專利名稱：古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素在制備抗炎、抑制胃痙攣、胃痛藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥技術領域，涉及古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素的醫(yī)藥新用途。具體涉及古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素在制備預防和治療急慢性炎癥、胃痙攣、胃痛藥物中的應用。
背景技術：
各種炎癥性疾病是目前危害人類健康的常見多發(fā)病，涉及面廣，危害性大?？v觀當前對急慢性炎癥的治療，用以抗生素、激素為主的治療雖然多能收到良好的效果，但因耐藥菌株的不斷增加，有越來越多的病例，盡管用抗生素治療，病情卻得不到及時控制，而且抗生素在臨床應用中產生副作用的病例是屢見不鮮，部分因病毒感染所致，抗生素基本無效。因此，近年來世界上對于抗炎藥理的篩選將目光轉向中草藥中尋找。
近年來，中藥的抗炎免疫作用已受到廣泛的關注。臨床及實驗證實很多中藥具有很好的抗炎作用，且多無嚴重的毒副作用。目前認為中藥有多種抗炎作用機制，有些對下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸功能產生影響，有些通過影響炎癥介質的產生和分泌來實現(xiàn)的。近年來，隨著對炎癥認識的深入，在中藥抗炎作用與一氧化氮(NO)的關系方面也有了一定的認識。我國中醫(yī)藥學具有悠久的歷史，在這些中草藥有效成分中，推測極有可能存在抗炎活性的物質，所以，從天然產物中篩選具有抗炎活性的先導化合物不失為一理想途徑；進而通過進行先導化合物的結構修飾及全合成，再從一系列衍生化合物中篩選活性較強的單體，并結合抗炎活性的構效關系研究，最終發(fā)現(xiàn)具有臨床應用前景的藥物。
金果欖為防己科青牛膽屬植物青牛膽(Tinospora sagittata(Oliv.)Gagnep.)或金果欖(Tinospora capillipes Gagnep.)的干燥塊根，又名九牛膽、金銀袋(廣西)、地苦膽(四川)、九牛子(江西)、地蛋(湖南)。為中國藥典歷版所收載，有清熱解毒、利咽止痛之功效。用于咽喉腫痛，癰疽疔毒，泄瀉，痢疾，脘腹熱痛。(中國藥典(一部.2005年版)150-151.北京化學工業(yè)出版社)。
金果欖膠囊經臨床驗證270例，其中上呼吸道感染76例，急性扁桃腺炎10例，咽喉炎78例，急性胃腸炎24例，肺炎40例，氣管炎42例，治愈136例，占50.4％；有效120例，占44.4％；無效14例，占5.25％；總有效率為94.8％。金果欖酒精浸物外敷治療輸液性靜脈炎78例，治愈64例，占82.2％；好轉12例，占15.2％；無效2例.占2.6％；總有效率為97.4％。與對照組硫酸鎂相比，治愈率和有效率經統(tǒng)計學處理均有顯著性差異(P＜0.01，P＜0.05)。
雖然金果欖有如此好的臨床應用效果，但由于對其化學成分研究不深入，藥理篩選不足，導致活性成分不明確以及沒有可行的質量標準。我們通過對金果欖藥材進行系統(tǒng)的化學成分分離、純化、結構鑒定，發(fā)現(xiàn)金果欖中主要含有大量的二萜內酯及原小檗堿型生物堿，進一步的藥理活性篩選證明，二萜內酯中主要為古倫賓(columbin)、異古倫賓(isocolumbin)、去氧黃藤苦素(fibleucin)，是其抗炎、抑制胃竇平滑肌節(jié)律、鎮(zhèn)痛的活性成分。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提出古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素在制造用于預防和治療急慢性炎癥、胃痙攣、胃痛及相關疾病藥物中的應用。
本發(fā)明所說的古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素的結構式為 古倫賓結構式 異古倫賓結構式去氧黃藤苦素結構式本發(fā)明提出的古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素可從金果欖藥材或其他植物中提取，經分離純化得到，也可以是經化學合成的方法制備得到。
發(fā)明人實驗研究證明，古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素具有抗炎，鎮(zhèn)痛，抑制胃竇平滑肌痙攣，保護胃粘膜急性損傷的作用。
古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素中的一種或多種可以作為制備預防和治療急慢性炎癥、胃痙攣、胃痛及相關疾病的藥物的有效成分。
古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素加上一種或多種藥學上可以接受的載體可以制備成臨床治療的藥物，用于治療急、慢性炎癥，如上呼吸道感染，扁桃腺炎，咽喉炎，胃腸炎，肺炎，氣管炎，靜脈炎等，治療胃痙攣、胃痛等疾病。
上文所述藥學上可接受的載體是指藥學領域常規(guī)的藥物載體，例如稀釋劑、賦形劑如水等，填充劑如淀粉、蔗糖等，粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；濕潤劑如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣或碳酸氫鈉，吸收促進劑如季銨化合物，表面活性劑如十六烷醇，吸附載體如高嶺土或皂粘土，潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣、鎂或聚乙二醇等。另外還可以在組合物中加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。
古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素的制劑可以通過口服，經皮、鼻吸入，直腸、腸胃外、靜脈或肌肉給藥的方式施用于需要這種治療的患者。用于口服時，可將其制成常規(guī)的固體制劑如片劑、粉劑、粒劑、膠囊等，制成液體制劑如水或油懸浮劑或其它液體制劑如糖漿、酏劑等；用于腸胃外給藥時，可將其制成注射用的溶液、水或油性懸浮劑等。優(yōu)選的形式是片劑、包衣片劑、膠囊、栓劑、鼻噴霧劑和注射劑。
古倫賓、異古倫賓和去氧黃藤苦素可以從金果欖藥材中提取分離制備而得。具體提取方法如下金果欖藥材粉碎后以70％濃度以上的乙醇溶液回流提取2～3次，每次1～3小時，合并提取液，減壓濃縮，得浸膏；用水分散浸膏，用氯仿萃取2～4次，減壓濃縮萃取部位，得粗品；將粗品用甲醇加熱至溶解，再過濾；將濾液置于4℃冰箱中冷藏過夜，析出古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素組合物晶體；取組合物上硅膠柱，以石油醚—氯仿系統(tǒng)梯度洗脫，合并含有相同成分的洗脫液，減壓濃縮至干，即得到古倫賓、異古倫賓和去氧黃藤苦素單體。
我們對古倫賓、異古倫賓和去氧黃藤苦素進行了藥理學實驗，證實其具有抗炎、抑制胃痙攣、胃痛的作用。具體實驗過程和結果如下一、古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素的鎮(zhèn)痛作用(一)醋酸扭體模型1實驗動物Swiss種小鼠，雄性，體重20-24g。
2.實驗模型和測試方法取小鼠80只，隨機分成8組，按表1所示的劑量灌胃給藥3d，于末次給藥后1h，腹腔注射0.6％醋酸溶液0.2ml/只。觀察20min內小鼠扭體次數(shù)，計算疼痛抑制率。
3統(tǒng)計分析全部實驗結果均以均數(shù)±標準誤表示。用student t-檢驗比較兩組間數(shù)據的顯著性差異，P＜0.05，表示差異有顯著性意義。
4試驗結果表1.古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素的鎮(zhèn)痛作用


b與空白對照比較，p＜0.01，c與空白對照比較，p＜0.001.
(二)熱板模型1實驗動物昆明種小鼠，雌性，體重18-22g。
2.實驗模型和測試方法取一只2000ml大燒杯放置于55±0.5℃恒溫水浴箱中，預熱10min.每次1只小鼠放在熱板上，小鼠自放在熱板上至出現(xiàn)舔后足所需時間(秒)作為該小鼠的痛閾值。凡舔后足時間小于5s或大于30s或跳躍頻繁者棄之不用。取合格小鼠80只，隨機分成8組，重復測其正常痛閾值，取兩次正常痛閾值的平均值作為該鼠給藥前的痛閾值。按表2所示的劑量灌胃給藥，測定給藥后30min內小鼠痛閾值并計算痛閾提高百分率。痛閾提高百分率＝(用藥后平均痛閾值-用藥前平均痛閾值)/用藥前平均痛閾值×100％。
4試驗結果表2.古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素的鎮(zhèn)痛作用

a與空白對照比較，p＜0.05.b與空白對照比較，p＜0.01以上實驗結果表明，古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素對醋酸扭體模型和熱板模型動物呈陽性結果，提示具有顯著的鎮(zhèn)痛作用。
二、古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素的抗炎作用(一)小鼠耳腫脹模型1實驗動物Swiss種小鼠，雄性，體重20-24g。
2.實驗模型和測試方法取小鼠80只，隨機分成8組，按表3所示的劑量灌胃給藥3d，于末次給藥后1h，用0.05ml的二甲苯將小鼠左耳致炎，用直徑為7mm的打孔器將雙耳重疊打孔，將打下的圓片在扭力天平(靈敏度為萬分之一)上稱量，用鼠耳兩圓片的重量差表示其腫脹度。
3統(tǒng)計分析全部實驗結果均以均數(shù)±標準誤表示。用student t-檢驗比較兩組間數(shù)據的顯著性差異，P＜0.05，表示差異有顯著性意義。
4試驗結果表3.古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素的抗炎作用

a與空白對照比較，p＜0.05.b與空白對照比較，p＜0.01.
(二)大鼠角叉菜膠足腫脹模型1實驗動物SD大鼠，雌雄兼用，體重180-220g。
2.實驗模型和測試方法取大鼠80只，隨機分成8組，按表4所示的劑量灌胃給藥4d，于末次給藥前測量致炎前容積；末次給藥后30min，于大鼠右后肢足跎皮下注射1％角叉菜膠0.1ml致炎。分別于致炎后2、4、6h測量右踝關節(jié)以下容積。
3統(tǒng)計分析全部實驗結果均以均數(shù)±標準誤表示。用student t-檢驗比較兩組間數(shù)據的顯著性差異，P＜0.05，表示差異有顯著性意義。
4試驗結果表4.古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素對大鼠角叉菜膠足腫脹的影響


a與空白對照比較，p＜0.05.b與空白對照比較，p＜0.01.
(三)小鼠腹腔毛細血管通透性試驗1實驗動物NH系小鼠，雌雄兼用，體重18-22g。
2.實驗模型和測試方法取大鼠80只，隨機分成8組，按表5所示的劑量灌胃給藥1h，尾靜脈注射2％依文思藍生理鹽水溶液0.1ml/10g體重，隨即腹腔注射0.8％醋酸生理鹽水溶液0.20ml/只，20min后脫頸椎處死小鼠，用5ml生理鹽水分數(shù)次洗滌腹腔，3000轉/分，離心15min；取上清液用酶標儀于570nm比色測定其光密度(OD)值3統(tǒng)計分析全部實驗結果均以均數(shù)±標準誤表示。用student t-檢驗比較兩組間數(shù)據的顯著性差異，P＜0.05，表示差異有顯著性意義。
4試驗結果表5古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素對小鼠腹腔毛細血管通透性的影響

a與空白對照比較，p＜0.05.
以上實驗結果表明，古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素能降低小鼠腹腔毛細血管的通透性，對大鼠耳腫脹模型和角叉菜膠足腫脹模型呈陽性結果，提示具有抗炎作用。
三、古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素對豚鼠胃竇平滑肌自發(fā)節(jié)律振幅的影響1實驗動物Hartley種豚鼠，雄性，體重250～350g。
2.實驗模型和測試方法采用離體肌張力測定系統(tǒng)測定受試藥物對豚鼠胃竇平滑肌條自發(fā)節(jié)律振幅的影響。
1)豚鼠胃平滑肌分離方法將豚鼠擊昏，斷頭處死，立即剖腹取出全胃，沿胃小彎剪開，用Krebs液(mMNaCl 118，NaHCO325，KCl 4.7，KH2PO41.2，CaCl22.5，MgSO41.2，葡萄糖11，pH＝7.35-7.45)沖洗干凈，再用精細鑷子迅速剝離胃竇粘膜，沿環(huán)行肌方向剪成2×8mm肌條。固定在含有10ml的充灌5％CO2+95％O2混合氣體、溫度維持在37℃的Krebs液浴槽中。
2)胃竇平滑肌條自發(fā)節(jié)律振幅的測定平滑肌肌條的下端固定在浴槽底部，上端連接MLT 0202/D型張力換能器(ADInstrument)，換能器的輸出通過PowerLab/4SP生物信號處理系統(tǒng)處理和通過Chart v3.4.6(PowerLab)軟件記錄、存儲和分析。肌條的起始張力調節(jié)到0.5g，平衡時間不少于60分鐘，每20分鐘換液1次，防止代謝產物的累積。當胃平滑肌肌條自發(fā)節(jié)律規(guī)則穩(wěn)定后開始實驗，將受試藥物按1、3、10、30、100、300、1000μg/ml的濃度累積加藥測試，每次加藥間隔10分鐘。
3)實驗數(shù)據表示以加藥前肌條平衡后自發(fā)節(jié)律的幅度為100％，藥物對平滑肌張力的影響以(加藥后自發(fā)節(jié)律的幅度/平衡時自發(fā)節(jié)律的幅度)×100％表示。
4)統(tǒng)計分析全部實驗結果均以均數(shù)±標準誤表示。用student t-檢驗比較兩組間數(shù)據的顯著性差異，P＜0.05，表示差異有顯著性意義。
3實驗結果表6.古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素對豚鼠胃竇平滑肌自發(fā)節(jié)律振幅的影響(％，n表示樣本數(shù))

*與平衡時平滑肌自發(fā)節(jié)律振幅比較，p＜0.05以上結果表明，古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素對豚鼠胃竇平滑肌自發(fā)節(jié)律振幅對豚鼠胃竇平滑肌自發(fā)節(jié)律振幅即有明顯的抑制作用(p＜0.05)，且濃度依賴性地抑制豚鼠胃竇平滑肌自發(fā)節(jié)律振幅。
四、古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素抗胃損傷效應(一)乙醇急性胃損傷模型1實驗模型和測試方法Sprague-Dawley種大鼠禁食不禁水24h，在口服1ml的99.5％乙醇，乙醇處理后1小時，處死動物，切腹取胃，胃內注入1％的福爾馬林10ml進行固定。10分鐘后，沿胃大彎切開，測量損傷程度。在解剖顯微鏡(×10)的方型坐標的視野下，計算胃損傷長度(mm)，每個動物損傷長度的總和代表損傷指數(shù)。給藥的動物在口服乙醇前1小時給藥。
2胃形態(tài)學觀察Sprague-Dawley種大鼠經造模后，處死，切腹取胃，胃內注入1％的福爾馬林10ml進行固定。10分鐘后，沿胃大彎切開，測量損傷程度。在解剖顯微鏡(×10)的方型坐標的視野下，計算胃損傷長度(mm)，每個動物損傷長度的總和代表損傷指數(shù)。
3統(tǒng)計分析全部實驗結果均以均數(shù)±標準誤或標準差表示。用student t-檢驗法比較兩組間數(shù)據的顯著性，P值小于0.05，表示具有顯著性意義。
4實驗結果表7古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素乙醇引起的大鼠胃損傷和酸分泌的影響

a與空白對照比較，p＜0.05.
(二)消炎痛急性胃損傷模型1實驗模型和測試方法Sprague-Dawley種大鼠禁食不禁水24h，在口服200mg/kg體重的消炎痛，消炎痛處理后3.5小時，尾靜脈內注射0.5ml的5％Evens blue，0.5小時后處死動物，切腹取胃，胃內注入1％的福爾馬林10ml進行固定。10分鐘后，沿胃大彎切開，測量損傷程度。在解剖顯微鏡(×10)的方型坐標的視野下，計算胃損傷長度(mm)，每個動物損傷長度的總和代表損傷指數(shù)。給藥的動物在口服消炎痛前1小時給藥。
2胃形態(tài)學觀察
Sprague-Dawley種大鼠經造模后，處死，切腹取胃，胃內注入1％的福爾馬林10ml進行固定。10分鐘后，沿胃大彎切開，測量損傷程度。在解剖顯微鏡(×10)的方型坐標的視野下，計算胃損傷長度(mm)，每個動物損傷長度的總和代表損傷指數(shù)。
3統(tǒng)計分析全部實驗結果均以均數(shù)±標準誤或標準差表示。用student t-檢驗法比較兩組間數(shù)據的顯著性，P值小于0.05，表示具有顯著性意義。
4實驗結果表8古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素消炎痛引起的大鼠胃損傷和酸分泌的影響

a與空白對照比較，p＜0.05.
(三)胃酸分泌增加模型1實驗模型和測試方法Sprague-Dawley種大鼠禁食不禁水24h，腹腔注射300mg/kg組胺，4小時之后，處死動物，打開腹腔，結扎賁門與幽門后將胃取出，收集胃液，經5,000rps離心后，測定pH值和H+含量。給藥的動物在注射組胺前1小時給藥。
2胃酸的測定通過pH211型pH計(HANNA，USA)測定其pH值，通過Metrohm電位滴定儀(MetrohmCo.，Switzerland)應用pH-stat技術測定灌流液中H+含量。取胃液1ml，用0.1M的NaOH將pH滴定到7.0，進行胃酸的測定。
3統(tǒng)計分析全部實驗結果均以均數(shù)±標準誤或標準差表示。用student t-檢驗法比較兩組間數(shù)據的顯著性，P值小于0.05，表示具有顯著性意義。
4實驗結果表9古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素組胺引起的大鼠酸分泌的影響


a與空白對照比較，p＜0.05.
以上結果表明，古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素對乙醇急性胃損傷模型、消炎痛急性胃損傷模型和胃酸分泌增加模型均呈陽性結果，提示古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素具有抗胃損傷效應。


圖1古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素對豚鼠胃竇平滑肌自發(fā)節(jié)律振幅影響的量效曲線(％)。
下面的實施例可以使本專業(yè)技術人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
具體實施例方式
實施例1金果欖干燥藥材2.5kg，用95％溶液50升回流提取2次，每次2小時，合并兩次提取液，減壓濃縮得到浸膏120g，用2升水分散后，以6L氯仿分三次萃??；減壓濃縮萃取部位，得到粗品20g，將粗品用500毫升甲醇加熱溶解，趁熱過濾，濾液置4℃冰箱中冷藏過夜，析出古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素組合物結晶，濾紙過濾，干燥，得到組合物12g，取組合物10g，與50g硅膠混合拌樣，加到已裝好的硅膠柱頂端，以石油醚∶氯仿(20∶1～5∶1)系統(tǒng)梯度洗脫，TLC跟蹤，合并含成分相同的洗脫液，減壓濃縮至干，得到古倫賓單體200mg，異古倫賓3.7g，去氧黃藤苦素3.0g。
實施例2片劑活性成分(三種單體或組合物)17g乳糖200g玉米淀粉50g硬脂酸鎂3g制成1000片制備方法將活性成分、乳糖和淀粉混合，用水均勻濕潤制成軟材，把濕潤后的混合物制粒，過20目篩，80℃烘干，加入硬脂酸鎂，再過篩，然后將混合物壓片，每片重270mg，活性成分含量為17mg。
本發(fā)明的活性成分與相關載體結合，還可以制成其他固體制劑，如粉劑、粒劑、膠囊等。這些制劑的工藝已很成熟，這里不一一列舉。
實施例3輸液活性成分(三種單體或組合物)2g氯化鈉 9g注射用水100000ml制成1000瓶制備方法將活性成分和氯化鈉溶解于100000ml的注射用水中，加0.01％活性炭吸附，中間體檢測，0.45um膜過濾，分裝，100ml/瓶，滅菌，檢驗即得。
本發(fā)明的活性成分與相關輔劑結合，還可以制成其他液體制劑，如鼻噴霧劑、注射劑等。
上述這些藥物劑型均可有效地用于治療和預防急慢性炎癥及胃痙攣、胃病及相關疾病。
權利要求
1.古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素在制備預防和治療急慢性炎癥及相關疾病藥物中的應用。
2.古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素在制備預防和治療胃痙攣、胃痛及相關疾病藥物中的應用。
3.根據權利要求1或2所述的應用，其特征在于古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素從植物中分離純化得到，或由化學合成。
4.根據權利要求1或2所述的應用，其特征在于古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素為單一化合物或兩兩組合物或三種的組合物。
5.根據權利要求1所述的應用，其特征在于急慢性炎癥包括上呼吸道感染，扁桃腺炎，咽喉炎，胃腸炎，肺炎，氣管炎，靜脈炎。
6.用于預防和治療急性和慢性炎癥、胃痙攣、胃痛的藥物，其中含有治療有效量的古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素一種或幾種及藥學上可接受的載體。
7.根據權利要求6所述的藥物，其特征在于劑型包括注射劑，片劑，丸劑，膠囊劑，溶液，懸浮液，乳劑的形式。
全文摘要
本發(fā)明屬醫(yī)藥技術領域，具體為古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素在制備預防和治療急慢性炎癥、胃痙攣、胃痛藥物中的應用。研究表明，古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抑制胃竇平滑肌痙攣、保護胃粘膜急性損傷的作用。因此，以古倫賓、異古倫賓、去氧黃藤苦素為有效成分，配以藥學上可以接受的載體，可制成用于治療急慢性炎癥、胃痙攣、胃痛及相關疾病的藥物。該藥物的劑型包括片劑、粉劑、粒劑、膠囊、輸液、注射劑等。
文檔編號A61P1/04GK1839825SQ20061002348
公開日2006年10月4日 申請日期2006年1月19日 優(yōu)先權日2006年1月19日
發(fā)明者張衛(wèi)東, 史琪容, 張川, 蘇娟, 柳潤輝, 徐?？?申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學