專利名稱：一種預(yù)防性乙肝疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗及其制備方法，特別是涉及一種預(yù)防性乙肝疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
乙型肝炎是一種嚴(yán)重危害人類健康的傳染性疾病，約三分之二的慢性感染者會發(fā)展成為肝硬化、肝癌等惡性肝疾患者，全球每年約有55萬人死于肝癌，而包括中國在內(nèi)的東亞死亡人數(shù)就達(dá)36萬(駱抗先主編，乙型肝炎基礎(chǔ)和臨床，北京人民衛(wèi)生出版社，2001第二版；Asian Liver center-statistcs)。乙肝病毒(HBV)屬于DNA病毒，且具有很強(qiáng)的種屬特異性，人HBV只能感染人、猩猩和狒狒。
通過對HBV結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，外膜蛋白是引起宿主保護(hù)性應(yīng)答的主要免疫原表位。而外膜蛋白又分為3種膜成分大蛋白(preS1+preS2+S)、中蛋白(preS2+S)和主蛋白(S)。其中，preS1和preS2對S免疫原性有協(xié)同作用。
目前，我國生產(chǎn)的預(yù)防性乙肝疫苗有兩種，一種是酵母表達(dá)的基因工程乙肝疫苗，另一種是哺乳動物(CHO)細(xì)胞表達(dá)的基因工程乙肝疫苗，兩種疫苗的活性成分均為乙肝表面S抗原，統(tǒng)稱為第二代預(yù)防性乙肝疫苗。
上述兩種乙肝疫苗能在競爭日益激烈的中國市場長期并存的原因主要是這兩種由不同表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的疫苗各具相互間不可替代的優(yōu)勢和無法克服的不足。酵母產(chǎn)乙肝疫苗主要優(yōu)勢是成本較低，免疫起效快、母嬰阻斷率高等特點(diǎn)(梁爭論等，國產(chǎn)重組酵母乙型肝炎疫苗人體免疫效果觀察。中華微生物學(xué)和免疫雜志，1999年第19卷第1期)，但存在以下幾方面問題①乙肝抗原在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，不能分泌，需要破碎菌體后純化抗原，因此需要發(fā)酵一批純化一批，并且純化工藝相對復(fù)雜，導(dǎo)致質(zhì)量控制工藝也較復(fù)雜。②酵母表達(dá)系統(tǒng)不能提供抗原的翻譯后修飾、蛋白質(zhì)折疊、大分子裝配和糖基化，而糖基化對誘導(dǎo)強(qiáng)的免疫效果起到重要作用。CHO產(chǎn)疫苗雖然表達(dá)量低、生產(chǎn)成本較高(目前生產(chǎn)使用的仍是轉(zhuǎn)瓶工藝)，但具有以下優(yōu)勢1)分泌表達(dá)，因此純化工藝相對簡單，回收率高；2)哺乳動物細(xì)胞更接近于人體細(xì)胞，因此抗原的表達(dá)后修飾加工更完善，糖基化完全，產(chǎn)生的乙肝表面抗原更接近于人血液中的乙肝表面抗原，不僅免疫效果好，而且穩(wěn)定性高、免疫保護(hù)周期長(陳長順等，不同劑量和種類基因工程乙型肝炎疫苗免疫效果研究。中國計(jì)劃免疫，2000年第3期第6卷)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種制備方法簡單、免疫效果較好的第二代預(yù)防性乙肝疫苗。
本發(fā)明所提供的預(yù)防性乙肝疫苗，它的活性成分為酵母產(chǎn)乙肝表面S抗原和CHO產(chǎn)乙肝表面S抗原的混合物；其中，所述酵母產(chǎn)乙肝表面S抗原占上述兩種乙肝表面S抗原總質(zhì)量的70％以下。
所述酵母產(chǎn)乙肝表面S抗原和CHO產(chǎn)乙肝表面S抗原的重量份數(shù)比可為3-7∶7-3。
如前所述，CHO產(chǎn)乙肝表面S抗原比酵母產(chǎn)乙肝表面S抗原具有更高的體液免疫效力，但其母嬰阻斷效果遜于酵母產(chǎn)乙肝表面S抗原。另一方面，CHO產(chǎn)乙肝表面S抗原比酵母產(chǎn)乙肝表面S抗原的生產(chǎn)成本大得多。因此，本疫苗的發(fā)明原則是在達(dá)到純CHO疫苗具有的體液免疫水平的前提下使用盡可能多的酵母產(chǎn)乙肝表面S抗原。這樣，可在不影響免疫效果并最大限度保證酵母疫苗優(yōu)勢情況下的使生產(chǎn)成本大幅降低。
所述酵母包括釀酒酵母和漢遜酵母。
所述酵母產(chǎn)乙肝表面S抗原的來源是廣泛的，可來源于任意生產(chǎn)同類產(chǎn)品的廠家，如北京天壇生物制品股份有限公司、深圳康泰生物制品股份有限公司、大連漢信生物制藥公司或葛蘭素史克公司等。
所述CHO產(chǎn)乙肝表面S抗原的來源是廣泛的，可來源于任意生產(chǎn)同類產(chǎn)品的廠家，如長春生物技術(shù)研究所、華北制藥集團(tuán)金坦生物技術(shù)公司、北京華爾盾生物技術(shù)有限公司、長春生物技術(shù)研究所、蘭州生物技術(shù)研究所、武漢生物技術(shù)研究所或成都生物技術(shù)研究所等。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種所述預(yù)防性乙肝疫苗的制備方法。
本發(fā)明所提供的預(yù)防性乙肝疫苗的制備方法，是將酵母產(chǎn)乙肝表面S抗原和CHO產(chǎn)乙肝表面S抗原混合，得到疫苗；其中，所述酵母產(chǎn)乙肝表面S抗原可占上述兩種乙肝表面S抗原總質(zhì)量的70％以下。
在上述制備方法中，所述酵母產(chǎn)乙肝表面S抗原和CHO產(chǎn)乙肝表面S抗原的重量份數(shù)比可為3-7∶7-3。
所述酵母包括釀酒酵母和漢遜酵母。
所述酵母產(chǎn)乙肝表面S抗原的來源是廣泛的，可來源于任意生產(chǎn)同類產(chǎn)品的廠家，如北京天壇生物制品股份有限公司、深圳康泰生物制品股份有限公司、大連漢信生物制藥公司或葛蘭素史克公司等。
所述CHO產(chǎn)乙肝表面S抗原的來源是廣泛的，可來源于任意生產(chǎn)同類產(chǎn)品的廠家，如長春生物技術(shù)研究所、華北制藥集團(tuán)金坦生物技術(shù)公司、北京華爾盾生物技術(shù)有限公司、長春生物技術(shù)研究所、蘭州生物技術(shù)研究所、武漢生物技術(shù)研究所或成都生物技術(shù)研究所等。
需要的時(shí)候，在上述疫苗中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、吸收促進(jìn)劑等。
為獲得更好的免疫效果，在上述疫苗中還可以融入顆粒白細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)、TGF-β4等一種或多種細(xì)胞因子作為免疫佐劑。
本發(fā)明的疫苗可以制成注射液，該劑型的疫苗可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
上述疫苗共需免疫3次。分別在第0、1、2(或6)個(gè)月注射免疫，每次注射劑量10-20微克。
本發(fā)明提供了一種混合型預(yù)防性乙肝疫苗。該疫苗是將酵母產(chǎn)乙肝表面S抗原和CHO產(chǎn)乙肝表面S抗原按一定比例混合后得到的疫苗。動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該混合型預(yù)防性乙肝疫苗同時(shí)具有酵母預(yù)防性乙肝疫苗和CHO預(yù)防性乙肝疫苗的優(yōu)勢，并具有比這兩類現(xiàn)有預(yù)防性乙肝疫苗更強(qiáng)、更廣泛的免疫保護(hù)作用，并可極大地降低乙肝疫苗的總體生產(chǎn)成本，乙肝疫苗的接種普及率可獲得進(jìn)一步提高。此外，該疫苗的制備方法簡單，具有工業(yè)化生產(chǎn)的可行性。本發(fā)明的疫苗及其制備方法將乙肝的預(yù)防中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、酵母產(chǎn)乙肝表面S抗原和CHO產(chǎn)乙肝表面S抗原混合比例的確定人體臨床實(shí)驗(yàn)表明(梁爭論等，國產(chǎn)重組酵母乙型肝炎疫苗人體免疫效果觀察。中華微生物學(xué)和免疫雜志，1999年第19卷第1期；李河民等，關(guān)于乙型肝炎疫苗免疫原性的評價(jià)，http//www.cfhpc.net/20040509-temp/013.ppt)，CHO預(yù)防性乙肝疫苗比酵母預(yù)防性乙肝疫苗的體液免疫效果更好(即含相同量的HBsAg，CHO疫苗可以比酵母疫苗誘發(fā)產(chǎn)生更多的抗-HBs)，特別是在動物實(shí)驗(yàn)中，通常誘發(fā)ED50所需的最低CHO抗原量僅為酵母抗原量的1/3?，F(xiàn)進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)檢測本發(fā)明的混合型預(yù)防性乙肝疫苗能否達(dá)到和純CHO疫苗相同的ED50值，并確定本發(fā)明的混合型預(yù)防性乙肝疫苗達(dá)到和純CHO疫苗相同的ED50值時(shí)所需的CHO疫苗的最低比例，實(shí)驗(yàn)方法如下實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)樣品組和對照組，實(shí)驗(yàn)樣品組將CHO預(yù)防性乙肝疫苗(購自山東萊蕪市防疫站，10微克/劑)與酵母預(yù)防性乙肝疫苗(購自山東萊蕪市防疫站，10微克/劑)按不同比例(1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1)混合；對照組包括上述純CHO預(yù)防性乙肝疫苗組、純酵母預(yù)防性乙肝疫苗組和生理鹽水組(陰性對照組)。按照“中國生物制品規(guī)程”中的規(guī)定進(jìn)行動物效力測定實(shí)驗(yàn)(ED50)，方法為每個(gè)實(shí)驗(yàn)組使用4周齡的BALB/c雌性小鼠10只，每只腹腔注射1毫升疫苗樣品或陰性對照樣品。4-6周采血，用RIA法測抗-HBs。
CHO預(yù)防性乙肝疫苗∶酵母預(yù)防性乙肝疫苗＝3∶7組的抗-HBs陽性小鼠比例見表1(抗原含量分別為2.5、0.625、0.3125、0.1563微克)，該混合比例實(shí)驗(yàn)組的ED50值見表2，表明本發(fā)明混合型疫苗中能夠獲得與純CHO預(yù)防性乙肝疫苗同等效力(相同ED50值)所需的最低CHO預(yù)防性乙肝疫苗比例為30％，按照重量份數(shù)比為3(CHO產(chǎn)乙肝表面S抗原)∶7(酵母產(chǎn)乙肝表面S抗原)配制而成的混合疫苗完全可以達(dá)到和純CHO預(yù)防性乙肝疫苗或純酵母預(yù)防性乙肝疫苗相同的體液免疫效果。
表1 CHO∶酵母＝3∶7組的抗原注射量及抗-HBs陽性小鼠比例

表2 CHO∶酵母＝3∶7組的ED50值

實(shí)施例2、預(yù)防性乙肝疫苗的制備及其檢測一、預(yù)防性乙肝疫苗的制備無菌條件下，將市售釀酒或漢遜酵母預(yù)防性乙肝疫苗和CHO預(yù)防性乙肝疫苗(均購自山東萊蕪市防疫站，10微克/劑)按重量份數(shù)比為1∶1混合，得到疫苗。
二、檢測對步驟一制備的預(yù)防性乙肝疫苗進(jìn)行以下方面檢測1、無菌試驗(yàn)按照《生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程》對步驟一制備的預(yù)防性乙肝疫苗及其每亞批進(jìn)行無菌試驗(yàn)，結(jié)果均無雜菌生長，符合標(biāo)準(zhǔn)。
2、安全試驗(yàn)每亞批疫苗皮下注射14-16g小白鼠，每只0.5mL，注射后觀察四周，免疫小鼠健存，表明本發(fā)明的疫苗具有較高的安全性。
3、免疫效力和鑒別試驗(yàn)將本發(fā)明疫苗4倍遞增稀釋(以上述CHO預(yù)防性乙肝疫苗為參比)，每個(gè)稀釋度接種BALB/cH2d雌性小白鼠20只，每只腹腔注射0.5mL，4-6周后采血，用RIA法測抗-HBs，計(jì)算本發(fā)明疫苗的ED50值與參比疫苗的ED50值，以檢品ED50值/參比ED50值為判定值，結(jié)果該比值≥1，符合標(biāo)準(zhǔn)。
上述檢測結(jié)果表明本發(fā)明的預(yù)防性乙肝疫苗具有較高的生物安全性及免疫效力。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防性乙肝疫苗，它的活性成分為酵母產(chǎn)乙肝表面S抗原和CHO產(chǎn)乙肝表面S抗原的混合物；其中，所述酵母產(chǎn)乙肝表面S抗原占上述兩種乙肝表面S抗原總質(zhì)量的70％以下。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于所述酵母產(chǎn)乙肝表面S抗原和CHO產(chǎn)乙肝表面S抗原的重量份數(shù)比為3-7∶7-3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于所述酵母為釀酒酵母和漢遜酵母。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于所述酵母產(chǎn)乙肝表面S抗原來源于北京天壇生物制品股份有限公司、深圳康泰生物制品股份有限公司、大連漢信生物制藥公司或葛蘭素史克公司。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于所述CHO產(chǎn)乙肝表面S抗原來源于長春生物技術(shù)研究所、華北制藥集團(tuán)金坦生物技術(shù)公司、北京華爾盾生物技術(shù)有限公司、長春生物技術(shù)研究所、蘭州生物技術(shù)研究所、武漢生物技術(shù)研究所或成都生物技術(shù)研究所。
6.一種制備權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的預(yù)防性乙肝疫苗的方法，是將酵母產(chǎn)乙肝表面S抗原和CHO產(chǎn)乙肝表面S抗原混合，得到疫苗；其中，所述酵母產(chǎn)乙肝表面S抗原占上述兩種乙肝表面S抗原總質(zhì)量的70％以下。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述酵母產(chǎn)乙肝表面S抗原和CHO產(chǎn)乙肝表面S抗原的重量份數(shù)比為3-7∶7-3。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述酵母為釀酒酵母和漢遜酵母。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述酵母產(chǎn)乙肝表面S抗原來源于北京天壇生物制品股份有限公司、深圳康泰生物制品股份有限公司、大連漢信生物制藥公司或葛蘭素史克公司。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述CHO產(chǎn)乙肝表面S抗原來源于長春生物技術(shù)研究所、華北制藥集團(tuán)金坦生物技術(shù)公司、北京華爾盾生物技術(shù)有限公司、長春生物技術(shù)研究所、蘭州生物技術(shù)研究所、武漢生物技術(shù)研究所或成都生物技術(shù)研究所。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種預(yù)防性乙肝疫苗。該疫苗的活性成分為酵母產(chǎn)乙肝表面S抗原和CHO產(chǎn)乙肝表面S抗原的混合物；其中，所述酵母產(chǎn)乙肝表面S抗原占上述兩種乙肝表面S抗原總質(zhì)量的70％以下。動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該混合型預(yù)防性乙肝疫苗同時(shí)具有酵母預(yù)防性乙肝疫苗和CHO預(yù)防性乙肝疫苗的優(yōu)勢，并具有比這兩類現(xiàn)有預(yù)防性乙肝疫苗更強(qiáng)、更廣泛的免疫保護(hù)作用，并可極大地降低乙肝疫苗的總體生產(chǎn)成本，乙肝疫苗的接種普及率可獲得進(jìn)一步提高。此外，該疫苗的制備方法簡單，具有工業(yè)化生產(chǎn)的可行性。本發(fā)明的疫苗及其制備方法將乙肝的預(yù)防中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號A61P1/16GK1887351SQ20061008892
公開日2007年1月3日 申請日期2006年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月26日
發(fā)明者程菠, 儀忠軍 申請人:程菠, 儀忠軍