專利名稱：新的酪氨酸酶抑制劑和它的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及聯(lián)苯糖苷類化合物，為新的酪氨酸酶抑制劑，作為黑色素抑制劑或美白劑應用于醫(yī)藥、食品、日用化工領域。
背景技術：
日光照射等原因引起的皮膚色素沉著，對中青年人，尤其是青年女性來講已經成為一大煩惱。隨著物質生活水平的提高，人們對擁有健康美白的肌膚的要求日益增加，消費市場也在不斷擴大。
近年的研究證明色素沉著是由紫外線激活表皮中的黑色素細胞內的黑色素生成酶，產生色素所引起的。在黑色素生成過程中，酪氨酸酶將酪氨酸轉化成多巴，多巴醌，經非酶氧化而聚合生成大分子的黑色素(李韶勇等“天津師范大學學報”2002，2217-21)。因此，通過抑制酪氨酸酶的活性可以限制黑色素生成，改善皮膚的色素沉著。
目前已有多種酪氨酸酶抑制劑用于改善或治療皮膚色斑，并已商品化，但尚不能滿足消費市場的需要。其中，L-抗壞血酸的穩(wěn)定性不佳，曲酸的效果較弱。氫醌雖然有一定的效果，但其在酪氨酸酶作用下被氧化成有毒性的半醌基物質，使黑色素細胞胞膜脂質發(fā)生氧化，導致細胞膜結構破壞，引起細胞死亡。因此，許多國家禁止氫醌在化妝品中使用。熊果苷，作為一種氫醌的糖苷衍生物，因在活性劑量下不具細胞毒性，而被開發(fā)成為商品。但其增白效果并不理想。甘草根、桑白皮、蘆薈等植物北傳統(tǒng)用于皮膚增白。但這些提取物時常因產地差異表現出不同的效果，難以保持產品的質量穩(wěn)定。所以，有效的黑色素抑制劑和增白劑有著廣闊的消費市場。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種對酪氨酸酶有抑制作用的新化合物，應用于防治色斑、雀斑、老年斑等皮膚的色素沉著和美白。
本發(fā)明的目的也包括提供含有該新化合物的組合物。
為了解決上述問題，本發(fā)明者從火棘果實中提取分離得到新的酪氨酸酶抑制劑，是由以下通式I表示的聯(lián)苯糖苷衍生物，
其中R1為H、OH、OCH3或葡萄糖基，R2為H、OH或葡萄糖基，R3、R4為H或葡萄糖基。
優(yōu)選R1為OCH3，R2、R3為H，R4為葡萄糖基時，化學名為4’-羥基-2，3’，5’-三甲氧基-(1，1’-二苯基)-2’-氧-葡萄糖苷，簡稱化合物1，化學結構式為 優(yōu)選R2、R3、R4為H，R1為葡萄糖基時，化學名為4’-羥基-3’，5’-二甲氧基-(1，1’-二苯基)-2-氧-葡萄糖苷，簡稱化合物2，化學結構式為 優(yōu)選R1為OH，R3、R4為H，R2為葡萄糖基時，化學名為2，4’-二羥基-3’，5’-二甲氧基-(1，1’-二苯基)-3-氧-葡萄糖苷，簡稱化合物3，化學結構式為 優(yōu)選R1、R4為H，R2為OH，R3為葡萄糖基時，化學名為3，4’-二羥基-3’，5’-二甲氧基-(1，1’-二苯基)-4-氧-葡萄糖苷，簡稱化合物4，化學結構式為 本發(fā)明所提供的新化合物，具有顯著的抑制酪氨酸酶作用，從而抑制黑色素細胞中的黑色素生成，對紫外線照射后的皮膚曬黑及對色斑、老年斑、雀斑等皮膚的色素沉著和美白具有良好防治作用。
上述的聯(lián)苯糖苷衍生物I，包括所優(yōu)選的任何一個化合物1～4都可作為黑色素生成抑制劑或美白劑，應用于防治色斑、雀斑、老年斑等皮膚的色素沉著和美白。并且，可用上述的酪氨酸酶抑制劑制成組合物，該組合物含有上述聯(lián)苯糖苷衍生物I或化合物1～4的任何一種或一種以上的酪氨酸酶抑制劑，并含有藥學上所允許的藥用輔料或常規(guī)的化妝品基質制成藥品或化妝品，用作抑制黑色素生成或美白的化妝品、醫(yī)藥品等皮膚外用劑。如在組合物中還可添加本發(fā)明所說的聯(lián)苯糖苷衍生物I以外的美白劑成分，通過美白劑成分和聯(lián)苯糖苷衍生物I的并用配合，能夠進一步提高黑色素生成抑制效果和美白效果。這些美白劑成分可采用但不限于下列成分L-抗壞血酸及其衍生物及它們的鹽、氫醌及其衍生物及它們的鹽、半胱氨酸及其衍生物及它們的鹽、曲酸及其衍生物及它們的鹽、羥基肉桂酸及其衍生物及它們的鹽、谷胱甘肽、植物提取物如桑白皮提取物、甘草提取物、蘆薈提取物、山楂提取物、野薔薇提取物、百合提取物、黃芩提取物、川芎提取物、苦參提取物、當歸提取物、柴胡提取物、大黃提取物、牡丹皮提取物、火棘提取物、甘草苷、異甘草苷、胎盤提取物等。美白劑成分可任意選擇1種或2種以上摻入。
本發(fā)明所提供的化合物及其組合物可以作藥品、或化妝品，使用量可視不同的用途而不同。
制備藥物時，用該化合物與常規(guī)的藥用載體，如軟膏基質、乳化劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、等制成乳劑或軟膏劑等外用制劑，制備工藝可采用常規(guī)的藥物制劑技術。其化合物的用量以0.5～3％比較合適。
制備化妝品時可在化妝品基質中添加0.1～1％的本發(fā)明的化合物即可。
具體的說，本發(fā)明是從薔薇科火棘屬植物火棘(Pyracantha fortuneana)的果實中分離得到的化合物。采用火棘的干燥果實粉碎成粗粉，將其浸入提取溶劑中冷提或在提取溶劑中加熱回流，然后過濾或通過離心等方法除去不溶物，再對所得提取溶液進行減壓濃縮，之后采用公知的分離精致手段進行分離得到上述的聯(lián)苯糖苷衍生物。
用于提取的溶劑可采用通常用于植物提取的溶劑，例如，可單獨或組合使用甲醇、乙醇等低級醇、丙酮和乙酸乙酯等有機溶劑及水。提取方法可采用常規(guī)方法，一般提取溫度為20-100℃，較好為40-80℃，總提取時間為1-48小時，較好為4-16小時。提取液，通過過濾除去不溶物，減壓濃縮。將提取物分散于等體積的水中，依次用系統(tǒng)溶劑萃取法如先用氯仿萃取，再用正丁醇萃取。取正丁醇萃取部分，真空減壓干燥，得丁醇萃取物。隨后，用正相、反相、凝膠色譜法分離精制得到化合物I，及分別得到化合物1～4。
本發(fā)明的有益效果是提供了一種新的酪氨酸酶抑制劑及其含有該新化合物的組合物，用作抑制黑色素生成或美白的化妝品、醫(yī)藥品等皮膚外用劑。本發(fā)明獲得了新的酪氨酸酶抑制劑具有對紫外線照射后的皮膚曬黑，以及對因曬黑等而產生的色斑、老年斑、雀斑等皮膚色素沉著具有良好預防、改善及治療效果。此外，本發(fā)明的組合物通過聯(lián)苯糖苷衍生物與其它美白劑成分的并用配合，能夠進一步提高黑色素生成抑制效果和美白效果。
以下，通過具體實施方式
對本發(fā)明的技術方案作詳細闡述。
具體實施例方式
實施例1、以下式I表示的聯(lián)苯糖苷衍生物的制備 取陜西秦嶺的火棘(Pyracantha fortuneana)的干燥果實，用5倍量60％乙醇溶液，熱回流提取三次，每次2小時，合并提取液，過濾除去不溶物，濾液減壓濃縮干燥，將干燥物分散于等體積的水中，依次用氯仿，正丁醇萃取。正丁醇萃取部分，真空減壓干燥，得正丁醇萃取物。隨后，以大孔吸附樹脂開放柱進行層析，用濃度分別為10，30，50，70，95％的乙醇水溶液梯度洗脫；取30％的乙醇水溶液洗脫部分進行硅膠開放柱層析，以氯仿∶甲醇分別為20∶1，10∶1，4∶1，2∶1，1∶1的溶液梯度洗脫，在氯仿∶甲醇為10∶1洗脫部分得到總聯(lián)苯糖苷衍生物。之后取總聯(lián)苯糖苷衍生物進行Toyopearl HW-40凝膠開放柱層析，用濃度分別為20，40，60，100％的甲醇水溶液梯度洗脫；取40％的甲醇水溶液洗脫部分經十八烷基硅烷鍵合硅膠柱進行制備液相分離，以15％乙腈水溶液洗脫，先后得到化合物1、2；取60％的甲醇水溶液洗脫部分經十八烷基硅烷鍵合硅膠柱進行制備液相分離，以15％乙腈水溶液洗脫，先后得到化合物3、4。通過理化常數和現代波譜學手段(IR、MS、NMR)鑒定了它們的結構。
化合物1是淡黃色膠狀物。結構式為 [α]D25-5.8°(c 1.45，MeOH)，UV圖譜(MeOH)λmax(logε)nm206(4.58)，255(3.62)，282(3.69)提示結構中有苯環(huán)存在。IR圖譜(KBr)vmaxcm-13430示有羥基存在，1630為苯環(huán)的特征吸收。ESI-MS給出準分子離子峰m/z 461[M+Na]+，437[M-H]-，提示分子量為438。HR-ESI-TOF-MSm/z461.1425[M+Na]+，理論值為461.1424(C21H26O10Na)，從而確定分子式為C21H26O10，不飽和度為9。
在1H-NMR中，可以觀測到5個芳香質子信號，和三個甲氧基信號(δ3.77，3.70，3.69)。根據耦合常數，提示結構中含有一個1，2-二取代苯[δ7.38(1H，d，J＝7.6Hz)，7.24(1H，t，J＝7.6Hz)，6.99(1H，d，J＝7.6Hz)，and6.89(1H，t，J＝7.6Hz)]和一個1，2，3，4，5-五取代苯(δ6.44，1H)。此外，結合HSQC譜，其余氫信號表明了結構中葡萄糖基的存在。HMBC譜中，連氧碳信號δ156.6與H-4(δ7.24)，H-6(δ7.38)相關，被歸屬為C-2；另兩個連氧碳信號δ140.8，140.8都與H-6’(δ6.44)相關，被歸屬為C-2’，C-4’。由兩個甲氧基信號δ3.69，3.70分別與C-2和C-3’(δ140.9)相關，提示了它們分別連接在C-2和C-3’。HMBC相關峰H-6’(δ6.44)/C-1(δ127.4)，表明其苷元結構為1，1’相連的聯(lián)苯。糖端基氫H-1”(δ4.69，1H，d，J＝7.6Hz)與C-4相關，提示葡萄糖連接在苷元的4位。ROESY譜中，甲氧基信號δ3.77與H-6’相關，表明其連接在苷元的5’位上。從而，化合物1的結構被確定為4’-羥基-2，3’，5’-三甲氧基-(1，1’-二苯基)-2’-氧-葡萄糖苷。
化合物2是淡黃色膠狀物。結構式為 [α]D17-36.1°(c 0.39，MeOH)，UV圖譜(MeOH)λmax(logε)nm205(4.17)，269(3.47)，286(sh)(3.45)提示結構中有苯環(huán)存在。IR圖譜(KBr)vmaxcm-13438示有羥基存在，1644為苯環(huán)的特征吸收。ESI-MS給出準分子離子峰m/z 431[M+Na]+，407[M-H]-，提示分子量為408。HR-ESI-TOF-MSm/z 431.1343[M+Na]+，理論值為431.1318(C20H24O9Na)，從而確定分子式為C20H24O9，不飽和度為9。
在1H-NMR中，可以觀測到6個芳香質子，和兩個甲氧基(δ3.79，6H，s)。根據耦合常數，提示結構中含有一個1，2-二取代苯[δ7.35(1H，d，J＝8.0Hz)，7.25(1H，t，J＝8.0Hz)，7.19(1H，d，J＝8.0Hz)，and 7.04(1H，t，J＝8.0Hz)]和一個1，3，4，5-四取代苯(δ6.91，2H，brs)。此外，結合HSQC，剩余氫信號表明了結構中葡萄糖基的存在。ROESY譜中，甲氧基質子(δ3.79，6H，s)與兩個化學等價的芳香質子H-2’，6’(δ6.91，2H，brs)相關，提示它們連接在C-3’，5’(δ147.5)。芳香質子δ6.99，7.24，6.89，7.38在COSY譜中順次相關，結合耦合裂分的特征，被歸屬為H-2，H-3，H-4，H-5。HMBC相關峰H-2’，6’/C-1(δ130.2)，表明其苷元結構為1，1’相連的聯(lián)苯。糖端基氫H-1”(δ5.07，1H，d，J＝7.8Hz，)在ROESY譜中與H-3相關，提示葡萄糖連接在苷元的2位。從而，化合物2的結構被確定為4’-羥基-3’，5’-二甲氧基-(1，1’-二苯基)-2-氧-葡萄糖苷。
化合物3是淡黃色膠狀物。結構式為
[α]D17-46.4°(c 0.79，MeOH)，UV圖譜(MeOH)λmax(logε)nm210(4.36)，267(3.78)，291(sh)(3.67)提示結構中有苯環(huán)存在。IR圖譜(KBr)vmaxcm-13427示有羥基存在，1625為苯環(huán)的特征吸收。ESI-MS給出準分子離子峰m/z 447[M+Na]+，423[M-H]-，提示分子量為424。HR-ESI-TOF-MSm/z 447.1275[M+Na]+，理論值為447.1267(C20H24O10Na)，從而確定分子式為C20H24O10，不飽和度為9。
化合物3的氫譜與化合物2的很相似，只是比2的氫譜少了一個芳香質子信號，提示在3的結構中存在一個1，2，3-三取代苯[δ7.07(1H，d，J＝7.6Hz)，6.98(1H，d，J＝7.6Hz)and 6.74(1H，t，J＝7.6Hz)]，而非1，2-二取代苯。芳香質子δ7.07，6.74，6.98在COSY中順次相關，結合耦合裂分特征，被歸屬為H-4，H-5，H-6。糖端基氫H-1”(δ4.60，1H，d，J＝6.8Hz)在HMBC譜中與C-3(δ146.0)相關，提示葡萄糖連接在苷元的3位。從而，化合物3的結構被確定為2，4’-二羥基-3’，5’-二甲氧基-(1，1’-二苯基)-3-氧-葡萄糖苷。
化合物4是淡黃色膠狀物。結構式為 [α]D17-41.6°(c 0.25，MeOH)，UV圖譜(MeOH)λmax(logε)nm210(4.66)，263(4.07)，296(sh)(3.92)提示結構中有苯環(huán)存在。IR圖譜(KBr)vmaxcm-13431示有羥基存在，1630為苯環(huán)的特征吸收。ESI-MS給出準分子離子峰m/z 447[M+Na]+，423[M-H]-，提示分子量為424。HR-ESI-TOF-MSm/z 447.1249[M+Na]+，理論值為447.1267(C20H24O10Na)，從而確定分子式為C20H24O10，不飽和度為9。
在1H-NMR中，可以觀測到5個芳香質子，和兩個甲氧基(δ3.79，6H，s)。根據耦合常數，提示結構中含有一個1，4，5-三取代苯[δ7.02(1H，brd，J＝8.8Hz)，6.72(1H，d，J＝3.0Hz)，6.62(1H，dd，J＝8.8，3.0Hz)]和一個1，3，4，5-四取代苯(δ6.87，2H，brs)。此外，結合HSQC，剩余氫信號表明了結構中葡萄糖基的存在。ROESY譜中，甲氧基質子(δ3.77，6H，s)與兩個化學等價的芳香質子H-2’，6’(δ6.87，2H，brs)相關，提示它們連接在C-3’，5’(δ147.4)。HMBC譜中，兩個連氧碳信號δ151.9，146.8分別與H-2(δ6.72)，H-5(δ7.02)以及H-2，H-5，H-6(δ6.62)相關，因此被歸屬為C-3，C-4。HMBC相關峰H-2/C-1’(δ128.0)，表明其苷元結構為1，1’相連的聯(lián)苯。糖端基氫H-1”(δ4.89，1H，d，J＝7.7Hz，)在HMBC譜中與C-4相關，提示葡萄糖連接在苷元的4位。從而，化合物4的結構被確定為3，4’-二羥基-3’，5’-二甲氧基-(1，1’-二苯基)-4-氧-葡萄糖苷。
表1化合物1-5的13C-NMR數據(100MHz for13C)a


注a在DMSO-d6中測試.
實施例2酪氨酸酶抑制活性的測定試驗樣品取實施例1制得的化合物1-4，酪氨酸酶購自Sigma公司從蘑菇中提取。
對照品熊果苷試驗方法首先將底物L-酪氨酸溶解在磷酸緩沖溶液(25mM，pH 6.8)中達到0.1mg/mL濃度。向96孔板中，加入40μL上述底物溶液，80μL磷酸緩沖液(25mM，pH 6.8)，以及40μL用20％甲醇-水溶解的式(I)。以40μL的20％甲醇-水加入空白對照空中。加入40μL酪氨酸酶的磷酸緩沖溶液(100U/mL，25mM，pH 6.8)，開始反應，在37℃下溫孵30分鐘。溫孵前后在492nm下，測定每孔的吸光度。
根據在492nm下的吸光度計算化合物(I)對酪氨酸酶的抑制率(％)，并將酶活性抑制率(％)達到50％時抑制劑的濃度測定為IC50值。抑制率(％)可以根據下式進行計算，抑制率(％)＝[(A-B)-(C-D)]/(A-B)×100上式中，A表示溫孵后空白孔在492nm下的吸光度，B表示溫孵前空白孔在492nm下的吸光度，C表示溫孵后樣品孔在492nm下的吸光度，D表示溫孵前樣品孔在492nm下的吸光度。
結果見表2表2 酪氨酸酶抑制活性

結論上表2可以看出，所有樣品在體外實驗中表現出酪氨酸酶抑制活性，尤其是化合物3、4的抑制活性強于對照品熊果苷。
實施例3美白霜處方化合物3 0.1g 半胱氨酸0.1g硬脂酸10.0g 鯨蠟醇 4.5g羊毛酯1.0g 丙二醇 15.0g三乙醇胺 0.7g 十二烷基硫酸鈉 0.5g對羥基苯甲酸乙酯 0.1g 蒸餾水 68.ml制法取硬脂酸、鯨蠟醇、羊毛酯混合；另取化合物、丙二醇、三乙醇胺、十二烷基硫酸鈉、對羥基苯甲酸乙酯、蒸餾水混合，分別置于燒杯中加熱至熔化或溶解，保存在70℃左右攪拌下將油相加到水相中，攪至冷凝，即得實施例4、美白面膜處方(1)PVA14g山梨醇 2g月桂醇硫酸鈉 3g 甘油2.5g聚山梨酯-80 2.5g 化合物2 0.05g化合物3 0.05g 加至蒸餾水 100g(2)PVA14g甘油2.5g聚山梨酯-80 2.5g 蒸餾水加至 100g(3)乙基纖維素 5g 氯仿加至100ml制法先將(1)漿涂膜，干燥后在膜面上涂(2)漿，干燥后涂(3)溶液，干燥后脫膜、剪切、包裝。
實施例5防曬露處方甘油 5g 透明質酸鈉 0.5g氫氧化鉀 0.1g 乙醇10g維生素E 0.5g 吐溫80 2g化合物3 0.1g 香精適量水加至100ml實施例6精華素處方甘油 5g 透明質酸鈉 0.3g聚氧乙烯 2g 乙醇10ml
香精適量對羥基苯甲酸乙酯 0.1g化合物4 0.1g水加至100ml實施例7驅斑軟膏處方化合物3 0.5g化合物4 0.5g間苯二酚1.0g羊毛酯10g凡士林 76.6g 薄荷腦5g制法取化合物3、4、間苯二酚、薄荷腦置乳缽中混勻，加入適量熔化的羊毛酯、凡士林研磨，再分次加入余下的羊毛酯、凡士林研勻即得。
實施例8 軟膏處方硬脂酸 12g單硬脂酸甘油脂3.5g液體石臘 6g 凡士林5g羊毛酯 5g 三乙醇胺 0.5g對羥基苯甲酸乙酯 0.1g 化合物4 1g水 73ml制法取硬脂酸、單硬脂酸甘油脂、液體石臘、凡士林和羊毛酯置燒杯內加熱至80左右使熔化完全；三乙醇胺、對羥基苯甲酸乙酯、化合物4和水加熱至80℃左右，攪拌下加入至取硬脂酸等的混合液中，至乳化即。
實施例9比較實施例3和實施例8的樣品對人體美白效果的測定試驗方法將30名有明顯老年斑和雀斑的健康志愿者，分為三組，每組10名，試驗組在每天早晨和入睡前，涂抹實施例3或8的樣品，對照組不涂擦任何化妝品。在位化妝的狀態(tài)下拍攝實驗開始日及4周后的彩色照片，目測比較判定與實驗開始日相比的膚色狀態(tài)。
結果見表3實施例3和實施例8的樣品對人體美白效果的比較

結論從表3可以看出，含有聯(lián)苯糖苷衍生物的實施例3、8均具有較好的美白效果。
權利要求
1.一種酪氨酸酶抑制劑，由以下通式(I)表示的聯(lián)苯糖苷衍生物， 其中R1為H、OH、OCH3或葡萄糖基，R2為H、OH或葡萄糖基，R3、R4為H或葡萄糖基。
2.按權利要求1的酪氨酸酶抑制劑，其特征在于，聯(lián)苯糖苷衍生物中的R1為OCH3，R2、R3為H，R4為葡萄糖基，化學名為4’-羥基-2，3’，5’-三甲氧基-(1，1’-二苯基)-2’-氧-葡萄糖苷的化合物(1)。
3.按權利要求1的酪氨酸酶抑制劑，其特征在于，聯(lián)苯糖苷衍生物中的R2、R3、R4為H，R1為葡萄糖基，化學名為4’-羥基-3’，5’-二甲氧基-(1，1’-二苯基)-2-氧-葡萄糖苷的化合物(2)。
4.按權利要求1的酪氨酸酶抑制劑，其特征在于，聯(lián)苯糖苷衍生物中的R1、R3、R4為H，R2為葡萄糖基，化學名為2，4’-二羥基-3’，5’-二甲氧基-(1，1’-二苯基)-3-氧-葡萄糖苷的化合物(3)。
5.按權利要求1的酪氨酸酶抑制劑，其特征在于，聯(lián)苯糖苷衍生物中的優(yōu)選R1、R4為H，R2、OH，R3為葡萄糖基，化學名為3，4’-二羥基-3’，5’-二甲氧基-(1，1’-二苯基)-4-氧-葡萄糖苷的化合物(4)。
6.一種組合物，其中含有如權利要求1中通式I所表示的任何一種或一種以上的酪氨酸酶抑制劑，并含有藥學上所允許的藥用輔料或常規(guī)的化妝品基質制成的藥品或化妝品。
7.一種如權利要求1中通式I所表示的任何一種或一種以上的酪氨酸酶抑制劑的用途是作為黑色素生成抑制劑或美白劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的酪氨酸酶抑制劑和它的用途。發(fā)明內容是提供聯(lián)苯糖苷類衍生物，作為黑色素抑制劑或美白劑應用于醫(yī)藥、日用化工領域。具體的說是提供由以上通式(I)表示的聯(lián)苯糖苷衍生物，其中R
文檔編號A61K8/60GK1827631SQ20061003497
公開日2006年9月6日 申請日期2006年4月13日 優(yōu)先權日2006年4月13日
發(fā)明者姚新生, 栗原博, 戴毅 申請人:暨南大學