專利名稱：熱靶向納米球抗癌藥物載體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種熱耙向抗癌藥物載體及其制備方法，更具體地說，本發(fā)明涉及一種可耙 向作用于癌組織細(xì)胞的熱敏型納米球抗癌藥物載體及其制備方法。
背景技術(shù)：
癌癥(即惡性腫瘤)是一類嚴(yán)重危害人類生命健康和生活質(zhì)量的常見病，目前，在癌癥 的治療方法中，化學(xué)治療作為一種全身性治療手段，具有對(duì)原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶和亞臨床轉(zhuǎn)移灶 均有治療作用等很多優(yōu)點(diǎn)，其存在的主耍問題不在于現(xiàn)有抗癌藥物對(duì)癌細(xì)胞的殺傷強(qiáng)度弱， 而是對(duì)正常組織同樣具有致死性，并且在腫瘤組織處分布較低。另外，熱療也是一種治療癌 癥的方法，即通過加熱使腫瘤組織達(dá)到40~43°C,引起腫瘤細(xì)胞組織生長(zhǎng)受阻和死亡。目 前，熱療常作為輔助方法，與化療聯(lián)合應(yīng)用可得到更好的治療效果。然而，在熱療與化療的 聯(lián)合應(yīng)用中，化療藥物對(duì)人體的毒副作用依然很嚴(yán)重，而且耍使化療藥物完全到達(dá)熱療的癌 組織是非常困難的，如果降低給藥劑量，可以減輕毒副作用，但同時(shí)對(duì)腫瘤的治療效果又會(huì) 降低'
如果我們能將抗癌化學(xué)藥物做成緩釋控釋劑型，就不需耍頻繁給藥也能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維 持體內(nèi)藥物有效濃度，從而就能達(dá)到降低毒副作用如果我們能讓抗癌化療藥物具有靶向性， 只作用于癌細(xì)胞而不作用于正常細(xì)胞，也就是采用耙向給藥系統(tǒng)，這就能提高療效并能降低 全身毒副作用，使患者免疫功能免遭破壞。因此，具有緩釋、控釋及靶向功能的藥物載體可 應(yīng)用于癌癥的化學(xué)治療，提高抗癌藥物的選擇性，降低其毒副作用。
目前，為了降低癌癥化學(xué)治療的毒副作用，具有緩釋、控釋和靶向功能的納米球藥物載 體得到了廣泛的研究，比如，嫁接了葉酸的白蛋白納米球[lnternational Journal of Pharmaceutics 287(2004) 155]、嫁接了單克隆抗體的納米粒子[藥學(xué)學(xué)報(bào)，30(9) (1995) 706]、 磁性白蛋白納米粒子[Hepatobiliary Pancreat Dis Int., 3(3) (2004) 365]以及熱敏型聚合物膠束 [J.Control. Release 65 (2000) 93, Colloids and Surface B: Biointerfaces 16 (1999) 195-205]。其 中，熱敏型聚合物膠束能夠在化療、熱療聯(lián)合應(yīng)用中主動(dòng)靶向癌細(xì)胞，但是通過疏水相互作 用形成的熱敏型聚合物膠束具有機(jī)械強(qiáng)度差、穩(wěn)定性不好等缺點(diǎn)，并且，當(dāng)熱敏型聚合物膠 束在腫瘤組織細(xì)胞處聚集后，密集的外殼親水性聚合物片斷會(huì)發(fā)生收縮，密集地堆積在納米 膠束的表面，從而使得抗癌藥物釋放減慢，影響化療藥物對(duì)腫瘤的治療作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述缺陷，提供一種熱靶向納米球抗癌藥物載體，它可生物相容 和生物降解，又具有緩釋、控釋作用，能靶向作用于癌組織細(xì)胞。
本發(fā)明的上述熱靶向納米球抗癌藥物載體由兩部分構(gòu)成，即可生物降解的納米球和具有 低臨界溶解溫度(LCST)的熱敏型高分子。其中，所述的納米球的材料選自亍以下可生物
降解的材料蛋白質(zhì)(如牛血清白蛋白和人血清白蛋白)、聚賴氨酸、聚精氨酸、聚谷氨酸、 聚天門冬氨酸、多肽、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚(乳酸-乙醇酸)(PLGA)、殼 聚糖、聚乳酸-聚乙醇(PLEA)、聚(乳酸-乙醇酸)-聚乙醇、聚己內(nèi)酯、聚原酸酯、聚酸酐、 聚異丁基丙烯氛酯、聚磷腈以及上述各物質(zhì)的衍生物中的一種或幾種；所述的熱敏型高分子 選自于聚異丙基丙烯酰胺、聚甲基乙烯基醚[poly(vinyl methyl ether)]、聚磷氮烯 (polyphosphazene derivatives)、聚N-乙烯己內(nèi)酰胺[poly(N-vinylcaprolactam)]、聚甲稱:烷氧 基乙二醇[poly(siloxyethylene glycol)]以及上述各物質(zhì)的衍生物中的一種或兒種(如聚異丙基 丙烯酰胺-丙烯酰胺和聚異丙基丙烯酰胺-N，N-二甲基丙烯酰胺)，其LCST為37 43°C。
可生物降解的納米球可作載體包埔抗癌藥物實(shí)現(xiàn)緩釋、控釋作用，為了防止體內(nèi)調(diào)理作 用的發(fā)生，納米球的粒徑最好小于200nm;在納米球的表面共價(jià)交聯(lián)一種LCST為37~43°C 的熱敏型高分子的目的是為了使該藥物載體具有粑向癌組織細(xì)胞的作用。
本發(fā)明的上述熱靶向納米球抗癌藥物載體的靶向原理敘述如下，如果熱療時(shí)(將腫瘤組 織部位加熱至43DC)靜脈注射該熱靶向納米球抗癌藥物載體，由于熱靶向納米球抗癌藥物 載體的粒徑小于200rnn，并且在溫度低于其LCST時(shí)其表面是親水性的，所以該熱粑向納米 球抗癌藥物載體能在體內(nèi)循環(huán)，不被淸除，然而，當(dāng)其隨體液循環(huán)到達(dá)癌組織處時(shí)，由于熱 療時(shí)癌組織處的溫度高于其LCST，其表面的高分子就會(huì)經(jīng)歷相轉(zhuǎn)變成為疏水性的高分子， 從而導(dǎo)致該熱靶向納米球抗癌藥物載體吸附沉淀在癌細(xì)胞上,這樣就可以實(shí)現(xiàn)抗癌藥物的主 動(dòng)靶向作用。
更重耍的是，當(dāng)熱靶向納米球抗癌藥物載體主動(dòng)靶向熱療時(shí)的癌組織細(xì)胞后，由于熱療 時(shí)癌組織處的溫度髙于納米球表面的熱敏型高分子的LCST時(shí)，熱敏型髙分子會(huì)發(fā)生收縮， 使得熱敏型高分子鏈之間的間隙增大，生物酶更容易與納米球接觸，從而導(dǎo)致抗癌藥物的釋 放加快，這就能克服以往膠束所存在的缺點(diǎn)。
本發(fā)明的目的還在于提供一種熱敏型納米球藥物載體的制備方法,即先用可生物降解材 料制作納米球藥物載體，再在納米球藥物載體的表面共價(jià)交聯(lián)一種熱敏型高分子(使一種熱 敏型高分子末端的功能基團(tuán)與納米球藥物載體表面的功能基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng))。例如，當(dāng)納米球 的材料含有羧基時(shí)(如聚谷氨酸、聚天門冬氨酸以及含有谷貧酸和天門冬氨酸的多肽和蛋白 質(zhì)等)，可以采用嵌段共聚法使熱敏型髙分子的一端具有數(shù)個(gè)丙烯胺，從而使得熱敏型高分 子的末端具有數(shù)個(gè)氨基，然后在pH4.0的磷酸緩沖液(100mM)中W EDAC和NHS活化納 米球表面的羧基，再滴加帶有末端貧基的熱敏型髙分子溶液，使活化的羧基與熱敏型髙分子 末端的氨基共價(jià)反應(yīng)形成穩(wěn)定的酰胺鍵當(dāng)納米球的材料含有貧基時(shí)(如聚賴氨酸、聚精氨
酸以及含有賴氨酸和精氨酸的多肽等)，可以采用嵌段共聚法使熱敏荊髙分子的一端良有數(shù) 個(gè)丙烯酸，從而使得熱敏型高分子的末端具有數(shù)個(gè)羧基，然后采取以上方法活化熱敏型高分 子末端的羧基后使之嫁接于納米球表面上；對(duì)于既不含有羧基、乂不含有氨基的可生物降解 材料(如聚乳酸類、聚乙醇酸類和聚乳酸-乙醉酸類等)，可以釆用共聚法使之帶有一些氨基 或者羧基，制作成納米球之后采用以上相同方法可使熱敏型高分子嫁接于納米球表面上。
本發(fā)明涉及到的納米球可以采用超聲乳化-化學(xué)交聯(lián)固化法制作，即先采用超聲乳化法 制作納米乳滴，再對(duì)納米乳滴進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)固化，最后除去化學(xué)交聯(lián)劑和乳化劑即可得到納 米球。更具體地說，所述的納米球藥物載體的制作可采取如下三種方法
1) 油包水法用溶解了親水性抗癌藥和親水性膜材的水溶液作為水相，用溶解了油溶 性乳化劑的有機(jī)溶劑作為油相，將水相與油相混合攪拌進(jìn)行粗分散后，再用超聲波 細(xì)胞破碎機(jī)進(jìn)行乳化，得到油包水型納米乳液，再在磁力攪拌下向所得納米乳液中 加入交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)固化，除去過量的交聯(lián)劑和乳化劑即可得到納米球藥物載體。
2) 水包油法用溶解了疏水性抗癌藥和疏水性膜材的有機(jī)溶劑作為油相，用溶解了水 溶性乳化劑的水溶液作為水相，將油相與水相混合攪拌進(jìn)行粗分散后，再用超聲波 細(xì)胞破碎機(jī)進(jìn)行乳化，得到水包油型納米乳液，再在磁力攪拌下向所得納米乳液中 加入交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)向化，除去過量的交聯(lián)劑和乳化劑即可得到納米球藥物載體。
3) W/0/W復(fù)乳法用溶解了親水性抗癌藥的水溶液作為水相，用溶解了疏水性膜材和 油溶性乳化劑的有機(jī)溶劑作為油相，將水相與油相混合攪拌進(jìn)行粗分散后，再用超 盧波細(xì)胞破碎機(jī)進(jìn)行乳化，得到油包水型納米乳液，再將所得油包水型納米乳液加 入溶有水溶性乳化劑的水相中進(jìn)行超聲乳化，從而得到W/O/W型納米乳液，再在 磁力攪拌下向所得W/O/W型納米乳液中加入交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)固化，除去過量的交 聯(lián)劑和乳化劑即可得到納米球藥物載體。
本發(fā)明涉及到的熱敏型髙分子選自于聚異丙基丙烯酰胺、聚甲基乙烯基醸[poly(vinyl methyl ether)]、 聚磷諷稀 (polyphosphazene derivatives )、 聚N-乙烯己內(nèi)酰胺 [poly(N-vinylcaprolactam)]、聚甲硅烷氧基乙二醇[poly(siloxyethylene glycol)]以及上述各物質(zhì) 的衍生物中的一種或兒種(如聚異丙基丙烯酰胺-丙烯酰胺和聚異丙基丙烯酰胺-N，N-二甲基 丙烯酰胺)。為了在熱敏型高分子的末端引入功能基團(tuán)氨基或羧基，可以在以上高分子的一 端嵌段共聚一段丙烯胺(AA)成丙烯酸(AAc),以聚異丙基丙烯酰胺-丙烯酰胺-丙烯胺為 例，可以采用白由基聚合法合成，即用N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)和丙稀酰胺(AAm) 作共聚單體、偶氮異二丁腈(A舊N)作引發(fā)劑、乙醇作溶劑，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下60X:時(shí)進(jìn)行自 由基聚合24h,之后再滴加丙烯胺(AA)聚合3.0h,最后將合成的樣品滴入無(wú)水乙醚中使 熱敏型髙分子Poly(NlPAM-co-AAm-6-AA)沉淀析出。
本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)和效果在于能夠制備出一種降低化療毒副作用的熱靶向納米球抗癌藥物載 體。本發(fā)明采用納米球作為藥物載體實(shí)現(xiàn)緩釋、控釋效果，通過在其表面嫁接熱敏型髙分子
實(shí)現(xiàn)熱靶向效果，由于納米球藥物載體經(jīng)過了化學(xué)交聯(lián)固化，因此，具有比熱敏型聚合物膠 束機(jī)械強(qiáng)度高、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)，并且在熱療時(shí)的腫瘤組織處聚集后，熱粑向納米球抗癌藥 物載體表面的親水性髙分子會(huì)發(fā)生收縮，使得熱敏型高分子鏈之間的間隙增大，生物酶更容 易與納米球接觸，從而導(dǎo)致抗癌藥物的釋放會(huì)加快。本發(fā)明制備出的熱粑向納米球抗癌藥物 載體不但解決了化療熱療聯(lián)合應(yīng)用治療癌癥時(shí)化療藥物在癌組織處分布不高的缺點(diǎn)，減少了 化療藥物對(duì)正常組織細(xì)胞的殺傷，還克服了熱敏型聚合物膠束機(jī)械強(qiáng)度不高、穩(wěn)定性不好和 在熱療時(shí)的癌組織處的藥物釋放減慢等缺點(diǎn)。


圖1親水性白蛋白納米球的化學(xué)交聯(lián)固化、希夫堿應(yīng)還原及其與熱敏型高分子
Poly(NPAM《o-AAm-6- AA)的嫁接反應(yīng)。
圖2熱敏型髙分子Poly(NIPAM-co-AAm-6-AA)的合成反應(yīng)。
圖3 共聚物Poly(NIPAM-co-AAm-6-AA)-l (空心三角形)、Poly(NIPAM-co-AAm陽(yáng)6-AA)-2 (空心圓)、Poly(NlPAM國(guó)co-AAm誦6-AAc)-l (實(shí)心三角形)和Poly(NlPAM《o-AAm -6-AAc)-2 (實(shí)心圓)水溶液(C = 5.00xl0-3gcnf3)的透光值的溫度依賴性。
圖4白蛋白納米球的掃描電鏡照片。
圖5不同溫度時(shí)PAN1 、 PAN2、 P-PLN1和P-PLN 2水溶液的水力學(xué)半徑。 圖6包埋有ADR的各種藥物載體的體外釋放行為。
具體實(shí)施例方式
下面通過具體實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但不限制本發(fā)明的內(nèi)容。 實(shí)施例l
1、熱敏型高分子的合成
本發(fā)明涉及到的熱敏型高分子可以是聚異丙基丙烯酰胺、聚甲基乙烯基醚[poly(vinyl methyl ether)]、 聚磷氮稀 (polyphosphazene derivatives )、 聚N-乙烯己內(nèi)酰胺 [poly(N-vinylcaprolactam)]、聚甲硅烷氧基乙二醇[poly(siloxyethylene glycol)]以及上述各物質(zhì) 的衍生物中的一種或幾種(如聚異丙基丙烯酰胺-丙烯酰胺和聚異丙基丙烯酰胺-N,N-二甲基 丙烯酰胺).以帶有數(shù)個(gè)末端氨基的共聚物聚異丙基丙烯酰胺-丙烯酰胺-丙烯胺 [Poly(NIPAM-co-AAm-6-AA)]為例，可采用兩步法合成(圖2)，合成方法采用以A舊N為引 發(fā)劑的自由基聚合。首先，將39.05gNIPAM、 2.95gAAm、 0.20gA舊N和250cm3乙醇加入 內(nèi)有攪拌子的三頸圓底燒瓶，該燒瓶放入溫度為60。C的油浴中，在通氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下攪 拌24h(圖2,a);其次，24h后向反應(yīng)混和物中滴加2cn^AA，之后在相同條件下繼續(xù)瑰抨 3.0h(圖2.b)。最后將所得聚合物滴入乙醚使之沉淀析出，以除去未聚合的單體、引發(fā)劑以 及低聚物，然后真空干燥得Poly(NIPAM-co-AAm-6-AA)-l。2、 納米球藥物載體的制備
本發(fā)明涉及到的納米球的材料可以是蛋白質(zhì)、聚賴氨酸、聚精氨酸、聚谷氨酸、聚大門 冬氨酸、多肽、聚乳酸、聚乙醇酸、聚(乳酸-乙醇酸)、殼聚糖、聚乳酸-聚乙醇、聚(乳 酸-乙醉酸)-聚乙醇、聚己內(nèi)酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚異丁基丙烯鍬酯、聚磷腈以及上述 各物質(zhì)的衍生物中的一種或幾種；納米球藥物載體的制作可采取油包水法，水包油法和 W/O/W復(fù)乳法等三種方法。以人血清白蛋白作為納米球的材料、油包水法作為納米球的制 作方法為例，即將0.6cm3 20wt.% HSA生理鹽水溶液加入30cm3含哲6.0wt.% Arlacel83的環(huán) 己烷中，先攪拌10min,再超聲乳化10min，超聲乳化器(TOMY UD-200)的輸出功率為 165W。加入3.0mL0.34mol/L戊二醛甲苯溶液(0.85mg/mg HSA)來(lái)交聯(lián)固化納米乳滴，固 化時(shí)持續(xù)攪拌24h，之后再加入0.50cm3乙醇胺來(lái)中和過量的醛基(圖1.a),反應(yīng)l.Oh后對(duì) 白蛋白納米球懸濁液進(jìn)行超離心(20000x& 20min),將離心后所得納米球分散于20mL環(huán) 己垸中，并在磁力攪拌的同時(shí)逐滴加入約3.0mL丙酮，直至納米球從環(huán)己垸中析出，超離 心后除去上清液，將納米球樣品真空干燥約1.0 h后溶于含有0.2 M NaBH4的20mL生理鹽 水(希夫堿應(yīng)還原)，攪拌1.0 h后超離心后即可得到親水性白蛋白納米球(albumin nanospheres)，可記為AN。
3、 熱敏型髙分子的嫁接
離心上述生理鹽水洗滌后的納米球后除去上清液,使之分散于lOmL磷酸緩沖液(pH4.0， lOOmM)中，稱量0.25gEDAC和0.30gNHS使之溶于IOmL磷酸緩沖液(冰浴)中，然后 再將EDAC/NHS混合液滴加入白蛋白納米球懸濁液中，混合溶液于室溫下持續(xù)攪拌2.0h; 2.0h后超離心除去上清液即可除去未反應(yīng)的EDAC和NHS,并再將納米球分散于10mL磷 酸緩沖液中，加入5.0mL0.10g/mL的Poly(NIPAM-co-AAm-6-AA)-l溶液，室溫下反應(yīng)3.0h (圖l.b);超離心后將納米球樣品進(jìn)行冷凍干燥，然后-20。C保存。嫁接有 Poly(NlPAM<o-AAm-6-AA)-l的白蛋白納米球可記為PANl。
將20wt.°/。 HSA生理鹽水溶液改為溶有2.5嗎ADR/mg HSA的20wt.% HSA生理鹽水溶 液，用上述相同的實(shí)驗(yàn)方法可制得ADR-AN和ADR-PAN1 ， ADR為抗癌藥物阿霧素。
實(shí)施例2
將實(shí)施例1中熱敏型髙分子合成時(shí)AIBN的用量改為0.10g,其他合成條件均不變，得 合成產(chǎn)物為 Poly(NIPAM-co-AAm-6-AA)-2 。 采用上述同樣方法將 Poly(NIPAM-co-AAm-6-AA)-2嫁接到空白白蛋白納米球(AN)和包埋有抗癌藥阿霉素ADR 的白蛋白納米球ADR-AN表面上，分別得到樣品PAN2和ADR-PAN2。
實(shí)施例3
將實(shí)施例l中納米球的材料改為聚賴貧酸(MW:3-7萬(wàn))，其他條件相同，制得聚賴氨酸 納米球(Polylysi加nanospheres),可記為PLN，最后將所得PLN分散于lOmL磷酸緩沖液 (pH4.0， lOOmM)中。將實(shí)施例1和2中與異丙基丙烯酰胺和丙烯酰胺共聚的2cm3丙烯胺都改為1.45g丙烯酸(AAc ), 合成出 Poly(NlPAM-co-AAm-6-AAc)-l和 Poly(NIPAM-co-AAm-6- AAc)-2。稱量0.25g EDAC和0.30g NHS使之溶于lOmL磷酸緩沖 液(冰浴)中，配制兩份，然后再將兩份EDAC/NHS混合液分別滴加入lO.OmL O.lOg/mL 的Poly(NlPAM-co-AAm-6-AAc)-l溶液和lO.OmL O.lOg/mL的Poly(NlPAM-co-AAm-&-AAc)-2溶液中，混合溶液于室溫下持續(xù)攪拌2.0h,再將兩種混合液分別滴入乙醚中沉淀， 除去上清，再真空干燥24h，即可得到末端羧基活化了的Poly(NIPAM-cO"AAm-6-AAc)-l和 Poly(NIPAM-co-AAm-6-AAc)-2;分別稱量0.5g末端羧基活化了的Poly(NIPAM-co-AAm-A-AAc)-l和Poly(NIPAM-co-AAm-6-AAc)-2，使之分別溶于lOmLPLN的磷酸緩沖液，室溫下 反應(yīng)3.0h,反應(yīng)過程中持續(xù)磁力攪拌超離心后將納米球樣品進(jìn)行冷凍干燥，然后-20。C保 存。嫁接有Poly(NIPAM《o-AAm-6-AAc)-l和Poly(NIPAM《o-AAm-6-AAc)-2的聚賴氨酸納 米球可分別記為P-PLN1和P-PLN2。
熱敏型高分子熱敏行為的測(cè)量
將Poly(NIPAM-co-AAm-6-AAH 、 Poly(NIPAM國(guó)co-AAm-A-AA)-2、 Poly(NIPAM隱co-AAm -fc-AAc)-l和Poly(NIPAM-co-AAm-6-AAc)-2分別配成5.00xl0'3g cm-3的溶液，用分光光度 計(jì)測(cè)量各溶液的透光值T與溫度的關(guān)系及LCST值，取透光值丁=50%時(shí)的溫度為L(zhǎng)CST,結(jié) 果見圖3， Poly(NIPAM-co隱AAm-6-AA)-l、 Poly(NIPAM-co-AAm-6-AA)-2、 Poly(NIPAM-co陽(yáng) AAm-6隱AAc)-l和Poly(NIPAM-co-AAm-6-AAc)-2的LCST為42.6°C、 42.4。C、 41.5。C和 41.1。C。
白蛋白納米球的表面形態(tài)觀察
將待測(cè)樣品通過雙面導(dǎo)電膠粘在樣品臺(tái)上，用減壓鍍金器(JFC-1600 fine coater， JEOL， Jap旭)在壓強(qiáng)低于5Pa時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行鍍金(120A， 20 s),再用掃描電鏡(JSM-6700F, JEOL， Japan)觀察白蛋白納米球的表面形態(tài)，結(jié)果如圖4所示。
熱靶向納米球抗癌藥物載體的水力學(xué)性質(zhì)及其體外藥物釋放 (1)熱靶向納米球抗癌藥物載體的水力學(xué)性質(zhì)
用DLS測(cè)量不同溫度時(shí)的PAN1、 PAN2、 P-PLN1和P-PLN2在純水中的水力學(xué)半徑 及h。每次測(cè)量前樣品溶液都在給定溫度下平衡10min，測(cè)量后加熱到下一個(gè)溫度進(jìn)行下一次 測(cè)量。水力學(xué)半徑/ h是通過Stokes-Einstein方程利用測(cè)得的擴(kuò)散系數(shù)估算出來(lái)的，結(jié)果見 圖5。
結(jié)果顯示，PAN1、 PAN2、 P-PLN1承l(wèi) P-PLN2在純水中的水力學(xué)半徑/ h會(huì)隨著溫度的 升髙而減小,這是因?yàn)榘椎鞍准{米球表面的熱敏型高分子隨著溫度的升高由伸展?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)?了收縮狀態(tài)。通過該實(shí)驗(yàn)即可證明該熱敏型蛋白質(zhì)納米球藥物載體具有較好的熱敏效果，而
且，由于高分子鏈的收縮，高分子鏈之間的間隙會(huì)增大。
(2) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及包埋率的測(cè)量用分光光度計(jì)測(cè)量不同濃度的抗癌藥物阿霉素 (ADR)溶液(都含有4.0mg/mL HSA和20mg/mL胰蛋白酶)的吸光值(ABS值)。參比
溶液為含有4.0mg/mLHSA和20mg/mL胰蛋白酶的水溶液。ADR的濃度分別為0.5、 1.0、 2.5、 5.0、 15.0和30.0ug/mL。通過ADR濃度和ABS值作圖即可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。再稱量24mg 包埋和未包埋ADR的藥物載體,使之溶于6mL 20mg/mL的胰蛋白酶溶液,在37°C降解4.0h, 用分光光度計(jì)測(cè)量降解了的包埋有ADR的藥物載體溶液的ABS值(用降解了的未包埋ADR 的藥物載體溶液作為參比溶液)，通過上述標(biāo)準(zhǔn)曲線可得到相應(yīng)的ADR的濃度，藥物裝載 率和包埋率可通過下述兩個(gè)公式計(jì)算
藥物裝載率=C"g/mL)x6(mL), 24(mg藥物載體)
包埋率=藥物裝載率(pgADR/mg藥物載體)x藥物載體(mg)x!Q0% 一 最初添加的ADR (嫂) X o
(3) 熱耙向納米球抗癌藥物載體的體外釋放
分別兩次稱量30mgADR-AN使之分別分散于37°C的磷酸緩沖液(PBS， pH7.4， lOmM) 和含有0.20mg/mL胰蛋白酶的磷酸緩沖液，再分別兩次稱量30mgADR-PANl和ADR-PAN2 使之分別分散于37nc和43。C的20mL含有0.20mg/mL胰蛋白酶的磷酸緩沖液。將各懸濁 液置于水浴中緩慢攪拌，經(jīng)過預(yù)定時(shí)間間隔對(duì)各樣品進(jìn)行超離心(44卯0xg， 20min)，并且 從上清液中取出l.OmL進(jìn)行分光光度分析(測(cè)量釋放出來(lái)的ADR的濃度)。釋放出來(lái)的ADR 的量占總包埋量(=包埋率*最初添加的ADR的量)的比例為釋放百分比。在37°C的磷酸 緩沖液中和含有0.20mg/mL胰蛋白酶的磷酸緩沖液中ADR-AN的ADR釋放、在37°C和43°C 的含有0.20mg/mL胰蛋白晦的磷酸緩沖液中ADR-PAN1和ADR-PAN2的ADR釋放結(jié)果見 圖6。
結(jié)果顯示(l)在不含胰蛋白酶的磷酸緩沖液中ADR-AN的ADR釋放緩慢，然而，在 含有胰蛋白酶的磷酸緩沖液中ADR-AN的ADR釋放要快得多。原因是胰蛋白酶降解白蛋白 納米球?qū)е箩尫潘俣鹊募涌?2)在37-C時(shí)，ADR-AN的ADR釋放最快，ADR-PAN1的 ADR釋放次之，ADR國(guó)PAN2的ADR釋放最慢，另夕卜，在43。C時(shí)，ADR-PAN1的ADR釋 放也比ADR-PAN2的ADR釋放要快,這說明表面嫁接的熱敏型髙分子的分子量變大會(huì)導(dǎo)致 該載體的藥物釋放變慢,不接有熱敏型髙分子的藥物載體比接有熱敏型高分子的藥物載體的 藥物釋放速度快(3) ADR-PAN1和ADR-PAN2在43°C下的藥物釋放都比在37°C下的藥 物釋放藥要快，這是因?yàn)?3°C大于ADR-PAN1和ADR-PAN2表面嫁接的熱敏型高分于的 LCST，因此，ADR-PAN1和ADR-PAN2表面的親水性聚合物發(fā)生了收縮，使得高分子鏈之 間的間隙增大，從而導(dǎo)致生物酶更容易跟蛋白質(zhì)納米球接觸，因此抗癌藥物的釋放會(huì)加快。
權(quán)利要求
1、一種熱靶向納米球抗癌藥物載體，其特征在于，在可生物降解納米球的表面嫁接具有低臨界溶解溫度的熱敏型高分子，其結(jié)構(gòu)為id="icf0001" file="A2006101442550002C1.gif" wi="62" he="21" top= "38" left = "97" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>
2、 如權(quán)利要求1所述的一種熱靶向納米球抗癌藥物載體，其特征在于，所述的熱敏型高分 子選自于聚異丙基丙烯酰胺、聚甲基乙烯基醚、聚磷氮烯、聚N-乙烯己內(nèi)酰胺、聚甲硅 烷氧基乙二醇以及上述各物質(zhì)的衍生物中的一種或兒種，其低臨界溶解溫度為3743°C。
3、 如權(quán)利耍求1所述的一種熱靶向納米球抗癌藥物載體，其特征在于，所述的納米球的材 料選自于蛋白質(zhì)、聚賴氨酸、聚精氨酸、聚谷氨酸、聚天門冬氨酸、多肽、聚乳酸、聚 乙醇酸、聚(乳酸-乙醇酸)、殼聚糖、聚乳酸-聚乙醇、聚(乳酸-乙醇酸)-聚乙醇、聚 己內(nèi)酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚異丁基丙烯銀酯、聚磔腈以及上述各物質(zhì)的衍生物中的 --種或幾種。
4、 如權(quán)利要求1所述的一種熱靶向納米球抗癌藥物載體，其特征在于，所述的納米球的粒 徑小于800nm,最優(yōu)值為100-200nm。
5、 如權(quán)利要求1所述的一種熱靶向納米球抗癌藥物載體，其特征在于，在溫度高于納米球 表面的熱敏型髙分子的低臨界溶解溫度時(shí)，抗癌藥物的釋放加快。
6、 一種熱耙向納米球抗癌藥物載體的制備方法，其特征在于包括如下步驟1) 用可生物降解材料制作納米球藥物載體2) 在納米球藥物載體的表面共價(jià)交聯(lián)一種熱敏型高分子。
7、 如權(quán)利要求6所述的一種熱耙向納米球抗癌藥物載體的制備方法，其特征在于，所述的 納米球藥物載體的制作可采取如下三種方法1) 油包水法用溶解了親水性抗癌藥和親水性膜材的水溶液作為水相，用溶解了油溶 性乳化劑的有機(jī)溶劑作為油相，將水相與油相混合攪拌進(jìn)行粗分散后，再用超聲波 細(xì)胞破碎機(jī)進(jìn)行乳化，得到油包水型納米乳液，再在磁力攪拌下向所得納米乳液中 加入交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)固化，除去過量的交聯(lián)劑和乳化劑即可得到納米球藥物載體。2) 水包油法用溶解了疏水性抗癌藥和疏水性膜材的有機(jī)溶劑作為油相，用溶解了水 溶性乳化劑的水溶液作為水相，將油相與水相混合攪拌進(jìn)行粗分散后，再用超聲波 細(xì)胞破碎機(jī)進(jìn)行乳化，得到水包油型納米乳液，再在磁力攪拌下向所得納米乳液中 加入交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)固化，除去過量的交聯(lián)劑和乳化劑即可得到納米球藥物載體。3) W/0/W復(fù)乳法用溶解了親水性抗癌藥的水溶液作為水相，用溶解了疏水性膜材和 油溶性乳化劑的有機(jī)溶劑作為油相，將水相與油相混合攪拌進(jìn)行粗分散后，再用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)進(jìn)行乳化，得到油包水型納米乳液，再將所得油包水型納米乳液加入溶有水溶性乳化劑的水相中進(jìn)行超聲乳化，從而得到w/o/w型納米乳液，再在 磁力攪拌下向所得w/o/w型納米乳液中加入交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)hsi化，除去過量的交 聯(lián)劑和乳化劑即可得到納米球藥物載體。
8、 如權(quán)利要求7所述的一種納米球藥物載體的制作方法，其特征在于，所述的膜材的濃度 范圍為1.0%-30.0%(w/v)，最優(yōu)值為20%(w/v)。
9、 如權(quán)利要求7所述的一種納米球藥物載體的制作方法，其特征在于，所述的乳化劑濃度 范圍為0.1%-8.0%(w/v)，最優(yōu)值為6.0%(w/v)。
10、 如權(quán)利要求6所述的一種熱靶向納米球抗癌藥物載體的制備方法，其特征在于，所 述的熱敏型髙分子的制作方法是采用嵌段共聚法在熱敏型高分子的末端引入功能基團(tuán) 氨基或羧基。
11 、 如權(quán)利耍求6所述的一種熱靶向納米球抗癌藥物載體的制備方法，其特征在于，所 述的納米球藥物載體與熱敏型髙分于之間的共價(jià)交聯(lián)是通過功能基團(tuán)羧基與氨基反應(yīng) 形成的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種熱靶向納米球抗癌藥物載體及其制備方法。本發(fā)明采用可生物降解的材料來(lái)制作納米球藥物載體，用于包埋抗癌藥物，以實(shí)現(xiàn)緩釋、控釋作用；在所述的納米球的表面共價(jià)交聯(lián)一種低臨界溶解溫度為37～43℃的熱敏型高分子，熱敏型高分子的嫁接會(huì)導(dǎo)致納米球具有熱靶向癌組織細(xì)胞的功能。表面嫁接了熱敏型高分子的可生物降解納米球藥物載體就是本發(fā)明所述的熱靶向納米球抗癌藥物載體。本發(fā)明制備的熱靶向納米球抗癌藥物載體可在人體內(nèi)長(zhǎng)期循環(huán)不被清除，在熱療時(shí)的癌組織處可加快釋放化療藥物，可解決現(xiàn)有化療藥物在腫瘤組織分布較低的缺陷，降低子化療藥物對(duì)人體正常細(xì)胞的損害。
文檔編號(hào)A61K47/48GK101190334SQ20061014425
公開日2008年6月4日 申請(qǐng)日期2006年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月30日
發(fā)明者強(qiáng) 衛(wèi), 沈折玉, 蘇志國(guó), 馬光輝 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院過程工程研究所