專利名稱::多肽及蛋白藥物的聚乙二醇偶合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明涉及聚乙二醇通過氨基酸或寡肽的連接子與胸腺五肽、胸腺素Cd、干擾素(IFN)或白介素等多肽或蛋白類藥物的連接形成的偶合物;這種偶合物在體內(nèi)能夠緩慢釋放活性多肽分子發(fā)揮藥理作用。
背景技術(shù):
:多肽和蛋白類藥物如奧曲肽、T-20、胸腺素od(TaJ,降4丐素,干擾素(IFN),白介素(IL)等在臨床得到越來越廣泛的應(yīng)用。但是,該類藥物口服無效,在體內(nèi)易被酶解失活,生物半衰期短,影響了其藥理作用的發(fā)揮。聚乙二醇(PEG)是具有良好的生物兼容性的中性聚合物,具有高度的親水性,在水溶液中有較大的水動(dòng)力學(xué)體積,并且沒有免疫原性。將PEG與多肽和蛋白類藥物分子偶聯(lián)后,能夠提高藥物在血漿中的穩(wěn)定性,減少藥物的酶解;避免免疫系統(tǒng)對(duì)藥物的識(shí)別和清除,降低免疫原性;同時(shí)避免藥物在腎臟的代謝清楚,從而顯著延長多肽或蛋白類藥物在體內(nèi)的半衰期。目前PEG對(duì)多肽或蛋白的化學(xué)修飾均是通過PEG的活性衍生物與藥物分子中的氨基形成酰胺鍵或氨基甲酸酯鍵。由于蛋白或多肽分子中存在多個(gè)氨基,因此得到的偶合物是多種交聯(lián)產(chǎn)物的混合物。而且,由于對(duì)活性位點(diǎn)的直接修飾或空間位阻作用,被修飾藥物的生物活性損失較大。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供聚乙二醇通過氨基酸或寡肽的連接子與多肽或蛋白類藥物的連接形成的偶合物。通過選擇適當(dāng)?shù)倪B接子可以保持偶合物在血漿中的穩(wěn)定性;到達(dá)靶組織后,連接子可以在細(xì)胞內(nèi)解離,釋放活性形式的多肽或蛋白分子,產(chǎn)生藥理作用。本發(fā)明一方面提供式I所示的聚乙二醇衍生物通過氨基酸或寡肽的連接子與多肽或蛋白分子中的氨基連接形成的偶合物CH30-PEG-0CH2C0NH-(AA)n-CONH-PI本發(fā)明另一方面提供式II所示的聚乙二醇衍生物通過氨基酸或寡肽的連接子與多肽或蛋白分子中的氨基連接形成的偶合物CH30-PEG-OCH2CH2OCONH-(AA)-CONH-PII本發(fā)明還提供式m所示的聚乙二醇衍生物通過氨基酸或寡肽的連接子與多肽分子中的羧基連接形成的偶合物CH30-PEG-OCH2CH「NHCO-(AA)n-NHCO-PIII式I中,PEG代表平均分子量5000-40000的聚乙二醇,AA代表L-殺^基酸殘基,P代表胸腺五肽、胸腺素cx,、干擾素(IFN)或白介素等多肽或蛋白藥物;n為1-6的整數(shù)。本發(fā)明還提供含有式I、II或III所示的聚乙二醇與多肽或蛋白的偶合物作為活性成分的藥物組合物。本發(fā)明最后還提供本發(fā)明還提供式i、n或m所示的聚乙二醇與多肽或蛋白的偶合物,以及含有式i、n或in所示的聚乙二醇與多肽或蛋白的偶合物作為活性成分的藥物組合物作為藥物的用途。具體實(shí)施例方式本發(fā)明中聚乙二醇與多肽或蛋白的偶合物的制備可以分為聚乙二醇衍生物的合成及其與多肽或蛋白的交聯(lián)兩個(gè)部分。式I所示的偶合物可以按照如下方法制備單甲氧基聚乙二醇在叔丁醇鉀作用下,與溴乙酸乙酯反應(yīng);反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)氫氧化鈉水解,然后將水解產(chǎn)物酸化,得到羧甲基取代的單曱氧基聚乙二醇衍生物CH30-PEG-OCH2COOH;通過接肽反應(yīng),制備寡肽衍生物CH30-PEG-OCH2CONH-(AA)n-COOH;CH30-PEG-OCH2CONH-(AA)n-COOH可以通過接肽反應(yīng)與多肽的末端氨基連接,形成偶合物CH30-PEG-OCH2CONH-(AA)N-CONH-P(I);也可以將CH30-PEG-OCH2CONH-(AA)n-C00H與N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)成活潑酯CH30-PEG-0CH2C0NH-(AA)n-C00Su,后者再與多肽或蛋白分子中的游離氨基連接,形成偶合物CH30-PEG-0CH2C0NH-(AA)n-CONH-P(I)。式II所示的偶合物可以按照如下方法制備單甲氧基聚乙二醇與光氣反應(yīng)得到單甲氧基聚乙二醇的氯曱酸酯衍生物CH30-PEG-OCH2CH2OCOCl,再與氨基酸分子中的氨基反應(yīng),形成氨基甲酸酯衍生物CH30-PEG-OCH2CH2OCONH-AA-COOH;后者通過接肽反應(yīng),制備寡肽衍生物CH30-PEG-OCH2CH2OCONH-(AA)n-COOH;CH30-PEG-OCH2CH2OCONH-(AA)n-COOH可以通過接肽反應(yīng)與多肽的末端氨基連接,形成偶合物CH30-PEG-OCH2CH2OCONH-(AA)n-CONH-P(II);也可以將CH30-PEG-OCH2CH2OCONH-(AA)n-COOH與N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)成活潑酯CH30-PEG-OCH2CH2OCONH"(AA)n-COOSu,后者再與多肽或蛋白分子中的游離氨基連接,形成偶合物CH30-PEG-OCH2CH2OCONH-(AA)n-CONH-P(II)。式III所示的偶合物可以按照如下方法制備單甲氧基聚乙二醇與對(duì)曱苯磺酰氯反應(yīng),得到單甲氧基聚乙二醇的對(duì)甲苯磺酸酯衍生物CH30-PEG-OCH2CH2-OTs,再與鄰苯二曱酰亞胺鉀反應(yīng),將反應(yīng)產(chǎn)物水解得到單甲氧基聚乙二醇的氨基衍生物CH30-PEG-OCH2CH2-NH2。后者通過接肽反應(yīng),制備寡肽衍生物CH30-PEG-0CH2CH廠NHC0-(AA)n-NH2;最后通過接肽反應(yīng)與多肽的末端羧基連接,形成偶合物CH30-PEG-OCH2C&-NHCO-(AA)n-NHCO-P。在本發(fā)明中使用的下列英文縮寫詞及其含義如下TP5,胸腺五肽;PEG,聚乙二醇;Arg,精氨酸;Asp,天冬氨酸;Tyr,酪氨酸;Val,纈氨酸;Fmoc,芴曱氧羰基;DCC,二環(huán)已基碳二亞胺;HOBT,l-羥基苯并三唑;HBTU,2-(lH-1-羥基苯并三唑)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸;IFN-a2b,a2b干擾素;N醒,N-甲基嗎啡啉;rhIL-2,重組人白介素-2;TFA,三氟乙酸;Ts-CI,對(duì)甲苯磺酰氯;RP-HPLC,反相高效液相色譜。下面的實(shí)施例可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述,然而,這些實(shí)施例不應(yīng)作為對(duì)本發(fā)明的范圍的限制。實(shí)施例1CH30-PEG5M。-OCH2CONH-Ala-Leu-CONH-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH(U的制備1.1CH30-PEG5。。。-0CH2C00H的制備將單甲氧基聚乙二醇(MW5000)20.0g(4mmol)加到安裝了分水器的圓底燒瓶中,加入曱苯溶解,蒸餾,并不斷補(bǔ)充干燥的曱苯,在油浴中加熱回流,至無水分蒸出.。4敬去分水器,加入8mmo1的4又丁醇鉀,回流反應(yīng)1小時(shí)。然后緩慢加入8mmo1的溴乙酸乙酯,回流反應(yīng)6小時(shí)。過濾,將濾液減壓蒸干,用CH2Cl2溶解殘留物,加無水乙醚沉淀出固體,濾集固體,溶于水中,緩慢加入0.1N的氫氧化鈉溶液,至pH達(dá)到10,室溫?cái)嚢?小時(shí)。然后用0.1N的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至3,用等體積的三氯甲烷提取3次,合并提取液,用無水疏酸鈉干燥,過濾,將濾液減壓濃縮,加無水乙醚沉淀,濾集固體,得CH30-PEG5。。。-0CH2C00H12.5g。1.2CH30-PEG5。。。-0CH2C0NH-Ala-Leu-OSu的制備將CH30-PEG5。M-OCH2COOH溶于干燥的四氫呋喃中,加入5倍摩爾量L-丙氨酸甲酯,5倍摩爾量的DCC,室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜,然后緩慢加入O.IN的氬氧化鈉溶液,至pH達(dá)到10,室溫?cái)嚢?小時(shí)。用0.IN的鹽酸溶液調(diào)節(jié)PH至3,減壓蒸除四氬呋喃,然后將水溶液用Sephadex-10凝膠柱層析分離,以0.2M碳酸氫氨水溶液洗脫。收集第一峰面積下組分,冰凍干燥,得到CH30-PEG5M。-OCH2CH2-NHCO-A1a-OH。將CH30-PEG測(cè)-0CH2CH廠NHC0-Ala-OH溶于干燥的四氫呋喃中,加入5倍摩爾量L-亮氨酸曱酯,5倍摩爾量的DCC,室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜,然后緩慢加入0.IN的氫氧化鈉溶液,至pH達(dá)到10,室溫?cái)嚢?小時(shí)。用0.IN的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至3,減壓蒸除四氯呋喃,然后將水溶液用Sephadex-IO凝膠柱層析分離,以0.2M碳酸氫氨水溶液洗脫。收集第一峰面積下組分,冰凍干燥,得到CH30-PEG5。。-OCH2CH2-NHCO-A1a-Leu-OH。將CH30-PEG5。。。-OCH2CH2-NHCO-Ala-Leu-OH溶于干燥的四氬吹喃中,加入5倍摩爾量N-羥基琥珀酰亞胺,1倍摩爾量的DCC,室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜,過濾,得到CH30-PEG5。Q。-OCH2CONH-Ala-Leu-OSu的溶液備用。1.3CH30—PEG5000-OCH2CONH—Ala-Leu-CONH-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr"OH(IJ的制備用lOOmgWang樹脂(0.05mmol)為固相栽體,F(xiàn)moc-Arg(Mtr),F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH,F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-0H,F(xiàn)moc-Val-OH,F(xiàn)moc-Tyr(tBu)為原料,DCC-HOBT作縮合劑,根據(jù)胸酰五肽的氨基酸序列,按標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc固相多肽合成方法合成H-Arg(Mtr)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Va卜Tyr(tBu)-Wang樹脂,加入2倍摩爾量的CH30-PEGs。。。-0CH2C0NH-Ala-Leu-C00Su(0.l咖ol),反應(yīng)48小時(shí)后,茚三酮法檢測(cè)為陰性,停止反應(yīng),將所得肽樹脂洗滌干燥。以間曱酚-TMBS-TFA用為裂解試劑,(TC反應(yīng)90分鐘,濾除樹脂,將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去TFA,加無水乙醚沉淀出固體,濾集固體,溶于水中,水凍干燥得白色粘稠固體,RP-HPLC純化得目標(biāo)產(chǎn)物。酸水解的氨基酸組成比例分析與理論值相符。實(shí)施例2CH30-PEG5。。。-OCH2CONH-Ala-Leu-CONH-Toc廣OH(I2)的制備用0.05mmolWang樹脂為固相栽體,F(xiàn)moc-AA-OH(0.2mmo1)為原料,DCC-HOBT(0.2mmo1)為縮合劑,按照胸腺素oc!(Toc,)的氨基酸序列,用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc固相多肽合成方法合成全保護(hù)肽鏈Fmoc-TocWang樹脂。用20%派p定/DMF脫除Fmoc后,加入0.6mmo1的CH30-PEG5。。。-0CH2C0NH-Ala-Leu-COOSu反應(yīng)48小時(shí)后,茚三酮法檢測(cè)為陰性,停止反應(yīng),將所得肽樹脂洗滌干燥。以5ml間曱酚-TMBS-TFA用為裂解試劑,(TC反應(yīng)90分鐘,濾除樹脂,將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去TFA,加無水乙醚沉淀出固體,濾集固體,溶于水中,水凍干燥得白色粘稠固體,RP-HPLC純化得目標(biāo)產(chǎn)物。酸水解的氨基酸組成比例分析與理論值相符。實(shí)施例3CH30-PEG12fl。。-0CH2C0NH-Ala-Leu-CONH-IFN-ct2b(U的制備參照實(shí)施例1.1的方法,用分子量12000的單甲氧基聚乙二醇代替分子量5000的單甲氧基聚乙二醇制備CH30-PEG,。-OCH2COOH。參照實(shí)施例1.2的方法,用CH30-PEG12a。。-OCH2COOH代替CH30-PEG5。。。-OCH2COOH制備CH30-PEG12。。。-OCH2CONH-Ala-Leu-OSu。將IFN-a2b溶于pH6.5,100mM的磷酸緩沖液,配成5mg/ml的溶液,滴加3倍摩爾量的<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>的溶液,4T攪拌反應(yīng)3小時(shí)。將反應(yīng)液用pH4.5,10mM醋酸銨緩沖液稀釋20倍。取羧甲基瓊脂糖離子交換樹脂(CM-Sepharose)裝柱,離子交換樹脂先用5個(gè)柱體積的PH4.5,lOmM醋酸銨緩沖液預(yù)平衡,然后將稀釋后的反應(yīng)液上樣,先用pH4.5,10mM醋酸銨緩沖液洗脫,除去未反應(yīng)的PEG衍生物;再用A液為pH4.5,40mM的醋酸銨緩沖液,A液為含2M氯化鈉的pH4.5,40mM的醋酸銨緩沖液梯度洗脫,收集第二峰面積下的組分,即得一分子PEG與一分子IFN-cc2b交聯(lián)的產(chǎn)物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>。實(shí)施4<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>的制備將重組人白介素-2(rhIL-2)溶于pH6.5,lOOmM的磷酸緩沖液,配成2mg/ml的溶液,滴加3倍摩爾量的CH30-PEG訓(xùn)。-OCH2CONH-Ala-Leu-COOSu的溶液,4。C攪拌反應(yīng)3小時(shí)。將反應(yīng)液用pH6.0,20mM磷酸緩沖液稀釋20倍。取羧曱基瓊脂糖離子交換樹脂(CM-Sepharose)裝柱,離子交換樹脂先用5個(gè)柱體積的pH6.0,20mM磷酸緩沖液預(yù)平衡,然后將稀釋后的反應(yīng)液上樣,先用pH6.0,20mM磷酸緩沖液洗脫,除去未反應(yīng)的PEG衍生物;再用A液為pH7.Q,20mM的磷酸緩沖液,B液為含1M氯化鈉的pH7.0,20mM的磷酸緩沖液梯度洗脫,收集第二峰面積下的組分,即得一分子PEG與一分子rhlL-2交聯(lián)的產(chǎn)物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>。實(shí)施例5<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>(IU的制備5.1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>的制備將單甲氧基聚乙二醇(MW12000)14.4g用20ml曱苯和12ml二氯甲烷的混合溶劑溶解,加入lg(20mmol)無水三乙胺,0.56g三光氣,攪拌反應(yīng)過夜。將反應(yīng)液減壓蒸干,將殘留物用干燥的四氫呋喃溶解,加入5倍摩爾量L-丙氨酸和干燥的三乙胺,室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜。用0.1N的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至3,減壓蒸除四氫呋喃,然后將水溶液用S印hadex-10凝膠柱層析分離,以0.2M碳酸氬氨水溶液洗脫。收集第一峰面積下組分,水凍干燥,得到CH3O-PEG12。0。-CH2CH2OCONH-Ala-OH。將CH30-PEGu。。-OCH2CH2OCONH-Ala-OH溶于千燥的四氬呔喃中,加入5倍摩爾量L-亮氨酸甲酯,5倍摩爾量的DCC,室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜,然后緩慢加入0.IN的氫氧化鈉溶液,至pH達(dá)到10,室溫?cái)嚢?小時(shí)。用0.IN的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至3,減壓蒸除四氬呋喃,然后將水溶液用Sephadex-IO凝膠柱層析分離,以0.2M碳酸氫氨水溶液洗脫。收集第一峰面積下組分,冰凍干燥,得到CH30-PEG12。。。-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-0H。將CH30-PEG12。。。-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-OH溶于干燥的四氬吹喃中,加入5倍摩爾量N-羥基琥珀酰亞胺,1倍摩爾量的DCC,室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜,過濾,得到CH30-PEG12。。。-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-C00Su的溶液備用。5.2CH3O-PEG12000-OCH2,CONH-Ala-Leu-CONH-Arg-Lys-Asp-VahTyr-OH(nj的制備按照實(shí)施例1.3的方法合成H-Arg(Mtr)-Lys(Boc)-Asp(0tBu)-Val-Tyr(tBu)-Wang樹脂,加入2倍摩爾量的CH30-PEG12。。。-OCH2CH2-OCONH-Ala-Leu-COOSu(0.lmmol),反應(yīng)48小時(shí)后,茚三酮法檢測(cè)為陰性,停止反應(yīng),將所得肽樹脂洗滌干燥。以5ml間甲酚-TMBS-TFA用為裂解試劑,(TC反應(yīng)90分鐘,濾除樹脂,將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去TFA,加無水乙醚沉淀出固體,濾集固體,溶于水中,冰凍干燥得白色粘稠固體,RP-HPLC純化得目標(biāo)產(chǎn)物。酸水解的氨基酸組成比例分析與理論值相符。實(shí)施例6CH30-PEGu。。。-OCH2CH20CONH-Ala-Leu-CONH-Ta廣OH(112)的制備按照實(shí)施例2的方法合成合成全保護(hù)肽鏈Fmoc-Ta廣Wang樹脂。用20%哌啶/DMF脫除Fmoc后,加入3倍摩爾量的CH30-PEG12。。。-OCH2CH2OOTH-Ala-Leu-OSu,反應(yīng)48小時(shí)后,茚三酮法檢測(cè)為陰性,停止反應(yīng),將所得肽樹脂洗滌干燥。以5ml間甲酚-TMBS-TFA用為裂解試劑,(TC反應(yīng)90分鐘,濾除樹脂,將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去TFA,加無水乙醚沉淀出固體,濾集固體,溶于水中,冰凍干燥得白色粘稠固體,RP-HPLC純化得目標(biāo)產(chǎn)物。酸水解的氨基酸組成比例分析與理論值相符。實(shí)施例7CH30-PEG12。。。-0CH2CH20C0NH-Ala-Leu-C0NH-IFN-oc2b(EU)的制備將IFN-oc2b溶于pH6.5,lOOmM的褲酸緩沖液,配成5mg/ml的溶液,滴加3倍摩爾量的CH30-PEG腦。-0CH2CH20C0NH-Ala-Leu-C00Su的溶液,4。C攪拌反應(yīng)3小時(shí)。將反應(yīng)液用pH4.5,10mM醋酸銨緩沖液稀釋20倍。取羧甲基瓊脂糖離子交換樹脂(CM-S印harose)裝柱,離子交換樹脂先用5個(gè)柱體積的PH4.5,lOmM醋酸銨緩沖液預(yù)平衡,然后將稀釋后的反應(yīng)液上樣,先用PH4.5,lOmM醋酸銨緩沖液洗脫,除去未反應(yīng)的PEG衍生物;再用A液為pH4.5,40mM的醋酸銨緩沖液,A液為含2M氯化鈉的PH4.5,40mM的醋酸銨緩沖液梯度洗脫,收集第二峰面積下的組分,即得一分子PEG與一分子IFN-a2b交聯(lián)的產(chǎn)物CH30-PEG12。。。-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-C0NH-IFN-oc2b。實(shí)施8CH30-PEG12。。。-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-C0NH-rhlL-2(EU)的制備將重組人白介素-2(rhlL-2)溶于pH6.5,100mM的磷酸緩沖液,配成2mg/ml的溶液,滴加3倍摩爾量的CH30-PEG12。。。-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-COOSu的溶液,4X:攪拌反應(yīng)3小時(shí)。將反應(yīng)液用pH6.0,20mM磷酸緩沖液稀釋20倍。取羧曱基瓊脂糖離子交換樹脂(CM-Sepharose)裝柱,離子交換樹脂先用5個(gè)柱體積的pH6.0,20mM磷酸緩沖液預(yù)平衡,然后將稀釋后的反應(yīng)液上樣,先用pH6.0,20mM磷酸緩沖液洗脫,除去未反應(yīng)的PEG衍生物;再用A液為pH7.0,20niM的磷酸緩沖液,B液為含1M氯化鈉的pH7.0,20mM的磷酸緩沖液梯度洗脫,收集第二峰面積下的組分,即得一分子PEG與一分子rhlL-2交聯(lián)的產(chǎn)物CH30-PEG12。。。-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-CONH-rhIL-2。實(shí)施例9CH30-PEG5。。。-OCH2CH2-NHCO-Ala-Leu-NHCO-Tyr-Val-Asp-Lys-Arg-H(m!)的制備9.1CH30-PBG5。。。-OCH2CH2-NH2的制備稱取CH30-PEG濯-0CH2CH20H10.Og置于250ml反應(yīng)瓶中,加入50mlCH2C12,固體溶解后再加入1.5g三乙胺和1.9gTs-Cl,室溫?cái)嚢璺磻?yīng)。TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全后,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑,力o100ml無水乙醚沉淀出固體,得6.5gCH30-PEG5。。。-0CH2CH20Ts。將6.0gCH30-PEG5。。-OTs溶于10mlDMF,加入2.0g鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽,120匸反應(yīng)4小時(shí)。減壓蒸去溶劑,將殘余物溶于50ml無水乙醇,加入1.5ml水合肼,回流反應(yīng)4小時(shí)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑,將殘余物溶于CH2C12,用無水乙醚沉淀出固體,再以無水乙醇-乙瞇重結(jié)晶,得4.2gCH3O-PEG5。0。-OCH2CHr"NH2。9.2CH30-PEG5。。。-OCH2CH2-NHCO-Ala-Leu-H的制備將CH30-PEG5。。。-OCH2CH2-NH2,溶于水,滴加5倍摩爾量的Fmoc-Ala-OSu的四氫吹喃溶液。加完后,室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜。減壓蒸去四氫呋喃,用噥啶脫除Fmoc后,用S印hadex-IO凝月交柱層析分離,以0.2M碳酸氬氨水溶液洗脫。收集第一峰面積下組分,冰凍干燥,得到CH30-PEG5。。。-OCH2CH2-NHCO-Ala-H。將CH30-PEG5。。。-OCH2CH2-NHCO-Ala-H溶于水,滴加5倍摩爾量的Fmoc-Leu-OSu的四氬呔喃溶液。加完后,室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜。減壓蒸去四氫呋喃,用哌p定脫除Fmoc后,用S印hadex-lO凝月交柱層析分離,以0.2M;友酸氫氨水溶液洗脫。收集第一峰面積下組分,冰凍干燥,得到CH30-PEG5。。。-OCH2CH2-NHC0-Ala-Leu-H。9.3CH30-PEG訓(xùn)。-OCH2CH2-NHCO-Ala-Leu-NHCO-Tyr-Va卜Asp-Lys-Arg-H(Hh)的制備以0.lmmolRink酰胺樹脂為固相載體,0.2mmo1的Fmoc-AA-OH為原料,HBTU(0.2mrno1)-N麗(O.3mmo1)為縮合劑,按胸腺五肽的^J^酸序列,按標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc固相多肽合成方法合成全保護(hù)肽樹脂。最后加入0.6mmo1的CH30-PEG5M。-0CH2CH「NHC0-Ala-Leu-H,HBTU(0.2mmo1)-N醒(0.3mmol),反應(yīng)48小時(shí)后,茚三酮法檢測(cè)為陰性,停止反應(yīng),將所得肽樹脂洗滌干燥。以EDT-間曱酚-TFA為裂解試劑,(TC反應(yīng)90分鐘,濾除樹脂,將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去TFA,加無水乙醚沉淀出固體,濾集固體,溶于水中,冰凍干燥得白色粘稠固體,RP-HPLC純化得目標(biāo)產(chǎn)物。酸水解的氨基酸組成比例分析與理論值相符。實(shí)施例IOCH30-PEG12。。。-0CH2CH2-NHC0-Ala-Leu-NHCO-Ta廣H(OU的制備參照實(shí)施例9.1的方法,用分子量12000的單甲氧基聚乙二醇代替分子量5000的單曱氧基聚乙二醇制備CH30-PEG12。。。-OCH2CH2-NH2。參照實(shí)施例9.2的方法,用CH30-PEG12。。。-OCH2CH2-NH2代替CH30-PEG漏-CH2CH2-冊(cè)2制備CH30-PEG12。。。-OCH2CH「NHCO-Ala-Leu-H。以0.lmmolRink酰胺樹月旨為固相載體,0.2畫1Fmoc-AA-OH為原料,HBTU(O.2mmo1)-N醒(O.3mmo1)為縮合劑,按Ta!的氨基^f歹'j,用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc固相多肽合成方法合成全保護(hù)肽樹脂。最后加入0.6mmo1的CH30-PEG12。。-OCH2CH2-HCO-Ala-Leu-H(O.2,1),HBTU(O.2mmol)-誦(0.3mmol),反應(yīng)48小時(shí)后,茚三酮法檢測(cè)為陰性,停止反應(yīng),將所得肽樹脂洗滌干燥。以EDT-間甲酚-TFA為裂解試劑,(TC反應(yīng)90分鐘,濾除樹脂,將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去TFA,加無水乙醚沉淀出固體,濾集固體,溶于水中,冰凍干燥得白色粘稠固體,RP-HPLC純化得目標(biāo)產(chǎn)物。酸水解的氨基酸組成比例分析與理論值相符。實(shí)施例11胸腺五肽及胸腺素ct!的PEG偶合物的活性評(píng)價(jià)11.1對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖的影響用3H-TdR摻入法測(cè)定目標(biāo)化合物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響。取小鼠脾臟,制成脾細(xì)胞懸液。裂解紅細(xì)胞后,洗滌三次;用苔盼蘭染色,細(xì)胞計(jì)數(shù),活細(xì)胞在95%以上。用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液將脾細(xì)胞濃度調(diào)為5xl06細(xì)胞/ml。于96孔板中加入100nl/孔的細(xì)胞懸液;然后加入50pl/孔的樣品,對(duì)照孔加5(^1含10%血清的培養(yǎng)液;最后加入50pl/孔的ConA,,總體積為200)il。于含5%C02的37。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)結(jié)束前12小時(shí),每孔加入25pl力-胸腺嘧咬核普酸(2xl()4Bq)。繼續(xù)培養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,然后將培養(yǎng)板凍存于-20。C冰箱;測(cè)定時(shí)將凍融的細(xì)胞用細(xì)胞收集儀收集至玻璃纖維膜上,加入閃爍液后于Beta記數(shù)儀上讀取摻入細(xì)胞DNA的[3H]-胸腺嘧咬核苷量,以cpm值K表細(xì)力包增殖的情況。表1小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>11.2對(duì)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2和IFN"Y的誘導(dǎo)作用用ELISA法測(cè)定目標(biāo)化合物對(duì)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2和IFN"Y的誘導(dǎo)作用。取活細(xì)胞計(jì)數(shù)95%以上的小鼠脾細(xì)胞懸液,用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液將脾細(xì)胞濃度調(diào)為lx107細(xì)胞/ml。于48孔板中加入800n1/孔的細(xì)胞懸液;然后加入10(Vl/孔的樣品,對(duì)照孔加10(^1含10%血清的培養(yǎng)液;最后加入100nl/孔的ConA。于含5%C02的37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí),離心取上清液。用小鼠IFN,和IL-2檢測(cè)試劑盒測(cè)定IFN"7和IL-2的含量。表2對(duì)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2和IFN,的影晌<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實(shí)施例12干擾素的PEG偶合物的抗病毒活性評(píng)價(jià)用Wish細(xì)胞-VSV病毒系統(tǒng)測(cè)定干擾素及其PEG偶合物的抗病毒活性。采用細(xì)胞致病效應(yīng)抑制為基礎(chǔ)的抑制微量測(cè)定法,以能夠保護(hù)半數(shù)細(xì)胞免受病毒攻擊的待測(cè)樣品的最大稀釋度的倒數(shù)為干擾素單位。用國家IFNa標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)確定效價(jià)(IU)。表3干擾素及其PEG偶合物的抗病毒活性<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實(shí)施例13白介素-2的PEG偶合物的活性評(píng)價(jià)用重組人白介素-2依賴細(xì)胞抹/MTT法測(cè)定白介素-2及其PEG偶合物的生物學(xué)活性,用國家標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)確定效價(jià)(IU)。以人血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,用Lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)含量,計(jì)算樣品生物活性(IU/ml)與蛋白質(zhì)含量(mg/ml)的比值,即為比活性。表4白介素-2及其PEG偶合物的生物活性<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實(shí)施例14體外蘇穩(wěn)定性的測(cè)定在pH7.8的0.1%的胰蛋白酶溶液,分別加入待測(cè)樣品,于37。C恒溫水浴寸呆-顯,分別于0、10min、30min、60min、120min及480min取才羊,按照實(shí)施例12、13的方法,測(cè)定各樣品在不同時(shí)間點(diǎn)的生物活性,以O(shè)時(shí)的活性為畫,計(jì)算相對(duì)活性。表5干擾素、白介素-2及其PEG偶合物的酶穩(wěn)定性<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>權(quán)利要求1、聚乙二醇通過氨基酸或寡肽的連接子與多肽或蛋白類藥物的連接形成的偶合物。2、式I所示的聚乙二醇衍生物通過氨基酸或寡肽的連接子與多肽或蛋白分子中的氨基連接形成的偶合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>式I中,PEG代表平均分子量5000-40000的聚乙二醇,AA代表酸殘基,P代表胸腺五肽、胸腺素cd、干擾素(IFN)或白介素等多肽或蛋白藥物;n為1-6的整數(shù)。3、式II所示的聚乙二醇衍生物通過氨基酸或寡肽的連接子與多肽或蛋白分子中的氨基連接形成的偶合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>式II中,PEG代表平均分子量5000-40000的聚乙二醇,AA代表L-氨基酸殘基,P代表胸腺五肽、胸腺素a,、干擾素(IFN)或白介素等多肽或蛋白藥物;n為1-6的整數(shù)。4、式III所示的聚乙二醇衍生物通過氨基酸或寡肽的連接子與多肽分子中的羧基連接形成的偶合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>式III中,PEG代表平均分子量5000-40000的聚乙二醇,AA代表L-#J^酸殘基,P代表胸腺五肽、胸腺素cd、干擾素(IFN)或白介素等多肽或蛋白藥物;n為1-6的整數(shù)。5、含有式I、II或ffl所示的聚乙二醇與多肽或蛋白的偶合物作為活性成分的藥物《且合物作為藥物的用途。6、式i、n或in所示的聚乙二醇與多肽或蛋白的偶合物,以及含有式i、n或ni所示的聚乙二醇與多肽或蛋白的偶合物作為活性成分的藥物組合物作為抗腫瘤或抗病毒藥物的用途。全文摘要本發(fā)明的目的是提供聚乙二醇通過氨基酸或寡肽的連接子與胸腺五肽、胸腺素α<sub>1</sub>、干擾素(IFN)或白介素等多肽或蛋白類藥物的連接形成的偶合物。通過選擇適當(dāng)?shù)倪B接子可以保持偶合物在血漿中的穩(wěn)定性;到達(dá)靶組織后,連接子可以在細(xì)胞類解離,釋放活性形式的多肽或蛋白分子,產(chǎn)生藥理作用。文檔編號(hào)A61K38/32GK101104078SQ200610098649公開日2008年1月16日申請(qǐng)日期2006年7月11日優(yōu)先權(quán)日2006年7月11日發(fā)明者文王,靳雪峰申請(qǐng)人:北京美倍他藥物研究有限公司