專利名稱：：促進(jìn)細(xì)胞和/或組織培養(yǎng)物中指定產(chǎn)物生長(zhǎng)和合成的肽組分的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及補(bǔ)充細(xì)胞或組織培養(yǎng)基的領(lǐng)域。更特別地，本發(fā)明涉及一種無血清和/或無蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有分離自油菜籽的肽組分(peptidefraction)，特別是分離自油菜籽餅的肽組分。本發(fā)明還涉及一種制備含有這些肽組分的細(xì)胞培養(yǎng)基的方法及其用途。
背景技術(shù)：
：因?yàn)榛铙w細(xì)胞的存在已為大眾所知，細(xì)胞培養(yǎng)基的類型和技術(shù)在不斷進(jìn)步和多樣化。最初，細(xì)胞培養(yǎng)基使用未作定義的培養(yǎng)介質(zhì)例如血漿、血清或胚胎提取物。直到20世紀(jì)50年代中期，最初被定義的培養(yǎng)介質(zhì)才出現(xiàn)，除了鹽和葡萄糖外，所述的培養(yǎng)基中包含了細(xì)胞自身不能合成的各種氨基酸和維生素。近來已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在所有的氨基酸當(dāng)中，L-谷氨酸起到一個(gè)重要作用，它既作為能量來源也可以作為碳源和氮源，并且主要用于嘌呤和嘧啶的合成。然而，存在的缺陷是谷氨酸不能以穩(wěn)定的游離氨基酸形式存在并且容易分解為銨離子和焦谷氨酸。解決這個(gè)問題的方法(基于應(yīng)用谷類水解反應(yīng))已在名稱為QUESTINTERNATIONAL的發(fā)明專利申請(qǐng)WO96/26266中公開。通常，細(xì)胞和組織，特別是動(dòng)物細(xì)胞，在體外在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基是堿基或基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中補(bǔ)充了5-20％的血清，通常是小牛胎盤血清或FCS。然而，這些血清的使用有其它缺陷，例如i)引入的動(dòng)物蛋白必須隨后除去，ii)可能引入潛在的污染物例如霉菌，細(xì)菌，病毒或朊病毒(prions)，iii)質(zhì)量不穩(wěn)定而且成本高。此外，尤其是為了控制醫(yī)用產(chǎn)品中的牛綿狀腦病(BSE)的威脅，所有國(guó)家的法律和國(guó)際法律都期望在不久的將來禁止使用來源于動(dòng)物的產(chǎn)品。在這些缺陷中，引入污染物的威脅是最大的問題并且促使人們使用無血清的培養(yǎng)基或SFM。然而，當(dāng)前使用的某些SFM仍然含有胨和來源于動(dòng)物的水解物，因此并不能完全令人滿意的解決上述提及的污染風(fēng)險(xiǎn)問題。至于不含動(dòng)物來源的材料的SFM，它們通常來源于富含蛋白質(zhì)的原材料，例如谷類原料，如大米(WO98/15614；WO99/57246)或小麥。其它可用原料的例子，如大豆(WO01/23527；WO00/03000)，或者黃瓜(WO99/47648)。然而，獲得這些培養(yǎng)基的成本通常相對(duì)較高，并且通常來源于含有高含量的蛋白質(zhì)的原料，這些原料也可用于其它應(yīng)用中，例如食品用途。因此實(shí)際上真正需要開發(fā)一種徹底無動(dòng)物來源產(chǎn)品的培養(yǎng)基，并且不貴或者，至少它來源于其價(jià)值是被和/或輕微開發(fā)的原料。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明意欲通過制備一種無血清的、來源于起始蛋白質(zhì)含量低的植物原料的培養(yǎng)基來克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。更特別地，本發(fā)明涉及使用肽提取物制備和/或補(bǔ)充無血清的體外細(xì)胞或組織的培養(yǎng)基，所述提取物通過連續(xù)分離植物原料獲得，特征在于所述的植物原料由油菜籽組成。術(shù)語(yǔ)“無血清培養(yǎng)基”應(yīng)該理解為不含動(dòng)物來源血清例如FCS，F(xiàn)BS(小牛胚胎血清)或其它類似血清的培養(yǎng)基。如今，源自細(xì)胞培養(yǎng)物的大部分產(chǎn)品是單克隆抗體，病毒和重組蛋白。從工業(yè)角度看，目前大規(guī)模培養(yǎng)的細(xì)胞，包括來自組織的細(xì)胞或在毒理學(xué)中作為動(dòng)物模型的替代品在內(nèi)的細(xì)胞，都是融合細(xì)胞，VERO細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞)，BHK細(xì)胞(幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞)，CHO細(xì)胞(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)，NS0細(xì)胞，或被桿狀病毒感染的草地貪夜蛾(Sf9)細(xì)胞。融合細(xì)胞是生產(chǎn)單克隆抗體的細(xì)胞，而VERO和CHO細(xì)胞通常用于制備病毒或其它重組蛋白。當(dāng)然，上述所列舉的細(xì)胞并不限制本發(fā)明，本發(fā)明可以涉及任意類型的細(xì)胞。通過不受限制的例子，要提到下述組織軟骨，肌肉細(xì)胞，皮膚，骨細(xì)胞，腱，胚胎細(xì)胞，人造器官。本發(fā)明的第一個(gè)特征是基于產(chǎn)油植物，特別是油菜籽的使用。實(shí)際上，與谷類或其它當(dāng)前利用的原料不同，這種菜籽尤其富含油脂并且蛋白質(zhì)含量低。因?yàn)檫@些原因，時(shí)到今日，本領(lǐng)域技術(shù)人員都沒有嘗試使用油菜籽制備培養(yǎng)基，因?yàn)槟壳捌毡檎J(rèn)為用作培養(yǎng)基的原料必須優(yōu)先含有大量的蛋白質(zhì)。完全令人驚訝的是，與現(xiàn)有技術(shù)的偏見相反，本發(fā)明證明了可以使用油菜籽制備無血清和/或無蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基。甚至更令人驚訝的是，本發(fā)明也證明了含有源自油菜籽的肽提取物的培養(yǎng)基不僅可以明顯提高放置在培養(yǎng)基中的細(xì)胞或組織的最終濃度，也可以提高一種或多種通過培養(yǎng)基中的細(xì)胞產(chǎn)生的所需目標(biāo)分子的生成率。此外，本發(fā)明還證明了最終細(xì)胞或組織濃度的提高與不僅與營(yíng)養(yǎng)作用相關(guān)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及上述提取物的用途，特征在于所述肽提取物的作用是提高細(xì)胞或組織濃度，和/或提高細(xì)胞的壽命，和/或提高細(xì)胞的一種或多種所需分子的特定生成率，上述作用不僅受基本氨基酸組成限制，而且受肽形式中的所述氨基酸組成的限制。本發(fā)明的積極效果尤其建立在與基本組成的培養(yǎng)基產(chǎn)生的效果的比較上，所述基本組成的培養(yǎng)基即由游離氨基酸組成的，在所有方面與本發(fā)明的肽提取物的組成相同，不同之處在于根據(jù)本發(fā)明的提取物中的氨基酸是肽形式。這一觀點(diǎn)可以更清楚地從下文的實(shí)施例看出。通常，現(xiàn)有技術(shù)表明，目前使用的培養(yǎng)基是為了給細(xì)胞或組織提供營(yíng)養(yǎng)物而制備的，所述營(yíng)養(yǎng)物尤其是氨基酸，其作為細(xì)胞需要的能量來源和碳源、氮源。這些氨基酸通常以游離氨基酸的形式存在于培養(yǎng)基中。某些氨基酸為了在液態(tài)培養(yǎng)基中保持足夠的穩(wěn)定性而以二肽或三肽的形式存在(WO96/26266)。完全令人驚訝地，本發(fā)明顯示本發(fā)明的肽提取物通過連續(xù)分離來源于油菜籽的原料而獲得，其功能在于促進(jìn)培養(yǎng)中細(xì)胞或組織的生長(zhǎng)和保證它們存活。事實(shí)上，如下文中的實(shí)施例可以更清楚的顯示，對(duì)于相同量的每種氨基酸而言，有必要使后者采用肽段的形式這樣才能提高濃度，特別是提高細(xì)胞或組織的壽命，以及提高一種或多種所需分子特定的生成率。已經(jīng)證明，本發(fā)明不僅僅基于游離氨基酸的量，而且還基于肽的特定組成，所述肽優(yōu)選二肽，三肽，四肽或五肽。不希望被任何理論所束縛，但本發(fā)明的目標(biāo)提取物不僅僅對(duì)生長(zhǎng)起到積極作用，而且還可以降低細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及肽提取物在制備和/或補(bǔ)充無蛋白質(zhì)的體外細(xì)胞或組織的培養(yǎng)基中的用途，所述提取物可通過連續(xù)分離植物原料獲得，其特征在于所述植物原料由油菜籽組成。在某種意義上與前述的無血清培養(yǎng)基類似，上述肽提取物的用途的特征在于所述的肽提取物具有提高細(xì)胞或組織濃度，和/或提高細(xì)胞壽命，和/或提高一種或多種所需分子的生成率的功能，所述功能不僅受基礎(chǔ)氨基酸組成的限制，而且受所述氨基酸在肽形式中的組成限制。表達(dá)形式“無蛋白質(zhì)”不應(yīng)被理解為完全無蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基，而應(yīng)被理解為完全無動(dòng)物源蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基。圍繞這一表達(dá)，也可以叫做ADCF(無動(dòng)物來源成分)或者叫做“無動(dòng)物蛋白質(zhì)”。事實(shí)上，蛋白質(zhì)的存在通常對(duì)于細(xì)胞或組織的生長(zhǎng)是必須的。如上面所述，重要的在于不存在動(dòng)物來源的蛋白質(zhì)。這樣的培養(yǎng)基可以消除(甚至比無血清培養(yǎng)基更徹底)動(dòng)物來源的分子、或該分子的一部分帶來的污染的威脅。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明可以直接涉及上述用途，所述用途的特征在于植物原料由油菜籽餅組成。術(shù)語(yǔ)“餅”應(yīng)被理解為當(dāng)產(chǎn)油的種子和水果中的油被提取后獲得的殘余固體(參見PetitLarousseIllustré，1989，975頁(yè))。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于使用的原料成本低。實(shí)際上，在所有產(chǎn)油作物中，餅是油脂工業(yè)的主要副產(chǎn)品，其價(jià)值至今還沒有引起重視。因此本發(fā)明提供一種回收和提高油脂工業(yè)廢棄物利用價(jià)值的方法。本發(fā)明的目標(biāo)肽提取物優(yōu)選通過水解油菜籽餅獲得。已經(jīng)公開了獲得這種提取物的分離提取過程。圖1是優(yōu)選方法的流程圖。當(dāng)然，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說任何修改都是顯而易見的，都是本發(fā)明的一部分。更優(yōu)選地，該方法包括六個(gè)連續(xù)的步驟，它們分別是步驟1蛋白質(zhì)的提取此步驟的目的是生產(chǎn)油菜籽蛋白的濃縮物，以期獲得富含油菜籽蛋白的原料(固體的70-80％是蛋白質(zhì)，而油菜籽餅中蛋白質(zhì)含量為30-40％)。步驟2水解此步驟的目的是水解蛋白質(zhì)，以期獲得含有肽的溶液。此處還應(yīng)說明的是，使用的方法是常規(guī)方法。使用Alcalase_堿性蛋白酶，它是一種來源于微生物的酶制劑，因此不會(huì)引起引入來源于動(dòng)物的生物成分(病原性對(duì)抗動(dòng)物細(xì)胞的病毒，朊病毒等)的危險(xiǎn)。水解時(shí)間5小時(shí)，T°＝60℃，pH＝9，酶濃度/底物濃度比率＝1/10。水解產(chǎn)物中游離氨基酸的濃度4％質(zhì)量。步驟3酸沉淀，pH4此步驟的目的在于去除“大”分子，尤其是水解產(chǎn)物中的大分子蛋白質(zhì)和肽，此操作可減少后續(xù)過濾步驟發(fā)生的結(jié)渣(clogging)。步驟4用截留值(cutoffthreshold)為3kDa的膜超濾此步驟的目的在于通過除去分子量大于3000Da的分子(酚類化合物如單寧和多肽)來收集小肽。使用的方法是常規(guī)的膜方法以增加水解物中含有的小肽。步驟5用截留值為500Da的膜進(jìn)行納米過濾本步驟的目的是降低由步驟4獲得的小肽溶液中的游離氨基酸的量，并且對(duì)此溶液脫鹽以降低混合物的等滲容摩。使用的是常規(guī)脫鹽方法。將鹽濃度降低80％更利于在步驟5中根據(jù)小肽的帶電荷對(duì)其進(jìn)行更好的分離。步驟6用截留值為1kDa的膜進(jìn)行超濾本步驟包括根據(jù)分子大小和帶電荷分離小肽。本步驟的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)在于它根據(jù)肽的大小和電荷使用超濾膜來分離植物水解物中含有的肽。與滲透物相比，相應(yīng)于本發(fā)明的肽提取物的最終的滯留物包括較高濃度的含有酸性氨基酸的肽和較低濃度的含有堿性氨基酸的肽。值得一提的是前述的方法僅僅給出了一種過濾的具體實(shí)施方式，但是這并不是對(duì)本發(fā)明的限制。今后的任何改良或提高都應(yīng)該認(rèn)為是本發(fā)明的一部分。為了更全面地限定本發(fā)明的目標(biāo)肽提取物的特征，已經(jīng)進(jìn)行了幾項(xiàng)研究和檢測(cè)，其詳細(xì)的方法和結(jié)果會(huì)在后面的實(shí)施例中敘述。而且，本發(fā)明的上下文中使用的肽提取物的特征在于，其含有至少80％，優(yōu)選至少90％質(zhì)量的氮原料。表達(dá)方式“氮原料”，在本發(fā)明的描述中被定義為任何含有氨基酸的原料，后者可以是游離態(tài)的或連接形成肽或蛋白質(zhì)的形式。這樣的氮原料濃縮物，可通過前述方法從低蛋白質(zhì)含量的產(chǎn)油原料特別是油菜籽中獲得。這一特征是非常有利的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)用于補(bǔ)充培養(yǎng)基的植物提取物具有較低含量的氮原料。例如，在名為“QUESTINTERNATIONAL”(WO96/26266)的發(fā)明專利申請(qǐng)中所述的來源于谷類的提取物含有的氮原料，其含量對(duì)于以下提取物分別為，大豆提取物54％，小麥提取物75％，大米提取物69％。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)的區(qū)別在于所使用的肽提取物中的氮原料含量高。此外，發(fā)明人證明了所述的氮原料幾乎不含有游離的氨基酸，但主要由小分子肽組成。涉及的方法和結(jié)果在隨后的實(shí)施例中介紹。更特別地，根據(jù)本發(fā)明的用途的特征在于所述的氮原料含有大約50％到大約60％的分子量小于500道爾頓的肽。一般認(rèn)為，小于500道爾頓的肽主要是二肽、三肽、四肽、五肽形式。事實(shí)上，氨基酸的平均摩爾分子量大約為150g/mol，甘氨酸的摩爾分子量最低為75.1g/mol，色氨酸的摩爾分子量最高為204.2g/mol。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述用途的特征在于所述的氮原料含有大約20％到大約30％的分子量為500-1000道爾頓的肽。本發(fā)明的目標(biāo)肽提取物令人感興趣的特征還在于，所述提取物顯示出含有高含量的酸性氨基酸。更優(yōu)選地，本發(fā)明涉及上述用途，的特征在于所述的提取物含有大約20％到40mol％的天冬氨酸和20％到40mol％的谷氨酸和/或它們各自的酰胺。最后，本發(fā)明的特征在于所述的肽提取物含有小于1％質(zhì)量的酚類化合物。更特別地，所述肽提取物具有下面的總氨基酸組成表中顯示的百分比為平均值，測(cè)量該百分比的方法在實(shí)施例中有清楚的描述。同一實(shí)施例中舉例說明了不同的優(yōu)選濃度。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明的用途，其特征在于所述細(xì)胞包含真核細(xì)胞，優(yōu)選動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)選的真核細(xì)胞的不受限制的例子是工業(yè)中應(yīng)用的細(xì)胞，例如CHO，BHK，NS0，PERC6，VERO，HEK293等細(xì)胞。根據(jù)另一方面，本發(fā)明不局限于如上所述的肽提取物用作補(bǔ)充元素的用途，本發(fā)明還涉及將其用作無血清培養(yǎng)基。更優(yōu)選地，本發(fā)明涉及一種通過使用或包含上述肽提取物獲得的無血清細(xì)胞或組織培養(yǎng)基。正如前面所述，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有根據(jù)培養(yǎng)要求的類型選擇的“基礎(chǔ)”培養(yǎng)基，可以向其中添加血清或其他增補(bǔ)劑，如水解物。本發(fā)明的目標(biāo)培養(yǎng)基可以根據(jù)添加的提取物的性質(zhì)區(qū)分，即如前所述來源于產(chǎn)油植物原料的提取物，特別是來源于油菜籽的提取物。此處使用的“堿性培養(yǎng)基”取決于希望制備的培養(yǎng)基的性質(zhì)。通過不受限制的實(shí)施例，使用了下述培養(yǎng)基RPMI(RoswellParkMemorialInstitute)，MEM(MinimumEssentialMedium)，Iscove’s，IMDM(Iscov’sModifiedDulbecco’smedium)，Ham’s，NCTC，TC100，Grace等。實(shí)際上，本發(fā)明的提取物以溶液形式使用，其中相同的肽提取物的濃度可以根據(jù)期望制備的培養(yǎng)基的類型而不同。通過不受限制的例子，在CHO(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)型細(xì)胞的培養(yǎng)中，優(yōu)選的濃度為2-6g/l，優(yōu)選4g/l。從后面的實(shí)施例中可以看出，較低濃度是不夠的，而較高濃度將導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制或者可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在后面的實(shí)施例中，所使用的相關(guān)培養(yǎng)基主要是RPMI1640培養(yǎng)基(SIGMA-ALDRICH)。根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施方式，根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基的特征在于它還含有維生素、無機(jī)鹽、游離氨基酸、有機(jī)酸和/或糖。本發(fā)明還包括本發(fā)明的培養(yǎng)基用于大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞或組織的用途。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還涉及的培養(yǎng)基不僅是無血清的，而且還是無蛋白質(zhì)的，即上面解釋的，是無動(dòng)物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基。本發(fā)明還包括通過使用或包含上述肽提取物而獲得的無蛋白質(zhì)的細(xì)胞或組織培養(yǎng)基。與前面所述的無血清培養(yǎng)基相同，根據(jù)一種實(shí)施方案，本發(fā)明的無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基也含有維生素、無機(jī)鹽、游離氨基酸、有機(jī)酸和/或糖。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基用作大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞或組織的用途。根據(jù)另一實(shí)施方式，本發(fā)明涉及一種體外細(xì)胞或組織培養(yǎng)的方法。這種方法的具體步驟通過如下不受限制的例子可以闡明，i)小規(guī)模(96孔板)靜態(tài)培養(yǎng)；ii)略大規(guī)模(25cm2，75cm2和175cm2培養(yǎng)燒瓶)靜態(tài)培養(yǎng)；然后iii)加大規(guī)模(錐形瓶，搖瓶和可控制的細(xì)胞培養(yǎng)儀)動(dòng)態(tài)培養(yǎng)。更優(yōu)選地，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的常規(guī)接種技術(shù)。更特別地，本發(fā)明涉及一種在無血清培養(yǎng)基中體外細(xì)胞或組織培養(yǎng)的方法，其特征在于包括將所述細(xì)胞或組織接種到含有肽提取物的培養(yǎng)基中的步驟，所述肽提取物通過連續(xù)分離植物原料獲得，所述植物原料包括油菜籽。一個(gè)具體實(shí)施方案就是進(jìn)行上述分離步驟，獲得具有所述性質(zhì)的提取物。更特別地，根據(jù)本發(fā)明的方法，其特征在于所述原料包含油菜籽餅。甚至更特別地，本發(fā)明的方法的特征在于所述提取物包含至少80％，優(yōu)選至少90％質(zhì)量的氮原料。更特別地，本發(fā)明的方法的特征在于所述氮原料含有大約50％到大約60％的分子量小于500道爾頓的肽。甚至更特別地，本發(fā)明的方法的特征在于所述氮原料含有大約20％到大約30％的分子量為500-1000道爾頓的肽。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法的特征在于所述提取物包含大約20到40mol％的天冬氨酸和20到40mol％谷氨酸和/或20到40mol％它們各自的酰胺。最后，甚至更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法的特征在于所述提取物具有下述總氨基酸組成與針對(duì)上述培養(yǎng)基相似的方式，本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種體外細(xì)胞或組織培養(yǎng)的方法，所述方法的特征在于在無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中進(jìn)行。更特別地，所述在無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中進(jìn)行的體外細(xì)胞或組織的培養(yǎng)方法的特征在于其包括將所述細(xì)胞或組織接種到含有肽提取物的培養(yǎng)基中，所述肽提取物是通過連續(xù)分離植物原料獲得的，所述植物原料包括油菜籽。與在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的方法相似，本發(fā)明涉及的在無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的方法的特征在于，所述原料包括油菜籽餅。更特別地，本發(fā)明的方法的特征在于所述提取物含有至少80％，優(yōu)選至少90％質(zhì)量的氮原料。甚至于更特別地，本發(fā)明的方法的特征在于所述氮原料含有大約50％到大約60％的分子量小于500道爾頓的肽。特別地，本發(fā)明的方法的特征在于所述氮原料含有大約20％到大約30％的分子量為500到1000道爾頓的肽。甚至于更特別地，本發(fā)明的方法的特征在于所述提取物含有大約20到40mol％的天冬氨酸和20到40mol％的谷氨酸和/或20到40mol％的它們各自的酰胺。更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法，其特征在于所述提取物含有下列的總氨基酸組成最后，根據(jù)本發(fā)明的最后一個(gè)方面，在將血清培養(yǎng)基調(diào)整為根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基時(shí)，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)很好的顯示出來。實(shí)際上，由于本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的不同原因，例如(i)用基因修飾的方法(轉(zhuǎn)染)獲得新的細(xì)胞系，(ii)在含有血清的培養(yǎng)基中先冷凍后解凍提高細(xì)胞的生命力；(iii)更高的生長(zhǎng)和(iv)細(xì)胞對(duì)剪切力的高耐受性，所以采用先在含有血清的培養(yǎng)基中開始培養(yǎng)，然后快或慢的，換成在無血清和/或無蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)是具有優(yōu)勢(shì)的。眾所周知，這種轉(zhuǎn)換是很難進(jìn)行的，因?yàn)榧?xì)胞很難抵抗住這種轉(zhuǎn)換過程中帶來的壓力，在多數(shù)情況下，對(duì)于它們來說這是致命的。為了避免這種壓力，細(xì)胞先被轉(zhuǎn)移到含有降低了濃度的血清的培養(yǎng)基中，這使得細(xì)胞更容易適應(yīng)新的無血清培養(yǎng)基。這一階段就是適應(yīng)期，是長(zhǎng)而單調(diào)的。完全令人驚訝地，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)證明這種壓力能夠通過如下方法避免，即將這種培養(yǎng)基換成含有本發(fā)明的目標(biāo)肽組分的無血清培養(yǎng)基，甚至于直接轉(zhuǎn)換。本發(fā)明的這一性質(zhì)會(huì)在隨后的實(shí)施例和附圖中被清晰地展示。因此，本發(fā)明涉及一種將在血清培養(yǎng)基中進(jìn)行的體外培養(yǎng)直接轉(zhuǎn)變?yōu)樵跓o血清培養(yǎng)基中進(jìn)行的體外培養(yǎng)的方法，特征在于其包括從血清培養(yǎng)基中收集細(xì)胞和/或組織，和將它們直接接種到如本發(fā)明所述的無血清培養(yǎng)基中的過程。根據(jù)另一個(gè)有利方面，本發(fā)明涉及一種將在血清培養(yǎng)基中進(jìn)行的體外培養(yǎng)調(diào)整為在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的方法，其特征在于其包括從血清培養(yǎng)基中收集細(xì)胞和/或組織，然后逐步將它們分別接種到具有遞減的血清濃度的培養(yǎng)基中。本發(fā)明包括一種如前所述的調(diào)整方法，其特征在于所述的調(diào)整方法包括如下四個(gè)步驟步驟175％血清培養(yǎng)基/25％無血清培養(yǎng)基+肽提取物，步驟250％血清培養(yǎng)基/50％無血清培養(yǎng)基+肽提取物，步驟325％血清培養(yǎng)基/75％無血清培養(yǎng)基+肽提取物，步驟4100％無血清培養(yǎng)基+肽提取物。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及一種直接將在血清培養(yǎng)基中進(jìn)行的體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)換為在無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的方法，其特征在于其包括從血清培養(yǎng)基中收集細(xì)胞和/或組織，然后將它們或它直接接種到本發(fā)明所述的無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中。根據(jù)另一個(gè)具體實(shí)施方案，本發(fā)明包括一種將在血清培養(yǎng)基中進(jìn)行的體外培養(yǎng)調(diào)整為在無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的方法，其特征在于它包括從血清培養(yǎng)基中收集細(xì)胞和/或組織，然后將它們逐步分別接種到具有遞減濃度的血清培養(yǎng)基中。更優(yōu)選地，本發(fā)明的調(diào)整方法的特征在于所述方法包括下列四個(gè)步驟步驟175％血清培養(yǎng)基/25％無血清培養(yǎng)基+肽提取物，步驟250％血清培養(yǎng)基/50％無血清培養(yǎng)基+肽提取物，步驟325％血清培養(yǎng)基/75％無血清培養(yǎng)基+肽提取物，步驟4100％無血清培養(yǎng)基+肽提取物。最后，根據(jù)最后一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種將在血清培養(yǎng)基中進(jìn)行的體外培養(yǎng)調(diào)整為在無蛋白培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的方法，其特征在于所述方法包括下列步驟步驟1進(jìn)行本發(fā)明的方法；步驟2從無血清培養(yǎng)基中收集細(xì)胞和/或組織；步驟3將所述細(xì)胞和/或組織直接接種到無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中；本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)會(huì)在實(shí)施例和后面的附圖中展示，其中圖1顯示了制備本發(fā)明的肽提取物的方法的一個(gè)具體實(shí)施方案的流程圖；圖2顯示了除菌過濾對(duì)本發(fā)明的提取物的效果；圖3的柱狀圖顯示了本發(fā)明的提取物的濃度對(duì)最大細(xì)胞密度的效果；圖4顯示了將來自血清培養(yǎng)基的VERO細(xì)胞調(diào)整為含有本發(fā)明提取物的無血清培養(yǎng)基和無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基；圖5顯示了將來自血清培養(yǎng)基的雜種細(xì)胞調(diào)整為含有本發(fā)明提取物的無血清培養(yǎng)基；圖6展示了將來自血清培養(yǎng)基的CHOK1dhfr細(xì)胞調(diào)整到含有本發(fā)明提取物的無血清培養(yǎng)基和無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基；圖7A和7B顯示了將來自無血清培養(yǎng)基的CHOC5細(xì)胞調(diào)整到含有本發(fā)明提取物的無血清培養(yǎng)基和無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基；圖8顯示了在延長(zhǎng)CHOC5細(xì)胞培養(yǎng)的情況下活細(xì)胞濃度的變化；圖9，10和11顯示了本發(fā)明的提取物對(duì)培養(yǎng)的CHOC5細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素的特定生成率的影響；和圖12顯示了本發(fā)明的提取物的功能不僅僅與基本氨基酸組成相關(guān)，而且與所述氨基酸在肽形式中的組成相關(guān)。實(shí)施例實(shí)施例1用于制備本發(fā)明的肽提取物的方法的方案圖1描述了下面所述的方案。更特別地，本實(shí)施例根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案重申了所有的步驟，描述了該方案的細(xì)節(jié)?？梢岳斫獾氖牵瑢?duì)于所有本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，可以對(duì)該方法進(jìn)行各種變化是顯而易見的。步驟1提取油菜籽蛋白的方案進(jìn)行該步驟的方案如下面描述的方式進(jìn)行。30kg脫油的油菜籽餅+300L0.2M的氫氧化鈉|渦輪式混合器(30min，室溫)↓餅/堿提取物的混合物|臥式螺旋沉降離心機(jī)(3500g)↓收集提取物并且用鹽酸(35％v/v)調(diào)整到pH4|澄清模式的板式分離器(3000g)↓收集沉淀物|用水對(duì)沉淀物的最后洗滌↓油菜籽餅蛋白濃縮物使用的植物蛋白是脫油的工業(yè)粗粉，其是油脂工業(yè)(Novance，Compiègne，F(xiàn)rance)的廢棄物，其中含有35％重量的氮原料。從該底物開始，通過用氫氧化鈉提取和在蛋白質(zhì)的pH等電點(diǎn)(pH4)酸沉淀的方法制備蛋白質(zhì)濃縮物(75％的氮原料)。用于從油菜籽餅中制備濃縮物的方法的蛋白質(zhì)總產(chǎn)率約為28％。所制備的濃縮物的組成如下(見表1)。表1制備的濃縮物的成分步驟2水解油菜籽餅蛋白濃縮物的方案用來源于微生物的酶制劑Alcalase2.4L_(堿性蛋白酶)，酶濃度/底物濃度比率＝1/10。濃縮物通過堿性蛋白酶2.4L_(NovoNordisk，Bagsvaerd，Denmark)的作用，并調(diào)節(jié)pH(加入氫氧化鈉維持在pH9)在恒溫?cái)嚢杵?60℃)被酶水解。水解5小時(shí)后，水解度達(dá)到28％(恒pH(pH-stat)技術(shù))，通過將酶失活(90℃持續(xù)10min)終止反應(yīng)。步驟3酸沉淀，pH4然后將在步驟2結(jié)束時(shí)獲得的水解物的pH值降低到4，使得大分子沉淀然后濃縮上清液中的肽。這個(gè)新步驟可以去除在下面的過濾步驟中會(huì)發(fā)生結(jié)渣的大分子，并且濃縮相對(duì)較小的肽。步驟4用截留值(cutoffthreshold)為3kDa的膜超濾此步驟的目的在于通過除去分子量大于3000Da的分子(酚類化合物+多肽)來純化小分子肽。此方法使用商業(yè)再生纖維素膜來濃縮理論摩爾分子量小于3000g/mol的肽。步驟5用截留值為500Da的膜進(jìn)行納米過濾此步驟的目的在于降低由步驟4獲得的含有小肽的溶液中的游離氨基酸的量，并且對(duì)該溶液脫鹽以降低所述混合物的等滲容摩。這一分離步驟使用含有聚胺/聚砜復(fù)合薄膜的膜，可降低80％的鹽濃度，從而在下面的步驟6中可以實(shí)現(xiàn)根據(jù)肽的帶電荷對(duì)其進(jìn)行更好的分離。步驟6用截留值為1kDa的膜超濾目的在于根據(jù)小肽的分子量(size)和帶電荷對(duì)其進(jìn)行分離。使用常規(guī)再生纖維素膜達(dá)到分離目的，根據(jù)分子量和帶電荷數(shù)，作為使用所述膜的條件和經(jīng)步驟5后回收的肽的函數(shù)，經(jīng)步驟5后收集的肽的摩爾分子量理論上可以保持在500到3000g/mol之間。經(jīng)此步驟后可以得到兩個(gè)組分一種是主要含有摩爾分子量理論上小于1000g/mol的肽的滲透物(permeate)；一種是滯留物，與滲透物相比，其首先具有較高含量的含有酸性氨基酸的肽，和其次含有較低含量的含有堿性氨基酸的肽。本發(fā)明的目標(biāo)肽提取物含有通過上述方法中獲得的滯留物。顯然，可以對(duì)該方法進(jìn)行改良。通過不受限制的實(shí)施例，可能預(yù)想在步驟5和6中將pH值調(diào)整到4而不是9，或者可選擇地去除步驟5。實(shí)施例2用于鑒定本發(fā)明的目標(biāo)提取物的方案2.1用凱氏定氮法分析氮·試劑礦化催化劑(17％Na2SO4；1.5％CuSO4·5H2O；1.5％鹽)Prolabo，22550-293-1NH2SO4Labosi，A4715891-35％H2O2Labosi，A4823251-40％NaOHMerck，191537-H3BO3Labosi，A4703851·原料-Vapodest4管滴定全自動(dòng)凱氏定氮儀(Vapodest4titramaticautomaticKjeldahlapparatus)GerhardtGmbH&Co.KG，Bonn，Germany。-645多劑量(Multi-dosimat)自動(dòng)滴定儀Metrohm，Herisau，Switzerland。-Kjeldatherm_KT12S礦化磚GerhardtGmbH&Co.KG，Bonn，Germany。·檢測(cè)方案用凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。測(cè)定方法的原理是將有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為硫酸銨(NH4)2SO4形式的無機(jī)氮。檢測(cè)用Vapodest4S自動(dòng)進(jìn)行。對(duì)于每一個(gè)樣品，要分析兩次后計(jì)算平均值。必須測(cè)定空白樣，為了在減去之后獲得樣品中實(shí)際含有的總氮值。結(jié)果表示為質(zhì)量形式的氮濃度，根據(jù)下列公式氮的量(g/l)＝(V-V0)×N×14/E其中V滴定樣品使用的H2SO4的體積，單位為ml，V0滴定空白樣品時(shí)使用的H2SO4的體積，單位為ml，NH2SO4溶液的滴定量(mol/l)，E樣品的量，單位為mg或ml。通過油菜籽蛋白的轉(zhuǎn)化系數(shù)(6.25)可以獲得蛋白質(zhì)含量，其本身是從這些蛋白質(zhì)含有的氮含量(16％)計(jì)算得出蛋白質(zhì)的量＝6.25×氮量。計(jì)算結(jié)果就是本發(fā)明的肽提取物的蛋白質(zhì)含量，其大約為90％(見后面的表2)。2.2肽的酸水解和氨基酸的檢測(cè)·試劑-三氯乙酸的50％(w/v)水溶液Prolabo，20734.295-9-芴基甲基氯甲酸酯(FMOC-C1)OSI，A4700.792，-2.5mg/ml的乙腈Fluka，23184-鄰苯二甲醛(OPA)Fluka，79760-3-巰基丙酸(3-MPA)Sigma，M-6750-將每種化合物(OPA和3-MPA)10mg加入到1ml的0.4N硼酸鹽緩沖液中，pH10.5Hewlett-Packard，5061-3339-氨基酸混合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液Sigma，AA-S-18-2NNaOH溶液Fluka，72071-6NHClLabosi，A4715801洗脫液溶劑A20mM的乙酸鈉·3H2O(OSI，27652.298)，含有0.024％(v/v)的三乙胺(OSI，28745.296)和0.5％(v/v)的四氫呋喃(OSI，28556.293)?；旌衔镉靡宜?OSI，20104.298)調(diào)整到pH7.2。溶劑B20％(v/v)的100mM乙酸鈉緩沖溶液(OSI，27652.298)，用乙酸調(diào)整到pH7.2，40％(v/v)的乙腈和40％(v/v)的甲醇(Prolabo，20865.322)·器材-0.22μm一次性過濾器Schleicher&Schuell，Dassel，Germany-700型培養(yǎng)箱Memmert，Schwabach，Germany-HypersilC18柱Interchim，H5C18-20R，Monlucon，F(xiàn)rance-HP1090色譜系統(tǒng)HewlettPackard，PaloAlto，UnitedStates?！し椒ㄏ冗M(jìn)行肽組分的酸水解，以獲得游離氨基酸的均勻混合物。將1g或1ml的樣品放到被塞住的檢驗(yàn)試管中。然后加入4ml的氫氯酸(6N)，隨之將檢驗(yàn)試管在密封前放置到氮?dú)庵小Ｔ谂囵B(yǎng)箱中110℃水解反應(yīng)24小時(shí)。冷卻后，通過加入4N氫氧化鈉將水解物調(diào)整到大約pH值6的中性狀態(tài)。將樣品最后通過0.22um的注射式過濾器過濾。酸水解的缺陷在于它破壞了色氨酸，并且將谷氨酰胺和天冬酰胺分別轉(zhuǎn)化為谷氨酸和天冬氨酸?？梢栽趬A水解后通過鐵交換色譜來分析色氨酸(HugliT.E.etal.，1972，Determinationofthetryptophancontentofperoteinsbyionexchangechromatographyofalkalinehydrolysates(，Ibid.，247，2828-2834)。考慮到油菜籽中的色氨酸的量非常少(GodonB.，1996，Lesméthodscourantesdelaboratoirepourlaséparationetl’analysedesprotéinsvégétales[Currentlaboratorymethodsfortheseparationandanalysisofplantproteins].InpublisherLavoisier.Protéinesvégétales[Plantproteins]，65-80)，這種氨基酸不能被分析。至于谷氨酰胺和天冬酰胺，它們的量可以與對(duì)應(yīng)的酸性氨基酸整合得出，其形式為Glx和Asx(Glx＝Gln+Glu，Asx＝Asn+Asp)?！し桨冈卩彵蕉兹?OPA)和9-芴基甲基氯甲酸酯(FMOC)存在下衍生化后，通過反向液相色譜分析氨基酸和丙氨酰-谷氨酰和甘氨酰-谷氨酰二肽。衍生化的原則如下所述在OPA和3-巰基丙酸(3-MPA)存在的條件下加入伯氨基酸，生成異吲哚，異吲哚是高熒光性的并且在UV范圍(338nm)內(nèi)被吸收(Godel等.，1992，AutomatedaminoacidanalysisusingcombinedOPAandFMOC-C1precolumnderivatization，LC-GCINTL.，5，44-49)。根據(jù)相同的原理，在FMOC存在的條件下仲氨基酸被衍生化，生成衍生物，該衍生物是高熒光性的并且在UV范圍內(nèi)(262nm)被吸收。檢測(cè)閾值為100pmol。通過使用HewlettPackardHP1090液相色譜系統(tǒng)可以使樣品自動(dòng)衍生化。3ul的樣品先用1.5ul的2NNaOH全部調(diào)整到中性，從而實(shí)現(xiàn)完全的衍生化。然后將全部衍生物與6.0ul的0.4N硼酸鹽緩沖液、2.5ul的OPA+3-MPA溶液和2.5ul的FMOC溶液混合?；旌铣掷m(xù)15min以實(shí)現(xiàn)衍生化作用；最后，將全部衍生物注入到HypersilC18層析柱上。洗脫溶劑是先100％A溶液洗脫17min，然后用40％的A溶液和60％的B溶液洗脫1min，最后，用100％的B溶液洗脫7min。氨基酸根據(jù)它們的極性被分離；最大極性的在分析開始時(shí)就被從柱上洗脫下來，而極性最小的在分析結(jié)束時(shí)被從柱上洗脫下來。當(dāng)它們被從柱上洗脫下來后，伯氨基酸和二肽通過用UV分析儀在338nm處檢測(cè)，仲氨基酸通過用UV分析儀在262nm處測(cè)定?？偡治鰰r(shí)間為25min。根據(jù)同樣的方法測(cè)定游離氨基酸的量，但是省略了酸水解的步驟。在分析樣品前，含有17種氨基酸的三種溶液其濃度分別為0.25，0.5和2.5mM被衍生化并且沒經(jīng)預(yù)先用2NNaOH調(diào)整到中性就注入到柱上。所得結(jié)果為每種氨基酸建立標(biāo)準(zhǔn)范圍圖，其可用于在對(duì)峰積分后測(cè)定樣品中含有的每種氨基酸的濃度(HewlettPackard系統(tǒng))。2.3固體分析通過在干燥箱中將樣品(1-5g)溫度升高到105℃，直到樣品總量不再變化，從而測(cè)定含水量。2.4用分子排阻色譜法測(cè)定肽的大小·器材-Superdex肽HR10/30柱(7000-200Da)AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden-0.22umMinisartRC25過濾器Sartorius，Goettingen，Germany-真空過濾設(shè)備，燒結(jié)的玻璃漏斗SM16309Sartorius，Goettingen，Germany-BioCAD_700E色譜系統(tǒng)AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，UnitedStates-203B型組分收集器Gilson，Middleton，UnitedStates.·方法操作條件如下-洗脫液ACN/H2O/TFA(40/60/0.1-v/v/v)，通過0.45um過濾-用氦氣脫氣的溶劑5ml/min-洗脫液的流速0.6ml/min-柱溫室溫(25℃)-測(cè)定紫外214nm-注射體積50ul-分析時(shí)間45min洗脫柱用已知分子量的肽預(yù)先調(diào)準(zhǔn)。作為持續(xù)時(shí)間的函數(shù)繪制摩爾分子量的對(duì)數(shù)圖可以獲得兩條直線。確定分子的摩爾分子量(MM)和它們?cè)谥系某掷m(xù)時(shí)間之間的聯(lián)系可以用來根據(jù)不同組分中含有的肽的大小定義分布。2.5酚類化合物的分析組分中酚類化合物的量可以作為芥子酸當(dāng)量物進(jìn)行估計(jì)。芥子酸(Sigma，D7927)，摩爾分子量為224g/mol，可以用作參考物，因?yàn)樗怯筒俗扬炛泻孔疃嗟姆铀?在70-90％之間，根據(jù)NaczkM.Etal.，1992，Recoveryofrapeseedtanninsbyvarioussolventsystems，F(xiàn)oodChem.，45，51-54。用與在分子排阻高效液相色譜中所使用的同樣的色譜條件進(jìn)行校準(zhǔn)和檢測(cè)，除了設(shè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)不同，在該情況下為310nm，這對(duì)應(yīng)于該酸的最大吸收波長(zhǎng)(SakakibaraH.Etal.，2003，SimultaneousdeterminationofallpolyphenolsInvegetables，fruitsandteas，J.Agric.FoodChem.，51，571-581)。每個(gè)組分中的酚類化合物的總量用芥子酸當(dāng)量(mg)/100g固含量表示。游離酚類化合物的含量通過計(jì)算與用于建立校準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)相同的持續(xù)時(shí)間(34-37min)的峰面積的比例而得出。實(shí)施例2的結(jié)果在下表中給出肽提取物中的氮原料和酚類原料的組成(見表2)表2PM肽原料；S固體肽分子量分布(以總肽原料計(jì))(見表3)表3肽提取物中的氨基酸組成(3次分析)(見表4)表4Asx天冬氨酸+天冬酰胺Glx谷氨酸+谷氨酰胺在后面的實(shí)施例4-9中，除非文中特別提及，所有都是在下列培養(yǎng)基中培養(yǎng)CHO-C5細(xì)胞對(duì)照培養(yǎng)基(○)＝RPMI1640(Sigma)+BITS+ET+谷氨酰胺所需(desired)培養(yǎng)基(△)＝對(duì)照培養(yǎng)基+4g/l的根據(jù)本發(fā)明的肽提取物。實(shí)施例3除菌過濾的效果所使用的培養(yǎng)系統(tǒng)包括125mlErlenmeyer燒瓶，Vu＝25ml。CHO-C5細(xì)胞在對(duì)照培養(yǎng)基(○)或所需培養(yǎng)基(△)中培養(yǎng)，培養(yǎng)基用0.22um的過濾器經(jīng)過1次(開放式)或3次(固體式)過濾除菌。所得結(jié)果見圖2。從后者可以看出，當(dāng)進(jìn)行0.22um過濾時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的肽提取物的效果沒有降低。實(shí)施例4本發(fā)明的肽提取物的“冷凍保護(hù)”效果(見表5)使用的培養(yǎng)系統(tǒng)包括靜態(tài)培養(yǎng)燒瓶。表5可以觀察到，在根據(jù)本發(fā)明的提取物存在的條件下，經(jīng)冷凍的細(xì)胞的可被較好回收。此性質(zhì)對(duì)于實(shí)際生產(chǎn)中有著尤其重要的作用，因?yàn)榧?xì)胞通常是經(jīng)冷凍后，然后解凍以被如保藏或運(yùn)輸。實(shí)施例5本發(fā)明的提取物的濃縮物對(duì)最大細(xì)胞密度的影響使用的培養(yǎng)系統(tǒng)包括96-孔板，Vu＝200ul。用細(xì)胞圖像分析儀(Innovatis)跟蹤監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)。所得結(jié)果已在圖3中示出。結(jié)果顯示4g/l的濃縮物能提供最好的效果。濃縮物的濃度太高會(huì)危害生長(zhǎng)。不希望被任何理論束縛，發(fā)明者認(rèn)為抑制劑或毒性化合物的濃縮物能破壞活化劑的積極作用。實(shí)施例6與各種細(xì)胞調(diào)整相關(guān)的檢測(cè)分析6.1從含有10％血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到含有本發(fā)明的肽提取物的不含血清的培養(yǎng)基使用的培養(yǎng)系統(tǒng)包括靜態(tài)培養(yǎng)燒瓶。6.1.1.VERO細(xì)胞(黏附細(xì)胞)使用的堿性培養(yǎng)基是αMEM。所述調(diào)整為突然調(diào)整。所得結(jié)果見圖4。連續(xù)傳代(passage)VERO細(xì)胞，用曲線(△)表示，展示了在本發(fā)明的提取物存在的條件下的調(diào)整過程。曲線(○)演示了缺少該提取物的細(xì)胞的調(diào)整過程。從D0到D17，F(xiàn)CS從10％減少到1％。在D17，F(xiàn)CS是被突然除去的，并且用混合物(根據(jù)本發(fā)明的肽提取物，BITS，ET，Q)代替。在D36中，BITS被除去。從結(jié)果可以看出，在本發(fā)明的肽提取物不存在的條件下，調(diào)整是不可能的(在兩個(gè)傳代內(nèi)細(xì)胞就死亡)。在所述提取物和BITS存在的條件下，細(xì)胞的調(diào)整過程是快速的(從第三個(gè)傳代階段開始恢復(fù)生長(zhǎng))。在相同提取物存在而無動(dòng)物蛋白的情況下(無蛋白培養(yǎng)基)，調(diào)整可能有些困難，但仍然是可能的。在BITS和肽提取物存在和無血清的條件下，VERO細(xì)胞保持黏附。當(dāng)移走BITS時(shí)，這些細(xì)胞也保持黏附，但是程度降低(胰酶消化作用需要的時(shí)間明顯減短)。6.1.2雜交細(xì)胞(在懸浮液中的細(xì)胞)使用的堿性培養(yǎng)基是RPMI。突然調(diào)整在突然調(diào)整的情況下，當(dāng)用混合物(肽提取物+BITS+ET+Q)直接代替FCS時(shí)很快可以觀察到細(xì)胞的死亡。逐步調(diào)整連續(xù)傳代雜交細(xì)胞。結(jié)果見圖5，其中曲線(△)顯示了在本發(fā)明的肽提取物存在的條件下細(xì)胞的調(diào)整過程，曲線(○)顯示了本發(fā)明的提取物不存在的條件下細(xì)胞的調(diào)整過程。從D0到D17，F(xiàn)CS從10％降低到1％。從D17到D35，F(xiàn)CS是逐步去除的，并且用混合物(肽提取物，BITS，ET，Q)取代。在D47，去除了BITS。結(jié)果可以看出，在不存在肽提取物的條件下，調(diào)整是不可能的(在25％/75％混合物中，細(xì)胞在2個(gè)傳代內(nèi)死亡)。在提取物和BITS存在、無血清的條件下，雜交細(xì)胞可以準(zhǔn)確地調(diào)整(在第四個(gè)傳代恢復(fù))。除去動(dòng)物蛋白(BITS)導(dǎo)致細(xì)胞的立即死亡。6.1.3CHOK1dhfr-(CHODUXB11)(在懸浮液中的細(xì)胞)使用的堿性培養(yǎng)基是αMEM+ribo-和脫氧核糖核苷類。突然調(diào)整觀察到與雜交細(xì)胞相同的情況(數(shù)據(jù)未示出)。逐步調(diào)整進(jìn)行數(shù)個(gè)CHOK1dhfr-細(xì)胞的連續(xù)傳代。圖6展示了結(jié)果，其中曲線(△)顯示了在肽提取物存在的條件下的調(diào)整，而曲線(○)展示了肽提取物不存在的條件下細(xì)胞的調(diào)整過程。從D0到D12，F(xiàn)CS從10％降低到2％。從D12到D40，F(xiàn)CS是逐步去除的，并且用混合物(肽提取物，BITS，ET，Q)代替。在D40，去除了BITS。從結(jié)果可以看出，在不存在肽提取物的條件下，調(diào)整是不可能的(在25％/75％混合物中，細(xì)胞在三個(gè)傳代階段內(nèi)死亡)。在提取物和BITS存在、無血清的條件下，CHOK1細(xì)胞可以準(zhǔn)確地調(diào)整(從第1傳代恢復(fù))。去除動(dòng)物蛋白(BITS)導(dǎo)致生長(zhǎng)緩慢和更長(zhǎng)的調(diào)整期(大約6個(gè)傳代階段)，但是仍然可以調(diào)整。6.2從無血清培養(yǎng)基(對(duì)照)轉(zhuǎn)換到含有肽提取物的無血清培養(yǎng)基(所需培養(yǎng)基或不含動(dòng)物來源蛋白質(zhì)的所需培養(yǎng)基)6.2.1CHOC5的連續(xù)傳代培養(yǎng)(在懸浮液中的細(xì)胞)使用的培養(yǎng)系統(tǒng)包括靜態(tài)培養(yǎng)燒瓶。在對(duì)照培養(yǎng)基(○)中、在所需培養(yǎng)基中(△)和在所需的無動(dòng)物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中(×)進(jìn)行數(shù)個(gè)CHOC5細(xì)胞的連續(xù)傳代培養(yǎng)。從對(duì)照培養(yǎng)基得到的結(jié)果見圖7A。從所需培養(yǎng)基得到的結(jié)果見圖7B。從這些圖可以看出，細(xì)胞對(duì)所需培養(yǎng)基的調(diào)整適應(yīng)和肽提取物的積極作用保持了至少7個(gè)傳代階段。同樣地，細(xì)胞在無動(dòng)物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中的繁殖所獲得的細(xì)胞濃度與在對(duì)照培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少7個(gè)傳代階段所獲得的濃度相近。結(jié)論是根據(jù)本發(fā)明的無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基能被用作保存細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)基，而且由于細(xì)胞僅需要每3天轉(zhuǎn)接一次(對(duì)照培養(yǎng)基是2天轉(zhuǎn)接一次)，所以更是如此。6.2.2長(zhǎng)期培養(yǎng)的動(dòng)力學(xué)(在懸浮液中的細(xì)胞)使用的培養(yǎng)系統(tǒng)包括500ml的旋轉(zhuǎn)器(spinners)，Vu＝160ml。沒有預(yù)先調(diào)整，在進(jìn)行CHOC5細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，活體細(xì)胞的濃度變化見圖8。更優(yōu)選地，圖顯示了在對(duì)照培養(yǎng)基(○)，無BITS(-)的對(duì)照培養(yǎng)基，在所需培養(yǎng)基(△)和在不含有BITS的所需培養(yǎng)基(×)中的培養(yǎng)過程。從結(jié)果可以清楚地看到，當(dāng)對(duì)照培養(yǎng)基除去動(dòng)物蛋白之后對(duì)照培養(yǎng)基不再適合細(xì)胞生長(zhǎng)。所需培養(yǎng)基事實(shí)上可以使最大濃度增加一倍。進(jìn)一步的，培養(yǎng)的持續(xù)時(shí)間(在活體細(xì)胞明顯消失前)被增加了3倍。當(dāng)動(dòng)物蛋白被除去后，所需培養(yǎng)基仍能使細(xì)胞生長(zhǎng)。在缺少動(dòng)物蛋白而存在肽提取物的條件下，最大細(xì)胞濃度沒有得到提高，但是培養(yǎng)的時(shí)間相對(duì)于對(duì)照培養(yǎng)基延長(zhǎng)了2倍。實(shí)施例7肽提取物對(duì)干擾素特定生成率的影響使用的培養(yǎng)系統(tǒng)包括2升的細(xì)胞培養(yǎng)器，可使用體積Vu＝1.2升。圖9展示了CHOC5細(xì)胞在對(duì)照培養(yǎng)基(○)和目標(biāo)培養(yǎng)基(△)中的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線。圖10部分展示了由同樣的CHOC5細(xì)胞在對(duì)照培養(yǎng)基中(○)和目標(biāo)培養(yǎng)基(△)中產(chǎn)生IFN(γ干擾素)的動(dòng)力學(xué)曲線。最后，圖11展示了由CHOC5細(xì)胞在對(duì)照培養(yǎng)基(虛線)和所需培養(yǎng)基(實(shí)線)中產(chǎn)生干擾素的特定生成率?！奶崛∥飳?duì)活體細(xì)胞的積極作用經(jīng)實(shí)驗(yàn)室反應(yīng)證實(shí)(*3.3)。→最終IFN的產(chǎn)量(*5.3)有巨大的提高。→這種提高可能是活體細(xì)胞增加的協(xié)同結(jié)果，也是特定生成率增加的協(xié)同結(jié)果(最大值實(shí)際上被增加了一倍)。實(shí)施例8對(duì)不僅與基本氨基酸的組成相關(guān)、而且與所述氨基酸在其肽形式中的組成有關(guān)的功能的說明使用的培養(yǎng)系統(tǒng)包括500ml的旋轉(zhuǎn)器，Vu＝160ml圖12是在旋轉(zhuǎn)器中的在對(duì)照培養(yǎng)基(○)、補(bǔ)充了游離氨基酸的對(duì)照培養(yǎng)基(×)和所需培養(yǎng)基(△)中培養(yǎng)的CHOC5活體細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)曲線。游離氨基酸對(duì)應(yīng)于在肽提取物中存在的總氨基酸(肽和游離)。以與肽提取物存在的比例相同的比例加入氨基酸(以肽的形式)并不能使活體細(xì)胞濃度升高。另一方面，其對(duì)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間的積極作用值得一提。單獨(dú)氨基酸的組成與使用的肽提取物的肽混合物的組成相同，有助于保持細(xì)胞存活(*3與對(duì)照培養(yǎng)基比較)。肽提取物不僅通過使活體細(xì)胞數(shù)量加倍而提高了細(xì)胞數(shù)量，而且還提高了細(xì)胞的活性(與對(duì)照培養(yǎng)基+游離氨基酸相比，存活時(shí)間延長(zhǎng)了50％，使用在該情況下得到的最大細(xì)胞濃度作為參考點(diǎn))。這些結(jié)果沒有顯示出它們僅由與總氨基酸的組成相關(guān)的效果產(chǎn)生的。它們也是由于具有特定組成、在本發(fā)明的肽提取物中的某些肽的存在衍生出來的“生長(zhǎng)因子”效應(yīng)導(dǎo)致的。權(quán)利要求1.肽提取物用于制備和/或補(bǔ)充無血清的體外細(xì)胞或組織培養(yǎng)基的用途，所述提取物由連續(xù)分離植物原料獲得，其特征在于所述植物原料包括油菜籽。2.肽提取物用于制備和/或補(bǔ)充無蛋白質(zhì)的體外細(xì)胞或組織培養(yǎng)基的用途，所述提取物由連續(xù)分離植物原料獲得，其特征在于所述植物原料包括油菜籽。3.根據(jù)權(quán)利要求1和2任一所述的用途，其特征在于所述的肽提取物具有提高細(xì)胞和組織濃度和/或提高細(xì)胞壽命和/或提高一種或多種所需分子的特定生成率的功能，所述功能不僅受基本氨基酸組成限制，而且受所述氨基酸在肽形式中的組成限制。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的用途，其特征在于所述植物原料包括油菜籽餅。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的用途，其特征在于所述肽提取物包括至少80％，優(yōu)選至少90％質(zhì)量的氮原料。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于所述氮原料包括大約50％到大約60％的分子量小于500道爾頓的肽。7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的用途，其特征在于所述氮原料包括大約20％到大約30％的分子量為500-1000道爾頓的肽。8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的用途，其特征在于所述提取物包括20-40mol％的天冬氨酸和20-40mol％的谷氨酸和/或20-40mol％的它們各自的酰胺。9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一所述的用途，其特征在于所述肽提取物包括小于1％質(zhì)量的酚類化合物。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一所述的用途，其特征在于所述肽提取物有下面總氨基酸組成11.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一所述的用途，用于培養(yǎng)細(xì)胞，其特征在于所述細(xì)胞包括真核細(xì)胞，優(yōu)選動(dòng)物細(xì)胞。12.一種使用權(quán)利要求1和3-11任一所述的肽提取物獲得的無血清細(xì)胞或組織培養(yǎng)基。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的培養(yǎng)基，其特征在于它還包括維生素、無機(jī)鹽、游離氨基酸、有機(jī)酸和/或糖。14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的培養(yǎng)基的用途，用于大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞或組織。15.一種無蛋白質(zhì)的細(xì)胞或組織培養(yǎng)基，其是通過使用權(quán)利要求2-11任一項(xiàng)所述的肽提取物獲得的。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的培養(yǎng)基，其特征在于它還包括維生素、無機(jī)鹽、游離氨基酸、有機(jī)酸和/或糖。17.根據(jù)權(quán)利要求15和16任一所述的培養(yǎng)基的用途，用于大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞或組織。18.一種在無血清培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)細(xì)胞或組織的方法，其特征在于它包括將所述細(xì)胞或組織接種到含有肽提取物的培養(yǎng)基中，所述肽提取物由連續(xù)分離植物原料獲得，所述植物原料包括油菜籽。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于所述原料包括油菜籽餅。20.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的方法，其特征在于所述提取物包括至少80％，優(yōu)選90％質(zhì)量的氮原料。21.根據(jù)權(quán)利要求18-20任一所述的方法，其特征在于所述氮原料包括大約50％到大約60％的分子量小于500道爾頓的肽。22.根據(jù)權(quán)利要求18-21任一所述的方法，其特征在于所述氮原料包括大約20％到大約30％的分子量為500-1000道爾頓的肽。23.根據(jù)權(quán)利要求18-22任一所述的方法，其特征在于所述提取物包括20-40mol％的天冬氨酸和20-40mol％谷氨酸和/或20-40mol％的它們各自的酰胺。24.根據(jù)權(quán)利要求18-23任一所述的方法，其特征在于所述提取物具有下面的總氨基酸組成25.一種在無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)細(xì)胞或組織的方法，其特征在于它包括將所述細(xì)胞或組織接種到含有肽提取物的培養(yǎng)基中，所述肽提取物由連續(xù)分離植物原料獲得，所述植物原料包括油菜籽。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于所述原料包括油菜籽餅。27.根據(jù)權(quán)利要求25或26所述的方法，其特征在于所述提取物包括至少80％，優(yōu)選90％質(zhì)量的氮原料。28.根據(jù)權(quán)利要求25-27任一所述的方法，其特征在于所述氮原料包括大約50％到大約60％的分子量小于500道爾頓的肽。29.根據(jù)權(quán)利要求25-28任一所述的方法，其特征在于所述氮原料包括大約20％到大約30％的分子量為500-1000道爾頓的肽。30.根據(jù)權(quán)利要求25-29任一所述的方法，其特征在于所述提取物包括20-40mol％的天冬氨酸和20-40mol％谷氨酸和/或20-40mol％的它們各自的酰胺。31.根據(jù)權(quán)利要求25-30任一所述的方法，其特征在于所述提取物具有下面的總氨基酸組成32.一種直接將在血清培養(yǎng)基中進(jìn)行的體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)換到在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的方法，其特征在于它包括從血清培養(yǎng)基中收集細(xì)胞和/或組織，然后將它們或它直接接種到如權(quán)利要求12或13所述的培養(yǎng)基中。33.一種將在血清培養(yǎng)基中進(jìn)行的體外培養(yǎng)調(diào)整為在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的方法，其特征在于它包括從血清培養(yǎng)基中收集細(xì)胞和/或組織，然后將它們逐步分別接種到如權(quán)利要求12或13所述的培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基具有遞減的血清濃度。34.根據(jù)權(quán)利要求33中所述的調(diào)整方法，其特征在于所述調(diào)整方法包括下列四個(gè)步驟-步驟175％血清培養(yǎng)基/25％無血清培養(yǎng)基+肽提取物，-步驟250％血清培養(yǎng)基/50％無血清培養(yǎng)基+肽提取物，-步驟325％血清培養(yǎng)基/75％無血清培養(yǎng)基+肽提取物，-步驟4100％無血清培養(yǎng)基+肽提取物。35.一種直接將在血清培養(yǎng)基中進(jìn)行的體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)換到在無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的方法，其特征在于它包括從血清培養(yǎng)基中收集細(xì)胞和/或組織，然后將它們直接接種到如權(quán)利要求15或16所述的培養(yǎng)基中。36.一種將在血清培養(yǎng)基中進(jìn)行的體外培養(yǎng)調(diào)整為在無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的方法，其特征在于它包括從血清培養(yǎng)基中收集細(xì)胞和/或組織，然后將它們各自逐步接種到如權(quán)利要求15或16所述的培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基具有遞減的血清濃度。37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的調(diào)整方法，其特征在于所述調(diào)整方法包括下列四個(gè)步驟-步驟175％血清培養(yǎng)基/25％無血清培養(yǎng)基+肽提取物，-步驟250％血清培養(yǎng)基/50％無血清培養(yǎng)基+肽提取物，-步驟325％血清培養(yǎng)基/75％無血清培養(yǎng)基+肽提取物，-步驟4100％無血清培養(yǎng)基+肽提取物。38.一種將在血清培養(yǎng)基中進(jìn)行的體外培養(yǎng)調(diào)整為在無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的方法，其特征在于所述方法包括下列步驟-步驟1使用如權(quán)利要求32，33和34任一所述的方法；-步驟2從無血清培養(yǎng)基中收集細(xì)胞和/或組織，-步驟3將所述細(xì)胞和/或組織直接接種到無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中。全文摘要本發(fā)明涉及制備和/或補(bǔ)充細(xì)胞或組織培養(yǎng)基的方法。實(shí)質(zhì)上，所述發(fā)明涉及一種含有肽組分的無血清和/或無蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基，所述肽組分分離自油菜籽，特別是分離自油菜籽餅。本發(fā)明還涉及制備含有所述肽組分的細(xì)胞培養(yǎng)基的方法和其用途。文檔編號(hào)C12N5/02GK101084304SQ200580042898公開日2007年12月5日申請(qǐng)日期2005年12月14日優(yōu)先權(quán)日2004年12月14日發(fā)明者A·馬克,J－L·格爾根,B·法爾熱－哈丹尼申請(qǐng)人:皮埃爾法布雷醫(yī)藥公司,國(guó)家科學(xué)研究中心