專利名稱：胸腺素α的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)是中國(guó)專利申請(qǐng)03131492.9的分案申請(qǐng)。
本發(fā)明涉及以天然或非天然氨基酸取代的胸腺素α1活性片段及其聚乙二醇化衍生物，其制備方法，含它們的藥物組合物及其在治療或預(yù)防與免疫缺陷、免疫功能低下有關(guān)疾病的藥物中的用途，包括在乙型肝炎，丙型肝炎，惡性黑色素瘤，非小細(xì)胞性肺癌，冠狀病毒引起的SARS(嚴(yán)重急性呼吸綜合征)等相關(guān)疾病的治療或預(yù)防中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
胸腺素α1(Tα1)是胸腺分泌的一種重要的多肽，是一種針對(duì)T淋巴細(xì)胞的免疫增強(qiáng)劑，能促進(jìn)T細(xì)胞的成熟和分化，并促使成熟的T細(xì)胞分泌多種淋巴因子(如白介素-2和γ-干擾素等)，還能促進(jìn)白介素-2受體的生成。Tα1由28個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為3108，等電點(diǎn)為4.2，N-端含有乙?；Y(jié)構(gòu)，其氨基酸序列如下1 10Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-20 28Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OHTα1具有明確的化學(xué)結(jié)構(gòu)和顯著增強(qiáng)免疫功能的作用，其臨床應(yīng)用研究始于二十世紀(jì)八十年代，但關(guān)于其構(gòu)效關(guān)系研究的報(bào)道不多。Abiko等(Chem Pharm Bull，1980，283542-8)用E-玫瑰花結(jié)形成試驗(yàn)證實(shí)Tα1的C-端部分片段具有一定的活性Tα1(100％)，14-28(9.83％)，19-28(1.04％)。Felix等(Int J Pept Protein Res，1985，26130-48)用免疫抑制小鼠試驗(yàn)證實(shí)N-端片段1-4，4-10，1-10及1-14基本無活性；C-端片段15-28和18-28與Tα1活性相當(dāng)，21-28(75％)，23-28(50％)和25-28(50％)具有部分活性。Ho等(Thymus，1987，977-84)報(bào)道C-端片段13-19與Tα1具有相同的促T細(xì)胞增殖活性，20-25和20-28具有部分活性。Ciaredelli等(Biochemistry，1982，214233-4237)用硫唑呤抑制E-玫瑰花結(jié)形成試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)C-端17-28區(qū)域部分片段有較好的活性，其中20-25和20-27活性與Tα1相當(dāng)，17-24活性略高于Tα1。Abiko等(Biotechnol Ther，1992，3159-68)以Phe和Phe(4-F)替代Tα1序列中21位的Glu合成了[Phe21]-desAc-Tα1和[Phe(4-F)21]-desAc-Tα1，E-玫瑰花結(jié)形成試驗(yàn)顯示[Phe(4-F)21]-desAc-Tα1比[Phe21]-desAc-Tα1活性高，[Phe21]-desAc-Tα1與desAc-Tα1活性相當(dāng)。
Grottesi等(Peptides，1998，191731-8)通過圓二色譜和二維核磁對(duì)Tα1在溶液中的構(gòu)象進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，Tα1在水溶液中并不形成優(yōu)勢(shì)的二級(jí)構(gòu)象，但在疏水環(huán)境中能形成一定的二級(jí)結(jié)構(gòu)。在40％的三氟乙醇水溶液中，Val5和Glu8之間形成β-轉(zhuǎn)角，Lys17和Glu24之間形成α-螺旋。鑒于Tα1受體結(jié)構(gòu)還未被發(fā)現(xiàn)，Grottesi等認(rèn)為Tα1與淋巴細(xì)胞的作用可能是Tα1首先通過極性氨基酸殘基與細(xì)胞膜形成靜電作用，然后誘導(dǎo)Tα1的Lys17至Glu24之間序列形成α螺旋結(jié)構(gòu)并嵌入細(xì)胞膜，進(jìn)而與IL-2受體跨膜區(qū)發(fā)生靜電作用。這一作用模型有助于解釋Tα1與IL-2的協(xié)同作用。
病毒性乙型和丙型肝炎，可以導(dǎo)致肝癌和肝硬化，WHO估計(jì)目前全球有3.5億乙型肝炎病毒攜帶者和1.7億丙型肝炎病毒攜帶者。乙型肝炎在亞洲尤為流行，我國(guó)是肝炎大國(guó)。Tα1用于免疫缺陷或免疫受抑制的疾病的臨床治療研究始于20世紀(jì)80年代，目前已經(jīng)取得了較好的效果。臨床試驗(yàn)的總結(jié)分析證明，Tα1單獨(dú)或與干擾素聯(lián)合使用治療慢性乙型肝炎是有效的。1996年，美國(guó)賽生制藥公司生產(chǎn)的化學(xué)合成胸腺素α1(商品名為日達(dá)仙)首先在中國(guó)上市，它單獨(dú)或與干擾素聯(lián)合使用治療慢性乙型肝炎。至2002年12月，日達(dá)仙已在30多個(gè)國(guó)家獲準(zhǔn)銷售。在治療丙型肝炎方面，日達(dá)仙與干擾素一起使用是目前最為有效的方法之一。對(duì)于許多其它疾病，包括非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤和艾滋病，Tα1都有一定的療效。另外，Tα1也可作為疫苗輔助藥加強(qiáng)流感疫苗和乙型肝炎疫苗的效果。
目前臨床使用的Tα1為化學(xué)合成品，價(jià)格昂貴、用藥劑量大、周期長(zhǎng)。尋找生物活性肽的活性中心是構(gòu)效關(guān)系研究的重要目的之一，因此進(jìn)行Tα1的構(gòu)效關(guān)系研究，尋找結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單并有較好活性的Tα1活性片段仍有意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人經(jīng)研究現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)式I化合物或其衍生物具有優(yōu)良的預(yù)防或治療免疫缺陷、免疫功能低下有關(guān)疾病的活性，并且它們與聚乙二醇形成的衍生物在保持固有活性的同時(shí)，延長(zhǎng)了式(I)化合物的體內(nèi)半衰期，從而降低了式(I)化合物的用量并延長(zhǎng)了式(I)化合物的體內(nèi)作用時(shí)間。
本發(fā)明第一方面涉及式(I)化合物或其立體異構(gòu)體X1-Y1-X2-X3-Y-Z1-Z2-Y2(I)X1為L(zhǎng)-或D-型的天然或非天然堿性或芳香性氨基酸及其衍生物，如Arg、Lys、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)等，其中X為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，取代基選自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；Y1為L(zhǎng)-或D-型的天然或非天然酸性或芳香性氨基酸及其衍生物，如Asp、Glu、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)等，其中X為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，取代基選自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；X2為L(zhǎng)-或D-型的天然或非天然堿性或芳香性氨基酸及其衍生物，如Arg、Lys、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)等，其中X為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，如H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；
X3為L(zhǎng)-或D-型的天然或非天然堿性或芳香性氨基酸及其衍生物，如Arg、Lys、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)等，其中X為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，如H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；Y為L(zhǎng)-或D-型的天然或非天然芳香性酸基酸，如His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)等，其中X為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，取代基選自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；Z1為L(zhǎng)-或D-型的中性或親脂性或芳香性氨基酸及其衍生物，如Gly、Ala、β-Ala、GABA、Val、Leu、Ile、Pro、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)等，其中X為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，取代基選自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；Z2為L(zhǎng)-或D-型的中性或親脂性或芳香性氨基酸及其衍生物，如Gly、Ala、β-Ala、BABA、Val、Leu、Ile、Pro、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)等，其中R為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，取代基選自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；Y2為L(zhǎng)-或D-型的天然或非天然酸性或芳香性氨基酸及其衍生物，如Asp、Glu、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)等，其中X為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，如H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；本發(fā)明再一方面涉及式(II)化合物，其為式(I)化合物任意位點(diǎn)的氨基經(jīng)PEG共價(jià)修飾的化合物，所述氨基包括N-端氨基或賴氨酸側(cè)鏈氨基，[PEG-X-(CH2)mCO-NH]z-X1-Y1-X2-X3-Y-Z1-Z2-Y2(II)
PEG表示RO(CH2CH2O)n-CH2CH2，R＝H或CH3，n＝5-1000；X＝O、NH或NHCO；m＝0-6；z＝1-4，X1，Y1，X2，X3，Y，Z1，Z2和Y2如式(I)中定義。
本發(fā)明還涉及式(III)化合物，其為式(I)化合物任意位點(diǎn)的羧基經(jīng)PEG共價(jià)修飾的化合物，所述羧基包括C-端羧基，天冬氨酸或谷氨酸側(cè)鏈的羧基，X1-Y1-X2-X3-Y-Z1-Z2-Y2-[CO-X-PEG]z(III)其中，X＝O或NH，z＝1-4，X1，Y1，X2，X3，Y，Z1，Z2和Y2如式(I)中定義。
本發(fā)明還涉及式(IV)化合物，其為式(I)化合物的N-端引入半胱氨酸后經(jīng)PEG-M修飾的化合物PEG-M-Cys-X1-Y1-X2-X3-Y-Z1-Z2-Y2(IV) Cys為半胱氨酸，它通過其側(cè)鏈硫醚原子與M基團(tuán)共價(jià)相連，Cys還以其羧基與式(I)化合物的N-端氨基形成酰胺鍵相連，X1，X2，X3，Y，Y1，Y2，Z1和Z2如式I中定義。
本發(fā)明所涉及藥物組合物，其包括至少一種式(I)或式(II)或式(III)或(IV)化合物及藥用載體或賦形劑。
本發(fā)明還涉及至少一種式(I)或式(II)或式(III)或(IV)化合物在制備用于預(yù)防或治療免疫缺陷或免疫低下有關(guān)疾病的藥物中用途，包括在乙肝，丙肝，惡性黑色素瘤，非小細(xì)胞性肺癌，冠狀病毒引起的SARS等相關(guān)疾病的治療或預(yù)防中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及制備式I化合物的方法，其包括，用已知固相或液相合成法合成。
本發(fā)明還涉及式II或式III化合物的制備方法，其包括將在PEG上引入羧基或氨基后與式(I)化合物的中的氨基或羧基的縮合反應(yīng)形成。
根據(jù)本發(fā)明，在本發(fā)明中使用的縮寫詞具有下面的含義Tα1胸腺素α1，PEG 聚乙二醇，PEG-MAL-馬來酰亞胺基聚乙二醇，PEG-VS-乙烯砜基聚乙二醇，PEG-IODO-碘代乙酰胺基聚乙二醇，Ala 丙氨酸，Arg 精氨酸，Asn-天冬酰胺，Asp 天冬氨酸，Cys-半胱氨酸，Glu 谷氨酸，Gly 甘氨酸，His 組氨酸，Ile 異亮氨酸，Leu 亮氨酸，Lys 賴氨酸，Mob β-胡椒基丙氨酸，Nal 萘丙氨酸，Phe 苯丙氨酸，Phg 苯基甘氨酸，Pya β-吡啶基丙氨酸，Pro 脯氨酸，Ser-絲氨酸，Thr-蘇氨酸，Trp 色氨酸，Tyr 酪氨酸，Val 纈氨酸，
GABAγ-氨基丁酸，Ac 乙?；?，Boc 叔丁氧羰基，F(xiàn)moc芴甲氧羰基，DMF 二甲基甲酰胺，DCC 二環(huán)已基碳二亞胺，HOBT1-羥基苯并三唑，HBTU2-(1H-1-羥基苯并三唑)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸，NMM N-甲基嗎啡啉，TFA 三氟乙酸，Ts-Cl 對(duì)甲苯磺酰氯RP-HPLC 反相高效液相色譜。
本發(fā)明中，所有氨基酸構(gòu)型除注明為D-型外，均為L(zhǎng)-型。
根據(jù)本發(fā)明，式I化合物優(yōu)選X1為L(zhǎng)ys；Y1為Glu；X2為L(zhǎng)ys；X3為L(zhǎng)ys；Y為L(zhǎng)-或D-型Phe(X)，其中X為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，如H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；Z1為Val；Z2為Val；Y2為Glu。
根據(jù)本發(fā)明，式II化合物優(yōu)選z＝1；X1為L(zhǎng)ys；Y1為Glu；X2為L(zhǎng)ys；X3為L(zhǎng)ys；Y為Glu、L-或D-型Phe(R)，R為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，如H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；Z1為Val；Z2為Val；Y2為Glu。
本發(fā)明所用的PEG-OH結(jié)構(gòu)為RO(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH，R＝H或CH3，n＝5-1000。平均分子量由幾百到幾萬的PEG-OH可作為商品化試劑購買到，PEG-NH2可以購買或通過以下反應(yīng)得到先將其轉(zhuǎn)化為PEG-NH2，再與琥珀酸酐反應(yīng)得到PEG-NHCOCH2CH2COOH，然后將此化合物可作為羧基組分，可在固相上將其偶聯(lián)到多肽的N-端，最后經(jīng)三氟乙酸裂解和反相高效液相色譜純化得產(chǎn)物。
在PEG的一端先引入氨基、羧基或制備PEG化修飾的氨基酸(如Fmoc-Lys(NH-COCH2-PEG)-OH、Fmoc-Glu(CO-NH-PEG)-OH Fmoc-Asp(CO-NH-PEG)-OH)，再用液相或固相法偶聯(lián)到肽序列中去，可實(shí)現(xiàn)對(duì)多肽的N-端氨基、C-端羧基、Lys側(cè)鏈氨基、Asp或Glu側(cè)鏈羧基的修飾。
將PEG-NH2分別與馬來酸酐、乙烯基氯化亞砜、碘代乙酸酐反應(yīng)得PEG-MAL、PEG-VS和PEG-IODO。PEG-MAL通過以下反應(yīng)得到 Tα1(17-24)的活性片段可用固相或液相多肽合成法合成，在合成過程中很容易在N-端或C-端引入一個(gè)Cys。將含Cys的肽鏈溶于水中，用碳酸氫鈉調(diào)pH 7-8，加入3倍當(dāng)量的PEG-MAL或PEG-MAL或PEG-VS和PEG-IODO室溫?cái)嚢璺磻?yīng)，用反相高效液相色譜純化得PEG修飾的Tα1的活性片段。PEG-MAL修飾Cys-Tα1(17-24)的反應(yīng)如下 本發(fā)明涉及的Wang樹脂、DCC、HOBT、HBTU、NMM、TFA和普通Fmoc-氨基酸通過購買獲得，下列非天然氨基酸由發(fā)明人合成并拆分Phe(4-F)，Phe(3-F)，Phe(2-F)，Phe(4-Cl)，Phe(3-Cl)，Phe(3-Cl)，Phe(2-Cl)，Phe(4-Br)，Phe(3-NO2，Phe(2，5-Cl2，Phe(4-F，3-Cl)，Mob，D-Phe，D-Phe(4-F)，D-Phe(3-F)，D-Phe(2-F)，D-Phe(3-Cl)，D-Phe(2-Cl)，D-Phe(4-Br)，D-Phe(3-NO2)，D-Phe(2，5-Cl2)，D-Phe(4-F，3-Cl)，D-Mob。
本發(fā)明合成的系列八肽衍生物是基于Tα1(17-24)的新結(jié)構(gòu)的Tα1活性片段及其聚乙二醇化衍生物，通過初步活性評(píng)價(jià)觀察到部分化合物具有較好的體外促小鼠淋巴細(xì)胞增殖的生物活性。含它們的藥物組合物可用于免疫缺陷、免疫功能低下等相關(guān)疾病的治療或預(yù)防。Tα1活性八肽衍生物可與一種或多種賦形劑結(jié)合制成適用于人的劑型，如用甘露醇作賦形劑制成注射劑，經(jīng)皮下給藥治療免疫缺陷、免疫功能低下等相關(guān)疾病，包括在乙型肝炎，丙型肝炎，惡性黑色素瘤，非小細(xì)胞性肺癌，冠狀病毒引起的SARS等相關(guān)疾病的治療或預(yù)防中的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明，式I化合物優(yōu)選下面的化合物[Phe21]-Tα1(17-24)[Phe(4-F)21]-Tα1(17-24)[Phe(3-F)21]-Tα1(17-24)[Phe(2-F)21]-Tα1(17-24)[Phe(4-Cl)21]-Tα1(17-24)[Phe(3-Cl)21]-Tα1(17-24)[Phe(2-Cl)21]-Tα1(17-24)[Phe(4-Br)21]-Tα1(17-24)[Phe(3-NO2)21]-Tα1(17-24)[Phe(2，5-Cl2)21]-Tα1(17-24)[Phe(4-F，3-Cl)21]-Tα1(17-24)[D-Phe21]-Tα1(17-24)[D-Phe(4-F)21]-Tα1(17-24)[D-Phe(3-F)21]-Tα1(17-24)[D-Phe(2-F)21]-Tα1(17-24)[D-Phe(3-Cl)21]-Tα1(17-24)[D-Phe(2-Cl)21]-Tα1(17-24)[D-Phe(4-Br)21]-Tα1(17-24)[D-Phe(3-NO2)21]-Tα1(17-24) -Tα1(17-24)[D-Phe(4-F，3-Cl)21]-Tα1(17-24)。
根據(jù)本發(fā)明，式II化合物優(yōu)選下面的化合物PEG-CH2CH2-X-(CH2)mCO-Tα1(17-24)PEG-CH2CH2-X-(CH2)mCO-[Phe(4-F)21]Tα1(17-24)PEG-CH2CH2-X-(CH2)mCO-[Phe(3-F)21]Tα1(17-24)PEG-CH2CH2-X-(CH2)mCO-[Phe(2-F)21]Tα1(17-24)PEG-CH2CH2-X-(CH2)mOO-[Phe(4-F，3-Cl)21]Tα1(17-24)X＝O、NH或NHCO；m＝0-6。
根據(jù)本發(fā)明，與免疫缺陷或免疫功能低下有關(guān)的疾病舉例有乙型肝炎，丙型肝炎，非小細(xì)胞肺癌，黑色素瘤或艾滋病，冠狀病毒引起的SARS。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明中所用術(shù)語“Tα1(17-24)序列是指Tα1的17位-24位的氨基酸序列。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例下述實(shí)施例代表本發(fā)明的說明性實(shí)施方案，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限制。
實(shí)施例所用固相合成載體Wang樹脂為ACT產(chǎn)品，DCC、HOBT、HBTU、Fmoc-保護(hù)氨基酸為上海吉爾生化產(chǎn)品，TFA為ACROS產(chǎn)品，平均分子量為2000的mPEG-OH為Sigma產(chǎn)品。
實(shí)施例1 Phe(4-F)21Tα1(17-24)的合成將0.285g H-Phe(4-F)-OH.HCl(1.3mmol)溶于10mL甲醇、10mL丙酮和10mL水中，加入0.218g NaHCO3(2.6mm0l)，攪拌使固體溶解后再加入等0.438g Fmoc-OSu(1.3mmol)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)。TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完成后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，用6N鹽酸調(diào)pH 2-3，乙酸乙酯提取水相3次，合并有機(jī)相，無水MgSO4干燥。濾除干燥劑，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑得白色固體。再以乙酸乙酯-石油醚重結(jié)晶得0.320g Fmoc-Phe(4-F)-OH，收率61.5％。
以100mg Wang樹脂(0.05mmol)為固相載體，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH為原料，DCC-HOBT作縮合劑，根據(jù)Tα1(17-24)的氨基酸序列，在21位以Fmoc-Phe(4-F)-OH代替Fmoc-Glu(OtBu)-OH，按標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc固相多肽合成方法操作合成H-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Phe(4-F)-Val-Val-Glu(OtBu)-Wang樹脂。
將5ml裂解液(4.5ml TFA，0.5ml間甲酚)冷卻至0℃，加入上述合成的肽樹脂反應(yīng)90分鐘。濾除樹脂并用少量TFA洗滌樹脂，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去TFA，加入無水乙醚沉淀出固體。濾集固體，溶于水，冰凍干燥后得粗品肽27.0mg，HPLC純化得純品9.3mg。FAB-MS1024.8(理論值1024.2)。酸水解(6N鹽酸水溶液，110℃，22小時(shí))的氨基酸組成比例分析與理論值相符Glu，2.37(2)；Val，1.61(2)；Lys，3.02(3)。
實(shí)施2 mPEG2000-NHCOCH2CH2CO-Tα1(17-24)的合成稱取mPEG2000OH 20g(10mmol)置于250ml反應(yīng)瓶中，加入50mlCH2Cl2，固體溶解后再加入7.5ml Et3N(50mmmol)和9.5g Ts-Cl(50mmol)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)。TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，加100ml無水乙醚沉淀出固體，得18.9g mPEG2000-OTs，收率94％將12g mPEG2000-OTs(6mmol)溶于30ml DMF，加入3.36g(18mmol)鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽，120℃反應(yīng)4小時(shí)。減壓蒸去溶劑，將殘余物溶于50ml無水乙醇，加入4.0ml水合肼，回流反應(yīng)4小時(shí)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，將殘余物溶于CH2Cl2，濾去不溶物，再將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，用無水乙醚沉淀出固體，再以無水乙醇-乙醚重結(jié)晶，得10.9g mPEG2000-NH2，收率90％。
將6.3g mPEG2000-NH2溶于20ml DMF中，加入0.45g琥珀酸酐，40℃反應(yīng)0.5小時(shí)，減壓蒸去溶劑，加無水乙醚沉淀出固體，得4.7gmPEG2000-NHCOCH2CH2COOH，收率74％。
以100mg Wang樹脂(0.05mmol)為固相載體，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH為原料，DCC-HOBT作縮合劑，根據(jù)Tα1(17-24)的氨基酸序列，按標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc固相多肽合成方法合成H-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Wang樹脂，加入mPEG2000-NHCOCH2CH2COOH(0.1mmol)，HBTU(0.1mmol)，NMM(0.15mmol)，反應(yīng)48小時(shí)后，茚三酮法檢測(cè)為陰性，停止反應(yīng)，將所得肽樹脂洗滌干燥。以5ml TFA為裂解試劑，0℃反應(yīng)90分鐘，濾除樹脂，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去TFA，加無水乙醚沉淀出固體，濾集固體，溶于水中，冰凍干燥得白色粘稠固體60mg。HPLC純化得目標(biāo)產(chǎn)物。
mPEG2000-NHCOCH2CH2CO-Tα1(17-24)經(jīng)MALDI-TOF-MS分析，在3127附近有一系列峰，相鄰兩峰分子量相差約44，具有聚乙二醇的典型結(jié)構(gòu)特征。酸水解(6N鹽酸水溶液，110℃，22小時(shí))的氨基酸組成比例分析與理論值相符Glu，2.37(2)；Val，1.61(2)；Lys，3.02(3)。
實(shí)施3 Cys(mPEG2000-MAL)-Tα1(17-24)的合成將1.0g mPEG2000-NH2溶于10ml二氧六環(huán)，加入馬來酸酐0.4g，80℃攪拌反應(yīng)30min。減壓蒸去溶劑，加入50ml無水乙醚，冷卻沉淀出固體，濾集固體，干燥后得0.95g。將所得固體溶于15ml乙酸酐，加入1.0g乙酸鈉，100℃攪拌反應(yīng)45min。減壓蒸去溶劑，將殘余物用二氯甲烷溶解，濾去不溶物，向?yàn)V液中加入適量活性炭，放置30min，濾除活性炭，將濾液濃縮至干，加入無水乙醚，沉淀出固體，濾集、干燥后得淺黃色固體0.55g mPEG2000-MAL，收率55％。
以100mg Wang樹脂(0.05mmol)為固相載體，F(xiàn)moc-Cys(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH為原料，DCC-HOBT作縮合劑，根據(jù)Tα1(17-24)的氨基酸序列，按標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc固相多肽合成方法合成H-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Wang樹脂。以EDT-間甲酚-TFA作裂解液，0℃反應(yīng)90分鐘，濾除樹脂，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去TFA，加無水乙醚沉淀出白色固體，濾集固體，溶于水中，冰凍干燥得白色干粉37mg。RP-HPLC純化，F(xiàn)AB-MS分析，M+1峰1092(理論值1091)。
將經(jīng)RP-HPLC純化后的Cys-Tα1(17-24)溶于水中，以碳酸氫鈉調(diào)pH至7-8，加入3倍當(dāng)量的mPEG2000-MAL，室溫反應(yīng)，用RP HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程和分離產(chǎn)物。
Cys(mPEG2000-MAL)-Tα1(17-24)經(jīng)MALDI-TOF-MS分析，在3096附近有一系列峰，相鄰兩峰分子量相差約44，具有聚乙二醇的典型結(jié)構(gòu)特征。酸水解(6N鹽酸水溶液，110℃，22小時(shí))的氨基酸組成比例分析與理論值相符Glu，3.36(3)；Val，1.50(2)；Lys，3.14(3)。
實(shí)施例43H-TdR摻入法檢測(cè)對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)斷頭放血處死小鼠，無菌條件下迅速取出脾臟，放入RPMI1640液中。將脾臟放在100目不銹鋼網(wǎng)上或尼龍網(wǎng)中用針芯或三角玻棒研磨，制成脾細(xì)胞懸液。用培養(yǎng)液離心洗滌脾細(xì)胞一次后，加入Tris-NH4Cl緩沖液(0.16M NH4Cl和0.17M Tris按9∶1混合，pH 7.2)作用3-5分鐘，溶解RBC，再用培養(yǎng)液離心洗滌兩次。用苔盼藍(lán)染色，活細(xì)胞數(shù)需在95％以上。用20％小牛血清1640液將細(xì)胞稀釋成5-10×106個(gè)/mL濃度備用。將脾細(xì)胞加入無菌96孔培養(yǎng)板中，5-10×105個(gè)/100μL/孔，再加入Con A 50μL/孔(終濃度O.5μg/mL)，37 C孵溫6小時(shí)。加入不同濃度待測(cè)樣品50μL/孔，置5％CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)66小時(shí)。終止培養(yǎng)前16小時(shí)，每孔加入3H-TdR 20μL，使其終濃度為1μci(37KBq)/mL。用TOMTEC公司Harvester96型96孔板細(xì)胞收集儀收集細(xì)胞樣本于型玻璃纖維濾紙片上，置80 C烘箱內(nèi)干燥30分鐘或自然干燥。將干燥的濾紙片放入盛有閃爍液的小瓶中，用PerkinElmer公司的MicoBeta Trilux 1450型微量液閃儀檢測(cè)cpm值。液閃儀每分鐘記錄的脈沖數(shù)(cpm)表示試驗(yàn)結(jié)果。

注n＝3，*，**，***表示與CON比較P＜0.05，＜0.01，＜0.001實(shí)施例5 Tα1活性片段的體外抗SARS病毒實(shí)驗(yàn)生長(zhǎng)成片的96孔塑膠板培養(yǎng)的Vero E6細(xì)胞，傾出培養(yǎng)液后，加入100TCID50的SARS病毒，吸附2小時(shí)，傾出病毒，加入待測(cè)樣品，終濃度為100μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)7天，每天在顯微鏡下觀察Vero E6細(xì)胞病變程度，結(jié)果如下

注4-/4表示4個(gè)孔都無病毒繁殖，即陰性；4+/4表示4個(gè)孔均為陽性。
結(jié)論Cys(mPEG5000-MAL)-Tα1(17-24)在100μg/ml時(shí)有體外抗SARS病毒活性。
權(quán)利要求
1.具有式(I)結(jié)構(gòu)的八肽衍生物或其立體異構(gòu)體X1-Y1-X2-X3-Y-Z1-Z2-Y2(I)X1為選自Arg、Lys、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)的L-或D-型的天然或非天然堿性或芳香性氨基酸及其衍生物，其中X為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，取代基選自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2；Y1為選自Asp、Glu、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)的L-或D-型的天然或非天然酸性或芳香性氨基酸及其衍生物，其中X為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，取代基選自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2；X2為選自Arg、Lys、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)的L-或D-型的天然或非天然堿性或芳香性氨基酸及其衍生物，其中X為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，取代基選自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2；X3為選自Arg、Lys、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)的L-或D-型的天然或非天然堿性或芳香性氨基酸及其衍生物，其中X為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，取代基選自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；Y為選自His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)的L-或D-型的天然或非天然芳香性酸基酸，其中X為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，取代基選自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2；Z1為選自Gly、Ala、β-Ala、GABA、Val、Leu、Ile、Pro、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)的L-或D-型的中性或親脂性或芳香性氨基酸及其衍生物，其中X為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，取代基選自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2；Z2為選自Gly、Ala、β-Ala、BABA、Val、Leu、Ile、Pro、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)的L-或D-型的中性或親脂性或芳香性氨基酸及其衍生物，其中R為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，取代基選自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2；Y2為選自Asp、Glu、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)的L-或D-型的天然或非天然酸性或芳香性氨基酸及其衍生物，其中X為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，取代基選自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物X1為L(zhǎng)ys；Y1為Glu；X2為L(zhǎng)ys；X3為L(zhǎng)ys；Y為L(zhǎng)-或D-型Phe(X)，其中X為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，取代基選自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2；Z1為Val；Z2為Val；Y2為Glu。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的化合物，其中所述化合物下列八肽衍生物[Phe21]-Tα1(17-24)[Phe(4-F)21]-Tα1(17-24)[Phe(3-F)21]-Tα1(17-24)[Phe(2-F)21]-Tα1(17-24)[Phe(4-Cl)21]-Tα1(17-24)[Phe(3-Cl)21]-Tα1(17-24)[Phe(2-Cl)21]-Tα1(17-24)[Phe(4-Br)21]-Tα1(17-24)[Phe(3-NO2)21]-Tα1(17-24)[Phe(2，5-Cl2)21]-Tα1(17-24)[Phe(4-F，3-Cl)21]-Tα1(17-24)[D-Phe21]-Tα1(17-24)[D-Phe(4-F)21]-Tα1(17-24)[D-Phe(3-F)21]-Tα1(17-24)[D-Phe(2-F)21]-Tα1(17-24)[D-Phe(3-Cl)21]-Tα1(17-24)[D-Phe(2-Cl)21]-Tα1(17-24)[D-Phe(4-Br)21]-Tα1(17-24)[D-Phe(3-NO2)21]-Tα1(17-24)[D-Phe(2，5-Cl2)21]-Tα1(17-24)[D-Phe(4-F，3-Cl)21]-Tα1(17-24)
4.式(I)結(jié)構(gòu)中任意位點(diǎn)的氨基經(jīng)PEG共價(jià)修飾的化合物(II)，其中所述氨基包括N-端氨基和賴氨酸側(cè)鏈氨基[PEG-X-(CH2)mCO-NH]z-X1-Y1-X2-X3-Y-Z1-Z2-Y2(II)PEG表示RO(CH2CH2O)n-CH2CH2，R＝H或CH3，n＝5-1000；X＝O、NH或NHCO；m＝0-6；z＝1-4；X1、Y1、X2、X3、Y、Z1、Z2、Y2的定義同權(quán)利要求1。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的化合物，z＝1；X1為L(zhǎng)ys；Y1為Glu；X2為L(zhǎng)ys；X3為L(zhǎng)ys；Y為Glu、L-或D-型Phe(R)，R為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，如H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；Z1為Val；Z2為Val；Y2為Glu。
6.下列化合物選自權(quán)利要求5的化合物PEG-X-(CH2)mCO-Tα1(17-24)PEG-X-(CH2)mCO-[Phe(4-F)21]Tα1(17-24)PEG-X-(CH2)mCO-[Phe(3-F)21]Tα1(17-24)PEG-X-(CH2)mCO-[Phe(2-F)21]Tα1(17-24)PEG-X-(CH2)mCO-[Phe(4-F，3-Cl)21]Tα1(17-24)X＝O、NH或NHCO；m＝0-6。
7.式(I)結(jié)構(gòu)中任意位點(diǎn)的羧基經(jīng)PEG共價(jià)修飾的化合物(III)，其中所述羧基包括C-端羧基、天冬氨酸和谷氨酸的側(cè)鏈羧基X1-Y1-X2-X3-Y-Z1-Z2-Y2-[CO-X-PEG]z(III)X1、Y1、X2、X3、Y、Z1、Z2、Y2的定義同權(quán)利要求1；X＝O或NH，z＝1-4。
8.式(I)結(jié)構(gòu)化合物的N-端引入半胱氨酸后經(jīng)PEG-MAL、PEG-VS或PEG-IODO修飾的化合物(IV)PEG-M-Cys-X1-Y1-X2-X3-Y-Z1-Z2-Y2(IV) Cys為半胱氨酸，通過側(cè)鏈硫醚原子與M基團(tuán)共價(jià)相連；X1、Y1、X2、X3、Y、Z1、Z2、Y2的定義同權(quán)利要求1。
9.式(I)結(jié)構(gòu)化合物的C-端引入半胱氨酸后經(jīng)PEG-MAL、PEG-VS或PEG-IODO修飾的化合物(V)X1-Y1-X2-X3-Y-Z1-Z2-Y2-Cys-M-PEG(V)X1、Y1、X2、X3、Y、Z1、Z2、Y2的定義同權(quán)利要求1；M的定義同權(quán)利要求8。
10.權(quán)利要求1-9中任一化合物在制備用于治療或預(yù)防免疫缺陷、免疫功能低下等相關(guān)疾病，乙型肝炎，丙型肝炎，惡性黑色素瘤，非小細(xì)胞性肺癌，冠狀病毒引起的SARS等相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及以天然或非天然氨基酸取代的胸腺素α
文檔編號(hào)A61P31/14GK1990037SQ20061015272
公開日2007年7月4日 申請(qǐng)日期2003年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月21日
發(fā)明者劉克良, 王良友, 梁遠(yuǎn)軍, 吳萍, 許笑宇, 劉尚義, 齊春會(huì), 趙修南 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所