、玉米蛋白提取物衍生物、大豆蛋白、小麥蛋白、殼多糖、基蒂克酸 (chitic acid)、瓊脂、膠質、橡膠和聚甲基丙烯酸甲酯衍生物。更為優(yōu)選的 是乙基纖維素、甲基纖維素和蟲漆。
優(yōu)選地，第一次包覆使用親水性聚合物的量是基于提取物顆粒的總重量
的1-30 wt%，和更為優(yōu)選地是4-15 wt%。優(yōu)選地，第二次包覆使用非親水性 聚合物的量是基于第一次包覆后的顆粒的總重量的1-10 wt%，和更為優(yōu)選地 是2-8 wt%。
在第一次包覆時，可以使用水制備包覆溶液。在第二次包覆時，可以使 用乙醇、甲醇、異丙醇乙腈、丙酮、乙醚、正己烷、氯仿、1,4-二氧六環(huán)、二 甲亞砜、四氫呋喃、乙酸乙酯、乙酸甲酯或它們的混合物制備包覆溶液。
可以使用本領域眾所周知的常規(guī)裝置來實施包覆，例如流化床制粒機、 噴霧干燥機、C/F制粒機等。本發(fā)明的范圍不被局限于這些裝置。
在用于治療或預防(尤其是蝦的)白斑綜合癥病毒的方法中，牡蒿提取 物和三白草提取物的供給總量優(yōu)選為300 — 700 g和更為優(yōu)選400 — 600 g/每噸 按照一只蝦體重的1%供給(每天)的普通飼料。因為超過700g后其效果不再 改善，所以供給超過700 g是不經濟的。在供給少于300 g時，提取物的藥效可 能不夠治療或預防蟲下的白斑綜合癥病毒。


圖l顯不了牡蒿(爿rte附^/a y'opow/cfl ) 提取物、二白草 ((Sawrams c/n'"em&)提取物、茵陳蒿(v4他脂's/a cap/〃腦S)提取物、青蒿dtem/s/a gme/z'm')提取物和魚腥草(/fowm(yw'a 提取物對白斑綜合癥病毒的 效果評價結果。
圖2顯示了牡蒿提取物和三白草提取物的混合比例對白斑綜合癥病毒的效 果評價結果。
圖3和圖4顯示了每噸普通飼料中包覆的牡蒿提取物和包覆的三白草提取 物的供給量對白斑綜合癥病毒的效果評價結果。
圖5和圖6是顯示了包覆的牡蒿提取物和包覆的三白草提取物的防-白斑綜 合癥病毒作用的藥理學機理的評價結果。
具體實施例方式
在下文中，非常詳細地描述本發(fā)明以幫助本領域的技術人員理解本發(fā) 明。然而，下述實例是被提供為示例性說明而不意圖限制本發(fā)明的范圍。很 顯然的是可以作出各種變化而不偏離本發(fā)明的精神和范圍或是損失其材料的 所有優(yōu)勢。
<實施例1>制備提取物
將5 kg干燥的牡嵩 (v4他m^/a y"Pom'ca ) 、 二白草 (iSawn/ri^ c/zz."e腦X)、茵陳蒿(Jrfew&a 〃a"S)、青蒿(爿他附/w'a gme/z'm')禾口魚 腥草(//owto"/a con/flto)分別用50 L水、乙醇和它們l:l的混合物在室溫下 來浸漬-提取。進行3天該浸漬-提取，然后沒有耽擱地重新進行2天。用10 um 濾紙來過濾提取物，并在真空于6(TC濃縮該濾液直到濾液的重量減少至起始 重量的5%。用約2.5倍濃縮物重量的乳糖和約總重量2%的二氧化硅將濃縮物 制成顆粒。
考慮到濃縮物的收率，乙醇提取是最有效的。因此，在下面的所有實施 例中使用通過乙醇得到的提取物。
<實施例2>每種提取物對白斑綜合癥病毒的效果評價 實施例l中制備的提取物對白斑綜合癥病毒的效果按照下面進行評價蝦使用條紋長臂蝦(/^/"ewow pm/c/^ra)且它們的平均體重為0.3g。 在測試前讓蝦適應于實驗環(huán)境l周。在適應期，給蝦供應普通飼料。
測試樣品分別使用實施例l中的牡蒿提取物、三白草提取物、茵陳蒿提 取物、青蒿提取物和魚腥草提取物。
測試分組使用沒有提取物的普通飼料作為對照組。分別使用牡蒿提取
物、三白草提取物、茵陳蒿提取物、青蒿提取物和魚腥草提取物作為5個測試 組。每組包括30只蝦。
測試樣品的喂料在感染病毒之前連續(xù)7天每天供應測試樣品以評價對白
斑綜合癥病毒的預防和治療效果。另外，在感染病毒之后連續(xù)7天每天供應測 試樣品。每天在早上10點進行喂料。
蝦的養(yǎng)育條件在10L水浴中養(yǎng)育這些蝦。水浴的溫度保持在2(TC。
白斑綜合癥病毒的感染蝦被白斑病綜合癥病毒人工感染且最終死亡。3
只死蟲下在IO ml蒸餾水中被細細地磨碎。將該研磨溶液以3500:1的比例加入到 水浴中以將水浴中的蝦用白斑綜合癥病毒感染。感染之后，統(tǒng)計蝦的死亡 率。
結果被示于圖l。如圖1所示，與對照組相比，牡蒿提取物、三白草提取 物和茵陳蒿提取物提高了蝦的存活率，這意味著在治療或預防白斑綜合癥病 毒中那些提取物是有用的。另外，牡蒿提取物比三白草提取物和茵陳蒿提取 物更為有效。
<實施例3>提取物混合物的混合對白斑綜合癥病毒的效果評價 評價了牡蒿提取物和三白草提取物的混合物對白斑綜合癥病毒的效果，
并且按下述方法研究了適當的混合物的混合比例
蝦使用條紋長臂蝦且它們的平均體重為0.3g。在測試前讓蝦適應于實
驗環(huán)境1周。在適應期，給蟲下供應普通飼料。
測試樣品分別使用實施例l中制備的牡蒿提取物和三白草提取物。 測試分組使用沒有牡蒿提取物和三白草提取物的普通伺料作為對照
組。分別使用混合比例為10:0、 6:4、 5:5、 4:6和0:10的牡蒿提取物和三白草 提取物的混合物的作為5個測試組。每組包括30只蝦。
測試樣品的喂料在感染病毒之前連續(xù)7天每天供應測試樣品以評價對白斑綜合癥病毒的預防和治療效果。另外，在感染病毒之后連續(xù)7天每天供應測
試樣品。每天在早上io點進行喂料。
蝦的養(yǎng)育條件在10L水浴中養(yǎng)育這些蝦。水浴的溫度保持在2o士rc。
白斑綜合癥病毒的感染蝦被白斑病綜合癥病毒人工感染且最終死亡。3
只死蝦在IO ml蒸餾水中被細細地磨碎。將該研磨溶液以3500:1的比例加入到 水浴中以將水浴中的蝦用白斑綜合癥病毒感染。感染之后，統(tǒng)計蝦的死亡 率。
結果被示于圖2。如圖2所示，與對照組相比，牡蒿提取物、三白草提取 物和它們的混合物提高了蝦的存活率。具有幾乎相等的混合比例、尤其是6:4 重量比例的牡蒿提取物和三白草提取物的混合物，顯示出比其它測試樣品更 高的存活率。
但是，當牡蒿提取物和三白草提取物僅通過與普通飼料簡單混合的方式 給蝦服用時，很多測試樣品沒有被蝦吃掉而是剩下了，這被認為是由于提取 物的獨特氣味造成的。因為這個問題，認為難點在于讓蝦能吃到足夠的提取 物，和需要提高蝦的飼料采食率。
<實施例4>提取物的包覆
用例如下面實施例中的聚合物包覆提取物以阻隔提取物的獨特氣味，即 以增加蝦對牡蒿提取物和三白草提取物的采食率。 <實施例4-1>
①第一次包覆
將IOO g羥丙甲基纖維素(HPMC2910)溶于1000 ml蒸餾水中以制備一包覆 溶液。將IOOO g實施例l中制備的牡蒿提取物顆粒和三白草提取物顆粒的混合 物(二者重量比為6:4)在流化床制粒機(GX40, Freund, Japan)上流化，并且通 過噴霧包覆溶液而被包覆。流化床制粒機的制備條件如下
進氣溫度約60"C
進氣流速0.3L/min
出氣流速0.5L/min
轉子轉數220 rpm
噴霧速度10 ml/min②第二次包覆
將49.5 g乙基纖維素溶于385 ml丙酮和110 ml乙醇的混合液中以制備一包 覆溶液。將上述包覆的顆粒在流化床制粒機上流化，并且通過噴霧第二包覆 溶液而被包覆。流化床制粒機的制備條件如下
進氣溫度約5(TC
進氣流速0.3L/min
出氣流速0.5L/min
轉子轉數230 rpm
噴霧速度12ml/min
<實施例4-2>
① 第一次包覆
將3 g藻酸鈉溶于1000 ml蒸餾水中以制備一包覆溶液。將IOOO g實施例l 中制備的牡蒿提取物顆粒和三白草提取物顆粒的混合物(二者重量比為6:4) 和97 g乳糖在流化床制粒機上流化，并且通過噴霧包覆溶液而被包覆。流化 床制粒機的制備條件與實施例4-l中的第一次包覆的條件類似。
② 第二次包覆
將49.5 g羥丙甲基纖維素(HPMCP)溶于247.5 ml丙酮和247.5 ml乙醇的混 合液中以制備一包覆溶液。將上述包覆的顆粒在流化床制粒機上流化，并且 通過噴霧第二包覆溶液而被包覆。流化床制粒機的制備條件與實施例4-l中的 第二次包覆的條件類似。
<實施例4-3>
① 第一次包覆
將IOO g羥丙甲基纖維素(HPMC2910)溶于1000 ml蒸餾水中以制備一包覆 溶液。將1000 g實施例l中制備的牡蒿提取物顆粒和三白草提取物顆粒的混合 物(二者重量比為6:4)在流化床制粒機上流化，并且通過噴霧包覆溶液而被 包覆。流化床制粒機的制備條件與實施例4-l中的第一次包覆的條件類似。
② 第二次包覆
將49.5 g蟲漆溶于495 ml乙醇中以制備一包覆溶液。將上述包覆的顆粒在
12流化床制粒機上流化，并且通過噴霧第二包覆溶液而被包覆。流化床制粒機 的制備條件與實施例4-l中的第二次包覆的條件類^U
<實施例5>包覆的提取物顆粒的采食率評價
用上述實施例4-l到4-3中制備的包覆的提取物顆粒對蝦進行喂料測試。
按照下面的方法評價根據包覆聚合物種類而定的采食率
蝦使用條紋長臂蝦且它們的平均體重為0.3g。在測試前讓蝦適應于實 驗環(huán)境1周。在適應期，給蝦供應普通飼料。
測試分組使用具有實施例l中制備的未包覆的牡蒿提取物顆粒和未包覆
的三白草提取物顆粒的混合物(二者重量比為6:4)的飼料的作為對照組。每 組包括30只蝦。
測試樣品的喂料從第0天到第5天供應測試樣品，其中第O天是一周的上
述適應期結束之后的那天。 一天一次供應2 g飼料，每天在早上10點進行喂 料。
蝦的養(yǎng)育條件在10L水浴中養(yǎng)育這些蝦。水浴的溫度保持在2o土rc。
評價項目從喂料測試樣品的第0天到第5天，每天在同一喂料時間記錄
在前一天供給的飼料的剩余量作為隨著在水浴中的剩余量而定的5個點(從l 到5)。在剩余量的評價完成后，將水浴打掃干凈并給蝦供應新飼料。將水浴 底部分為6個部分(在寬度上分3份和在長度上分2份)，承認以下幾點等級 0 (-)-所有6個部分都沒有剩余飼料；等級l (+) -6個部分中的一個部分有剩 余飼料；等級2 (++)-兩個部分有剩余飼料；等級3 (+++)-三個部分有剩余 詞料；等級4 (++++)-四個部分有剩余飼料；和等級5 (+++++)-五個部分或所 有部分有剩余飼料。結果列于下表l。
表l
第一天第二天第三天第四天第五天
對照++++++++++++++++++
實施例4-1++++++
實施例4-2++++++++++++
實施例4-3+++++++++++如表1所示，使用實施例4-l到4-3具有包覆的樣品的組顯示出比使用未包
覆的提取物的對照組更高的采食率。特別是，實施例4-l顯示出最高的詞料采食率。
<實施例6>根據供應量對白斑綜合癥病毒的治療效果和預防效果的評價
如下所述，根據包覆的提取物的供應量來評價對白斑綜合癥病毒的治療 效果和預防效果。
蟲下使用日本對蟲下Kuruma shrimp (斑 Mams/ e"aews /"P謹'c^)且 該蝦的平均體重為10.5-18.9 g。每組包括17-20只蝦。在測試前讓蝦適應于實 驗環(huán)境2周。在適應期，給蝦供應普通飼料。
測試樣品使用實施例4-l中制備的包覆的提取物顆粒。
測試飼料使用Gold Prawn (Higashimaru, Kagoshima, Japan)作為測試材 料。每噸測試飼料中添加O g、 125 g、 250 g、 500 g或1000 g的測試樣品。測 試飼料的供應量是一只蝦體重的1% (每一天)。
測試飼料的喂料從感染病毒之前的7天到病毒感染后的14天每天供應測 試飼料。每天在晚上6點進行測試飼料的喂料。
蝦的養(yǎng)育條件在60L水浴中養(yǎng)育這些蝦。水浴的溫度保持在2o土rc。
白斑綜合癥病毒的感染蝦被白斑病綜合癥病毒人工感染且最終死亡。3 只死奸在IO ml滅菌海水中被細細地磨碎。將該研磨溶液用滅菌海水稀釋為 80000:1的比例以制備一病毒感染溶液。通過將各組的蝦在該病毒感染溶液中 浸2小時和然后再次將蝦轉移到60 L水浴中來進行病毒的感染。感染之后，統(tǒng) 計10天期奸的死亡率。
評價項目在感染病毒后，評價各組蝦的死亡率和白斑綜合癥病毒的常 規(guī)癥狀。
進行了2次實施例6，結果分別示于圖3和圖4。如圖3和圖4所示，食用測 試樣品的組比對照組表現(xiàn)出更高的存活率。尤其是食用500 g和1000 g測試樣 品的組表現(xiàn)出比對照組更更高的存活率。這些結果表明，在每天每只蝦按照 1%體重的供應量喂食時，每噸普通飼料添加超過500 g包覆的提取物顆?？捎?效地治療或預防蝦的白斑綜合癥病毒。
14<實施例7>提取物對白斑綜合癥病毒的藥理學機理
從實施例6中使用的各個測試組的蝦中收集血細胞以研究血細胞吞噬細胞
的活性。通過用填有KC-199介質[1L中含11 g NaCl、 0.4 g KC1 、 3 g MgS04.7H20、 3 gMgCl2-6H20、 0.9 g CaCl2.2H20、 0.05 gNaH2P042H20、和 0.15 g L-谷氨酸，向其中加入50 g L-半胱氨酸(抗-凝血劑)和用6N NaOH將介 質的pH調至7.6]的注射器直接從蝦的心臟抽出血淋巴來進行血細胞的收集。 通過在K-199介質[與KC-199相比去除了L-半胱氨酸和用NaHC03調節(jié)介質的 pH至7.6]中的離心過濾(2500 rpm， IO分鐘，4。C)洗滌收集的血細胞。洗過的 血細胞Clx105細胞/ml)被移至包括K-199介質和熒光標記的乳膠小珠(lx108 小珠/ml)的細菌培養(yǎng)皿中并充分混合。將顯微鏡的蓋玻片放在血細胞和小珠 的混合物上，并于25。C培養(yǎng)30分鐘和用戊二醛固定。將血細胞附著其上的蓋 玻片倒置翻轉，并置于熒光顯微鏡下400x觀察。在蓋玻片上的300個血細胞中 清點被吞噬的小珠的數量和吞噬細胞的數量。在同樣的條件下，每只蝦重復3 次上述實驗。根據下面的數學等式1和2計算吞噬指數(PI)和吞噬百分比(。/。P)。 同樣的實驗被重復2次，結果被分別示于圖5和圖6。 [數學等式l]
PI^吞噬小珠的細胞數/所觀察的細胞總數)x (被吞噬的小珠數/所觀察的細 胞總數)x 100 [數學等式2]
% =(吞噬小珠的細胞數/所觀察的細胞總數)x 100
如圖5和圖6所示，食用測試樣品的測試組比對照組表現(xiàn)出更高的血細胞 的吞噬活性。特別是，食用500 g和1000 g測試樣品的測試組比對照組表現(xiàn)出 更更高的血細胞的吞噬活性。這些結果表明，本發(fā)明的植物提取物的預防效 果是非常靈驗的，這種預防效果被認為與提高疾病抵抗力相關聯(lián)的，其被認 為是引起了血細胞的吞噬活性。從這些結果，本發(fā)明的植物提取物對蝦的白 斑綜合癥病毒的作用被推測是通過血細胞的激活并直接吞噬病毒導致的。
工業(yè)應用性
如上所示，本發(fā)明提供一種用于治療或預防白斑綜合癥病毒的組合物，包括作為有效成分的牡蒿提取物，或更為優(yōu)選地包括牡蒿提取物和三白草提 取物和三白草提取物。本發(fā)明還提供一種用于治療或預防白斑綜合癥病毒的 方法，該方法使用所述的組合物。
權利要求
1. 一種用于治療或預防白斑綜合癥病毒的組合物，包括作為有效成分的牡蒿提取物。
2. 根據權利要求l所述的組合物，還包括作為有效成分的三白草提取物。
3. 根據權利要求2所述的組合物，其特征在于所述牡蒿提取物和三白草提取物的混合重量比為7:3至(J3:7。
4. 根據權利要求2或3所述的組合物，其特征在于所述牡蒿提取物和三 白草提取物被一聚合物包覆。
5. 根據權利要求4所述的組合物，其特征在于所述牡蒿提取物和三白 草提取物在被聚合物包覆之前先被制成顆粒。
6. 根據權利要求4所述的組合物，其特征在于所述牡蒿提取物和三白 草提取物首先被一親水性聚合物包覆，其次再被一非親水性聚合物包覆。
7. 根據權利要求6所述的組合物，其特征在于所述的親水性聚合物選自下面化合物中的至少一種羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥乙甲基纖維素、羥丙甲基纖維素、羥丙乙基纖維素、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、纖 維素衍生物、藻酸鈉、褐藻酸、大豆蛋白、小麥蛋白、角叉膠、黃芪膠、瓊 脂、阿拉伯膠、瓜爾膠、黃原膠、橡膠、膠質、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲 酯衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、聚環(huán)氧垸、聚環(huán)氧垸衍生物、聚烷撐基二醇、 聚乙烯-聚丙烯聚合物、聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙垸聚合物、玉米蛋白、二乙基 胺基乙酸酯、胺基垸基甲基丙烯酸酯共聚物、環(huán)糊精、殼多糖、殼聚糖和明 膠。
8. 根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述的非親水性聚合物選 自下面化合物中的至少一種甲基纖維素、乙基纖維素、蟲漆、聚醋酸乙烯 酯、聚-L-賴氨酸、鄰苯二甲酸羥丙甲基纖維素、高粘度的纖維素衍生物、乙 酸琥珀酸羥丙甲基纖維素、乙酸鄰苯二甲酸纖維素、玉米蛋白提取物、玉米 蛋白提取物衍生物、大豆蛋白、小麥蛋白、殼多糖、基蒂克酸、瓊脂、膠 質、橡膠和聚甲基丙烯酸甲酯衍生物。
9. 一種用于治療或預防白斑綜合癥病毒的方法，使用牡蒿提取物。
10. 根據權利要求9所述的方法，其特征在于 一起使用牡蒿提取物和三 白草提取物。
11. 根據權利要求10所述的方法，其特征在于所述牡蒿提取物和三白草提取物的混合重量比為7:3至(J3:7。
12. 根據權利要求10或11所述的方法，其特征在于所述牡蒿提取物和 三白草提取物被一聚合物包覆。
13. 根據權利要求12所述的方法，其特征在于所述牡蒿提取物和三白草提取物在被聚合物包覆之前先被制成顆粒。
14. 根據權利要求12所述的方法，其特征在于所述牡蒿提取物和三白草提取物首先被一親水性聚合物包覆，其次再被一非親水性聚合物包覆。
15. 根據權利要求ll所述的方法，其特征在于所述牡蒿提取物和三白 草提取物的供給總量為300—700 g/每噸普通飼料。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種組合物和方法，用于治療或預防節(jié)肢動物的白斑綜合癥病毒。本發(fā)明是基于使用牡蒿提取物，和更為優(yōu)選地是使用牡蒿提取物和三白草提取物的混合物作為有效成分。更優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種用于治療或預防白斑綜合癥病毒的組合物，包括被一聚合物包覆的牡蒿提取物和三白草提取物。本發(fā)明還提供一種用于治療或預防節(jié)肢動物的白斑綜合癥病毒的方法，其使用被一聚合物包覆的牡蒿提取物和三白草提取物。
文檔編號A61K36/282GK101454014SQ200780019581
公開日2009年6月10日 申請日期2007年5月29日 優(yōu)先權日2006年5月30日
發(fā)明者全泓烈, 劉世根, 吳華均, 成耆洪, 桂弘錫, 河東真 申請人:西梯茜生命工學股份有限公司