專利名稱：一種抗尿激酶型纖溶酶激活劑受體的抗體樣分子ATF－Fc融合蛋白及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗尿激酶型纖溶酶激活劑受體(uPAR)的抗體樣分子ATF-Fc融合蛋白及其在腫瘤治療中的用途，屬于生物制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
尿激酶型纖溶酶激活劑(urokinase-type plasminogen activator，uPA)是由411個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，包括沒有酶催化活性的單鏈uPA(scu-PA)和有酶催化活性的雙鏈uPA(tcu-PA)，單鏈uPA也稱尿激酶原(Pro-UK)，在纖溶酶、胰蛋白酶和激肽釋放酶等作用下，Lys158-Ile159間的肽鍵斷裂后形成的有激活纖溶酶原功能的雙鏈uPA(即尿激酶，UK)。
天然的uPA是由411個(gè)氨基酸組成的分子量約52-54kD的糖蛋白，有12對二硫鍵，一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(Asn302)和一個(gè)O-糖基化位點(diǎn)(Thr18)，具有三個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域(圖1)(1)類表皮生長因子區(qū)(EGF-like區(qū)，第5-49位氨基酸殘基組成)，主要負(fù)責(zé)與uPA受體(uPAR)結(jié)合；(2)Kringle區(qū)(50-135aa)，可能與趨化活性相關(guān)；(3)絲氨酸蛋白酶活性部位區(qū)，是uPA發(fā)揮其纖維蛋白溶解活性的主要結(jié)構(gòu)域，其中His204、Asp255和Ser356構(gòu)成酶的活性中心。
uPA的EGF-like區(qū)和Kringle區(qū)合稱為ATF(Amino-Terminal Fragment，ATF)。uPA的許多重要功能都與ATF相關(guān)，比如與uPA受體(uPAR)結(jié)合及生物趨化性。uPA一系列重要功能的發(fā)揮有賴于與uPAR(urokinase-type plasminogen activator receptor，uPAR)的結(jié)合。uPAR由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成(D1，D2，D3)，通過糖基磷脂酰肌醇錨定在細(xì)胞表面。D1結(jié)合uPA后，uPAR轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚誀顟B(tài)，具有高度的趨化活性。uPA通過EGF結(jié)構(gòu)域與uPAR結(jié)合，附著在細(xì)胞表面，激活纖溶酶原(plasminogen)，使之轉(zhuǎn)變?yōu)橛写呋钚缘睦w溶酶(plasmin)，繼而plasmin則激活與胞外基質(zhì)降解相關(guān)的酶，如金屬基質(zhì)蛋白酶等，降解胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移。最近很多研究表明，幾乎所有的惡性腫瘤，尤其是晚期，其腫瘤細(xì)胞膜上都過量表達(dá)uPAR，uPA及其受體uPAR在結(jié)腸癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌和肺癌等多種惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。uPA-uPAR系統(tǒng)參與了腫瘤生長、血管生成和轉(zhuǎn)移，uPAR已經(jīng)成為抗癌治療的新的靶標(biāo)。目前國內(nèi)外還沒有研制ATF-Fc融合蛋白的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的主要技術(shù)問題是提供一種安全、有效的抗uPAR的人源抗體類人工蛋白ATF-Fc融合蛋白。
本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種遺傳性狀穩(wěn)定、表達(dá)量高的ATF-Fc融合蛋白的表達(dá)載體。
本發(fā)明要解決的最后一個(gè)問題是提供ATF-Fc融合蛋白和含有編碼該融合蛋白的基因的表達(dá)載體在制備治療癌癥的藥物中的用途。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種ATF-Fc融合蛋白，是uPA的ATF區(qū)(EGF-like區(qū)+Kringle區(qū)，高分子量uPA的第1-134位氨基酸)與人免疫球蛋白IgG1的Fc段(鉸鏈區(qū)(Hinge region)、重鏈恒定區(qū)2(CH2)和重鏈恒定區(qū)3(CH3))通過Ser-Gly-Ser-Gly-Ser接頭(linker)連接形成的二聚體融合蛋白(圖2)，單鏈ATF-Fc分子具有序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，共391個(gè)氨基酸殘基；其中前20個(gè)氨基酸為uPA的信號肽，所以成熟的單鏈ATR-Fc有371aa，二聚體為742aa。
本發(fā)明研制的ATF-Fc融合蛋白是一種anti-uPAR的人源抗體類人工蛋白，ATF負(fù)責(zé)與uPAR結(jié)合，而人IgG1的Fc段則發(fā)揮抗體分子的生理功能，如抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)(ADCC)、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒效應(yīng)(CDC)或免疫調(diào)理作用，從而靶向性殺死uPAR過度表達(dá)的腫瘤細(xì)胞。
編碼具有序列表SEQ ID No.1所示氨基酸序列的ATF-Fc融合蛋白單鏈的基因，具有序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
編碼具有序列表SEQ ID No.1所示氨基酸序列的ATF-Fc的融合蛋白單鏈的基因，包括但不限于SEQ ID No.2。運(yùn)用本領(lǐng)域公知技術(shù)，可以依據(jù)所采用的表達(dá)系統(tǒng)而設(shè)計(jì)其偏好的編碼核苷酸序列以提高表達(dá)效率，例如可采用酵母表達(dá)系統(tǒng)或大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的偏好密碼子等。所有能夠表達(dá)序列表SEQ ID No.1所示氨基酸序列的編碼核苷酸序列均屬于對本發(fā)明的等同替換。另外，運(yùn)用本領(lǐng)域公知技術(shù)，可以運(yùn)用其他linker連接ATF和Fc兩段肽段，甚至可以不用linker連接ATF和Fc。所有包含ATF和人IgG Fc組成的ATF-Fc同源二聚體融合蛋白均視為本發(fā)明的等同蛋白。
含有SEQ ID No.2所示核苷酸序列的表達(dá)載體，這些表達(dá)載體可以是商業(yè)來源的或者經(jīng)過結(jié)構(gòu)改進(jìn)而構(gòu)建得到的。
含有上述表達(dá)載體的細(xì)胞，包括但不限于原核或者真核細(xì)胞，例如大腸桿菌、酵母和CHO細(xì)胞等。
本發(fā)明構(gòu)建的ATF-Fc融合蛋白是采用基因重組技術(shù)在CHO細(xì)胞(中國倉鼠卵巢細(xì)胞)中表達(dá)的，具體過程為(1)ATF基因克隆，以pIRES-dhfr/HMW-ProUK載體為模板(該表達(dá)載體在中國微生物菌種保臧管理委員會普通微生物中心保存，保臧日為2006年2月24日，保藏號為CGMCC No.1623，參據(jù)的微生物株為pIRES-dhff/HMW-ProUK，建議的分類命名為大腸埃希氏菌Escherichia coli，中國發(fā)明專利200610065813.4)，以引物ATFs和ATFx為上下游引物，PCR擴(kuò)增ATF基因，回收ATF基因。
ATFs5’-TGCGCTAGCCCACCATGAGAGCCCTGCTGGCGCG-3’ATFx5’-CGCGGATCCACTTACCTGTACTGCCAGATCCGCTTCCATCTGCGCAGTCATGCAC-3’(2)構(gòu)建ATF-Fc融合蛋白的真核表達(dá)載體，以Nhe I和BamH I雙酶切ATF基因，同時(shí)用Nhe I和BamH I雙酶切載體pcDNA3.1/ATR-Fc(已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存，登記入冊編號為CGMCC No.1399，中國發(fā)明200510084233.5)，回收表達(dá)載體pcDNA3.1/Fc，將回收的兩段DNA用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選陽性克隆進(jìn)行酶切鑒定和雙向序列測定，得到表達(dá)ATF-Fc融合蛋白的真核表達(dá)載體pcDNA3.1/ATF-Fc。
(3)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞并篩選高表達(dá)的陽性克隆，將表達(dá)ATR-Fc融合蛋白的真核表達(dá)載體pcDNA3.1/ATF-Fc用脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染至CHO-K1細(xì)胞中，用G418篩選并獲得ATF-Fc表達(dá)水平為10-15μg/(106cells·d)的基因工程CHO細(xì)胞系A(chǔ)TF-Fc-H6。
(4)細(xì)胞培養(yǎng)并純化重組ATF-Fc蛋白，用轉(zhuǎn)瓶無血清培養(yǎng)ATF-Fc-H6細(xì)胞，收集上清采用蛋白A純化重組蛋白，并用ELISA法鑒定ATF-Fc既具有與anti-uPA多克隆抗體結(jié)合的特性，表明ATF-Fc中的ATF保持了uPA中ATF相同的結(jié)構(gòu)特性，又可以與anti-human IgG1 Fc的多克隆抗體結(jié)合，表明ATF-Fc具有人IgG Fc的結(jié)構(gòu)特性。
(5)細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評價(jià)ATF-Fc抗腫瘤的生物學(xué)活性，用人乳腺癌細(xì)胞系、胃癌細(xì)胞系和食管癌細(xì)胞系評價(jià)了ATF-Fc抑制腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的特性，結(jié)果表明，ATF-Fc對乳腺癌細(xì)胞系有很強(qiáng)的殺傷作用，對胃癌細(xì)胞系有一定的殺傷作用并能抑制細(xì)胞遷移，對食管癌細(xì)胞系沒有殺傷作用，但有一定的抑制其遷移的作用。在裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)中，ATF-Fc表現(xiàn)出較好的抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的療效，并且療效與劑量呈明顯的正相關(guān)性。
本發(fā)明構(gòu)建的ATF-Fc融合蛋白的真核表達(dá)載體pcDNA3.1/ATF-Fc已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存，保藏日期為2006年8月3日，登記入冊編號為CGMCC No.1774，保存的微生物株名稱為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，(地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，中國科學(xué)院微生物研究所，100080)。采用LipofectamineTM2000陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen Co)將該載體(CGMCCNo.1774)轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞(ATCCNo.CRL9096)，經(jīng)G418篩選克隆獲得了表達(dá)水平較高的表達(dá)ATF-Fc的基因工程CHO細(xì)胞系A(chǔ)TF-Fc-H6，該細(xì)胞系的表達(dá)水平約10-15μg/(106cells·d)，并且連續(xù)傳代培養(yǎng)1年，表達(dá)水平?jīng)]有變化。
ATF-Fc融合蛋白和用于表達(dá)ATF-Fc的真核表達(dá)載體真核表達(dá)載體pcDNA3.1/ATF-Fc(CGMCC No.1774)用于制備治療腫瘤的藥物的用途。
所述腫瘤為乳腺癌、胃癌及其他uPAR高表達(dá)腫瘤。
本發(fā)明的尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)與其受體(uPAR)結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域ATF與人免疫球蛋白IgG1的重鏈恒定區(qū)Fc連接形成的ATF-Fc融合蛋白可用于制備uPAR過量表達(dá)的腫瘤的治療藥物的應(yīng)用。
由于ATF-Fc融合蛋白既保留了uPA中與uPAR結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域ATF，又缺失了uPA中激活纖溶酶原(plasminogen)的酶活性中心，這樣ATF-Fc可與uPA競爭性結(jié)合uPAR，阻止uPA與uPAR結(jié)合，阻斷plasminogen的活化，從而抑制了胞外基質(zhì)的降解和細(xì)胞的遷移。另一方面，由于ATF-Fc具有Fc段，結(jié)合到uPAR高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞表面后，可以通過CDC效應(yīng)、ADCC效應(yīng)、促進(jìn)吞噬作用及誘發(fā)細(xì)胞凋亡等作用，殺死腫瘤細(xì)胞，即ATF-Fc與anti-uPAR的人源抗體具有相同功能，只是ATF-Fc具有更高的親和力，并且封閉的uPAR位點(diǎn)正是與uPA結(jié)合的區(qū)域，因而較anti-uPAR抗體具有更好的療效。細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)ATF-Fc可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞和胃癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，該融合蛋白值得進(jìn)一步研究并開發(fā)成治療乳腺癌、胃癌細(xì)胞及其他uPAR過度表達(dá)的腫瘤的抗體類藥物。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是這種融合蛋白可與抗原高親和力結(jié)合，相當(dāng)于抗體的Fab片段，而Fc段又提供了抗體的生物學(xué)活性，它有以下特點(diǎn)(1)無抗原性，ATF和Fc兩段蛋白均來自人體；(2)親和力高，一般配體和受體的親和力都較高(Kd～10-10M)，uPA與uPAR結(jié)合的親和常數(shù)Kd～10-10M；(3)封閉位點(diǎn)特異，由于uPAR有308aa，具有多個(gè)抗原表位，因此有可能篩到高親和力的anti-uPAR單克隆抗體可能不能阻止uPA與uPAR結(jié)合，而ATF-Fc特異性封閉uPAR結(jié)合uPA的結(jié)構(gòu)域，從而阻止uPA與uPAR的結(jié)合；(4)也具有抗體的ADDC效應(yīng)和CDC效應(yīng)；(5)半衰期長，與人源抗體相近(10～20天左右)。
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，不以任何方式限制本發(fā)明的實(shí)施。凡是依照本發(fā)明公開的內(nèi)容進(jìn)行的任何本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。


圖1為尿激酶型纖溶酶原激活劑(u-PA)一級結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為ATF-Fc結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3為真核表達(dá)載體pcDNA3.1/ATF-Fc Nhe I/Xho I酶切鑒定電泳圖。
圖4-A為獲得的rCHO工程細(xì)胞系A(chǔ)TF-Fc-H6的形態(tài)圖。
圖4-B為篩選到的32個(gè)單克隆細(xì)胞測定其表達(dá)ATF-Fc水平的ELISA照片。
圖5為SDS-PAGE檢測純化的ATF-Fc蛋白。
圖6-A為ATF-Fc融合蛋白殺傷乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的實(shí)驗(yàn)中正常生長的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7。
圖6-B為ATF-Fc融合蛋白殺傷乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)基中ATF-Fc濃度為1.25μg/ml時(shí)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的形態(tài)，可見所有細(xì)胞已萎縮凋亡。
圖6-C為ATF-Fc融合蛋白殺傷乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)基中ATF-Fc濃度為2.5μg/ml時(shí)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的形態(tài)，可見所有細(xì)胞已萎縮凋亡。
圖6-D為ATF-Fc融合蛋白殺傷乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)基中ATF-Fc濃度為5μg/ml時(shí)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的形態(tài)，可見所有細(xì)胞已萎縮凋亡。
圖7為ATF-Fc融合蛋白對幾種腫瘤細(xì)胞遷移的抑制試驗(yàn)結(jié)果。
圖8-A為ATF-Fc融合蛋白抑制胃癌細(xì)胞BGC-823遷移試驗(yàn)顯示未加入ATF-Fc融合蛋白的對照組試驗(yàn)結(jié)果，有新生腫瘤細(xì)胞遷移到劃痕處生長。
圖8-B為ATF-Fc融合蛋白抑制胃癌細(xì)胞BGC-823遷移試驗(yàn)顯示加入ATF-Fc融合蛋白的試驗(yàn)組，無新生腫瘤細(xì)胞，表明能夠抑制腫瘤細(xì)胞遷移。
圖8-C為ATF-Fc融合蛋白抑制胃癌細(xì)胞BGC-823遷移試驗(yàn)顯示加入Pro-UK的試驗(yàn)組，有大量新生腫瘤細(xì)胞遷移到劃痕處生長，提示Pro-UK誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞遷移。
圖8-D為ATF-Fc融合蛋白抑制胃癌細(xì)胞BGC-823遷移試驗(yàn)顯示加入ATF-Fc融合蛋白和Pro-UK的試驗(yàn)組，沒有新生腫瘤細(xì)胞遷移到劃痕處生長，提示ATF-Fc融合蛋白抑制了Pro-UK誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞遷移。
圖9為ATF-Fc融合蛋白對裸鼠接種胃癌細(xì)胞BGC-823抑制腫瘤生長的作用結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
試驗(yàn)材料及來源感受態(tài)大腸桿菌DH5α購自天為時(shí)代公司，CHO-K1細(xì)胞株(ATCC No.CRL 9096)、dhfr基因、pro-UK基因本研究室保存(中國專利CN96119836.2)、質(zhì)粒pUC19(TakaraBiotechnology Co.，產(chǎn)品號No.D3219)，pcDNA3.1真核表達(dá)載體(Invitrogen公司)，源自基因組(含有內(nèi)含子)的編碼人免疫球蛋白IgG1Fc段(鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū))的基因(美國R&D Systems公司，載體名為pIG1，產(chǎn)品編號為pIg vectors，MBV-002-10)。
限制性內(nèi)切酶Nhe I、BamH I、Hind III、Xho I和Not I等購自NEB公司，T4 DNA連接酶及高保真Taq酶Pyrobest購自寶生物工程有限公司(TaKaRa)。質(zhì)粒提取、PCR產(chǎn)物回收及酶切產(chǎn)物回收試劑盒均購自Promega公司。DNA Marker購自天為時(shí)代公司。
DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基及加強(qiáng)型小牛血清購自Hyclone公司；無血清培養(yǎng)基添加物為本室配制(中國專利ZL 200310124257.X)；G418購自Sigma公司；LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；酶聯(lián)檢測儀為Bio-Rad550；nProtein A Sepharose4Fast Flow分離介質(zhì)購自Amersham Bioscience。
所有寡核苷酸的引物合成均由中國英駿生物技術(shù)公司完成(China Invitrogen公司)。
實(shí)施例1.ATF基因的克隆及pcDNA3.1/ATF-Fc真核表達(dá)載體構(gòu)建以pIRES-dhfr/HMW-ProUK載體為模板(該表達(dá)載體在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存，保藏日為2006年2月24日，保藏號為CGMCC No.1623，參據(jù)的微生物株為pIRES-dhfr/HMW-ProUK，建議的分類命名為大腸埃希氏菌Escherichia coli，中國發(fā)明專利申請?zhí)枮?00610065813.4)，以引物ATFs和ATFx為上下游引物，PCR擴(kuò)增ATF基因，回收ATF基因。
ATFs5’-TGCGCTAGCCCACCATGAGAGCCCTGCTGGCGCG-3’ATFx5’-CGCGGATCCACTTACCTGTACTGCCAGATCCGCTTCCATCTGCGCAGTCATGCAC-3’PCR反應(yīng)體系為8μL dNTP(2.5mmol/L)、0.5μL Pyrobest聚合酶、2μLpIRES-dhfr/HMW-ProUK載體、10μL 10×Buffer、2μL ATFs上游引物(10μmol/L)、2μL ATFx下游引物(10μmol/L)、75.5μL水，總反應(yīng)體系為100μL，PCR反應(yīng)條件94℃，2min(預(yù)變性)→[94℃，30s→60℃，60s→72℃，1min]×25循環(huán)→72℃，5min→4℃，5min。用0.8％-1％低熔點(diǎn)瓊脂糖膠回收PCR產(chǎn)物(Promega，Agarose LMP)。
PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收的ATF基因用Nhe I和BamH I雙酶切，同時(shí)用Nhe I和BamHI雙酶切載體pcDNA3.1/ATR-Fc(已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存，登記入冊編號為CGMCC No.1399，中國發(fā)明專利申請?zhí)枮?00510084233.5)，回收表達(dá)載體pcDNA3.1/Fc，將回收的兩段DNA用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆經(jīng)搖瓶培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后用引物進(jìn)行酶切鑒定和雙向序列測定，泳結(jié)果表明ATF-Fc基因片段大小約2000bp(圖3)，測序結(jié)果證明，ATF-Fc重組基因序列與設(shè)計(jì)基因完全一致，該基因含有NheI和BamHI酶切位點(diǎn)、Kozak序列、ATF基因，得到表達(dá)ATF-Fc融合蛋白的真核表達(dá)載體pcDNA3.1/ATF-Fc。
實(shí)施例2.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染與細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)染采用Invitrogen公司生產(chǎn)的LipofectamineTM2000陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒，按照試劑盒說明書操作。轉(zhuǎn)染的CHO-K1細(xì)胞培養(yǎng)于5％CO2、37℃溫箱。轉(zhuǎn)染12h后，換含10％加強(qiáng)型小牛血清(Hyclone)的DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone)。48h后，采用750μg/mL G418(Sigma)篩選培養(yǎng)基加壓篩選，每2-3d換液一次，加壓約12d后，將抗性細(xì)胞克隆用0.25％的胰酶消化，用有限稀釋法在96孔微孔細(xì)胞培養(yǎng)板(NUNC公司)中進(jìn)行單克隆化培養(yǎng)，即用含10％小牛血清和300μg/mL G418的DMEM/F12培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至10個(gè)/mL，在每個(gè)微孔中接種200μL培養(yǎng)基(平均每個(gè)孔中含有約2個(gè)細(xì)胞)，2周后出現(xiàn)細(xì)胞克隆。換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3d，收集培養(yǎng)上清以直接競爭ELISA挑選陽性克隆，即將無血清培養(yǎng)上清直接包被NUNCTM酶聯(lián)板4℃過夜，3％BSA封閉后加入HRP標(biāo)記山羊抗人IgG(H+L)，孵育后加入TMB試劑顯色，405nm測OD值(圖4-B)。以無血清培養(yǎng)基為陰性對照，表達(dá)水平較高的細(xì)胞克隆出現(xiàn)的幾率約為10％-20％(圖4(B))。
選擇表達(dá)水平最高的基因重組CHO工程細(xì)胞系A(chǔ)TF-Fc-H6(圖4-A)于1000mL轉(zhuǎn)瓶中用含2％小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃，待細(xì)胞長滿瓶壁時(shí)(約3天)，換為無血清培養(yǎng)基(中國專利ZL200310124257.X)，隔天收液，可連續(xù)收液3-4次(培養(yǎng)方法請參考高麗華，胡顯文，陳薇等.炭疽毒素受體與人IgG1的Fc段融合蛋白在CHO細(xì)胞中的表達(dá).生物工程學(xué)報(bào)，2005，21(5)826)。
實(shí)施例3.表達(dá)蛋白的純化及SDS-PAGE分析收集的ATF-Fc-H6無血清培養(yǎng)上清用蛋白A親和層析柱(Pharmacia)分離純化。利用蛋白A對IgG的特異性吸附作用，采用nProtein A Sepharose 4 Fast Flow分離介質(zhì)(Amersham Biosciences)進(jìn)行親和層析，純化表達(dá)蛋白。操作方法參見產(chǎn)品說明。結(jié)合的蛋白用pH2.5、0.1mol/L甘氨酸-HCl緩沖液洗脫，有一明顯的洗脫峰(圖4(A))，洗脫成分用2mol/L的Tris-HCl緩沖液將洗脫液pH調(diào)至7。純化后，以紫外分光光度計(jì)測定A260和A280吸光度推算蛋白濃度，蛋白定量公式為蛋白含量(mg/mL)＝1.45×A260-0.74×A280。以SDS-PAGE測定蛋白的純度、分子量。
如果ATF-Fc融合蛋白能夠在CHO細(xì)胞中正確表達(dá)，表達(dá)的蛋白預(yù)計(jì)應(yīng)是同源二聚體抗體樣分子，即ATF-Fc單鏈在Hinge區(qū)通過鏈間二硫鍵連接成二聚體。單鏈ATF-Fc分子共有391個(gè)氨基酸殘基。由于Fc段有糖基化位點(diǎn)，因此單鏈ATF-Fc的分子量預(yù)期在45-50kD。親和層析純化得到的ATR-Fc融合蛋白，分別在還原和非還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE分析，考馬斯亮藍(lán)染色。在非還原條件下，在97kD處有一條蛋白帶，而在還原條件下，在45kD處有一條明顯的蛋白帶，并且沒有其他的蛋白帶(圖5)。由于還原條件下所有二硫鍵包括鏈間二硫鍵都被打斷，測得的分子量為單鏈ATF-Fc分子，而非還原條件下不同肽鏈仍通過二硫鍵連接，在非還原條件下的分子量正好是還原條件下分子量的兩倍，表明我們獲得的ATF-Fc融合蛋白為同源二聚體抗體樣分子，與預(yù)期的結(jié)果相符。
實(shí)施例4.生物學(xué)活性一ATF-Fc融合蛋白對乳腺癌細(xì)胞MCF-7的殺傷效應(yīng)為了檢測所表達(dá)的ATF-Fc融合蛋白是否具有殺傷腫瘤細(xì)胞的效果，做了腫瘤細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)。方法在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar公司產(chǎn)品)中用含10％的胎牛血清(Hyclone公司產(chǎn)品)的DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞MCF-7(ATCC，Cat.No.HTB-22)，37℃培養(yǎng)，待細(xì)胞長到融合率80％時(shí)，加入ATF-Fc蛋白(終濃度分別為1.25、2.5和5μg/ml)，繼續(xù)在37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，觀察ATF-Fc對細(xì)胞的殺傷效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)幾乎100％的乳腺癌細(xì)胞被殺死，而對照組的乳腺癌細(xì)胞生長正常(圖6-A至圖6-D)，證明我們構(gòu)建的ATF-Fc融合蛋白有著很強(qiáng)的殺傷乳腺癌細(xì)胞MCF-7的作用。因此本發(fā)明可用于人乳腺癌治療的抗體類藥物的開發(fā)。
實(shí)施例5.生物學(xué)活性二ATF-Fc融合蛋白對幾種腫瘤細(xì)胞遷移的抑制效應(yīng)由于uPAR在腫瘤細(xì)胞的遷移中起著舉足輕重的作用，封閉uPAR可能會抑制腫瘤細(xì)胞的遷移。ATF-Fc具有封閉uPAR的作用，觀察了ATF-Fc對腫瘤細(xì)胞遷移的影響。
方法分別在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar公司產(chǎn)品)中用含10％的胎牛血清(Hyclone公司產(chǎn)品)的DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、胃癌細(xì)胞系BGC-823(可通過以下實(shí)驗(yàn)室獲得，Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro c/o CBA(ICLC，Genova)，細(xì)胞系編號為ICLC HTL98007，www.biotech.ist.unige.it/cldb/cl4930.html)和食管癌細(xì)胞系EC109細(xì)胞株(購自中科院上海細(xì)胞所)。37℃培養(yǎng)，待細(xì)胞長到融合率80％時(shí)，劃痕，加入ATF-Fc蛋白(終濃度為5μg/ml)，設(shè)立pro-UK(來源中國專利CN96119836.2)和低分子量UK(來源中國專利200610065813.4)(終濃度均為1μg/ml)對照組，繼續(xù)在37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，觀察ATF-Fc對細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果(見圖7和圖8)(1)對于乳腺癌細(xì)胞MCF-7，只要含有ATF-Fc融合蛋白的培養(yǎng)孔，其中的細(xì)胞均死亡，無法觀察ATF-Fc抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7的遷移，而加入pro-UK和UK的對照組，所有的乳腺癌細(xì)胞均存活，并且密度很高，而且劃痕處有新長出的細(xì)胞，說明pro-UK和UK均能刺激乳腺癌細(xì)胞MCF-7的生長和遷移；(2)對于胃癌細(xì)胞，經(jīng)過24小時(shí)培養(yǎng)后，含有ATF-Fc融合蛋白的培養(yǎng)孔有部分細(xì)胞被殺死，其中的細(xì)胞在劃痕處均無新生長的細(xì)胞，說明ATF-Fc有很強(qiáng)的抑制胃癌細(xì)胞遷移并有一定的殺傷作用，培養(yǎng)48小時(shí)后殺傷效應(yīng)表現(xiàn)更顯著，相反，沒有加入ATF-Fc的培養(yǎng)孔，尤其是加入了pro-UK或UK的培養(yǎng)孔，其中的細(xì)胞生長致密，并且劃痕處長出了許多新細(xì)胞，說明pro-UK和UK能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移；(3)對于食管癌細(xì)胞，無論是否含有ATF-Fc，細(xì)胞的生長均不受抑制，而ATF-Fc能輕微抑制鼻咽癌細(xì)胞的遷移。本實(shí)驗(yàn)表明ATF-Fc具有很強(qiáng)的抑制胃癌細(xì)胞遷移的作用，可用于開發(fā)治療乳腺癌和胃癌的生物技術(shù)藥物。
實(shí)施例6.生物學(xué)活性三ATF-Fc融合蛋白對裸鼠接種胃癌細(xì)胞BGC-823抑制腫瘤生長的作用選擇對ATF-Fc中度敏感的胃癌細(xì)胞BGC-823做荷瘤實(shí)驗(yàn)，選擇的理由是如果ATF-Fc在小鼠體內(nèi)對胃癌細(xì)胞具有很強(qiáng)的抑制生長和轉(zhuǎn)移的作用，可以推測，ATF-Fc對于乳腺癌應(yīng)具有更好的療效。方法取對數(shù)生長期的BGC-823細(xì)胞，用新鮮培養(yǎng)液DMEM(Hyclone)配制成5×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，每只小鼠腋皮下接種0.2ml，接種后小鼠隨機(jī)分為生理鹽水組、CTX(環(huán)磷酰胺)組(100mg/kg)，ATF-Fc 100、40和8mg/kg三個(gè)劑量組，共5組，每組7只小鼠。待腫瘤長至約0.3cm×0.3cm體積大小是給藥，給藥方式隔日皮下注射，共7次。給藥體積為0.2ml/20g體重，末次給藥后2天脫頸處死動(dòng)物，解剖取瘤塊，稱瘤重，根據(jù)以下公式計(jì)算腫瘤生長抑瘤率

ATF-Fc在劑量100、40、8mg/kg時(shí)，隔日皮下注射7次，對裸鼠BGC-823胃癌的抑瘤率分別為73.59、60.92、53.87％，結(jié)果見表1和圖9。該結(jié)果表明，ATF-Fc在體內(nèi)具有抑制胃癌生長的作用。
表1ATF-Fc連續(xù)皮下注射對裸鼠BGC-823胃癌的療效

本發(fā)明提供了一種治療晚期惡性腫瘤的、安全、有效的抗uPAR的的人源抗體類ATF-Fc融合蛋白。
序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院<120>一種抗尿激酶型纖溶酶激活劑受體的抗體樣分子ATF-Fc融合蛋白及其用途<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>391<212>PRT<213>人屬，人種<220>
<221>uPA的信號肽<222>(1)..(20)<400>1Met Arg Ala Leu Leu Ala Arg Leu Leu Leu Cys Val Leu Val Val Ser1 5 10 15Asp Ser Lys Gly Ser Asn Glu Leu His Gln Val Pro Ser Asn Cys Asp20 25 30Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Val Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn Ile35 40 45His Trp Cys Lys Cys Pro Lys Lys Phe Gly Gly Gln His Cys Glu Ile50 55 60Asp Lys Ser Lys Thr Cys Tyr Glu Gly Asn Gly His Phe Tyr Arg Gly65 70 7580Lys Ala Ser Thr Asp Thr Met Gly Arg Pro Cys Leu Pro Trp Asn Ser
85 90 95Ala Thr Val Leu Gln Gln Thr Tyr His Ala His Arg Ser Asp Ala Leu100 105110Gln Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Arg115120 125Arg Arg Pro Trp Cys Tyr Val Gln Val Gly Leu Lys Pro Leu Val Gln130 135 140Glu Cys Met Val His Asp Cys Ala Asp Gly Ser Gly Ser Gly Ser Glu145 150155160Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro165170175Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys180 185190Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val195 200205Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp210215220Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr225 230 235240Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp245 250255Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu260 265270Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg275 280 285Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys290 295300Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp305 310315320Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
325 330335Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser340345350Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser355 360365Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser370 375380Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys385 390<210>2<211>1176<212>DNA<213>人屬，人種<400>2atgagagccc tgctggcgcg cctgcttctc tgcgtcctgg tcgtgagcga ctccaaaggc60agcaatgaac ttcatcaagt tccatcgaac tgtgactgtc taaatggagg aacatgtgtg120tccaacaagt acttctccaa cattcactgg tgcaagtgcc caaagaaatt cggagggcag180cactgtgaaa tagataagtc aaaaacctgc tatgagggga atggtcactt ttaccgagga240aaggccagca ctgacaccat gggccggccc tgcctgccct ggaactctgc cactgtcctt300cagcaaacgt accatgccca cagatctgat gctcttcagc tgggcctggg gaaacataat360tactgcagga acccagacaa ccggaggcga ccctggtgct atgtgcaggt gggcctaaag420
ccgcttgtcc aagagtgcat ggtgcatgac tgcgcagatg gaagcggatc tggcagtgag480cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg540ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc600cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac660tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac720aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc780aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc840tccaaagcca aaggtcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat900gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac960atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc1020gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg1080tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac1140acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatga 117權(quán)利要求
1.一種ATF-Fc融合蛋白，其特征在于它是uPA的ATF區(qū)與人免疫球蛋白IgG1的Fc段、重鏈恒定區(qū)2和重鏈恒定區(qū)3通過Ser-Gly-Ser-Gly-Ser接頭連接形成的二聚體融合蛋白，具有742個(gè)氨基酸；單鏈ATF-Fc分子具有序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，其中前20個(gè)氨基酸為uPA的信號肽。
2.編碼具有序列表SEQ ID No.1所示氨基酸序列的ATF-Fc的融合蛋白單鏈的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼具有序列表SEQ ID No.1所示氨基酸序列的ATF-Fc的融合蛋白單鏈的基因，其特征在于具有序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
4.含有SEQ ID No.2所示核苷酸序列的表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于所述表達(dá)載體保存在大腸埃希氏菌中，保藏號為CGMCC No.1774。
6.含有權(quán)利要求4或5所述的表達(dá)載體的細(xì)胞。
7.權(quán)利要求1所述的ATF-Fc融合蛋白用于制備治療腫瘤的藥物的用途。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的ATF-Fc融合蛋白用于制備治療腫瘤的藥物的用途，其特征在于所述腫瘤為乳腺癌、胃癌及其他uPAR高表達(dá)腫瘤。
9.權(quán)利要求4或5所述的表達(dá)載體用于轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞制備治療腫瘤的藥物的用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備治療腫瘤的藥物的用途，其特征在于所述腫瘤為乳腺癌、胃癌及其他uPAR高表達(dá)腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗尿激酶型纖溶酶激活劑受體的抗體樣分子ATF－Fc融合蛋白及其應(yīng)用，屬于生物制藥領(lǐng)域。一種ATF－Fc融合蛋白，它是uPA的ATF區(qū)與人免疫球蛋白IgG1的Fc段、重鏈恒定區(qū)2和重鏈恒定區(qū)3通過Ser－Gly－Ser－Gly－Ser接頭連接形成的二聚體融合蛋白，具有742個(gè)氨基酸；單鏈ATF－Fc分子具有序列表SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列，其中前20個(gè)氨基酸為uPA的信號肽。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是無抗原性、親和力高、封閉位點(diǎn)特異、具有抗體的ADDC效應(yīng)和CDC效應(yīng)、半衰期長，與人源抗體相近、可抑制過度表達(dá)uPAR的腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。本發(fā)明提供了一種治療晚期惡性腫瘤的、安全、有效的抗uPAR的的人源抗體類ATF－Fc融合蛋白。
文檔編號A61K38/17GK1919874SQ20061011317
公開日2007年2月28日 申請日期2006年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月18日
發(fā)明者胡顯文, 高麗華, 段海峰, 陳惠鵬, 陳金龍, 殷亮, 潘淑媛, 郗永又 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所