專利名稱：仙靈骨葆制劑中淫羊藿苷及朝藿定c的含量測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種仙靈骨葆制劑中淫羊藿苷及朝藿定C的含量測定方法，屬于藥品質(zhì)量控制技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
淫羊藿所含化學(xué)成分為黃酮類、木脂體類、揮發(fā)油、臘醇、三十一烷、植物甾醇、鞣質(zhì)及油脂類等。淫羊藿具有補(bǔ)腎陽，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕之功效，主要用于陽痿遺精，筋骨痿軟，風(fēng)濕痹痛，麻木拘攣，更年期高血壓等癥。仙靈骨葆制劑由淫羊藿、續(xù)斷、丹參、知母、補(bǔ)骨脂和地黃組合而成，具有滋補(bǔ)肝腎，接骨續(xù)筋，強(qiáng)身健骨的功能，主要用于骨質(zhì)疏松和骨質(zhì)疏松癥，骨折，骨關(guān)節(jié)炎，骨無菌性壞死等。在仙靈骨葆制劑中，淫羊藿為方中君藥，起著關(guān)鍵的補(bǔ)腎助陽、強(qiáng)筋健骨的作用，因此對(duì)制劑中淫羊藿藥材的含量測定可有效控制仙靈骨葆制劑的質(zhì)量，從而確保其臨床療效。
目前，藥典要求的淫羊藿藥材的指標(biāo)性成分僅為淫羊藿苷，經(jīng)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)原淫羊藿苷的含量測定標(biāo)準(zhǔn)建立時(shí)由于受條件限制，在測定過程中淫羊藿苷峰與朝藿定C峰重疊，造成含量偏高。而且，經(jīng)研究得知淫羊藿中的有效部位(總黃酮)中朝藿定C的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他黃酮類成分。所以有增加淫羊藿藥材指標(biāo)性成分的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的必要，即增加朝藿定C的含量測定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種仙靈骨葆制劑中淫羊藿苷及朝藿定C的含量測定方法，本發(fā)明在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用高效分離柱，將流動(dòng)相組分進(jìn)行更換，使淫羊藿苷峰與朝藿定C峰徹底分離，并經(jīng)過試驗(yàn)重新制定了含量限度，增加了其中峰面積較大的朝藿定C的含量限度，從而制定了兩者之間的比例范圍，使仙靈骨葆制劑的質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)更加完善。
本發(fā)明所述的仙靈骨葆制劑是由淫羊藿、續(xù)斷、丹參、知母、補(bǔ)骨脂和地黃按照中國國家藥品監(jiān)督管理局的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[如WS-10269(ZD-0269)-2002、WS-10289(ZD-0289)-2002]制備而成。
本發(fā)明所述仙靈骨葆制劑中淫羊藿苷及朝藿定C的含量測定方法是以淫羊藿苷及朝藿定C對(duì)照品為對(duì)照，以乙腈∶水為流動(dòng)相的高效液相色譜法。
具體的說，仙靈骨葆制劑中淫羊藿苷及朝藿定C的含量測定方法為照中國藥典2005年版一部附錄VID高效液相色譜法測定色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈∶水＝25∶75為流動(dòng)相；檢測波長為270nm；理論板數(shù)按朝藿定C峰計(jì)算應(yīng)不得低于5000；理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計(jì)算應(yīng)不得低于5000；對(duì)照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥器中干燥36小時(shí)的淫羊藿苷及朝藿定C對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml分別含淫羊藿苷及朝藿定C 50μg、25μg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液，即得；供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的本制劑或其內(nèi)容物，研細(xì)，取0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，稱定重量，在功率250W、頻率25kHz下超聲處理30～60分鐘，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，取上清液，濾過，取續(xù)濾液，即得；測定法 分別吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得；本膠囊劑每粒含朝藿定C及淫羊藿苷分別不得少于1.0mg、0.5mg，且朝藿定C與淫羊藿苷峰面積比值不得少于2∶1。
為了確保本發(fā)明含量測定方法科學(xué)、合理、可行，申請(qǐng)人進(jìn)行了以下試驗(yàn)研究1.含量測定指標(biāo)成分的選擇淫羊藿為仙靈骨葆制劑方中的君藥，淫羊藿主要含有黃酮類化合物，包括朝藿定C、淫羊藿苷，還含有淫羊藿苷-I、淫羊藿苷-C、金絲桃苷、寶藿苷-I、鼠李糖基淫羊藿次苷-II、箭藿苷B、寶藿苷-II、大花淫羊藿苷C和大花淫羊藿苷F等成分及木質(zhì)素類成分。具有補(bǔ)腎陽，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕的作用。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明淫羊藿具有提高性機(jī)能，增強(qiáng)免疫力，保護(hù)心臟，改善心肌缺血，增加冠脈流量，抗心率失常，降壓，抗血小板聚集，抗炎，抗衰老等作用。經(jīng)相關(guān)研究可知淫羊藿中的有效部位(總黃酮)中朝藿定C的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他黃酮類成分，因此，有必要增加朝藿定C的含量測定，以進(jìn)一步完善淫羊藿指標(biāo)性成分的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
為了完成本發(fā)明，申請(qǐng)人對(duì)淫羊藿藥材提取工藝進(jìn)行了考察，確定最佳提取工藝，并制備大量朝藿定C，對(duì)總黃酮富集工藝進(jìn)行考察，應(yīng)用大孔樹脂進(jìn)行朝藿定C分離，純化，并制定了專屬性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性及重現(xiàn)性好、結(jié)果可靠的高效液相色譜法。
2.儀器與試劑儀器高效液相色譜儀 Agilent1100、DAD檢測器、Agilent工作站。
色譜柱Agilent ODS 5μm 4.0×250mm對(duì)照品淫羊藿苷、朝藿定C。
試劑乙腈(色譜純，F(xiàn)isher)，娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)，乙醇(分析純，北京化工廠)。
3.方法與結(jié)果3.1色譜分析條件流動(dòng)相乙腈-水(25∶75)；流速1ml/min；檢測波長270nm；理論板數(shù)按朝藿定C計(jì)算不低于5000。
3.2實(shí)驗(yàn)條件的選擇3.2.1測定波長的選擇用甲醇溶解朝藿定C對(duì)照品，制成每1ml含有0.05mg的溶液，在U-2000型可見-紫外分光光度儀上測定吸收光譜，結(jié)果在270nm處有最大吸收，故選擇270nm作為檢測波長。
3.2.2流動(dòng)相的選擇試用乙腈-水(30∶70)，峰型不好，分離效果很不理想。
改為乙腈-水(24∶76)，達(dá)到較好的分離。
3.2.3空白試驗(yàn)空白溶液的制備是按處方中藥味的比例，自配不含淫羊藿的群藥，按其工藝制成空白制劑，再按供試品溶液制備方法制備與測定，結(jié)果空白溶液在與朝藿定C、淫羊藿苷對(duì)照品相同的保留時(shí)間處未見色譜峰。
3.2.4提取溶劑選擇稱取仙靈骨葆制劑0.5g(批號(hào)051209)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入甲醇、稀乙醇、乙醇各50ml，超聲處理1小時(shí)，測定其淫羊藿苷及朝藿定C含量。結(jié)果見表1表1 不同提取溶劑對(duì)朝藿定C、淫羊藿苷含量的影響

結(jié)果表明，稀乙醇作提取溶劑的效果最好。因此，選用稀乙醇作為提取溶劑進(jìn)行提取。
3.2.5提取時(shí)間確定稱取仙靈骨葆制劑0.5g(批號(hào)051209)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入稀乙醇50ml，超聲處理(功率250W，頻率25KHz)各0.5、1.0、1.5小時(shí)，測定其淫羊藿苷及朝藿定C的含量，結(jié)果見表2表2 不同提取時(shí)間對(duì)朝藿定C、淫羊藿苷含量的影響


根據(jù)以上結(jié)果，選擇超聲提取1小時(shí)較為適宜。
3.3線性關(guān)系考察精密吸取朝藿定C對(duì)照品溶液(0.0404mg/ml)2、4、8、12、16μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以對(duì)照品朝藿定C進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為A＝1509.3524X+13.7157(r＝0.9992)，將線性斷最低點(diǎn)值帶入上式計(jì)算，結(jié)果相對(duì)偏差小于1％，認(rèn)為工作曲線近似過原點(diǎn)，因此采用外表一點(diǎn)法進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果表明朝藿定C進(jìn)樣量在0.0808～0.6464μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。
同理，精密吸取淫羊藿苷對(duì)照品溶液(0.1004mg/ml)1、3、5、8、10μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以對(duì)照品淫羊藿苷進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為Y＝2109.8x+4.6272(r＝0.9998)，擬合為過原點(diǎn)方程為Y＝2115.063X，將線性短最低點(diǎn)值帶入上述兩式計(jì)算，結(jié)果相對(duì)偏差為0.96％，認(rèn)為工作曲線近似過原點(diǎn)，因此采用外標(biāo)一點(diǎn)法進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果表明淫羊藿苷進(jìn)樣量在0.10～1.2μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。結(jié)果見表3、表4。
表3 朝藿定C線性關(guān)系考察

表4 淫羊藿苷線性關(guān)系考察

3.4穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品(批號(hào)051214)0.5g，參照標(biāo)準(zhǔn)中供試品溶液制備方法進(jìn)行制備，分別于配制后0，2，4，6，8、10小時(shí)，依上法測定朝藿定C及淫羊藿苷峰面積，記錄峰面積值，結(jié)果表明供試品溶液在10小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好，見表5、6。
表5 朝藿定C穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

在除雙重單情況(case)的其它情況下，給出了諸如2n-1(n＝1，2和3)的信道ID。此時(shí)，n與數(shù)據(jù)流數(shù)目相同。在雙重單的情況下，信道ID 2n-1分給CH0而信道ID分給CH1。
當(dāng)用戶通過諸如遙控器的裝置按下音頻改變鍵時(shí)，比當(dāng)前再現(xiàn)信道ID更大的數(shù)目被順序選擇和輸出。當(dāng)用戶選擇信道ID時(shí)，對(duì)應(yīng)于該ID的音頻數(shù)據(jù)流被選擇、解碼和輸出。
按照本發(fā)明，在音頻信道選擇方法中，當(dāng)節(jié)目改變時(shí)，前一個(gè)節(jié)目中選擇的音頻信道在下一個(gè)節(jié)目中被跟蹤和選擇。而且，當(dāng)節(jié)目改變前沒有音頻信道時(shí)，將選擇默認(rèn)的音頻信道。
這里，假定當(dāng)數(shù)據(jù)被再現(xiàn)時(shí)輸入新的數(shù)據(jù)流。在新的數(shù)據(jù)流中可以記錄不同于前面的數(shù)據(jù)流的音頻數(shù)據(jù)。例如，當(dāng)在前面的數(shù)據(jù)流中記錄一種雙重單音頻數(shù)據(jù)流時(shí)，在新的數(shù)據(jù)流中將記錄兩種非雙重單數(shù)據(jù)流。
按照本發(fā)明，在音頻信道選擇方法中，當(dāng)存在相應(yīng)于要被再現(xiàn)的信道ID的數(shù)據(jù)時(shí)，該數(shù)據(jù)被選擇和再現(xiàn)。當(dāng)缺省為沒有相應(yīng)的數(shù)據(jù)時(shí)，對(duì)應(yīng)于信道ID-1的數(shù)據(jù)被選擇和輸出。
當(dāng)存在相應(yīng)于正在被再現(xiàn)的信道ID的數(shù)據(jù)時(shí)，該數(shù)據(jù)被選擇和再現(xiàn)。當(dāng)不存在相應(yīng)的數(shù)據(jù)時(shí)，并且當(dāng)當(dāng)前信道為偶數(shù)編號(hào)時(shí)，搜索當(dāng)前信道ID-1。當(dāng)存在相應(yīng)于信道ID-1的數(shù)據(jù)時(shí)，該數(shù)據(jù)被選擇和輸出。當(dāng)不存在所述數(shù)據(jù)時(shí)，相應(yīng)于信道ID 1的數(shù)據(jù)被選擇和輸出。當(dāng)不存在相應(yīng)的數(shù)據(jù)且當(dāng)前信道為奇數(shù)據(jù)編號(hào)時(shí)，相應(yīng)于信道ID 1的數(shù)據(jù)被選擇和輸出。
表5示出了音頻數(shù)據(jù)流的組合的另一個(gè)示例。
表5


表10 重復(fù)性試驗(yàn)中淫羊藿苷測定結(jié)果

3.7回收率試驗(yàn)采用加樣回收法。精密稱取已知含量的同一批號(hào)(批號(hào)051214，已知朝藿定C及淫羊藿苷含量分別為4.4561mg/g、1.9909mg/g)的樣品約0.25g各5份，精密稱定，分別精密加入朝藿定C及淫羊藿苷混合對(duì)照品溶液各50ml(取朝藿定C、淫羊藿苷對(duì)照品，加稀乙醇制成濃度分別為0.024mg/ml、7.52μg/ml的溶液)，按本發(fā)明含量測定項(xiàng)下供試液的制備方法制備及上述色譜條件測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表11、12。
表11 仙靈內(nèi)葆膠囊中朝藿定C回收率試驗(yàn)及結(jié)果

表12 仙靈內(nèi)葆膠囊中淫羊藿苷回收率試驗(yàn)及結(jié)果

以上結(jié)果表明，朝藿定C及淫羊藿苷平均回收率分別為100.11％、97.47％，RSD分別為1.99％、2.19％。說明該方法可行。
根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明含量測定方法的條件確定為用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-水(25∶75)為流動(dòng)相；流速1.0ml/min；檢測波長為270nm。理論板數(shù)按朝藿定C峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。
本發(fā)明的供試品溶液制備方法確定為取裝量差異項(xiàng)下的本制劑或其內(nèi)容物，研細(xì)，取0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，稱定重量，超聲處理(功率250W，頻率25kHz)1小時(shí)，放冷，再稱定重量，用乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，即得。
3.8含量測定計(jì)算方法 本測定法采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算含量，精密稱取供試品0.5g，按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制備供試液，進(jìn)樣測定，計(jì)算公式如下。
(1)供試品溶液濃度計(jì)算CS=CR×ASAR---(1)]]>式中CS為供試品溶液濃度(mg/ml)。
CR為對(duì)照品溶液濃度(mg/ml)。
As為供試品溶液峰面積值(mAu*s)AR為對(duì)照品溶液峰面積值(mAu*s)(2)制劑含量計(jì)算公式 式中Cs供試品溶液濃度(mg/ml)VS為供試品溶液的體積(ml)。
W1為樣品的稱量(g)。
W2為平均粒重(g)。
合并(1)(2)式，其計(jì)算公式為(3) 3.9樣品測定及含量限度制定 我們對(duì)本公司十批“仙靈骨葆膠囊”，按上述高效液相色譜法測定其朝藿定C及淫羊藿苷含量，結(jié)果見表13。
表13 朝藿定C測定結(jié)果表

根據(jù)以上朝藿定C及淫羊藿苷十批峰面積及含量測定結(jié)果，暫定“仙靈骨葆膠囊”中每粒含朝藿定C及淫羊藿苷分別不得少于1.0mg、0.5mg，且朝藿定C與淫羊藿苷峰面積比值不得少于2∶1。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明含量測定方法采用高效分離柱，將流動(dòng)相組分進(jìn)行更換，使淫羊藿苷峰與朝藿定C峰徹底分離，并經(jīng)過試驗(yàn)重新制定了含量限度，增加了其中峰面積較大的朝藿定C的含量限度，從而制定了兩者之間的比例范圍，使仙靈骨葆制劑的質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)更加完善，從而確保了藥品的安全性、有效性、可靠性。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的實(shí)施例1仙靈骨葆制劑中淫羊藿苷及朝藿定C的含量測定方法為照中國藥典2005年版一部附錄VID高效液相色譜法測定色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈∶水＝25∶75為流動(dòng)相；檢測波長為270nm；理論板數(shù)按朝藿定C峰計(jì)算應(yīng)不得低于5000；對(duì)照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥器中干燥36小時(shí)的淫羊藿苷及朝藿定C對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml分別含淫羊藿苷及朝藿定C 50μg、25μg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液，即得；供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的本制劑或其內(nèi)容物，研細(xì)，取0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，稱定重量，在功率250W、頻率25kHz下超聲處理60分鐘，放冷，再稱定重量，用乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，取上清液，濾過，取續(xù)濾液，即得；測定法 分別吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得；本膠囊劑每粒含朝藿定C及淫羊藿苷分別不得少于1.0mg、0.5mg，且朝藿定C與淫羊藿苷峰面積比值不得少于2∶1。
權(quán)利要求
1.仙靈骨葆制劑中淫羊藿苷及朝藿定C的含量測定方法，其特征在于它是以淫羊藿苷及朝藿定C對(duì)照品為對(duì)照，以乙腈∶水為流動(dòng)相的高效液相色譜法。
2.按照權(quán)利要求1所述仙靈骨葆制劑中淫羊藿苷及朝藿定C的含量測定方法，其特征在于具體的測定方法為照中國藥典2005年版一部附錄VID高效液相色譜法測定色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈∶水＝25∶75為流動(dòng)相；檢測波長為270nm；理論板數(shù)按朝藿定C峰計(jì)算應(yīng)不得低于5000；理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計(jì)算應(yīng)不得低于5000；對(duì)照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥器中干燥36小時(shí)的淫羊藿苷及朝藿定C對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml分別含淫羊藿苷及朝藿定C50μg、25μg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液，即得；供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的本制劑或其內(nèi)容物，研細(xì)，取0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，稱定重量，在功率250W、頻率25kHz下超聲處理30～60分鐘，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，取上清液，濾過，取續(xù)濾液，即得；測定法 分別吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得；本膠囊劑每粒含朝藿定C及淫羊藿苷分別不得少于1.0mg、0.5mg，且朝藿定C與淫羊藿苷峰面積比值不得少于2∶1。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種仙靈骨葆制劑中淫羊藿苷及朝藿定C的含量測定方法，它是以淫羊藿苷及朝藿定C對(duì)照品為對(duì)照，以乙腈∶水為流動(dòng)相的高效液相色譜法；與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明含量測定方法采用高效分離柱，將流動(dòng)相組分進(jìn)行更換，使淫羊藿苷峰與朝藿定C峰徹底分離，并經(jīng)過試驗(yàn)重新制定了含量限度，增加了其中峰面積較大的朝藿定C的含量限度，從而制定了兩者之間的比例范圍，使仙靈骨葆制劑的質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)更加完善，從而確保了藥品的安全性、有效性、可靠性。
文檔編號(hào)A61P19/00GK1857589SQ20061020032
公開日2006年11月8日 申請(qǐng)日期2006年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月6日
發(fā)明者周寧, 馮澤熹, 譚靜, 楊昌生, 朱穎, 童寅, 余勵(lì), 龐媛媛 申請(qǐng)人:貴州同濟(jì)堂制藥有限公司