專利名稱：用于預(yù)防和治療轉(zhuǎn)移性腫瘤的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請主要涉及癌癥預(yù)防和治療領(lǐng)域，更具體地涉及用于癌癥(特別是轉(zhuǎn)移性腫瘤)免疫預(yù)防和治療的方法和組合物。
背景技術(shù)：
腫瘤的放射治療和化療并不能完全清除腫瘤細胞，同時還損傷了免疫系統(tǒng)。殘存的腫瘤細胞(包括轉(zhuǎn)移腫瘤)往往最終奪取了患者的生命。免疫治療提供了最理想的完全清除殘存腫瘤的方法，但是腫瘤往往因免疫系統(tǒng)被腫瘤抗原激活不足而逃脫免疫系統(tǒng)的攻擊。免疫系統(tǒng)的激活不足原因在于免疫細胞浸入腫瘤細胞不足，或缺乏足夠強的對浸潤腫瘤的淋巴細胞的活化信號。增加T淋巴細胞對腫瘤的浸潤常常帶來良好的預(yù)后。如何增加對腫瘤的免疫力成為清除腫瘤而又不損傷免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵。
轉(zhuǎn)移性疾病是癌癥致病率和死亡率的主要原因，而且盡管經(jīng)過數(shù)十年在治療結(jié)果改善方面付出的巨大努力，其惡性腫瘤仍然是主要的醫(yī)學(xué)挑戰(zhàn)。免疫治療有潛力成為有希望的根除散布的轉(zhuǎn)移性腫瘤的方案，尤其是在早期。然而，目前在手術(shù)切除腫瘤后實行化療或放療的標(biāo)準(zhǔn)策略可能會在無意中阻礙免疫治療的潛在益處。盡管手術(shù)切除可以適當(dāng)?shù)厝コ皇苡绊懙囊呀⒌哪[瘤塊，然而伴隨此，腫瘤抗原的主要來源將消失，從而可能降低免疫應(yīng)答的可能性和效力，因為過少的轉(zhuǎn)移性腫瘤可能不能使CTL致敏。減少腫瘤負荷的化療/放療可能無意中破壞先前產(chǎn)生的腫瘤特異性CTL并抑制新產(chǎn)生抗腫瘤的CTL，以及可能地誘導(dǎo)耐受性。如何在目前的治療方案和相關(guān)免疫治療之間達成適當(dāng)?shù)钠胶猓恢笔歉⒉嫉霓D(zhuǎn)移性腫瘤的主要挑戰(zhàn)。
目前使用體外擴增的腫瘤特異性T細胞進行的主動免疫策略和過繼轉(zhuǎn)移治療很大程度地依賴于對給定的腫瘤抗原的了解。這些治療可以應(yīng)用有限數(shù)量的帶有特征性腫瘤抗原的癌癥患者，但是當(dāng)出現(xiàn)抗原丟失變體(這常?？梢栽诮?jīng)歷免疫學(xué)壓力的腫瘤上觀察到)時卻時常無效。
LIGHT是一種新近鑒定到的針對基質(zhì)細胞上的LTβR以及T細胞上的皰疹病毒進入介質(zhì)(HVEM)的配體。我們先前的數(shù)據(jù)提示，LIGHT介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可以增強腫瘤中用于幼稚細胞的募集和活化的淋巴組織趨化因子的產(chǎn)生。但是，不清楚LIGHT是否可用于轉(zhuǎn)移性腫瘤的防治。在本申請中，我們著重于用高表達突變LIGHT的腺病毒進行腫瘤內(nèi)注射以產(chǎn)生充足的CTL來根除轉(zhuǎn)移性腫瘤。
因此，在本領(lǐng)域中需要提供改進的轉(zhuǎn)移性腫瘤預(yù)防和治療方法。本發(fā)明滿足了這一需要和其它需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人檢查了手術(shù)切除前腫瘤微環(huán)境中直接產(chǎn)生的免疫應(yīng)答是否將允許更多的腫瘤抗原特異性T細胞走出腫瘤部位以巡查和消除周邊的轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞。在本研究中，我們證實，將表達LIGHT的腺病毒直接接種入自發(fā)轉(zhuǎn)移的高侵略性4T1乳腺癌中，之后手術(shù)去除該原發(fā)性腫瘤，可以根除散布的轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞。而且，我們能夠清楚地證實，局部治療可以在腫瘤部位誘導(dǎo)促炎細胞因子環(huán)境，并產(chǎn)生充足的腫瘤特異性CTL以離開原發(fā)性腫瘤并根除轉(zhuǎn)移性腫瘤。
我們的研究提示，手術(shù)前靶向原發(fā)性腫瘤可能是一項產(chǎn)生CTL以根除周邊和遠處的轉(zhuǎn)移性腫瘤的有效策略。因此，我們的研究開辟了一條通過技巧地利用免疫治療作為根除轉(zhuǎn)移性疾病的手段治療癌癥的新路徑。
一般而言，本發(fā)明涉及預(yù)防和/或治療腫瘤的方法，該方法包括向患者施用免疫細胞(NK，T，and DC細胞)的激活劑。在特別優(yōu)選的實施方案中，通過手術(shù)前靶向原發(fā)性腫瘤來預(yù)防和/或治療轉(zhuǎn)移瘤。
免疫細胞激活劑可以是CD8+T細胞的激活劑。所述激活劑的例子是抗體，尤其是單克隆抗體，人源化抗體等。在一個實施方案中，所述激活劑是編碼激活CD8+T細胞的多肽的核酸。
在一個實施方案中，所述免疫細胞激活劑是編碼激活免疫細胞的多肽、或者編碼激活免疫細胞的多肽的核酸或者包含它的藥用組合物。特別地，所述激活劑是LIGHT多肽或者編碼LIGHT的核酸。
在另一個實施方案中，所述免疫細胞激活劑是包含并表達編碼LIGHT的核酸的重組載體(例如重組病毒，優(yōu)選重組腺病毒或者禽痘病毒)或者包含這種重組載體的藥用組合物。
在另一個實施方案中，所述免疫細胞激活劑是包含并表達編碼LIGHT的核酸的腫瘤細胞或者腫瘤(優(yōu)選地，該腫瘤細胞或者腫瘤還包含并表達腫瘤抗原)或者包含腫瘤細胞或者腫瘤的藥用組合物，特別是治療性疫苗或者預(yù)防性疫苗。
在本發(fā)明中，除非另有說明，當(dāng)提及LIGHT時，LIGHT可以是野生型的、也可以是突變的，尤其是突變LIGHT。優(yōu)選地，所述突變LIGHT包含阻止蛋白酶對其降解的突變，例如，所述突變LIGHT是不含蛋白酶裂解位點的LIGHT，特別是，對于人LIGHT蛋白，不含人LIGHT蛋白第81-84位的蛋白酶解位點EQLI的突變LIGHT。但是，本發(fā)明不限于通過該突變來減少蛋白酶的消化或降解?；蛘撸鐾蛔僉IGHT優(yōu)選是具有細胞外域氨基酸序列和標(biāo)簽序列(例如便于純化的標(biāo)簽)，如具有LIGHT第85-239位的氨基酸序列和flag序列。LIGHT可以來自哺乳動物，優(yōu)選來自人，但也可以來自其它動物。
患者可以是哺乳動物，包括但不局限于人。
所述腫瘤可以是任何形式的腫瘤?？梢允窃l(fā)性腫瘤，但是更優(yōu)選是轉(zhuǎn)移性腫瘤。例如，在一些情況下，腫瘤是實體癌癥，例如但不局限于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、頭和頸癌、前列腺癌、甲狀腺癌、膀胱癌、胃癌、腦癌、黑色素瘤、鼻咽癌、皮膚癌或腎癌。癌癥可以是轉(zhuǎn)移的癌癥，例如轉(zhuǎn)移的乳腺癌。癌癥可以是生血細胞的癌癥，例如淋巴瘤或白血病。當(dāng)然，熟練技術(shù)人員會理解根據(jù)本發(fā)明可以治療任何數(shù)目的腫瘤/癌癥。
在本發(fā)明中，除非另有說明，“原發(fā)性腫瘤”是一個與“轉(zhuǎn)移性腫瘤”相對的概念，因此，在原發(fā)性腫瘤切除后發(fā)生的轉(zhuǎn)移性腫瘤也可看作“原發(fā)性腫瘤”。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述腫瘤是肝臟腫瘤。
在一個尤其優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明涉及預(yù)防和/或治療轉(zhuǎn)移性腫瘤的方法，該方法包括向患者施用免疫細胞激活劑。該免疫細胞激活劑可以是本文提到的任何免疫細胞激活劑，特別是LIGHT多肽或者編碼LIGHT的核酸、包含并表達編碼LIGHT的核酸的重組載體(例如重組病毒，優(yōu)選重組腺病毒或者禽痘病毒)、包含并表達編碼LIGHT的核酸的腫瘤細胞或者腫瘤、或者包含它們中一種或者多種的藥物組合物。
本發(fā)明方法可以采用任何適當(dāng)?shù)姆绞浇o藥，例如系統(tǒng)性給藥，優(yōu)選的是例如皮下、腫瘤內(nèi)給藥。
優(yōu)選的是，在原發(fā)性腫瘤切除之前靶向原發(fā)性腫瘤。在此情況下，可以在腫瘤內(nèi)給藥。對于肝臟中的腫瘤，表達LIGHT或其它免疫刺激物的腺病毒也可以進行系統(tǒng)性地遞送。
本發(fā)明還涉及免疫細胞激活劑在制備用于預(yù)防或者治療腫瘤的藥物中的用途。
本發(fā)明還涉及包含免疫細胞激活劑的腫瘤細胞或者腫瘤。
本發(fā)明還涉及包含免疫細胞激活劑、用于預(yù)防或者治療腫瘤的藥物組合物，特別是治療性疫苗或者預(yù)防性疫苗。
在另一方面，本發(fā)明涉及預(yù)防和/或治療肝臟病原體感染的方法，該方法包括向患者施用免疫細胞激活劑。如果適當(dāng)?shù)脑挘撁庖呒毎せ顒┛梢允潜疚奶岬降娜魏蚊庖呒毎せ顒?，特別是LIGHT多肽或者編碼LIGHT的核酸、包含并表達編碼LIGHT的核酸的重組載體(例如重組病毒，優(yōu)選重組腺病毒或者禽痘病毒)、或者包含它們中一種或者多種的藥物組合物。組織特異性靶向可能是局部疾病更有效的治療方法。腺病毒可用作病原體誘導(dǎo)的肝炎和肝癌(包括原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性肝癌)的肝特異性靶向試劑。腺病毒-LIGHT是靶向肝臟疾病(病原體和癌癥)的理想試劑。
本發(fā)明該方法可以采用任何適當(dāng)?shù)姆绞浇o藥，優(yōu)選系統(tǒng)性給藥。
本發(fā)明還涉及免疫細胞激活劑在制備用于預(yù)防或者治療肝臟病原體感染的藥物中的用途。
本發(fā)明還涉及包含免疫細胞激活劑、用于增強肝臟組織內(nèi)的免疫和/或預(yù)防或者治療肝臟病原體感染的藥物組合物。
在優(yōu)選實施方案中，肝臟病原體感染是病毒感染(特別是HBV和HCV感染)。
在更具體的方面，本發(fā)明涉及消除原發(fā)性腫瘤的方法，該方法包括給患者施用(例如，向腫瘤內(nèi)導(dǎo)入)包含并表達編碼LIGHT的核酸的重組載體(例如重組病毒，優(yōu)選重組腺病毒或者禽痘病毒)或者包含這種重組載體的藥用組合物。所述編碼LIGHT的核酸可以編碼突變或者未突變的LIGHT，和/或可以經(jīng)過密碼子優(yōu)化或者未經(jīng)過密碼子優(yōu)化。優(yōu)選所述編碼LIGHT的核酸編碼本文所述的突變LIGHT，并經(jīng)過密碼子優(yōu)化。
本發(fā)明還涉及預(yù)防轉(zhuǎn)移性腫瘤的方法，該方法包括給患者施用(例如，向原發(fā)性腫瘤內(nèi)導(dǎo)入)包含并表達編碼LIGHT的核酸的重組載體(例如重組病毒，優(yōu)選重組腺病毒或者禽痘病毒)或者包含這種重組載體的藥用組合物。
本發(fā)明還涉及治療已有轉(zhuǎn)移性腫瘤的方法，該方法包括給患者施用(例如，向原發(fā)性腫瘤內(nèi)導(dǎo)入)包含并表達編碼LIGHT的核酸的重組載體(例如重組病毒，優(yōu)選重組腺病毒或者禽痘病毒)或者包含這種重組載體的藥用組合物。
本發(fā)明還涉及預(yù)防或者治療肝臟病原體感染的方法，該方法包括給患者施用包含并表達編碼LIGHT的核酸的重組載體(例如重組病毒，優(yōu)選重組腺病毒或者禽痘病毒)或者包含這種重組載體的藥用組合物。
本發(fā)明還涉及用于消除原發(fā)性腫瘤、預(yù)防轉(zhuǎn)移性腫瘤、和/或治療已有轉(zhuǎn)移性腫瘤的藥用組合物，其含有包含并表達編碼LIGHT的核酸的重組載體(例如重組病毒，優(yōu)選重組腺病毒或者禽痘病毒)。
本發(fā)明還涉及用于預(yù)防或者治療肝臟病原體感染的藥用組合物，其含有包含并表達編碼LIGHT的核酸的重組載體(例如重組病毒，優(yōu)選重組腺病毒或者禽痘病毒)。所述編碼LIGHT的核酸可以編碼突變或者未突變的LIGHT，和/或可以經(jīng)過密碼子優(yōu)化或者未經(jīng)過密碼子優(yōu)化。優(yōu)選所述編碼LIGHT的核酸編碼本文所述的突變LIGHT，并經(jīng)過密碼子優(yōu)化。
相應(yīng)地，本發(fā)明涉及包含并表達編碼LIGHT的核酸的重組載體(例如重組病毒，優(yōu)選重組腺病毒或者禽痘病毒)在制備藥物中的用途，所述藥物用于消除原發(fā)性腫瘤、預(yù)防轉(zhuǎn)移性腫瘤、和/或治療已有轉(zhuǎn)移性腫瘤。例如，該藥物可通過將所述重組病毒導(dǎo)入到原發(fā)性腫瘤內(nèi)來給藥。
本發(fā)明還涉及包含并表達編碼LIGHT的核酸的重組載體(例如重組病毒，優(yōu)選重組腺病毒或者禽痘病毒)在制備藥物中的用途，所述藥物用于預(yù)防或者治療肝臟病原體感染。
在另一具體方面，本發(fā)明涉及包含并表達編碼LIGHT的核酸的腫瘤細胞或者腫瘤。優(yōu)選地，該腫瘤細胞或者腫瘤還包含并表達腫瘤抗原。
在一個具體實施方案中，本發(fā)明涉及腫瘤細胞或者腫瘤，其轉(zhuǎn)導(dǎo)了包含并表達編碼LIGHT的核酸的重組載體(例如重組病毒，優(yōu)選重組腺病毒或者禽痘病毒)。
優(yōu)選地，該腫瘤細胞或者腫瘤還被輻射處理。
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明腫瘤細胞或者腫瘤的藥用組合物，特別是治療性疫苗或者預(yù)防性疫苗。
在一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于消除原發(fā)性腫瘤、預(yù)防轉(zhuǎn)移性腫瘤、和/或治療已有轉(zhuǎn)移性腫瘤的治療性和/或預(yù)防性腫瘤疫苗，該腫瘤疫苗包含上述本發(fā)明的腫瘤細胞或者腫瘤。優(yōu)選地，該腫瘤疫苗還可包含可藥用載體。
相應(yīng)地，本發(fā)明還涉及包含并表達編碼LIGHT的核酸的重組載體(例如重組病毒，優(yōu)選重組腺病毒或者禽痘病毒)在制備例如治療性和/或預(yù)防性腫瘤疫苗中的用途，所述腫瘤疫苗用于消除原發(fā)性腫瘤、預(yù)防轉(zhuǎn)移性腫瘤、和/或治療已有轉(zhuǎn)移性腫瘤。
本發(fā)明也涉及上述本發(fā)明的腫瘤細胞或者腫瘤在制備治療性和/或預(yù)防性腫瘤疫苗中的用途，所述腫瘤疫苗用于消除原發(fā)性腫瘤、預(yù)防轉(zhuǎn)移性腫瘤、和/或治療已有轉(zhuǎn)移性腫瘤。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明上述腫瘤疫苗在制備藥物中的用途，所述藥物用于消除原發(fā)性腫瘤、預(yù)防轉(zhuǎn)移性腫瘤、和/或治療已有轉(zhuǎn)移性腫瘤。
相關(guān)地，本發(fā)明涉及消除原發(fā)性腫瘤的方法，該方法包括向患者施用本發(fā)明的腫瘤疫苗。
本發(fā)明還涉及預(yù)防轉(zhuǎn)移性腫瘤的方法，該方法包括向患者施用本發(fā)明的腫瘤疫苗。
本發(fā)明還涉及治療已有轉(zhuǎn)移性腫瘤的方法，該方法包括向患者施用本發(fā)明的腫瘤疫苗。
在用本發(fā)明的腫瘤疫苗治療或者預(yù)防疾病時，可通過多種途徑來給藥，優(yōu)選通過皮下途徑給藥。本發(fā)明的腫瘤疫苗可以在手術(shù)切除原發(fā)性腫瘤之后給予。
本發(fā)明還涉及用于增強肝臟抗轉(zhuǎn)移性腫瘤、原發(fā)性腫瘤和/或病毒感染(例如HBV和HCV)的免疫力的表達免疫增強劑，其含有包含并表達編碼LIGHT的核酸的重組載體(例如重組病毒，優(yōu)選重組腺病毒或者禽痘病毒)。
LIGHT可刺激各種免疫細胞、T細胞、NK細胞和DC，因而可以作為免疫增強劑。LIGHT可打破局部腫瘤部位或者肝臟部位的耐受性，由于在這些部位LIGHT的高表達。腺病毒可以特異性靶向肝臟，肝臟含有比其它周圍組織更多的T細胞和NK細胞。
本發(fā)明還涉及含有包含并表達編碼LI GHT的核酸的重組載體(例如重組病毒，優(yōu)選重組腺病毒或者禽痘病毒)在用于制備表達免疫增強劑中的用途，所述表達免疫增強劑用于增強肝臟抗轉(zhuǎn)移性腫瘤、原發(fā)性腫瘤和/或病毒感染(例如HBV和HCV)的免疫力。
本發(fā)明還涉及增強肝臟抗轉(zhuǎn)移性腫瘤、原發(fā)性腫瘤和/或病毒感染(例如HBV和HCV)的免疫力的方法，該方法包括給患者施用包含并表達編碼LIGHT的核酸的重組載體(例如重組病毒，優(yōu)選重組腺病毒或者禽痘病毒)或者上述本發(fā)明的表達免疫增強劑。
本發(fā)明也還涉及增加肝臟中TNF-α和IFN-γ或者CD8+T細胞的量的方法，該方法包括給患者施用包含并表達編碼LIGHT的核酸的重組載體(例如重組病毒，優(yōu)選重組腺病毒或者禽痘病毒)或者本發(fā)明的表達免疫增強劑。
在本發(fā)明中，本發(fā)明的藥物和治療方法可以與其它藥物和治療方法聯(lián)合使用，例如本發(fā)明的藥物和治療方法還可以包括將原發(fā)性腫瘤切除、和/或化學(xué)治療、和/或放射治療。
在一個優(yōu)選的實施方案中，在原發(fā)性腫瘤切除之前向原發(fā)性腫瘤內(nèi)給予本發(fā)明的免疫細胞激活劑。
在一個實施方案中，本發(fā)明的藥物(藥物組合物)還包括其它活性成分，并且所述藥物被配制成適于本發(fā)明的免疫細胞激活劑和所述其它活性成分同時給藥或者分開給藥的形式。
在某些實施方案中，免疫細胞激活劑和其它活性成分同時進行遞送。在某些實施方案中，免疫細胞激活劑和其它活性成分在不同的時候進行遞送。在一個實施方案中，所述其它活性成分是化學(xué)治療藥物，尤其是對免疫細胞沒有實質(zhì)性毒性的化療藥物。在另一個實施方案中，所述其它活性成分是放療藥物。在一個實施方案中，所述其它活性成分是抗癌疫苗，例如基因疫苗或者肽疫苗。在一個實施方案中，所述其它活性成分是治療性多肽或者編碼治療性多肽的核酸。
在另一方面本發(fā)明還涉及包含并表達編碼突變LIGHT的核酸的重組病毒，優(yōu)選地，該重組病毒是重組腺病毒或者禽痘病毒。優(yōu)選地，所述突變LIGHT包含阻止蛋白酶對其降解的突變，例如，所述突變LIGHT是不含蛋白酶裂解位點的LIGHT，特別是不含小鼠LIGHT蛋白第79-82位的蛋白酶解位點EKLI的小鼠突變LIGHT，或者不含人LIGHT蛋白第81-84位的蛋白酶解位點EQLI的人突變LIGHT。在另一個實施方案中，所述突變LIGHT具有細胞外域氨基酸序列和標(biāo)簽序列(例如便于純化的標(biāo)簽)，如具有LIGHT第85-239位的氨基酸序列和flag序列。
為了獲得更好的轉(zhuǎn)錄和翻譯，還可以優(yōu)化LIGHT的密碼子。密碼子修飾可改變基因的10-15％，以優(yōu)化GC含量等。但是，密碼子修飾不改變編碼的氨基酸序列。
發(fā)明人已經(jīng)系統(tǒng)地修飾了LIGHT的密碼子，改變了10％的密碼子。這允許更穩(wěn)定地表達高水平的LIGHT。優(yōu)選的例子在下文實施例中進行了描述。
優(yōu)選所述編碼LIGHT的核酸編碼本文所述的突變LIGHT，并經(jīng)過密碼子優(yōu)化。
在另一方面本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明重組病毒的藥用組合物，特別是治療性疫苗或者預(yù)防性疫苗。
在另一方面本發(fā)明還涉及本發(fā)明病毒或者組合物在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。
在另一方面，本發(fā)明還涉及治療癌癥或者破壞腫瘤的方法，包括向癌癥患者給予包含并表達編碼突變LIGHT的核酸的重組載體(例如重組病毒，優(yōu)選重組腺病毒或者禽痘病毒)或者包含這種重組載體的藥用組合物；或者向癌癥患者給予包含并表達編碼突變LIGHT的核酸的腫瘤細胞或者腫瘤(優(yōu)選地，該腫瘤細胞或者腫瘤還包含并表達腫瘤抗原)或者包含這種腫瘤細胞或者腫瘤的藥用組合物，特別是治療性疫苗或者預(yù)防性疫苗。在一個優(yōu)選實施方案中，所述給予是向腫瘤內(nèi)給予。
在另一方面，本發(fā)明還涉及包含并表達編碼突變LIGHT的核酸的腫瘤細胞或者腫瘤，優(yōu)選地，該腫瘤細胞或者腫瘤還包含并表達腫瘤抗原；還涉及包含本發(fā)明腫瘤細胞或者腫瘤的藥用組合物，特別是治療性疫苗或者預(yù)防性疫苗。
在本發(fā)明的所有方面(包括本發(fā)明的組合物、用途、腫瘤細胞或者腫瘤、疫苗、或者重組病毒，如果適用的話)的一個優(yōu)選實施方案中，所述LIGHT編碼核酸是相對于宿主進行了密碼子優(yōu)化的核酸，更優(yōu)選進行了密碼子優(yōu)化并突變了蛋白酶裂解位點以阻止蛋白酶對編碼的LIGHT蛋白降解的核酸，例如，編碼不含小鼠LIGHT蛋白第79-82位的蛋白酶解位點EKLI的小鼠突變LIGHT多肽或者不含人LIGHT蛋白第81-84位的蛋白酶解位點EQLI的人突變LIGHT多肽并經(jīng)過密碼子優(yōu)化的核酸，優(yōu)選SEQ ID NO2和3中所示的編碼核酸。
本發(fā)明還涉及經(jīng)過密碼子優(yōu)化但不改變氨基酸序列的LIGHT編碼核酸，優(yōu)選人LIGHT編碼核酸。本發(fā)明還涉及經(jīng)過密碼子優(yōu)化并突變了蛋白酶裂解位點以阻止蛋白酶對編碼的LIGHT蛋白降解的核酸，例如，編碼不含小鼠LIGHT蛋白第79-82位的蛋白酶解位點EKLI的小鼠突變LIGHT多肽或者不含人LIGHT蛋白第81-84位的蛋白酶解位點EQLI的人突變LIGHT多肽并經(jīng)過密碼子優(yōu)化的核酸，優(yōu)選SEQ IDNO2和3中所示的編碼核酸。本發(fā)明還涉及包含上述核酸的載體以及轉(zhuǎn)化了該載體的宿主細胞。
可考慮到，如果適當(dāng)，在該說明書中所討論的任何實施方案可以就本發(fā)明的任何方法或組合物進行實施，反之亦然。此外，本發(fā)明的組合物可以用于獲得本發(fā)明的方法。
在整個該申請中，術(shù)語“大約”用于表明，值包含用于測定該值的設(shè)備、方法的固有誤差變化，或者包含在研究患者中存在的變化。
在該說明書和權(quán)利要求中使用時，詞“含有”、“具有”、“包括”或“包含”是寬泛的或無限制的，它們不排出另外的、未描述的成分或方法步驟。
本發(fā)明的其他目標(biāo)、特征和優(yōu)點將會從下面的詳述中清楚地了解到。可是，應(yīng)當(dāng)理解，詳述和特殊的實施例雖然指出了本發(fā)明的特殊實施方案，但只是為了舉例說明，因為從該詳述中，在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修飾對于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來說都會是顯而易見的。


圖1A.通過用Ad-LIGHT在腫瘤內(nèi)治療來根除已經(jīng)建立的轉(zhuǎn)移性腫瘤。在Balb/c小鼠脅腹皮下注射的4T1乳腺癌細胞在腫瘤接種后第14天和第17天用Ad-LIGHT或Ad-control(Ad-對照)(2×109PFU)皮下處理。在第28天手術(shù)切除原發(fā)腫瘤(～150mm3)，在第35天處死小鼠用于肺集落生成試驗(colonogenic assay)。數(shù)據(jù)代表三個實驗。
B.用輻射后的自體腫瘤細胞接種根除已建立的腫瘤轉(zhuǎn)移。在第0天在Balb/c脅腹皮下接種6×104個4T1腫瘤細胞。在第22天手術(shù)取出原發(fā)腫瘤，之后向乳房脂肪墊中皮下注射經(jīng)Ad-LIGHT或Ad-對照(4×109PFU)感染及輻射后的4T1細胞(1×106個細胞)。第21天，在小鼠的乳房墊中第二次注射接種新鮮制備的細胞。腫瘤接種后第45天處死小鼠，并通過肺集落生成試驗進行分析。數(shù)據(jù)為兩個獨立實驗的代表。
#cologenic tumer cells per liver每個肝臟的集落生成腫瘤細胞數(shù)Ad-Control含有對照的腺病毒Ad-LIGHT含有LIGHT的腺病毒圖2.肝細胞對腺病毒感染敏感。給小鼠注射3×109pfu。48小時后，消化肝細胞并收獲用于通過LTbR-Ig和抗人-FITC測定進行的LIGHT表達分析。
圖3.1×106個腫瘤細胞鋪于100mm細胞培養(yǎng)皿中24小時，然后用Ad-LIGHT以4×108pfu/ml感染24小時。收獲細胞，并通過FACS檢查LIGHT表達先使用0.02mg/mL LTβR-Ig染色，然后使用第二步抗體PE偶聯(lián)的猴抗人IgG染色(白色)；或者僅僅使用第二步抗體進行染色，作為對照(灰色)。
圖4.Ad-LIGHT治療可控制自發(fā)性轉(zhuǎn)移瘤。A-B.4T1腫瘤細胞上LIGHT的局部表達可預(yù)防自發(fā)性轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)生。體外培養(yǎng)的4T1乳腺癌(1×106個細胞)用Ad-LIGHT或者Ad-對照(4×108PFU/ml)感染24小時，然后皮下注射1×105個細胞到Balb/c小鼠脅腹。檢測腫瘤生長(A)，直到接種腫瘤后第35天處死小鼠，進行肺集落生成分析(B)。數(shù)據(jù)代表了兩個實驗。C.向腫瘤內(nèi)注射Ad-LIGHT可預(yù)防轉(zhuǎn)移瘤擴散。皮下注射1×105個4T1乳腺癌細胞到Balb/c小鼠脅腹。在接種腫瘤后第7天，向腫瘤內(nèi)注射Ad-LIGHT或者Ad-對照(5×109PFU)。在第18天手術(shù)切除原發(fā)性腫瘤。在接種腫瘤后第35天處死小鼠，用于肺集落生成試驗。數(shù)據(jù)代表兩個獨立實驗。
圖5.腫瘤內(nèi)LIGHT刺激的抗原特異性T細胞可轉(zhuǎn)移到遠端部位。A.向OT-1小鼠皮下接種表達相同量Ld抗原的106Ag104Ld或者Ag104Ld-LIGHT細胞。10-14天后，向這些OT-1小鼠輸注3×106CFSE-標(biāo)記的2C T細胞。過繼轉(zhuǎn)移后第14-20天在引流淋巴結(jié)(DLNs)、非DLNs和脾臟以及腫瘤本身中評價2C T細胞表達CD44和分泌IFN-γ的情況。B-C.每只OT-1小鼠用兩個腫瘤接種。原發(fā)性腫瘤是106Ag104Ld或者Ag104Ld-LIGHT腫瘤細胞，而繼發(fā)性腫瘤是105Ag104Ld腫瘤細胞。在腫瘤攻擊后第10-14天，向小鼠輸注3x106CFSE-標(biāo)記的2C T細胞。在原發(fā)性腫瘤和繼發(fā)性腫瘤中在過繼轉(zhuǎn)移后第3、5和10天評價2C T細胞的存在和CFSE稀釋(CFSE dilution)(B)。比較在帶有表達LIGHT的Ag104Ld或者親本Ag104Ld的宿主中繼發(fā)性腫瘤內(nèi)2C T細胞的百分比(C)。D.過繼轉(zhuǎn)移后，來自Ad-LIGHT處理小鼠淋巴器官的T細胞介導(dǎo)了對已建立腫瘤的排斥。將105Ag104Ld腫瘤細胞接種到C3B6F1小鼠中。在腫瘤攻擊后第14天用5×1010個Ad-LIGHT或Ad-control病毒顆粒處理小鼠。在處理后第7天，我們從處理小鼠收集脾臟和淋巴結(jié)，純化T細胞，并將107個這些T細胞過繼轉(zhuǎn)移到帶有已經(jīng)建立7天的Ag104Ld腫瘤的C3B6F1小鼠中。檢測這些小鼠中腫瘤的生長。
圖6.對原發(fā)性腫瘤用Ad-LIGHT處理可在繼發(fā)性腫瘤中誘導(dǎo)強烈的抗腫瘤免疫應(yīng)答。在原發(fā)性腫瘤攻擊6天后用105Ag104Ld和105Ag104Ld腫瘤細胞接種每只C3B6F1小鼠。在繼發(fā)性腫瘤接種5天后在原發(fā)性腫瘤接種物上用5×1010腺病毒顆粒進行腫瘤內(nèi)Ad-LIGHT處理。檢測原發(fā)性和繼發(fā)性腫瘤的生長(A)。檢查DLN、脾臟、原發(fā)性腫瘤和繼發(fā)性腫瘤中CD8+T細胞占Ly5.2+細胞的百分數(shù)以及產(chǎn)生IFN-γ的CD8+T細胞占CD8+T細胞的百分數(shù)(B)，并進行統(tǒng)計學(xué)分析(C)。在Ad-LIGHT或者Ad-對照處理7天后收獲脾臟和腫瘤組織，研磨這些組織，收集上清液進行細胞因子測定(D)。
圖7顯示了一個突變了蛋白酶位點、同時又優(yōu)化了密碼子的小鼠LIGHT序列(SEQ ID NO3)。
圖8顯示了野生型LIGHT、突變型LIGHT、突變且經(jīng)密碼子修飾的LIGHT的表達。
具體實施例方式
LIGHT治療LIGHT是一個新發(fā)現(xiàn)的作用于免疫調(diào)節(jié)的基因。我們所進行的突變和密碼子修飾能夠提高其在細胞表面表達的穩(wěn)定性從而更好地刺激免疫反應(yīng)。對LIGHT的四個氨基酸的突變阻止了該蛋白質(zhì)的降解。在未突變時，在轉(zhuǎn)染的細胞系中沒有抗腫瘤活性。密碼子修飾允許表面上的LIGHT增加4-8倍(見下文實施例)。LIGHT的增加對于起抗腫瘤活性的增加是重要的。我們關(guān)于采用LIGHT將腫瘤組織轉(zhuǎn)化為淋巴組織的發(fā)明包括了一個新的基因免疫治療的思想和一個新的突變基因。
我們已經(jīng)明確一種新的對腫瘤的免疫治療方法通過在腫瘤組織中誘發(fā)淋巴組織使淋巴細胞能夠直接接觸和攻擊腫瘤細胞，在腫瘤內(nèi)部誘導(dǎo)適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)并產(chǎn)生更多的效應(yīng)T細胞從而清除轉(zhuǎn)移瘤及根除腫瘤。LIGHT是作為基質(zhì)細胞表達的淋巴毒受體和T細胞表達的HVEM的配合體。通過將突變的LIGHT引入腫瘤組織之中，將誘發(fā)出高水平的化學(xué)因子和粘附分子，并且伴隨大量的未活化T淋巴細胞的津潤。LIGHT的突變體阻止了蛋白酶對其的降解，使得LIGH能夠在腫瘤細胞的表面完整表達。LIGHT對免疫反應(yīng)的協(xié)同激活活性將對腫瘤特異的T淋巴細胞反應(yīng)的選擇性激活有極大的幫助，從而有益于清除現(xiàn)存的高進行性的原發(fā)腫瘤和其他衍生部位的腫瘤。表達LIGHT的腫瘤細胞可以作為臨床相關(guān)的治療性疫苗，可用于根除已存的原發(fā)腫瘤。表達LIGHT的腫瘤細胞作為臨床相關(guān)的治療性疫苗將在腫瘤內(nèi)部吸引并活化原始淋巴細胞，從而產(chǎn)生更多的抗腫瘤淋巴細胞用于清除腫瘤。我們的研究已經(jīng)證明腫瘤壞死因子超家族(TNFSF14)和LIGHT能夠在腫瘤內(nèi)部的基質(zhì)細胞和淋巴細胞表面形成受體信號并吸引腫瘤特異性的T細胞。我們發(fā)現(xiàn)LIGHT轉(zhuǎn)化的腫瘤細胞能夠通過協(xié)同其兩類受體的新的作用而增強對已存原發(fā)腫瘤的免疫清除反應(yīng)。我們的研究數(shù)據(jù)表明腫瘤組織表達的LIGHT具有更強的激發(fā)對原發(fā)進行性腫瘤的清除作用，強于其他細胞因子和協(xié)同刺激分子的激發(fā)作用(NatureImmunology，Vol.5，No.2，2004年2月，p.141-149)。到目前為止，象LIGHT這樣，有如此雙重的征召和激活T細胞的效能的分子尚未見有任何其他的報道。這樣的特性使我們能夠開發(fā)出一種全新的對腫瘤的免疫治療方法。
優(yōu)選地，LIGHT是突變LIGHT。特別優(yōu)選的是，所述突變LIGHT包含阻止蛋白酶對其降解的突變，例如，所述突變LIGHT是不含蛋白酶裂解位點的LIGHT，特別是不合LIGHT蛋白第79-82位的蛋白酶解位點EQLI(對于人LIGHT而言)的突變LIGHT。在另一個實施方案中，所述突變LIGHT具有細胞外域氨基酸序列和標(biāo)簽序列(例如便于純化的標(biāo)簽)，如具有LIGHT第85-239位的氨基酸序列和flag序列。LIGHT氨基酸序列以及氨基酸殘基編號參見Nature Immunology，Vol.5，No.2，2004年2月，p.141-149。另一個重要的改變是密碼子修飾，這允許更好地表達LIGHT。在本發(fā)明之前，沒有人進行密碼子修飾來研究其表達。我們的數(shù)據(jù)顯示，突變和密碼子修飾顯著提供了LIGHT的表達。
LIGHT或者突變體LIGHT的給藥優(yōu)選是通過各種病毒投送系統(tǒng)或表達LIGHT的腫瘤細胞來進行的。具體地，包括向癌癥患者給予包含并表達編碼突變LIGHT的核酸的重組載體(例如重組病毒，優(yōu)選重組腺病毒或者禽痘病毒)或者包含這種重組載體的藥用組合物；或者向癌癥患者給予包含并表達編碼突變LIGHT的核酸的腫瘤細胞或者腫瘤(優(yōu)選地，該腫瘤細胞或者腫瘤還包含并表達腫瘤抗原)或者包含這種腫瘤細胞或者腫瘤的藥用組合物，特別是治療性疫苗或者預(yù)防性疫苗。在一個優(yōu)選實施方案中，所述給予是向腫瘤內(nèi)給予。特別是，將上述重組病毒或者腫瘤細胞注射到腫瘤原發(fā)部位優(yōu)選的病毒投送系統(tǒng)包括，但不限于，重組的腺病毒和禽痘病毒(fowlpox virus)等其他病毒。在特別優(yōu)選的實施方案中，突變體LIGHT通過重組的腺病毒和禽痘病毒來給藥。如果原發(fā)腫瘤細胞在1-2月內(nèi)未能被清除，腫瘤將被手術(shù)切除或放射照射。我們的前期實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)過LIGHT的治療處理，動物體建立了強烈的腫瘤免疫記憶，能夠清除末梢部位的腫瘤。
使用重組的腺病毒和禽痘病毒來給藥具有特別的優(yōu)點，例如，效率更高和更安全。由于易于生產(chǎn)而且產(chǎn)量高，重組腺病毒已經(jīng)廣泛用于人和動物實驗，但是大多數(shù)患者可能會有抗腺病毒抗體，它們可能會迅速中和注入的腺病毒。還不清楚腫瘤內(nèi)注射腺病毒是否會避免這種快速清除。很少有患者在血清中有抗禽痘病毒抗體。因此，這種重組病毒的持續(xù)是一個潛在優(yōu)點。有可能能夠初始使用重組腺病毒、然后用禽痘病毒治療患者，以降低宿主清除病毒的反應(yīng)。我們的初步結(jié)果顯示，將帶有50ul of重組LIGHT的5×1010病毒顆粒在腫瘤內(nèi)注射到已建立的Ag104Ld腫瘤中，導(dǎo)致局部和遠處腫瘤的排斥(5/5)，而對照病毒(沒有LIGHT)沒有明顯保護(5只小鼠中0只被排斥)并且所有小鼠在兩個月內(nèi)死于腫瘤。重復(fù)實驗獲得了相似的結(jié)果。(請給出具體試驗過程，更多的實例在以下給出)Ad-LIGHT可介導(dǎo)已經(jīng)建立的自發(fā)肝轉(zhuǎn)移性腫瘤(establishedspontaneous liver metastasis)的排斥?，F(xiàn)有治療方法可成功根除轉(zhuǎn)移性腫瘤的極為稀少。我們目前測試了在手術(shù)切除腫瘤之前在腫瘤組織內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答是否能夠產(chǎn)生足以根除遠處轉(zhuǎn)移性腫瘤(distant metastases)的腫瘤特異性效應(yīng)T細胞。將表達LIGHT的腺病毒接種到處于已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移的階段的原發(fā)性4T1乳腺癌中。如下面的實施例證明的，這種治療能夠根除轉(zhuǎn)移性腫瘤。
藥物組合物本發(fā)明藥物組合物含有有效量的免疫細胞激活劑和可藥用載體。術(shù)語“可藥用”是指當(dāng)施用于動物(如果合適，例如為人類)時，不產(chǎn)生不利的、過敏的或其它不想要的反應(yīng)的分子實體和組合物。根據(jù)本發(fā)明的公開內(nèi)容以及Remington′s Pharmaceutical Sciences，18thEd.Mack Printing Company，1990(此處引用作為參考)的說明，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道如何制備含有免疫細胞激活劑的藥物組合物。而且，對于動物(例如人類)施用來說，應(yīng)理解該制劑應(yīng)該滿足管理當(dāng)局所要求的無菌性、熱原性、總體安全性和純度標(biāo)準(zhǔn)。
如此處所用，″可藥用的載體″是指本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣劑、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗細菌劑、抗真菌劑)、等滲劑、吸收延緩試劑、鹽、防腐劑、藥物、藥物穩(wěn)定劑、凝膠、結(jié)合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、調(diào)味劑、染料、類似物質(zhì)及其組合(參見，例如Remington′sPharmaceutical Sciences，18th Ed.Mack Printing Company，1990，pp.1289-1329，此處引用作為參考)。除非傳統(tǒng)載體與活性組分不相容，否則它們都可以用于所述藥物組合物中。
本發(fā)明的藥物組合物可以含有不同類型的載體，這取決于它是以固體、液體還是氣霧劑的形式施用以及它是否需要滅菌以適用于注射之類的施用途徑。本發(fā)明組合物可以如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的經(jīng)靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、透皮、鞘內(nèi)、動脈內(nèi)、腫瘤內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、直腸內(nèi)、表皮(topical)、肌內(nèi)、皮下、粘膜地、口服、表皮地、局部地、吸入(例如氣霧劑吸入)、注射、輸注、連續(xù)輸注等方式施用，或直接、經(jīng)導(dǎo)管、經(jīng)灌洗器而局部灌注擴散于靶細胞，或以霜劑、液體組合物(例如脂質(zhì)體)或其它方式或上述的任何組合來施用。參見，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th Ed.Mack PrintingCompany，1990，此處引用作為參考)。
對于HBV、HCV、原發(fā)性肝臟腫瘤或肝臟中的轉(zhuǎn)移性腫瘤，表達LIGHT或其它免疫刺激物的腺病毒也可以進行系統(tǒng)性地遞送。
系統(tǒng)性給藥的腺病毒能夠優(yōu)先地定位于肝臟并在該位點刺激局部免疫細胞以根除腫瘤。
用于癌癥/腫瘤的組合療法為了增強免疫細胞激活劑的效能，理想的是，將本發(fā)明的這些組合物和方法與有效治療過度增生性疾病的物質(zhì)(例如抗癌試劑)聯(lián)用。“抗癌”試劑能對受試者中的癌產(chǎn)生負影響，例如，通過殺死一種或多種癌細胞、在一種或多種癌細胞中誘導(dǎo)細胞凋亡、降低一種或多種癌細胞的生長速率、降低轉(zhuǎn)移的發(fā)生率或數(shù)目、減少腫瘤大小、抑制腫瘤生長、減少對腫瘤或一種或多種癌細胞的血液供應(yīng)、提高對一種或多種癌細胞或腫瘤的免疫應(yīng)答、防止或抑制腫瘤的發(fā)展、或者增加癌癥患者的壽命。抗癌試劑包括，例如，化療試劑(化學(xué)療法)、放療試劑(放射療法)、手術(shù)方法(手術(shù))、免疫治療試劑(免疫療法)、遺傳治療試劑(基因療法)、激素療法、其它生物試劑(生物療法)和/或替代性療法。
“抗癌”試劑的一個優(yōu)選例子是調(diào)節(jié)性T細胞耗損劑。調(diào)節(jié)性T細胞耗損劑是任何一種或多種耗損調(diào)節(jié)性T細胞的化合物、組合物、混合物或者聯(lián)合制劑。調(diào)節(jié)性T細胞耗損劑包括，但不限于，抗調(diào)節(jié)性T細胞抗體，如人源化的抗-CD4抗體；或者此處公開的、現(xiàn)有技術(shù)已知的或?qū)⒁话l(fā)現(xiàn)的耗損調(diào)節(jié)性T細胞(特別是CD4+T細胞)的任何其它化合物或者一個或者多個這種化合物的組合。
在這些方面，所述調(diào)節(jié)性T細胞優(yōu)選是CD4+T細胞，特別是CD4+CD25+T細胞。所述調(diào)節(jié)性T細胞可以在腫瘤部位處，和/或在腫瘤內(nèi)，和/或在腫瘤外。所述耗損可以是腫瘤局部的，和/或是全身性的。
在一個實施方案中，所述調(diào)節(jié)性T細胞耗損劑是調(diào)節(jié)性T細胞的抗體，特別是抗CD4+抗體，如抗CD4+CD25+抗體；或者，所述調(diào)節(jié)性T細胞耗損劑是IL2-毒素。所述抗體優(yōu)選是抗人CD4+抗體。所述抗體可以是單克隆抗體或者多克隆抗體。優(yōu)選地，抗體是人源化抗體。
更一般地說，這樣的(抗癌)試劑將與免疫細胞激活劑一起以有效殺死癌細胞或抑制其增殖的組合量提供。這樣的方法可以包括將細胞與試劑和免疫細胞激活劑同時接觸，或者在一個時間段內(nèi)接觸，其中將免疫細胞激活劑與試劑分開施用給細胞、組織或生物產(chǎn)生了所需的治療效果。這也可以通過下述方式實現(xiàn)將細胞、組織或生物與同時含有免疫細胞激活劑和一種或多種試劑的單一組合物或藥物制劑接觸，或者將細胞與兩種或多種不同的組合物或制劑接觸，其中一種組合物包含免疫細胞激活劑，而另一種組合物包含一種或多種試劑。
當(dāng)用于細胞、組織或生物時，術(shù)語“接觸”和“暴露”在此處是指這樣一種過程，借助于該過程，免疫細胞激活劑和/或其它試劑(例如化療試劑或放療試劑)的治療構(gòu)建物被遞送于靶細胞，或被直接并列置于所述靶細胞、組織或生物中。為了殺死細胞或使細胞靜息，免疫細胞激活劑和/或額外試劑以有效殺死所述細胞或防止它們分裂的組合量遞送給一種或多種細胞。
免疫細胞激活劑可以在其它試劑之前、與其同時和/或在其之后施用，其間的時間間隔為數(shù)分鐘至數(shù)星期。在一些實施方案中，免疫細胞激活劑與其它試劑分開施用于細胞、組織或生物，在這樣的實施方案中，通常應(yīng)該保證每次遞送之間的時間間隔不應(yīng)太長，從而使得耗損CD4+T細胞的化合物和試劑仍能對所述細胞、組織或生物施加有利的組合效果。
實施例引入下面實施例來證明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將意識到，下面實施例所公開的技術(shù)代表本發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的用于很好實施本發(fā)明的技術(shù)，因此可以認為它們構(gòu)成了實施本發(fā)明的優(yōu)選方式。但是，在閱讀本發(fā)明公開內(nèi)容后，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員也應(yīng)認識到，可以對所公開的具體實施方案進行許多改變而仍能得到相似的結(jié)果，但又不背離本發(fā)明的精神和范圍。
材料和方法小鼠和細胞系。5-8周大小的雌性C3HxB6F1(C3B6F1)和C3H小鼠購自US National Cancer Institute的Frederick CancerResearch Facility，并被飼養(yǎng)于芝加哥大學(xué)的不含病原體的特定設(shè)備中。根據(jù)學(xué)院和National Institutes of Health(NIH)的規(guī)定對動物進行照料和研究，并經(jīng)芝加哥大學(xué)的動物使用委員會的批準(zhǔn)。已經(jīng)描述了表達鼠H-2Ld(AG104-Ld)的Ag104細胞系(Wang，2001)和Ag104纖維肉瘤(Wick等人，1997)。
組織學(xué)和免疫學(xué)。用于組織學(xué)檢查的人類腫瘤組織于10％緩沖的中性福爾馬林中固定，石蠟包埋，并使用標(biāo)準(zhǔn)方法用蘇木精和曙紅(H&E)染色，或根據(jù)制造商的說明用特異于CD4(NovocastraLaboratories，UK)和CD8(DAKO，CA)的單克隆抗體染色。分別通過使用DAB(Sigma-Aldrich，MO)的過氧化物酶技術(shù)或使用Vector Blue(Vector，CA)的APAAP技術(shù)來揭示抗-CD4或抗-CD8抗體的結(jié)合。對于乳腺癌樣本，在一個隨機選取的40倍高被視野中對CD4+和CD8+細胞進行手工計數(shù)。
測量脾和腫瘤中的細胞因子。根據(jù)描述(Janssen等人，2003)，本發(fā)明人制備了腫瘤和脾的勻漿。簡而言之，收集相當(dāng)數(shù)量的腫瘤或脾組織，稱重，并在含有蛋白酶抑制劑的PBS中進行勻漿，通過離心收集上清液。根據(jù)制造商的說明，在配有細胞QuestPro和CBA軟件的FACSCaliber血細胞計數(shù)器(BD Pharmingen)中使用細胞計數(shù)珠陣列試劑盒(CBA)來定量上清液中的細胞因子數(shù)量。
流式細胞分析。使用異硫氰酸熒光素(FITC)綴合的、藻紅蛋白(PE)綴合的、Cy-鉻綴合的或生物綴合的針對小鼠CD45RB、CD4、CD8、CD25和IFN的抗體(均來自BD Pharmingen)進行FACS分析。鏈霉親合素-Cy-鉻綴合物來自BD Pharmingen；針對2C TCR的生物素綴合的克隆型抗體(1B2)細胞染色按照所描述的進行(Sun和Bevan，2003)。對于細胞內(nèi)細胞因子染色，在Brefeldin A(Sigma-Aldrich)的存在下，用PMA(50ng/ml，Sigma-Aldrich)和離子霉素(500ng/ml，Sigma-Aldrich)對純化自腫瘤組織的T細胞再刺激4小時。對于CFSE-標(biāo)記的2C T細胞的分析，用生物素化的1B2抗體對分離的腫瘤或脾單細胞懸浮液進行染色，洗滌，并用PE偶聯(lián)的抗-CD8和CyC偶聯(lián)的鏈霉親合素的混合物染色。用FlowJo軟件(BD Pharmingen)分析FACS數(shù)據(jù)。
2C T細胞的適應(yīng)性轉(zhuǎn)移。本發(fā)明人首先通過將106MC57-SIY個腫瘤細胞皮下接種于B6/Rag-1-/-背景的2C小鼠(2C小鼠)的多個位點來激活2C T細胞(Sun和Bevan，2003)。發(fā)明人接著從這些被攻擊的2C小鼠中分離淋巴結(jié)細胞和脾細胞，并在腫瘤接種后5天用CD8+T細胞富集試劑盒(Miltenyi Biotec)對CD8+T細胞進行負選擇。當(dāng)分析時，大部分2C細胞表達CD44高CD62L低表型。按照所描述的(Sun和Bevan，2003)，接著用CFSE對這些2C T細胞進行標(biāo)記。發(fā)明人將3×106個CFSE-標(biāo)記的T細胞(體積0.2-ml)靜脈內(nèi)注射于帶有腫瘤的小鼠的眼窩后血管叢(retro-orbital plexus)。轉(zhuǎn)移后48小時從脾和腫瘤中分離細胞，并進行FACS分析。
實時定量性RT-PCR檢測。按照描述(Shedlock和Shen，2003)，對foxp-3進行實時定量性反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測。簡而言之，從腫瘤中分離總RNA，使用First Strand cDNA Synthesis Kit(Amersham Pharmacia，NJ)將5μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成互補。在CepheidSmartCycler實時熱循環(huán)儀(Cepheid，CA)上進行實時定量性PCR分析。根據(jù)制造商的說明(PE Applied Biosystems，MA)，用含有AmpliTaqGold DNA Polymerase的TaqMan Universal PCR master混合物擴增每一cDNA樣品中的foxp-3和GAPDH。發(fā)明人利用比較型CT(擴增曲線和閾值的交點處的閾值循環(huán)數(shù)目)方法確定了目標(biāo)基因的濃度，并將數(shù)值對內(nèi)部GAPDH對照進行標(biāo)準(zhǔn)化。用于foxp-3的引物序列為5′-CCCAGGAAAGACAGCAACCTT-3′(正向引物)和5′-TTCTCACAACCAGGCCACTTG-3′(反向引物)，用于FOXP-3的探針為5′-ATCCTACCCACTGCTGGCAAATGGAGTC-3′。
制備表達LIGHT的腺病毒。先前(22)已經(jīng)制備了突變鼠LIGHT(mmLIGHT)。為了構(gòu)建重組mmLIGHT-腺病毒，從pCDN3.1-mmLIGHT切下含有鼠LIGHT cDNA的BamH1/NotI片段，將該片段克隆在第一親本質(zhì)粒pLEP-ubp(左端質(zhì)粒(？)，Tetr)的BamH/NotI位點中位于人類泛素啟動子(ubp)后。之后，pLEP-mmLIGHT與第二質(zhì)粒pREP(右端質(zhì)粒，Ampr)在唯一的內(nèi)含子編碼的Cla I位點連接。用λ噬菌體包裝提取物包裝連接產(chǎn)物。通過Amp/Tet LB瓊脂板上的生長選擇pLEP/pREP雜合粘粒。利用Bgl II消化進一步鑒定含有插入的mmLIGHT的重組粘粒。通過I-Ceu I消化從重組粘粒中釋放出Adv-mmLIGHT DNA片段，并且不經(jīng)進一步純化，用I-CeuI消化的混合物轉(zhuǎn)染293細胞以制備重組腺病毒(Adv-mmLIGHT)。
腫瘤注射、治療和通過集群生成試驗評價腫瘤轉(zhuǎn)移。對于Ag104Ld腫瘤，用結(jié)果部分中所述的劑量皮下接種C3B6F1小鼠的尾根部周圍區(qū)域。對于B16-SIY和MC38腫瘤，分別用106或105個腫瘤細胞皮下接種B6小鼠的尾根部周圍區(qū)域。對于4T1腫瘤，用105個腫瘤細胞皮下接種Balb/c小鼠的尾根部周圍區(qū)域或乳房脂墊內(nèi)。在含有所示量的病毒粒和pfu的50μl PBS中用Ad-LIGHT或Ad-對照病毒腫瘤內(nèi)接種腫瘤塊。為了手術(shù)切除原發(fā)性4T1腫瘤，在手術(shù)前麻醉小鼠，用無菌器械切除腫瘤。以金屬夾閉合傷口。所有小鼠均未發(fā)生手術(shù)中的死亡。從此實驗中排除在手術(shù)切除部位復(fù)發(fā)原發(fā)性腫瘤的小鼠。對于腫瘤轉(zhuǎn)移的評價，收集并切碎肺，之后在補充5％FCS并含有1.5mg/ml 4型膠原酶(Sigma)的DMEM中于37℃振蕩孵育期中以178rpm速度離解30分鐘。然后，以在補充10％FCS和60μM 6-硫代鳥嘌呤的DMEM中的不同稀釋度接種器官。5-10天后計數(shù)代表微轉(zhuǎn)移的各單集落。
體外感染和用輻射后的腫瘤細胞免疫接種。在100mm細胞培養(yǎng)皿中接種1×106個細胞24小時，然后用Ad-對照或Ad-LIGHT以4×108pfu/ml進行24小時感染。收獲細胞，通過以0.02mg/mL LTβR-Ig之后以PE-偶聯(lián)的驢抗人IgG(Jackson，West grove，PA)染色，利用FACS檢查LIGHT的表達。對于免疫接種，感染后收獲的、經(jīng)確認表達LIGHT的腫瘤細胞以1500rads照射，之后皮下注射至乳房脂墊內(nèi)。所有感染均在經(jīng)核準(zhǔn)的防生物危害罩中實施。
從腫瘤組織分離細胞。首先給小鼠放血以減少血液對腫瘤組織的污染。收集腫瘤組織，PBS中洗滌，切成碎片，之后重新懸浮在補充5％FCS和1.5mg/ml膠原酶D(膠原酶D溶液)的DMEM中于37℃振蕩孵育器中孵育40分鐘。40分鐘后收集單細胞懸浮液，在膠原酶D溶液中再消化細胞團快40分鐘直到所有腫瘤組織均分解成單細胞懸浮液。
腫瘤生長差異的統(tǒng)計學(xué)分析。由于在相同小鼠中隨時間重復(fù)觀察到腫瘤的生長，故使用長度數(shù)據(jù)的隨機效應(yīng)模型來分析該數(shù)據(jù)。對于每一實驗，假定腫瘤生長取決于治療并且隨時間遵循線性生長速率。該模式針對每組給出了線性生長的截距和斜率的大體估計。截距和斜率均被允許隨小鼠個體而變化。我們的興趣主要在于比較斜率，即生長速率，是否在不同的治療組是不同的。由于在整個跟蹤研究期間腫瘤的實際生長不可能遵循線性生長趨勢。在一些實驗中，腫瘤生長在早期時增加緩慢，在后期變快。我們也通過在上述隨機效應(yīng)模型中加入跟蹤時間的二次項，對此進行了研究。
實施例1手術(shù)切除腫瘤前在腫瘤內(nèi)給予ad-LIGHT可根除預(yù)先已經(jīng)存在的轉(zhuǎn)移性腫瘤由于皮下注射1054T1腫瘤細胞一貫在腫瘤接種后11天在肺中產(chǎn)生可檢測的轉(zhuǎn)移性腫瘤，所以在第11天的時間點之后用Ad-LIGHT(可表達LIGHT的重組腺病毒)治療將會表明該治療對接種的(seeded)轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞的有效性。我們給WT Balb/c小鼠皮下接種了1054T1腫瘤細胞。在腫瘤攻擊后第14天，腫瘤已經(jīng)建立成顯著的實體塊，此時開始2×109pfu Ad-LIGHT或者Ad-對照的治療。該治療給予兩次(第14天和第17天)。然后，在最后一次治療后，從用Ad-LIGHT或者Ad-對照治療的小鼠經(jīng)手術(shù)取出原發(fā)性腫瘤。
在接種原發(fā)性腫瘤后第35天處死小鼠，分析肺中的轉(zhuǎn)移性腫瘤。在Ad-對照治療的小鼠中觀察到大量轉(zhuǎn)移性集落，而在用Ad-LIGHT治療的小鼠中檢測到的轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞的數(shù)量顯著降低(見圖1A)。該結(jié)果提示，腫瘤內(nèi)給予ad-LIGHT可有效增強免疫，根除預(yù)先已經(jīng)存在的轉(zhuǎn)移性腫瘤，特別是在肝臟中。
實施例2接種Ad-LIGHT感染的腫瘤細胞可治療轉(zhuǎn)移性腫瘤本實施例確定經(jīng)過輻射的自體腫瘤細胞進行免疫接種是否能根除已經(jīng)建立的轉(zhuǎn)移性腫瘤。在第0天在Balb/c小鼠脅腹皮下接種6×1044T1腫瘤細胞。在第22天手術(shù)取出原發(fā)性腫瘤，之后在乳腺脂肪墊中皮下注射Ad-LIGHT或者Ad-對照(4×109PFU)感染的、經(jīng)過輻射的4T1細胞(1×106細胞)。在第21天，在小鼠乳腺脂肪墊中第二次免疫接種(注射)新鮮制備的細胞。在腫瘤接種后第45天處死小鼠，通過肺集落生成實驗進行分析。結(jié)果見圖1B，表明用輻射后的自體腫瘤細胞接種根除了已建立的腫瘤轉(zhuǎn)移。
重要的是，對于患有肝轉(zhuǎn)移性腫瘤的這類腫瘤患者ad-LIGHT感染的腫瘤細胞可以是非常有效的疫苗。有利的是，在手術(shù)除去原發(fā)性腫瘤之后用這種疫苗治療患者。
實施例3用Ad-LIGHT可治療肝臟病原體感染和腫瘤為了檢查注射ad-LIGHT后肝細胞是否表達LIGHT，用5×1010ad-LIGHT注射小鼠。24小時后，分離肝細胞并用可溶性LTbR(LIGHT的受體)染色。結(jié)果(見圖2)清楚地顯示，一部分肝細胞(4.5％)為LIGHT陽性。此數(shù)據(jù)證實肝細胞對腺病毒敏感。
如圖1和圖2所示，遞送的表達免疫刺激的腺病毒可以在肝中累積，并增強局部免疫力。我們提議也可以將此方法用于治療肝臟中的病原體和原發(fā)性癌癥，例如，HBV、HCV和肝細胞癌(HCC)。
實施例4Ad-LIGHT控制自發(fā)的腫瘤轉(zhuǎn)移已知腫瘤轉(zhuǎn)移是癌癥患者發(fā)病和死亡的主要原因，因此確定Ad-LIGHT對原發(fā)性腫瘤的治療是否能夠誘導(dǎo)足夠的免疫應(yīng)答以控制散布的轉(zhuǎn)移瘤是極為有意義的。4T1乳腺癌就其解剖學(xué)位置、免疫原性、生長特征、及更重要的，轉(zhuǎn)移性質(zhì)而言極為類似人類乳腺癌(23-25)。由于手術(shù)去除生長中的4T1腫瘤后將不能賦予對再次攻擊的防御作用，該腫瘤具有差的免疫原性(10)(數(shù)據(jù)未顯示)。當(dāng)我們向野生型(WT)Balb/c小鼠的乳房脂墊或尾根部周圍區(qū)域皮下注射105個4T1腫瘤細胞時，在腫瘤接種后11天于各種器官和引流淋巴結(jié)(LN)中一致地檢測到腫瘤轉(zhuǎn)移。
為了確定在原發(fā)性腫瘤部位通過Ad-LIGHT產(chǎn)生的抗腫瘤應(yīng)答是否可能足以清除或控制微散布的腫瘤細胞，我們首先用Ad-LIGHT或Ad-對照體外感染4T1腫瘤細胞。感染后24小時，用Ad-LIGHT感染的4T1腫瘤細胞表達高水平的LIGHT，而用Ad-對照感染的細胞不表達可檢測水平的LIGHT(圖3)。然后，從Ad-LIGHT感染后24小時的培養(yǎng)物收獲腫瘤細胞，并將105個表達LIGHT的或Ad-對照感染的4T1腫瘤細胞皮下接種至Balb/c小鼠體內(nèi)。監(jiān)測皮下生長的原發(fā)性腫瘤35天，之后處死小鼠，使用集落試驗評價肺中的轉(zhuǎn)移。我們發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性腫瘤的生長受到阻礙但是仍然繼續(xù)發(fā)展而未完全受到排斥(圖4A)。然而，盡管未能排斥原發(fā)性腫瘤，但是在接種表達LIGHT的4T1腫瘤細胞的小鼠的肺中未檢測到轉(zhuǎn)移細胞的集落，而在攜帶對照腫瘤的小鼠的肺中檢測到大量的轉(zhuǎn)移(圖4B)。CD8+T細胞的耗竭廢除了該效應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。對腫瘤轉(zhuǎn)移的控制可以歸因于在原發(fā)性腫瘤中局部表達的LIGHT，因為在該模型中遠處的腫瘤細胞不可能被感染而表達LIGHT。這些結(jié)果說明，4T1腫瘤在腫瘤生長初期的LIGHT表達不足以誘導(dǎo)對原發(fā)性腫瘤產(chǎn)生排斥，但是足以在存在生長的腫瘤細胞的情況下控制腫瘤的轉(zhuǎn)移。
我們接著意欲測試Ad-LIGHT的治療效果。我們研究了直接遞送至已建立的腫瘤內(nèi)的Ad-LIGHT是否可以控制癌轉(zhuǎn)移。7天在Balb/c小鼠皮下建立105個4T1腫瘤細胞的生長，之后向腫瘤內(nèi)注射5×109pfuAd-LIGHT或Ad-對照。我們觀察到，原發(fā)性腫瘤的生長在Ad-LIGHT治療后受到一定程度的抑制，但是仍繼續(xù)生長(數(shù)據(jù)未顯示)。為了模擬臨床治療情況，在腫瘤接種后18天手術(shù)移除原發(fā)性腫瘤。然后在注射原發(fā)性腫瘤后35天處死小鼠，使用集落生成試驗評價肺中的腫瘤轉(zhuǎn)移。有意義的是，我們未在得到Ad-LIGHT治療的小鼠的肺中檢測到轉(zhuǎn)移，而在對照小鼠的肺中發(fā)現(xiàn)了大量的轉(zhuǎn)移癌細胞(圖4C)。這些結(jié)果說明通過腺病毒基因轉(zhuǎn)移遞送至已經(jīng)建立的原發(fā)性腫瘤中的LIGHT能夠誘導(dǎo)顯著的腫瘤特異性CTL以控制自發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。
實施例5激活的腫瘤抗原特異性T細胞離開LIGHT介導(dǎo)的腫瘤環(huán)境并隨后出現(xiàn)在淋巴組織中我們觀察到通過腺病毒向腫瘤內(nèi)遞送的LIGHT誘導(dǎo)了強烈的抗腫瘤免疫并且對自發(fā)性轉(zhuǎn)移造成排斥。我們猜測，Ad-LIGHT能夠從腫瘤內(nèi)刺激腫瘤特異性CD8+T細胞并產(chǎn)生效應(yīng)/記憶T細胞，這些效應(yīng)/記憶T細胞隨后系統(tǒng)循環(huán)并對散布的腫瘤細胞產(chǎn)生排斥作用。然而，驗證在引流LN中檢測到的激活的腫瘤特異性T細胞是來自腫瘤或者是在引流LN中產(chǎn)生的是困難的，因為在兩個區(qū)室中可能發(fā)生腫瘤抗原的交叉呈現(xiàn)。為了清楚地區(qū)分該腫瘤特異性T細胞是最先在腫瘤中或是在淋巴組織中被激活，我們使用了如下系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中反應(yīng)性T細胞僅僅通過腫瘤細胞上的直接呈遞識別抗原。我們先前已經(jīng)報道過，在B6/OT-1/Rag-1-/-宿主(H-2b)(OT-1小鼠)中，識別Ag104Ld腫瘤(經(jīng)轉(zhuǎn)染表達H-2Ld的纖維肉瘤)的過繼轉(zhuǎn)移的2C TCR轉(zhuǎn)基因T細胞不能被間接呈遞所激活，而是僅僅能夠通過異常MHC I型分子的直接呈遞而被激活(22，26)。這些宿主小鼠缺乏與Ag104Ld腫瘤反應(yīng)的內(nèi)源性T細胞，而且2C T細胞是介導(dǎo)該抗腫瘤應(yīng)答的唯一T細胞。此外，2C T細胞不能在CD8+OT-1 T細胞存在時在轉(zhuǎn)移至這些小鼠中后經(jīng)歷穩(wěn)態(tài)擴增(Brown，提交的手稿)。因此，在該模型中，由Ag104Ld腫瘤造成的致敏僅取決于腫瘤中向2C T細胞的直接呈遞。此外，為了集中研究LIGHT的局部效應(yīng)并避免能夠到達淋巴器官的Ad-LIGHT的系統(tǒng)性擴散的可能性，我們使用了Ag104Ld或表達LIGHT的Ag104Ld腫瘤系。
在OT-1小鼠中皮下接種106Ag104Ld或Ag104Ld-LIGHT細胞，10-14天后輸注3×106個CFSE-標(biāo)記的2C T細胞。過繼轉(zhuǎn)移后14-20天在引流淋巴結(jié)(DLN)、非DLN和脾中以及在腫瘤自身中評價激活的2C T細胞的存在。我們首先觀察到，在表達LIGHT的Ag104Ld腫瘤內(nèi)存在大量激活的2C T細胞，這些細胞展示出CD44的高表面表達和產(chǎn)生IFN-γ(圖5A)。相反，在親本Ag104Ld腫瘤中幾乎檢查不到激活的2CT細胞(數(shù)據(jù)未顯示)。重要的是，在此時，我們在淋巴組織(包括DLN、非DLN和脾)中發(fā)現(xiàn)百分比高得多的激活的2C T細胞(圖5A)。這些激活的2C T細胞均表達高水平的CD44和IFN-γ(圖5A)。本實驗的結(jié)果強烈地提示，在LIGHT于腫瘤內(nèi)部局部表達后，一些激活的抗原特異性T細胞能夠遷移出腫瘤并進入系統(tǒng)循環(huán)中。
實施例6從原發(fā)性腫瘤產(chǎn)生的激活的腫瘤抗原特異性T細胞向遠端腫瘤的移動由于闡明了腫瘤內(nèi)的LIGHT表達能夠引起活化的T細胞的系統(tǒng)再循環(huán)，我們意欲研究這些已有的腫瘤抗原特異性T細胞然后是否能夠出巡周邊組織以浸潤不表達LIGHT的遠端繼發(fā)性腫瘤塊。為了避免能夠到達遠端腫瘤的Ad-LIGHT的系統(tǒng)擴散的可能性，我們繼續(xù)使用Ag104Ld或表達LIGHT的Ag104Ld腫瘤系以解決LIGHT在原發(fā)性腫瘤中的局部存在是否能夠在遠端腫瘤上引發(fā)抗腫瘤免疫的問題。我們使用與上述相同的模型系統(tǒng)，其中將2C T細胞過繼轉(zhuǎn)移至攜帶Ag104Ld腫瘤的OT-1小鼠，但是此次每只OT-1小鼠接種兩個腫瘤。原發(fā)性腫瘤是106Ag104Ld或Ag104Ld-LIGHT，而繼發(fā)性腫瘤是105Ag104Ld。腫瘤攻擊后10-14天，轉(zhuǎn)移CFSE標(biāo)記的2C T細胞。在過繼轉(zhuǎn)移至腫瘤內(nèi)后于第3、5和10天評價2C T的增殖。轉(zhuǎn)移后3天，在表達LIGHT的Ag104Ld原發(fā)性腫瘤中存在CFSEhi未增殖的2C細胞。通過CFSE的原位稀釋，在轉(zhuǎn)移后5天觀察到這些2C T細胞的隨后增殖。到第10天，在Ag104Ld-LIGHT腫瘤中發(fā)現(xiàn)大量的增殖的2C T細胞(圖5B)。在繼發(fā)性Ag104Ld腫瘤中，在攜帶Ag104Ld-LIGHT腫瘤的小鼠中比在攜帶Ag104Ld的小鼠中以更高的頻率檢測到稀釋的CFSE標(biāo)記的2C T細胞的存在(圖5B和C)。在攜帶兩個Ag104Ld腫瘤的小鼠的原發(fā)性和繼發(fā)性腫瘤中均僅僅檢測到一小群浸潤腫瘤的2C T細胞(圖5C)。這些數(shù)據(jù)支持了如下觀點LIGHT治療后一些激活的抗原特異性T細胞能夠遷移出原發(fā)性腫瘤并前往繼發(fā)性腫瘤。
實施例7在原發(fā)性腫瘤部位Ad-LIGHT產(chǎn)生更多的CTL我們的實驗結(jié)果到目前為止已經(jīng)說明，在LIGHT介導(dǎo)的環(huán)境中激活的抗原特異性T細胞能夠向遠處不表達LIGHT的腫瘤遷移。為了檢驗Ad-LIGHT是否能夠從原發(fā)性腫瘤產(chǎn)生更多的抗腫瘤CTL，然后這些CTL系統(tǒng)循環(huán)以排斥遠端腫瘤，我們進行了過繼轉(zhuǎn)移實驗，以研究來自經(jīng)治療的小鼠的淋巴器官的T細胞是否能夠介導(dǎo)對已經(jīng)建立的腫瘤產(chǎn)生排斥作用。由于腫瘤攻擊后2周次級淋巴組織常常被轉(zhuǎn)移性4T1腫瘤細胞污染，故這些實驗不能使用4T1模型。我們給C3B6F1小鼠接種了105個Ag104Ld腫瘤細胞，然后在腫瘤接種后14天用5×109pfuAd-LIGHT或Ad-對照處理。在第21天，從處理的小鼠收集脾和淋巴結(jié)并純化T細胞，將107個T細胞過繼轉(zhuǎn)移至經(jīng)過7天已經(jīng)建立了Ag104Ld腫瘤的C3B6F1小鼠體內(nèi)。我們發(fā)現(xiàn)，接受來自Ad-LIGHT處理的小鼠的T細胞的小鼠均排斥其腫瘤，而接受來自Ad-對照處理的小鼠的T細胞的那些小鼠死于腫瘤負荷(圖5D)。該結(jié)果說明，Ad-LIGHT處理而非對照病毒處理后循環(huán)中存在的活化的抗原特異性T細胞足以排斥已經(jīng)建立的遠端腫瘤。這些結(jié)果也說明，用Ad-LIGHT局部治療腫瘤能夠產(chǎn)生更多的CTL進入引流LN，之后這些CTL可以攻擊已經(jīng)建立的遠端腫瘤。
實施例8Ad-LIGHT的局部治療增強在該局部位置和遠處位置的T細胞介導(dǎo)的應(yīng)答評價Ad-LIGHT治療是否直接改變原發(fā)性腫瘤位置和遠處位置的腫瘤環(huán)境，相隔6天向C3B6F1小鼠兩次皮下接種Ag104Ld腫瘤，以模擬新皮下轉(zhuǎn)移瘤的形成。繼發(fā)性腫瘤接種后5天，向原發(fā)性腫瘤施以腫瘤內(nèi)Ad-LIGHT治療。我們發(fā)現(xiàn)，在用Ad-LIGHT處理的小鼠中原發(fā)性和繼發(fā)性腫瘤均受到排斥，而用Ad-對照處理的小鼠出現(xiàn)腫瘤的發(fā)展(圖6A)。由于Ad-LIGHT的效應(yīng)是CD8介導(dǎo)的，故我們檢查了DLN、脾臟、原發(fā)性和繼發(fā)性腫瘤中CD8+T細胞占Ly5.2+白細胞的百分數(shù)和產(chǎn)生IFN-γ的效應(yīng)細胞在所有的這些CD8+T細胞中所占的百分數(shù)。Ad-LIGHT處理后原發(fā)性腫瘤和繼發(fā)性腫瘤中CD8+T細胞和產(chǎn)生IFN-γ的效應(yīng)CD8+T細胞的數(shù)量均急劇地增加(圖6B和C)。導(dǎo)致腫瘤退化的抗腫瘤免疫的發(fā)生可能與細胞因子環(huán)境的改變相關(guān)(27)。為了檢查這些淋巴器官中以及腫瘤自身內(nèi)的細胞因子環(huán)境，在Ad-LIGHT或Ad-對照處理后7天收獲了脾和腫瘤組織，研磨這些組織并收集上清液用于細胞因子測定。我們發(fā)現(xiàn)，相對于用Ad-對照處理的小鼠的脾臟，所測試的細胞因子，TNF-α，IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，在Ad-LIGHT處理的小鼠的脾臟中無一存在顯著改變。然而，在Ad-LIGHT處理下在原發(fā)性和繼發(fā)性腫瘤中TNF-α和IFN-y均有相當(dāng)大的增加(圖6D)。因此，腫瘤排斥伴隨著CD8+T細胞的增加、由效應(yīng)CD8+T細胞產(chǎn)生的IFN-γ的產(chǎn)量增加、以及炎性細胞因子TNF-α和IFN-γ在原發(fā)性和繼發(fā)性腫瘤內(nèi)的增加。這些結(jié)果說明，Ad-LIGHT在原發(fā)性腫瘤上的治療能夠從該腫瘤產(chǎn)生大量的效應(yīng)細胞，這些細胞能夠有效地勘查周圍組織并應(yīng)答遠端腫瘤，從而導(dǎo)致繼發(fā)性腫瘤負荷的衰退。
實施例9LIGHT的密碼子修飾為了獲得更好的轉(zhuǎn)錄和翻譯，發(fā)明人優(yōu)化了LIGHT的密碼子。密碼子修飾改變了基因的10-15％，以優(yōu)化GC含量等，但是不改變編碼的氨基酸序列。
圖7顯示了一個突變了蛋白酶位點、同時又優(yōu)化了密碼子的小鼠LIGHT序列(SEQ ID NO3)。合成基因序列，并將合成的基因克隆到質(zhì)粒中。以野生型LIGHT和突變了蛋白酶位點的LIGHT(突變型LIGHT)為對照。突變了蛋白酶位點的小鼠LIGHT核酸見NatureImmunology，Vol.5，No.2，2004年2月，p.141-149。
通過標(biāo)準(zhǔn)lipofetant試驗將2ug質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染到293細胞系中。兩天后，用小鼠LTbR-Ig測定LIGHT的表達。通過FACS和免疫熒光染色進行測定。結(jié)果顯示，突變并經(jīng)密碼子修飾的LIGHT表達最佳。突變型LIGHT的表達也好于野生型LIGHT。結(jié)果見圖8。
總體上看，通過修飾后，蛋白質(zhì)的表達增加了10倍。
由此可以看出，將蛋白酶位點的突變和密碼子修飾相結(jié)合，是一種新的有效增加LIGHT表達的方法。
按照同樣的方法，發(fā)明人還優(yōu)化了人的LIGHT。野生型和經(jīng)過密碼子修飾和蛋白酶位點突變的LIGHT的序列如下(SEQ ID NO2)。通過以上相同的實驗方法證實，密碼子修飾的人LIGHT有效增加了LIGHT的表達(結(jié)果未顯示)。
正常人LIGHT(SEQ ID NO1)AGCCCAGGAGTGTTGAGCAATTTCGGTTTCCTCTGAGGTTGAAGGACCCAGGCGTGTCAG起始密碼子＞CCCTGCTCCAGACACCTTGGGCATGGAGGAGAGTGTCGTACGGCCCTCAGTGTTTGTGGTGGATGGACAGACCGACATCCCATTCACGAGGCTGGGACGAAGCCACCGGAGACAGTCGTGCAGTGTGGCCCGGGTGGGTCTGGGTCTCTTGCTGTTGCTGATGGGGGCCGGGCTGGCCGT
CCAAGGCTGGTTCCTCCTGCAGCTGCACTGGCGTCTAGGAGAGATGGTCACCCGCCTGCCTGACGGACCTGCAGGCTCCTGGGAGCAGCTGATACAAGAGCGAAGGTCTCACGAGGTCAACCCAGCAGCGCATCTCACAGGGGCCAACTCCAGCTTGACCGGCAGCGGGGGGCCGCTGTTATGGGAGACTCAGCTGGGCCTGGCCTTCCTGAGGGGCCTCAGCTACCACGATGGGGCCCTTGTGGTCACCAAAGCTGGCTACTACTACATCTACTCCAAGGTGCAGCTGGGCGGTGTGGGCTGCCCGCTGGGCCTGGCCAGCACCATCACCCACGGCCTCTACAAGCGCACACCCCGCTACCCCGAGGAGCTGGAGCTGTTGGTCAGCCAGCAGTCACCCTGCGGACGGGCCACCAGCAGCTCCCGGGTCTGGTGGGACAGCAGCTTCCTGGGTGGTGTGGTACACCTGGAGGCTGGGGAGAAGGTGGTCGTCCGTGTGCTGGATGAACGCCTGGTTCGACTGCGTGATGGTACCCGGTCTTACTTCGGGGCTTTCATGGTGTGA人LIHGT的密碼子修飾(經(jīng)過密碼子修飾和蛋白酶位點的突變)(SEQID NO2)起始密碼子＞GAATTCGAGCTCGGTACCCGACACGGTACCGGATCCGCCACCATGGAGGAGAGCGTTGTGAGGCCCAGCGTGTTCGTGGTGGACGGCCAGACCGACATCCCCTTCACCCGGCTGGGCCGGAGCCACCGGAGGCAGAGCTGCTCCGTGGCCAGAGTGGGGCTGGGCCTGCTGCTCCTGCTGATGGGAGCCGGCCTGGCCGTGCAGGGCTGGTTCCTGCTGCAGCTGCACTGGCGGCTGGGCGAGATGGTGACCCGGCTGCCCGATGGCCCTGCCGGCAGCTGGCAGGAGCGGCGGAGCCACGAGGTGAACCCTGCCGCCCACCTGACCGGCGCCAACAGCAGCCTGACCGGCAGCGGCGGACCCCTGCTGTGGGAGACCCAGCTGGGCCTGGCCTTCCTGAGGGGCCTGAGCTACCACGACGGCGCCCTGGTGGTGACCAAGGCCGGCTACTACTACATCTACAGCAAGGTGCAGCTGGGCGGAGTGGGCTGCCCTCTGGGGCTGGCCAGCACCATCACCCACGGCCTGTACAAGCGGACC
CCCAGATACCCCGAGGAGCTGGAGCTGCTGGTGTCCCAGCAGAGCCCCTGTGGCAGGGCCACCTCCAGCAGCCGGGTGTGGTGGGACAGCAGCTTCCTGGGCGGCGTGGTGCACCTGGAGGCCGGCGAGAAAGTGGTTGTGAGGGTGCTGGACGAGCGGCTTGTGAGGCTGAGGGACGGCACCCGGAGCTACTTCGGCGCCTTCATGGTGTGATGAGCGGCCGCGAGCTCGTCTCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTG參考文獻以下參考文獻并入本文作為參考，它們補充、解釋或者教導(dǎo)了這里使用的方法、技術(shù)和/或組合物，或者提供了為這些方法、技術(shù)和/或組合物提供了背景。
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序列表<110>傅陽心<120>用于預(yù)防和治療轉(zhuǎn)移性腫瘤的組合物<130>IDC050145<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>805<212>DNA<213>人<400>1agcccaggag tgttgagcaa tttcggtttc ctctgaggtt gaaggaccca ggcgtgtcag60ccctgctcca gacaccttgg gcatggagga gagtgtcgta cggccctcag tgtttgtggt120ggatggacag accgacatcc cattcacgag gctgggacga agccaccgga gacagtcgtg180cagtgtggcc cgggtgggtc tgggtctctt gctgttgctg atgggggccg ggctggccgt240ccaaggctgg ttcctcctgc agctgcactg gcgtctagga gagatggtca cccgcctgcc300tgacggacct gcaggctcct gggagcagct gatacaagag cgaaggtctc acgaggtcaa360cccagcagcg catctcacag gggccaactc cagcttgacc ggcagcgggg ggccgctgtt420atgggagact cagctgggcc tggccttcct gaggggcctc agctaccacg atggggccct480tgtggtcacc aaagctggct actactacat ctactccaag gtgcagctgg gcggtgtggg540ctgcccgctg ggcctggcca gcaccatcac ccacggcctc tacaagcgca caccccgcta600ccccgaggag ctggagctgt tggtcagcca gcagtcaccc tgcggacggg ccaccagcag660ctcccgggtc tggtgggaca gcagcttcct gggtggtgtg gtacacctgg aggctgggga720gaaggtggtc gtccgtgtgc tggatgaacg cctggttcga ctgcgtgatg gtacccggtc780ttacttcggg gctttcatgg tgtga 805<210>2<211>814<212>DNA<213>人工合成的<400>2gaattcgagc tcggtacccg acacggtacc ggatccgcca ccatggagga gagcgttgtg60aggcccagcg tgttcgtggt ggacggccag accgacatcc ccttcacccg gctgggccgg120agccaccgga ggcagagctg ctccgtggcc agagtggggc tgggcctgct gctcctgctg180atgggagccg gcctggccgt gcagggctgg ttcctgctgc agctgcactg gcggctgggc240
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1.包含免疫細胞激活劑、用于預(yù)防或者治療腫瘤(特別是轉(zhuǎn)移性腫瘤)的藥物組合物，特別是治療性疫苗或者預(yù)防性疫苗。
2.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述免疫細胞激活劑是編碼激活免疫細胞的多肽、或者編碼激活免疫細胞的多肽的核酸或者包含它的藥用組合物；特別地，所述激活劑是LIGHT多肽或者編碼LIGHT的核酸。
3.權(quán)利要求1-2任一項的藥物組合物，其中所述免疫細胞激活劑是包含并表達編碼LIGHT的核酸的重組載體(例如重組病毒，優(yōu)選重組腺病毒或者禽痘病毒)。
4.權(quán)利要求1-3任一項的藥物組合物，其中所述免疫細胞激活劑是包含并表達編碼LIGHT的核酸的腫瘤細胞或者腫瘤(優(yōu)選地，該腫瘤細胞或者腫瘤還包含并表達腫瘤抗原)；特別是所述藥物組合物作為治療性疫苗或者預(yù)防性疫苗。
5.權(quán)利要求1-4任一項的藥物組合物，其中所述藥物采用系統(tǒng)性或者腫瘤內(nèi)途徑給藥。
6.免疫細胞激活劑在制備用于預(yù)防或者治療腫瘤(特別是轉(zhuǎn)移性腫瘤)的藥物中的用途。
7.權(quán)利要求6的用途，其中免疫細胞激活劑是權(quán)利要求2-4任一項所述的免疫細胞激活劑。
8.用于消除原發(fā)性腫瘤、預(yù)防轉(zhuǎn)移性腫瘤、和/或治療已有轉(zhuǎn)移性腫瘤的藥用組合物，其含有包含并表達編碼LIGHT的核酸的重組載體(例如重組病毒，優(yōu)選重組腺病毒或者禽痘病毒)。
9.包含并表達編碼LIGHT的核酸的重組載體(例如重組病毒，優(yōu)選重組腺病毒或者禽痘病毒)在制備藥物中的用途，所述藥物用于消除原發(fā)性腫瘤、預(yù)防轉(zhuǎn)移性腫瘤、和/或治療已有轉(zhuǎn)移性腫瘤；例如，該藥物可通過將所述重組病毒導(dǎo)入到原發(fā)性腫瘤內(nèi)或者經(jīng)過系統(tǒng)性途徑來給藥。
10.包含免疫細胞激活劑的腫瘤細胞或者腫瘤；優(yōu)選地，該腫瘤細胞或者腫瘤還被輻射處理。
11.權(quán)利要求10的腫瘤細胞或者腫瘤，其是包含并表達編碼LIGHT的核酸的腫瘤細胞或者腫瘤；優(yōu)選地，該腫瘤細胞或者腫瘤還包含并表達腫瘤抗原。
12.權(quán)利要求10的腫瘤細胞或者腫瘤，其轉(zhuǎn)導(dǎo)了包含并表達編碼LIGHT的核酸的重組載體(例如重組病毒，優(yōu)選重組腺病毒或者禽痘病毒)。
13.包含權(quán)利要求10-12任一項的腫瘤細胞或者腫瘤的藥用組合物，特別是治療性疫苗或者預(yù)防性疫苗。
14.用于消除原發(fā)性腫瘤、預(yù)防轉(zhuǎn)移性腫瘤、和/或治療已有轉(zhuǎn)移性腫瘤的治療性和/或預(yù)防性腫瘤疫苗，該腫瘤疫苗包含權(quán)利要求10-12任一項的腫瘤細胞或者腫瘤；優(yōu)選地，該腫瘤疫苗還可包含可藥用載體。
15.包含并表達編碼LIGHT的核酸的重組載體(例如重組病毒，優(yōu)選重組腺病毒或者禽痘病毒)在制備治療性和/或預(yù)防性腫瘤疫苗中的用途，所述腫瘤疫苗用于消除原發(fā)性腫瘤、預(yù)防轉(zhuǎn)移性腫瘤、和/或治療已有轉(zhuǎn)移性腫瘤。
16.權(quán)利要求10-12任一項的腫瘤細胞或者腫瘤在制備治療性和/或預(yù)防性腫瘤疫苗中的用途，所述腫瘤疫苗用于消除原發(fā)性腫瘤、預(yù)防轉(zhuǎn)移性腫瘤、和/或治療已有轉(zhuǎn)移性腫瘤。
17.權(quán)利要求14的腫瘤疫苗在制備藥物中的用途，所述藥物用于消除原發(fā)性腫瘤、預(yù)防轉(zhuǎn)移性腫瘤、和/或治療已有轉(zhuǎn)移性腫瘤。
18.用于增強肝臟抗轉(zhuǎn)移性腫瘤、原發(fā)性腫瘤和/或病毒感染(例如HBV和HCV)的免疫力的表達免疫增強劑，其含有包含并表達編碼LIGHT的核酸的重組載體(例如重組病毒，優(yōu)選重組腺病毒或者禽痘病毒)。
19.含有包含并表達編碼LIGHT的核酸的重組載體(例如重組病毒，優(yōu)選重組腺病毒或者禽痘病毒)在用于制備表達免疫增強劑中的用途，所述表達免疫增強劑用于增強肝臟抗轉(zhuǎn)移性腫瘤、原發(fā)性腫瘤和/或病毒感染(例如HBV和HCV)的免疫力。
20.包含并表達編碼LIGHT的核酸的重組載體(例如重組病毒，優(yōu)選重組腺病毒或者禽痘病毒)在制備藥物中的用途，所述藥物用于增加肝臟中TNF-α和IFN-γ或者CD8+T細胞。
21.權(quán)利要求1-9、13-20任一項的藥物組合物或者用途或者疫苗，其中所述藥物或者藥物組合物與其它藥物或者治療方法聯(lián)合使用，例如將原發(fā)性腫瘤切除、和/或化學(xué)治療、和/或放射治療。
22.權(quán)利要求21的藥物組合物或者用途或者疫苗，在原發(fā)性腫瘤切除之前向原發(fā)性腫瘤內(nèi)給予免疫細胞激活劑或者在原發(fā)性腫瘤切除之后給予腫瘤疫苗。
23.包含并表達編碼突變LIGHT的核酸的重組病毒，優(yōu)選地，該重組病毒是重組腺病毒或者禽痘病毒；優(yōu)選地，所述突變LIGHT包含阻止蛋白酶對其降解的突變，例如，所述突變LIGHT是不含蛋白酶裂解位點的LIGHT，特別是不含人LIGHT蛋白第81-84位的蛋白酶解位點EQLI的突變LIGHT；在另一個實施方案中，所述突變LIGHT具有細胞外域氨基酸序列和標(biāo)簽序列(例如便于純化的標(biāo)簽)，如具有LIGHT第85-239位的氨基酸序列和flag序列。
24.包含權(quán)利要求23的重組病毒的藥用組合物，特別是治療性疫苗或者預(yù)防性疫苗。
25.權(quán)利要求23的重組病毒或者權(quán)利要求24的組合物在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。
26.包含并表達編碼突變LIGHT的核酸的腫瘤細胞或者腫瘤，優(yōu)選地，該腫瘤細胞或者腫瘤還包含并表達腫瘤抗原。
27.包含權(quán)利要求26的腫瘤細胞或者腫瘤的藥用組合物，特別是治療性疫苗或者預(yù)防性疫苗。
28.包含免疫細胞激活劑、用于增強肝臟組織內(nèi)的免疫和/或預(yù)防或者治療肝臟病原體感染的藥物組合物。
29.權(quán)利要求28的藥物組合物，其中所述免疫細胞激活劑是編碼激活免疫細胞的多肽、或者編碼激活免疫細胞的多肽的核酸或者包含它的藥用組合物；特別地，所述激活劑是LIGHT多肽或者編碼LIGHT的核酸。
30.權(quán)利要求28-29任一項的藥物組合物，其中所述免疫細胞激活劑是包含并表達編碼LIGHT的核酸的重組載體(例如重組病毒，優(yōu)選重組腺病毒或者禽痘病毒)。
31.免疫細胞激活劑在制備用于預(yù)防或者治療肝臟病原體感染的藥物中的用途。
32.權(quán)利要求31的用途，其中免疫細胞激活劑是權(quán)利要求29-30任一項所述的免疫細胞激活劑。
33.權(quán)利要求28-29任一項的藥物組合物或者權(quán)利要求31-32的用途，其中肝臟病原體感染是病毒感染(例如HBV和HCV)。
34.權(quán)利要求1-22和28-33任一項的組合物、用途、腫瘤細胞或者腫瘤、或者疫苗，其中所述LIGHT多肽或者所述核酸編碼的LIGHT多肽是野生型人LIGHT。
35.權(quán)利要求1-22和28-33任一項的組合物、用途、腫瘤細胞或者腫瘤、或者疫苗，其中所述LIGHT多肽或者所述核酸編碼的LIGHT多肽是相對于野生型人LIGHT而言突變的LIGHT；優(yōu)選地，所述突變LIGHT包含阻止蛋白酶對其降解的突變，例如，所述突變LIGHT是不含蛋白酶裂解位點的LIGHT，特別是不含小鼠LIGHT蛋白第79-82位的蛋白酶解位點EKLI的小鼠突變LIGHT，或者不含人LIGHT蛋白第81-84位的蛋白酶解位點EQLI的人突變LIGHT；在另一個實施方案中，所述突變LIGHT具有細胞外域氨基酸序列和標(biāo)簽序列(例如便于純化的標(biāo)簽)，如具有LIGHT第85-239位的氨基酸序列和flag序列。
36.權(quán)利要求1-35任一項的組合物、用途、腫瘤細胞或者腫瘤、疫苗、或者重組病毒，其中所述LIGHT編碼核酸是相對于宿主進行了密碼子優(yōu)化的核酸，更優(yōu)選進行了密碼子優(yōu)化并突變了蛋白酶裂解位點以阻止蛋白酶對編碼的LIGHT蛋白降解的核酸，例如，編碼不含小鼠LIGHT蛋白第79-82位的蛋白酶解位點EKLI的小鼠突變LIGHT多肽或者不含人LIGHT蛋白第81-84位的蛋白酶解位點EQLI的人突變LIGHT多肽并經(jīng)過密碼子優(yōu)化的核酸，優(yōu)選SEQ ID NO2和3中所示的編碼核酸。
37.經(jīng)過密碼子優(yōu)化但不改變氨基酸序列的LIGHT編碼核酸，優(yōu)選人LIGHT編碼核酸。
38.經(jīng)過密碼子優(yōu)化并突變了蛋白酶裂解位點以阻止蛋白酶對編碼的LIGHT蛋白降解的核酸，例如，編碼不含小鼠LI GHT蛋白第79-82位的蛋白酶解位點EKLI的小鼠突變LIGHT多肽或者不含人LIGHT蛋白第81-84位的蛋白酶解位點EQLI的人突變LIGHT多肽并經(jīng)過密碼子優(yōu)化的核酸，優(yōu)選SEQ ID NO2和3中所示的編碼核酸。
39.包含權(quán)利要求37和38的核酸的載體以及轉(zhuǎn)化了該載體的宿主細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于轉(zhuǎn)移性腫瘤免疫預(yù)防和治療的方法和組合物、以及用于增強肝臟組織內(nèi)的免疫和/或預(yù)防或者治療肝臟病原體感染的方法和組合物。所述組合物包含免疫細胞激活劑。優(yōu)選地，所述免疫細胞激活劑是LIGHT多肽或其變體或者它們的編碼核酸。
文檔編號A61P35/00GK101091794SQ20061008681
公開日2007年12月26日 申請日期2006年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月19日
發(fā)明者傅陽心 申請人:博爾誠(北京)科技有限公司