專利名稱：從發(fā)酵茶中萃取的高分子多酚、線粒體病治療劑、糖尿病預(yù)防·治療劑和飲食品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從發(fā)酵茶中萃取的、具有活化線粒體作用的高分子多酚、含有該高分子多酚的線粒體病治療劑和糖尿病治療劑以及飲食品。
背景技術(shù)：
多酚是在同一分子內(nèi)具有多個(gè)酚類羥基的化合物的總稱，在植物中廣泛存在。近年，由于發(fā)現(xiàn)多酚類具有抗氧化作用、抗菌作用等多種多樣的作用而備受矚目，目前，正在進(jìn)行關(guān)于各種多酚的發(fā)現(xiàn)·萃取及其多酚的藥理作用等的研究。
多酚大體上可以分為類黃酮類、香豆素類、姜黃類、木酚素類、苯羧酸類等。其中，作為黃酮類，又分為兒茶酸類、花色素類、黃酮類、黃酮醇類、異黃酮類、黃烷類等。
兒茶素類(catechins)是C6-C3-C6骨架中具有多個(gè)酚類羥基的黃烷-3-醇骨架的物質(zhì)，特別是，在茶葉中大量含有。作為兒茶素類，例如為兒茶素、棓酸兒茶酯(catechin gallate)、表兒茶素、棓酸表兒茶酯、表?xiàng)攦翰杷?、棓酸表?xiàng)攦翰桴ァ攦翰杷帷斔釛攦翰杷狨サ?。代表例為“?”所示的兒茶素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。兒茶素類(兒茶素和兒茶素衍生物)如“化1”的化學(xué)結(jié)構(gòu)式所示、基本骨架具有A環(huán)、B環(huán)、C環(huán)。例如，棓兒茶酸為“化1”的化學(xué)結(jié)構(gòu)式中的B環(huán)的5’位的氫(H)被羥基(OH基)取代的物質(zhì)。

另一方面，花色素苷是由C6-C3-C6骨架組成的花色素(黃羊鹽)形成非糖類成分，并結(jié)合各種糖類成分而成的糖苷，有花色素糖苷、翠雀素糖苷等。已知主要較多存在于花·果實(shí)·葉等中的水溶性植物色素，并作為抗氧化物質(zhì)。
另外，在多酚中，也存在兒茶素類、花色素苷類等高度聚合的物質(zhì)(高分子多酚)。高分子多酚較多包含在葡萄酒、發(fā)酵茶等中，也認(rèn)為是在發(fā)酵或熟化過程中，兒茶素類、花色素苷類等通過聚合而生成。在非專利文獻(xiàn)中，也記載了從紅茶中萃取的高分子多酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)。在非專利文獻(xiàn)1中記載了的高分子多酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)如“化2”所示。另外，“化2”所示的化學(xué)結(jié)構(gòu)式中，R1為H(氫)或沒食子酸酰基、R1和R3為H(氫)或OH(羥基)。
另外，專利文獻(xiàn)1涉及多酚類的萃取方法，在“現(xiàn)有技術(shù)”欄中，記載了多酚的抗氧化作用。專利文獻(xiàn)2涉及兒茶素類、矢車菊苷配基類(procyanidins)的抗皮膚老化作用。該專利文獻(xiàn)的抗皮膚老化作用是基于MMPs(基質(zhì)金屬蛋白酶)的活性抑制的作用。專利文獻(xiàn)3涉及紅茶多酚的黑色素生成抑制劑。在專利中，記載了該抑制劑在美白效果方面是優(yōu)異的。
專利文獻(xiàn)1特開平7-199645號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2特開2003-252745號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3特開2001-158726號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)1Tetsuo Ozawa，Mari Kataoka，Keiko Morikawa，and OsamuNegishi，″Elucidation of the Partial Structure of Polymeric Thearubigins fromBlack Tea by ChemicalDegration″，Biosci.Biotech.Biochem.，60(12)，2023-2027，1996如前所述，多酚是多種多樣，未分離·萃取的多酚也很多。特別地，兒茶素類、花色素苷類或其他物質(zhì)高度聚合·鍵合的高分子多酚更多是未分離·萃取的，其藥理作用也沒有闡明的多酚較多。

發(fā)明內(nèi)容
所以，本發(fā)明的目的在于分離·萃取新穎的高分子多酚并提供該高分子多酚的新穎的藥理作用。
本發(fā)明的發(fā)明者們積極研究的結(jié)果，重新發(fā)現(xiàn)從發(fā)酵茶中萃取的高分子多酚具有線粒體活化作用、抑制血糖上升作用、抑制體重上升作用等。所以，本發(fā)明提供一種從發(fā)酵茶中萃取的高分子多酚，在部分結(jié)構(gòu)中，具有兒茶素類和/或其沒食子酸酯類聚合的矢車菊苷配基類結(jié)構(gòu)、以及兒茶素類和/或其沒食子酸酯類的B環(huán)之間聚合的結(jié)構(gòu)，并且該高分子多酚的數(shù)均分子量為9,000～18,000。
本發(fā)明涉及的高分子多酚可以通過以下步驟得到例如用乙酸乙酯萃取發(fā)酵茶中的水溶性成分，將在所述乙酸乙酯萃取中未能萃取的乙酸乙酯非溶解性成分用丁醇萃取，將在所述丁醇萃取中所萃取的丁醇溶解成分通過使用含水丙酮溶劑的柱色譜高度提純。
另外，例如可以通過以下步驟得到用乙酸乙酯萃取發(fā)酵茶中的水溶性成分，用丁醇萃取在所述乙酸乙酯萃取中未能萃取的乙酸乙酯非溶性成分，將所述在丁醇萃取中未能萃取的丁醇非溶性成分在氧化后，再次用丁醇萃取，將通過第二次丁醇萃取得到的丁醇溶解成分，通過使用含水丙酮溶劑的柱色譜高度提純。
認(rèn)為本發(fā)明涉及的高分子多酚在部分結(jié)構(gòu)中包括以下結(jié)構(gòu)兒茶素結(jié)構(gòu)(“化1”所示的以A環(huán)、B環(huán)、C環(huán)為基本骨架的結(jié)構(gòu))、兒茶素結(jié)構(gòu)中沒食子酸殘基以酯形式鍵合的結(jié)構(gòu)、矢車菊苷配基結(jié)構(gòu)(兒茶素結(jié)構(gòu)中的C環(huán)和別的兒茶素中的A環(huán)鍵合的結(jié)構(gòu))、兒茶素結(jié)構(gòu)中的A環(huán)和別的兒茶素結(jié)構(gòu)中的B環(huán)鍵合的結(jié)構(gòu)、兒茶素結(jié)構(gòu)中的B環(huán)和別的兒茶素結(jié)構(gòu)中的B環(huán)鍵合的結(jié)構(gòu)、苯醌結(jié)構(gòu)等(包括在部分結(jié)構(gòu)中存在相同部分的情況)。
如上所述，可知本發(fā)明涉及的高分子多酚具有線粒體活化作用，通過使用含有該高分子多酚的組合物作醫(yī)藥品，可以改善線粒體病。
而且，由于線粒體在主要承擔(dān)ATP合成任務(wù)的主要的細(xì)胞內(nèi)小器官中擔(dān)負(fù)生成細(xì)胞活動(dòng)基礎(chǔ)的能量的作用，因此通過活化線粒體可以進(jìn)行細(xì)胞的活化或細(xì)胞膜的穩(wěn)定化等。因此，通過使用本發(fā)明中涉及的高分子多酚，可以獲得抗老化作用、美肌作用、促進(jìn)能量代謝作用、抗肥胖作用、預(yù)防運(yùn)動(dòng)性貧血作用等。另外，含有本發(fā)明中涉及的高分子多酚的組合物除了可以適用作藥劑、運(yùn)動(dòng)性貧血預(yù)防劑，還適用作化妝品。另外，作為健康食品等，在飲食品中也可以含有本發(fā)明涉及的高分子的多酚。
另外，精子運(yùn)動(dòng)能力由于很大程度上依賴于鞭毛中的線粒體的ATP合成能力，因此含有本發(fā)明涉及的高分子多酚的組合物，也可以適用于男性(或雄性)的不孕癥治療或提高人·牛等人工受精中的受精率。
另外，由于纖毛的運(yùn)動(dòng)能力也很大程度上依賴于線粒體的ATP合成能力，因此通過使用本發(fā)明涉及的高分子多酚，可以增強(qiáng)祛痰作用或輸卵管的纖毛運(yùn)動(dòng)等。因此，含有本發(fā)明涉及的高分子多酚的組合物祛痰劑可以使用于女性(或雌性)使用的不孕治療劑等。
如上所述，含有本發(fā)明涉及的高分子多酚的組合物可以使用作藥劑、化妝品。另外，作為健康食品等，在飲食品中可以含有本發(fā)明涉及的高分子多酚。
而且，如上所述，本發(fā)明涉及的高分子多酚由于具有抑制血糖上升作用、抑制體重上升作用等，因此也適用作糖尿病預(yù)防·治療劑或抗糖尿病健康食品。
以下，對(duì)本發(fā)明中涉及的用語進(jìn)行定義。
“發(fā)酵茶”是指烏龍茶、紅茶等在制造工序中包括發(fā)酵階段的茶的全部。
“水”是指作為物質(zhì)名的水(H2O)。即在本發(fā)明中，“水”還包括沸水、熱水、水蒸氣等。因此，本發(fā)明中的“水溶性成分”包括通過沸水、熱水、水蒸氣等萃取時(shí)溶解的成分。
“線粒體病”是起源于線粒體DNA的遺傳變異、導(dǎo)致線粒體的機(jī)能降低的各種先天性疾病的總稱。包括濃赤染線維肌病、進(jìn)行性眼外肌麻痹、Leigh癥候群、伴隨濃赤染線維肌病的肌陣攣癲癇伴破碎紅纖維綜合癥(MERRF)、線粒體肌病、腦病、乳酸中毒癥、stroke-like episodes(MELAS)、Lieber眼性神經(jīng)病。
根據(jù)本發(fā)明涉及的多酚，可以活化細(xì)胞內(nèi)的線粒體。


圖1表示丁醇萃取烏龍茶的中性餾分的溶解曲線。
圖2表示萃取烏龍茶的酸性餾分的溶解曲線。
圖3表示丁醇萃取紅茶的中性餾分的溶解曲線。
圖4表示丁醇萃取紅茶的酸性餾分的溶解曲線。
圖5是表示將從發(fā)酵茶中萃取的有效餾分向糖尿病小鼠模型給藥時(shí)的體重變化的曲線。
圖6是表示將從發(fā)酵茶中萃取的有效餾分向糖尿病小鼠模型給藥時(shí)的血糖值變化的曲線。
圖7是表示將高分子多酚和低分子多酚分別向小鼠給藥時(shí)的血糖值變化的曲線。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1在實(shí)施例1中，進(jìn)行發(fā)酵茶萃取成分的分餾。分別從烏龍茶和紅茶中用丁醇萃取中性餾分、用丁醇萃取酸性餾分后，使用柱色譜進(jìn)行更細(xì)的分餾。
烏龍茶的成分萃取按以下步驟進(jìn)行。
首先，從烏龍茶茶葉中萃取水溶性成分。在1000ml沸水中加入30g烏龍茶茶葉。約沸騰1分鐘后，靜置10分鐘。接著，過濾并除去烏龍茶茶葉，得到過濾液。進(jìn)行4次的操作，得到含有從120g烏龍茶茶葉中熱水萃取的水溶性成分的水溶液。
接著，從含有水溶性成分的水溶液中萃取乙酸乙酯溶解性成分。該步驟是為了從烏龍茶茶葉水溶性成分中通過乙酸乙酯溶解和除去較低分子的多酚而進(jìn)行的。在含有水溶性成分的500ml水溶液中加入200ml的水飽和乙酸乙酯，攪拌，靜置后，分離乙酸乙酯相。該操作循環(huán)10次，收集分離的乙酸乙酯相，得到含有乙酸乙酯溶解性成分的萃取液。
接著，從乙酸乙酯溶解性成分萃取時(shí)殘留的水相中萃取丁醇溶解性成分，得到“丁醇萃取烏龍茶的中性餾分”。首先，在所述乙酸乙酯溶解性成分萃取的步驟中，對(duì)分離萃取乙酸乙酯相后殘留的水相減壓濃縮，除去殘留的乙酸乙酯。接著，在該500ml水相溶液中加入200ml水飽和正丁醇，和所述同樣地?cái)嚢琛㈧o置后，分離萃取丁醇相。該操作反復(fù)10次，收集分離萃取的丁醇相，得到含有丁醇溶解性成分的萃取液。接著，通過對(duì)萃取液減壓濃縮，除去丁醇，得到含有丁醇溶解性成分的水溶液。冷凍干燥該水溶液，形成“丁醇萃取烏龍茶的中性餾分”的樣品(產(chǎn)量4.5g/每120g茶葉)。
接著，調(diào)節(jié)丁醇溶解性成分萃取時(shí)殘留的水相成酸性，然后再次萃取正丁醇溶解性成分，得到“丁醇萃取烏龍茶的酸性餾分”。首先，在所述丁醇溶解性成分萃取的步驟中，在丁醇相分離萃取后殘留的水相中，加入鹽酸，調(diào)整pH為約3。接著，與所述同樣地，在該500ml水相溶液中加入200ml水飽和正丁醇，攪拌、靜置后，分離萃取丁醇相。該操作重復(fù)5次，收集分離萃取后的丁醇相，得到含有丁醇溶解性成分萃取液。接著，通過對(duì)萃取液減壓濃縮，除去丁醇，得到含有丁醇溶解性成分的水溶液。冷凍干燥該水溶液，形成“丁醇萃取烏龍茶的酸性餾分”的樣品(產(chǎn)量3.2g/每120g烏龍茶葉)。
對(duì)于紅茶成分萃取，也通過和烏龍茶相同的步驟進(jìn)行制備，分別得到“丁醇萃取紅茶的中性餾分”、“丁醇萃取紅茶的酸性餾分”。
另外，紅茶時(shí)，各餾分制備的前階段即水溶性成分的萃取是通過在500ml沸水中加入25g紅茶葉，10分鐘慢慢沸騰后，直接通過布氏漏斗過濾并除去紅茶葉而進(jìn)行。
在這次實(shí)驗(yàn)中，丁醇萃取紅茶的中性餾分的產(chǎn)量為1.5g、丁醇萃取紅茶的酸性餾分的產(chǎn)量為1.9g。
接著，對(duì)所述各有機(jī)溶劑萃取餾分進(jìn)行柱色譜分離，更細(xì)地分餾。在固定相中，使用Toyopearl HW-40F(Tosoh株式會(huì)社制、“Toyopearl”為注冊(cè)商標(biāo))，在移動(dòng)相中使用含水丙酮溶液。
首先，在直徑2.4cm×長(zhǎng)35cm的柱中填充Toyopearl HW-40F。另外，準(zhǔn)備600ml 20％丙酮溶液和600ml 50％丙酮溶液作為移動(dòng)相中使用的溶劑。
接著，在3ml 20％丙酮中溶解0.3g所述有機(jī)溶劑萃取餾分，該溶液流入到柱中。接著，在所述有機(jī)溶劑萃取餾分中，通過使用所述兩種濃度的丙酮溶液配制成20～50％的直線濃度梯度，依次洗脫出在20％丙酮溶液條件下吸附在固定相(Toyopearl)上的成分。使用餾分收集器向試驗(yàn)管中分別各取出5g洗脫液。洗脫液的流速為0.3g/分。
接著，對(duì)各試驗(yàn)管內(nèi)的洗脫液，分別測(cè)定在350nm中的吸光度，制作成洗脫曲線。基于洗脫曲線對(duì)有機(jī)溶劑萃取餾分作更細(xì)分餾，收集屬于相同餾分的試驗(yàn)管內(nèi)的洗脫液，減壓濃縮，除去丙酮，冷凍干燥。
在后述實(shí)驗(yàn)中使用由以上的步驟更細(xì)地分餾的發(fā)酵茶萃取成分作為樣品。
另外，圖1表示丁醇萃取烏龍茶的中性餾分的洗脫曲線(洗脫圖形)，圖2表示萃取烏龍茶的酸性餾分的洗脫曲線，圖3表示丁醇萃取紅茶的中性餾分的洗脫曲線，圖4表示丁醇萃取紅茶的酸性餾分的洗脫曲線。在圖1至圖4中，橫坐標(biāo)表示回收洗脫液的試驗(yàn)管序號(hào)(回收順序)，縱坐標(biāo)表示在350nm下的吸光度。
另外，圖1～圖4記載的“餾分”是表示基于洗脫曲線更細(xì)分餾分時(shí)的餾分。如圖所示，在圖1的丁醇萃取烏龍茶的中性餾分和圖2的萃取烏龍茶的酸性餾分中更細(xì)分餾成1～15餾分，在圖3的丁醇萃取紅茶的中性餾分中更細(xì)分餾成1～16餾分，在圖4的丁醇萃取紅茶的酸性餾分中更細(xì)分餾成1～11的餾分。
實(shí)施例2在實(shí)施例2中，對(duì)實(shí)施例1中分餾的各發(fā)酵茶萃取樣品的線粒體的活化作用進(jìn)行研究。
線粒體活化作用是通過使用Rhodamine-123測(cè)定在對(duì)原生動(dòng)物的四膜蟲給予發(fā)酵茶萃取的樣品時(shí)，線粒體膜電位是否上升而進(jìn)行檢測(cè)的。其中，“Rhodamine-123”是指與線粒體內(nèi)膜結(jié)合，通過氫離子從線粒體的基質(zhì)部分汲出到膜間部分所生成的電位差，而產(chǎn)生強(qiáng)熒光的試劑。本實(shí)驗(yàn)使用SIGMA社制造的Rhodamine-123。實(shí)驗(yàn)步驟如下所示。
首先，對(duì)原生動(dòng)物的四膜蟲給予發(fā)酵茶萃取的樣品。在實(shí)施例1中，將分餾的各發(fā)酵茶萃取樣品分別溶解于5％DMSO溶液中，制作1mg/ml的發(fā)酵茶萃取樣品溶液。對(duì)照使用5％DMSO溶液。接著，對(duì)于全部發(fā)酵茶萃取樣品溶液(包括對(duì)照，以下相同)，分別在2.7ml(1～2×104細(xì)胞/ml)四膜蟲中加入發(fā)酵茶萃取樣品溶液0.3ml(發(fā)酵茶萃取樣品溶液的最終濃度為0.1mg/ml)、在室溫下振蕩10～12小時(shí)。為了中止四膜蟲和發(fā)酵茶萃取樣品的反應(yīng)，使用手動(dòng)離心機(jī)過濾，舍棄上清液后，加入NKC溶液(34.7mM NaCl、1.07mM KCl、1.08mM CaCl2)、沖洗從發(fā)酵茶中萃取的樣品。
接著，進(jìn)行Rhodamine-123染色。在用各個(gè)發(fā)酵茶萃取樣品處理過的四膜蟲中加入NKC溶液和Rhodamine-123(最終濃度為10μg/ml)至3ml。振蕩45分鐘進(jìn)行染色。離心分離四膜蟲，舍棄上清液后，對(duì)加入NKC的步驟重復(fù)7次，沖洗Rhodamine-123。
接著，進(jìn)行線粒體膜電位的測(cè)定。首先，將Rhodamine-123染色的各個(gè)四膜蟲振蕩4小時(shí)后，使各個(gè)樣品的細(xì)胞數(shù)一致。接著，在96孔板上分別以100μl/孔裝入Rhodamine-123染色后的四膜蟲，靜置1小時(shí)。所述96孔板制成在室溫下靜置1小時(shí)的和在冰上靜置1小時(shí)的兩種。
靜置1小時(shí)后，將96孔板放置在小平板導(dǎo)管(激發(fā)485nm、吸收535nm)中，測(cè)定熒光光度。
接著，計(jì)算線粒體膜電位上升程度。在冰上靜置1小時(shí)時(shí)，由于四膜蟲的運(yùn)動(dòng)能力降低，無論樣品中是否具有線粒體活化能，線粒體活性仍然是那么低。所以，計(jì)算出在室溫下靜置1小時(shí)的四膜蟲和在冰上靜置1小時(shí)的四膜蟲的熒光光度差，將該數(shù)值作為是表示線粒體膜電位上升程度的值。另外，在本實(shí)驗(yàn)中，在得出在室溫下靜置1小時(shí)和在冰上靜置1小時(shí)的四膜蟲的熒光光度差后，換算成對(duì)照的熒光光度差為1時(shí)的相對(duì)值，作為表示線粒體膜電位上升程度的值。
結(jié)果(表示線粒體膜電位上升程度的相對(duì)值)如表1～表4所示。表1表示對(duì)于丁醇萃取烏龍茶的中性餾分的線粒體膜電位上升的程度，表2對(duì)于丁醇萃取烏龍茶的酸性餾分的線粒體膜電位上升的程度，表3表示對(duì)于丁醇萃取紅茶的中性餾分的線粒體膜電位上升的程度，表4表示對(duì)于丁醇萃取紅茶的酸性餾分的線粒體膜電位上升的程度。另外，表1至表4中，“產(chǎn)量”是指柱處理發(fā)酵茶萃取樣品0.30～0.35g時(shí)可以回收的量，是表示各餾分分別含有何種程度的高分子多酚的參考值。





如表1～表4所示，丁醇萃取烏龍茶的中性餾分、丁醇萃取烏龍茶的酸性餾分、丁醇萃取紅茶的中性餾分和丁醇萃取紅茶的酸性成分的任一種，都是在柱色譜法的后半段(丙酮濃度35～50％)洗脫出來的餾分中線粒體膜電位上升的程度高。即，丁醇萃取烏龍茶的中性餾分(表1)在餾分12后，丁醇萃取烏龍茶的酸性餾分(表2)在餾分10后，丁醇萃取紅茶的中性餾分(表3)在餾分10后，丁醇萃取紅茶的酸性餾分(表4)在餾分7后，線粒體膜電位上升的程度提高。
在柱色譜中于后半段洗脫出來的餾分，可以推測(cè)其為兒茶素類等復(fù)雜聚合的高分子聚合物。因此，認(rèn)為線粒體膜電位上升是由于兒茶素類等復(fù)雜聚合的高分子聚合物。
線粒體膜電位在如下情況下上升，即在產(chǎn)生ATP時(shí)呼吸鏈酶復(fù)合物活躍地發(fā)揮作用，將氫離子汲出到膜間部分時(shí)。因此這些結(jié)果暗示了發(fā)酵茶中包含的高分子多酚具有活化線粒體需氧呼吸的作用。
實(shí)施例3在實(shí)施例3中，對(duì)實(shí)施例1中分餾的丁醇萃取烏龍茶的酸性餾分的餾分15(以下，在本實(shí)施例和下述實(shí)施例4中，稱為“烏龍茶活性餾分”)和同樣在實(shí)施例1中分餾的丁醇萃取紅茶的中性餾分的餾分15(以下，在本實(shí)施例和下述實(shí)施例4中，稱為“紅茶活性餾分”)進(jìn)行鞣酸酶分解。這里，“鞣酸酶”是從兒茶素類、鞣酸類(tannins)等中切去沒食子酸性殘基的酶。
另外，“烏龍茶活性餾分”僅是表示在實(shí)施例2中在具有活化線粒體作用的餾分中，選擇丁醇萃取烏龍茶的酸性餾分的餾分15用于本實(shí)驗(yàn)中，但具有活化線粒體作用的餾分并不是局限于該含義(以下相同)。“紅茶活性餾分”也相同。
通過以下步驟進(jìn)行鞣酸酶分解。首先，在0.2ml水中分別溶解1.10mg烏龍茶活性餾分和0.86mg紅茶活性餾分，加入0.3ml鞣酸酶水溶液，在30℃的條件下，反應(yīng)3小時(shí)，進(jìn)行酶反應(yīng)。鞣酸酶水溶液使用將鞣酸酶(和光純藥工業(yè)株式會(huì)社制)用水調(diào)制成17.3U的水溶液。
接著，對(duì)酶反應(yīng)液(含有通過酶反應(yīng)的分解生成物)進(jìn)行紙色譜法分析。展開溶劑分別使用以下兩種。
(1)2％的乙酸水溶液(2)正丁醇、乙酸、水以4∶1∶5(體積比)混合的溶劑上層。
使沒食子酸(對(duì)照)和酶反應(yīng)液通過紙色譜儀同時(shí)展開，噴注0.5％鐵明礬和0.5％鐵氰化鉀，檢測(cè)展開的反應(yīng)生成物，求得Rf。其中，“Rf(rateof flow)表示通過紙色譜法從原點(diǎn)展開物質(zhì)移動(dòng)的距離。
其結(jié)果是烏龍茶活性餾分、紅茶活性餾分在(1)的溶劑中展開時(shí)，Rf為0.37，在(2)的溶劑中展開時(shí)，Rf為0.59，都檢測(cè)到了斑點(diǎn)。該斑點(diǎn)與沒食子酸的斑點(diǎn)的Rf一致。
因此，該結(jié)果表示在丁醇萃取烏龍茶的酸性餾分和丁醇萃取紅茶的中性餾分中含有的線粒體活性成分，在高次的化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有與表兒茶酸、表?xiàng)攦翰杷峄蛩鼈兊臎]食子酸酯相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
另外，本發(fā)明者們分別對(duì)丁醇萃取烏龍茶的中性餾分和丁醇萃取紅茶的酸性餾分進(jìn)行了同樣的實(shí)驗(yàn)。其結(jié)果是得到了同樣的結(jié)果。該結(jié)果表示在丁醇萃取烏龍茶的中性餾分和丁醇萃取紅茶的酸性餾分中含有的線粒體活性成分也與所述相同，在高次的化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有與表兒茶酸、表?xiàng)攦翰杷峄蛩鼈兊臎]食子酸酯相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例4
在實(shí)施例4中，對(duì)在實(shí)施例1中分餾的丁醇萃取烏龍茶的酸性餾分的烏龍茶活性餾分和同樣地在實(shí)施例1中分餾的丁醇萃取的紅茶的中性餾分的紅茶活性餾分進(jìn)行了鹽酸-丁醇分解。步驟如下。
首先，準(zhǔn)備1.1ml鹽酸和8.9ml正丁醇的混合試劑。接著，取烏龍茶活性餾分和紅茶活性餾分各0.5mg分別放入小反應(yīng)容器中，加入1.0ml所述混合試劑，蓋上螺旋蓋，在105℃的高壓釜中加熱50分鐘。
接著，對(duì)反應(yīng)生成物進(jìn)行紙色譜法分析。展開溶劑分別使用以下兩種。
(1)乙酸、鹽酸和水以30∶3∶10(體積比)混合的溶劑。
(2)正丁醇、乙酸和水以4∶1∶5(體積比)混合的溶劑的上層。
其結(jié)果在烏龍茶活性餾分中，在(1)的溶劑中展開時(shí)，于Rf0.57和Rf0.36處，在(2)的溶劑中展開時(shí)，于Rf0.46和Rf0.27處，檢測(cè)到花色素苷類特有的粉紅色的斑點(diǎn)。另外，在紅茶活性餾分中，在(1)溶劑中展開時(shí)，于Rf0.56和Rf0.36處，在(2)溶劑中展開時(shí)，于Rf0.46和Rf0.27處，檢測(cè)到了花色素苷類特有的粉紅色的斑點(diǎn)。認(rèn)為這些斑點(diǎn)中Rf值較高的為花色素、Rf值較低的為翠雀素。
因此，該結(jié)果表示丁醇萃取烏龍茶的酸性餾分和丁醇萃取紅茶的中性餾分中含有的線粒體活性成分，在高次的化學(xué)結(jié)構(gòu)中，含有矢車菊苷配基結(jié)構(gòu)。
另外，本發(fā)明者們分別對(duì)丁醇萃取烏龍茶的中性餾分和丁醇萃取紅茶的酸性餾分進(jìn)行了同樣的實(shí)驗(yàn)。其結(jié)果是得到了同樣的結(jié)果。該結(jié)果表示在丁醇萃取烏龍茶的中性餾分和丁醇萃取紅茶的酸性餾分中含有的線粒體活性成分也與所述相同，在高次的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有矢車菊苷配基結(jié)構(gòu)。
綜合實(shí)施例3和實(shí)施例4的結(jié)果，可以推測(cè)在實(shí)施例2中，顯示線粒體活化作用的成分為具有高次的化學(xué)結(jié)構(gòu)的多酚，在其部分結(jié)構(gòu)中，含有表兒茶酸、表?xiàng)攦翰杷峒八鼈兊臎]食子酸酯聚合的矢車菊苷配基結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例5在實(shí)施例5中，測(cè)定從發(fā)酵茶中萃取的有效餾分的平均分子量。
對(duì)于樣品，使用在實(shí)施例1中分餾的丁醇萃取的烏龍茶的中性餾分的餾分15、同樣地在實(shí)施例1中分餾的丁醇萃取烏龍茶的酸性餾分的餾分14、同樣地在實(shí)施例1中分餾的丁醇萃取的紅茶的中性餾分的餾分15、同樣地在實(shí)施例1中分餾的丁醇萃取的紅茶的酸性餾分的餾分11，共4種。
通過尺寸排阻色譜法(SEC；Size exclusion chromatography)進(jìn)行平均分子量的測(cè)定。
作為高速色譜儀裝置，使用LC-10A系統(tǒng)(株式會(huì)社島津制作所制)，柱使用TSK-GELα-3000(分離柱尺寸7.8mmI·D·×30cm、Tosoh株式會(huì)社制)。柱溫度為40℃。展開溶劑使用含有10mM氯化鋰(LiCl)的二甲基甲酰胺。流速設(shè)定為0.6ml/分鐘。檢測(cè)器使用包括于LC-10A系統(tǒng)的UV檢測(cè)器。檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為275nm。
首先，使分子量標(biāo)準(zhǔn)化合物流入到反應(yīng)柱中，洗脫時(shí)間為橫坐標(biāo)、UV檢測(cè)值為縱坐標(biāo)繪制，制作校正曲線。分子量標(biāo)準(zhǔn)化合物使用TSK標(biāo)準(zhǔn)聚苯乙烯(Tosoh株式會(huì)社制)。
接著，各樣品流入柱中，洗脫時(shí)間為橫坐標(biāo)、UV檢測(cè)值為縱坐標(biāo)繪制，基于校正曲線算出平均分子量。計(jì)算出數(shù)均分子量和重均分子量?jī)烧咦鳛槠骄肿恿俊?br> 結(jié)果如表5所示。


通過表5的結(jié)果可以看出從發(fā)酵茶中萃取的有效餾分的數(shù)均分子量為9,000～18,000，重均分子量為14,000～25,000。
實(shí)施例6在實(shí)施例6中，使用熱分解-氣相色譜-質(zhì)譜(Py-GC-MS)分析裝置，進(jìn)行從發(fā)酵茶中萃取的有效餾分的結(jié)構(gòu)分析。
通過熱分解裝置(Py)對(duì)樣品進(jìn)行熱分解后，將該分解生成物分別導(dǎo)入到氣相色譜裝置(GC)中，另外，通過質(zhì)譜裝置(MS)對(duì)各個(gè)化合物進(jìn)行分析，可以得到關(guān)于樣品化合物的熱性質(zhì)或化學(xué)結(jié)構(gòu)的見解。
樣品與實(shí)施例5相同，使用在實(shí)施例1中分餾的丁醇萃取的烏龍茶的中性餾分的餾分15，同樣地在實(shí)施例1中分餾的丁醇萃取烏龍茶的酸性餾分的餾分14，同樣地在實(shí)施例1中分餾的丁醇萃取紅茶的中性餾分的餾分15，同樣地在實(shí)施例1中分餾的丁醇萃取的紅茶的酸性餾分的餾分11，共4種。
熱分解(Py)使用Curie point熱分解裝置“JHP-5(日本分析工業(yè)株式會(huì)社)”。
首先，使?fàn)t內(nèi)和氣相色譜儀導(dǎo)入部的溫度為250℃。接著，用鐵磁性的焦箔(pyrofoils)(厚度50μm)包裹樣品，將5μL10％的氫氧化四甲基銨的甲醇溶液加入到樣品中，然后加入爐內(nèi)，在315℃下處理4秒鐘，進(jìn)行熱分解后，將分解生成物送到氣相色譜中。另外，10％的氫氧化四甲基銨的甲醇溶液是為了通過甲基化樣品中的化合物，在質(zhì)譜分析的階段中獲得揮發(fā)性·熱穩(wěn)定性而使用的。
氣相色譜-質(zhì)譜分析(GC-MS)使用氣相色譜質(zhì)譜分析計(jì)“JMS-600M(日本電子株式會(huì)社制)”。另外，使用TSS-2000(日本分析興行株式會(huì)社制)作為數(shù)據(jù)處理裝置。使用毛細(xì)管柱“HP-1MS(柱尺寸0.25mm×30m、涂層后的液層的厚度為0.25μm、Agilent Technologies制)作為氣相色譜用柱。
熱分解生成物和載氣流入到柱內(nèi)，分離熱分解生成物中存在的物質(zhì)，另外，獲得與保留時(shí)間有關(guān)的數(shù)據(jù)。另外，對(duì)分離的各物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析，得到了與化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)的見解。柱內(nèi)溫度開始在50℃下保持1分鐘，接著，以5℃/分鐘的速度直線升溫至300℃，接著在300℃下保持14分鐘。載氣使用氦氣。其流速設(shè)定為1.0ml/分鐘。另外，質(zhì)譜分析是在離子源溫度250℃、離子化電壓70eV的條件下進(jìn)行的。
對(duì)由氣相色譜-質(zhì)譜分析所得的數(shù)據(jù)與合成標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的已知數(shù)據(jù)比較，研究樣品中所含物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)等。
其結(jié)果，由各個(gè)樣品的熱分解物，檢測(cè)出下述10種化合物?！盎?”至“化5”表示這些化合物的化學(xué)式。另外，這些化合物的保留時(shí)間(tR；retention time)和分子量如下所示?；衔?(tR23.0分鐘；分子量168)、化合物2(tR22.1分鐘；分子量166)、化合物3(tR30.3分鐘；分子量196)、化合物4(tR30.5分鐘；分子量226)、化合物5(tR31.1分鐘；分子量254)、化合物6(tR32.4分鐘；分子量254)、化合物7(tR32.9分鐘；分子量254)、化合物8(tR35.2分鐘；分子量284)、化合物9(tR36.9分鐘；分子量312)、化合物10(tR46.5分鐘；分子量450)。
化3 化4 2R1＝R2＝R3＝R4＝H3R1＝R3＝R4＝H，R2＝OCH34R1＝R4＝H，R2＝R3＝OCH35R1＝COOCH3，R2＝OCH3，R3＝R4＝H6R1＝R4＝H，R2＝OCH3，R3＝COOCH37R1＝R3＝H，R2＝OCH3，R4＝COOCH38R1＝H，R2＝R3＝OCH3，R4＝COOCH39R1＝R4＝COOCH3，R2＝OCH3，R3＝H化5
這些結(jié)果顯示了在各個(gè)樣品中所含化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)中，含有提供上述10種分解生成物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
另外，通過質(zhì)譜分析結(jié)果，暗示了該化合物在兒茶素類或其沒食子酸酯類的化學(xué)結(jié)構(gòu)中的C2′、C5′、C6′部位、兒茶素類的C4-C8之間、C6-C6′之間或C6′-C6′之間具有聚合部位。
綜合實(shí)施例3～實(shí)施例6的結(jié)果，可以推測(cè)在實(shí)施例2中顯示活化線粒體作用的成分，是在部分結(jié)構(gòu)中含有兒茶素類和/或其沒食子酸酯類聚合了的矢車菊苷配基結(jié)構(gòu)以及兒茶素類和/或其沒食子酸酯類的B環(huán)之間相互結(jié)合的結(jié)構(gòu)的、數(shù)均分子量為9,000～18,000(重均分子量14,000～25,000)的高分子多酚。
基于上述見解，本發(fā)明涉及的高分子多酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)式的一個(gè)例子如“化6”所示。另外，本發(fā)明涉及的高分子多酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)并不局限于此。
化6 RI＝H或沒食子酰，R2＝R3＝H或OH
實(shí)施例7在實(shí)施例7中，將從發(fā)酵茶中萃取的有效餾分投入到糖尿病模型小鼠中，研究該成分是否具有抑制血糖值上升效果。
首先，將實(shí)施例2中的有效餾分溶解在PBS中，得到2.7mg/ml和0.9mg/ml的給藥液。接著，對(duì)II型糖尿病模型小鼠(BSK.Cg-+Lepr<db>/+Lepr<db>/Jcl、雄性6周年齡、購(gòu)自日本CLEA社)每天腹腔給藥0.1ml/天(0.27mg/天或者0.09mg/天)。另外，作為參照，每天腹腔給予PBS0.1ml。并且每天通過尾部靜脈采血，測(cè)定血糖值。
結(jié)果如圖5和圖6所示。圖5表示給予從發(fā)酵茶中萃取的有效餾分時(shí)，體重的變化。圖6表示給予從發(fā)酵茶中萃取的有效餾分時(shí)，血糖值的變化。圖5和圖6的橫坐標(biāo)表示給藥開始的周數(shù)。圖5的縱坐標(biāo)表示小鼠的體重(g)、圖6的縱坐標(biāo)表示血糖值(mg/dl)。另外，各曲線中的給藥個(gè)數(shù)為5只或6只。
在0.27mg/天的給藥群中，如圖5所示，與PBS給藥群(對(duì)照)相比，觀察到經(jīng)過10周后，體重降低約5g。另外，如圖6所示，大約過4周后觀察到血糖值的上升得到了抑制，另外，與PBS給藥群相比，在經(jīng)過10周時(shí)，血糖值降低約33％。
另外，在0.09mg/天的給藥群中，如圖5所示，與PBS給藥群(對(duì)照)相比，觀察到經(jīng)過10周后，稍微抑制了體重的增加。另外，如圖6所示，大約經(jīng)過6周后，觀察到血糖值的上升得到了抑制，另外，與PBS給藥群相比，在經(jīng)過10周后，血糖值降低約20％。
這些結(jié)果表示在給予較高濃度的從發(fā)酵茶中萃取的有效餾分時(shí)，可以抑制早期的體重增加和血糖值上升，并且，當(dāng)給予較低濃度時(shí)，通過長(zhǎng)期給藥，也可以抑制體重的增加和血糖值的上升。
實(shí)施例8在實(shí)施例8中，分別給予小鼠本發(fā)明涉及的高分子多酚和低分子多酚，比較血糖值上升的抑制效果。
實(shí)驗(yàn)步驟幾乎與實(shí)施例7相同。在本實(shí)驗(yàn)中，使用B6小鼠(C57BL、購(gòu)自日本CLEA社)。在高分子多酚給藥群中，以0.27mg/天、每天腹腔給予實(shí)施例2中的有效餾分的PBS溶解液，在低分子多酚給藥群中，以0.27mg/天、每天腹腔給予表兒茶酸的PBS溶解液。在給藥第一天和給藥開始過15天后，從尾部靜脈進(jìn)行采血，測(cè)量血糖值。
結(jié)果如圖7所示。圖7表示分別給予小鼠高分子多酚和低分子多酚時(shí)的血糖值的變化。圖中的橫坐標(biāo)表示給藥開始后的天數(shù)，縱坐標(biāo)表示將給藥第一天的血糖值設(shè)為100時(shí)的血糖值的變化的比例(％)。
如圖7所示，在高分子多酚給藥群中，血糖值降低了約16％，在低分子多酚給藥群中，血糖值幾乎沒有變化。
該結(jié)果暗示了本發(fā)明涉及的高分子多酚比低分子多酚具有更強(qiáng)的抑制血糖值上升的作用。
含有本發(fā)明涉及的高分子多酚的組合物適合用作藥品、化妝品。另外，作為健康食品等，在飲食品中可以含有本發(fā)明涉及的高分子多酚。
權(quán)利要求
1.一種從發(fā)酵茶中萃取出的高分子多酚，其特征在于在部分結(jié)構(gòu)中含有兒茶素類和/或其沒食子酸酯類聚合的矢車菊苷配基結(jié)構(gòu)，以及兒茶酸類和/或其沒食子酸酯類的B環(huán)之間結(jié)合的結(jié)構(gòu)，該高分子多酚的數(shù)均分子量為9,000～18,000。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高分子多酚，其特征在于所述發(fā)酵茶為烏龍茶或紅茶。
3.一種至少含有權(quán)利要求1所述的高分子多酚的線粒體病治療劑。
4.一種至少含有權(quán)利要求1所述的高分子多酚的糖尿病預(yù)防和治療劑。
5.一種至少含有權(quán)利要求1所述的高分子多酚的飲食品。
全文摘要
本發(fā)明提供一種高分子多酚的新穎的藥理作用。提供一種從發(fā)酵茶(烏龍茶、紅茶等)中萃取出的高分子多酚，提供一種在部分結(jié)構(gòu)中含有兒茶素類和/或其沒食子酸酯類聚合了的矢車菊苷配基結(jié)構(gòu)，以及兒茶素類和/或其沒食子酸酯類的B環(huán)之間聚合了的結(jié)構(gòu)，數(shù)均分子量為9,000～18,000的高分子多酚。該高分子多酚具有活化線粒體作用、抑制血糖上升作用、抑制體重上升作用等。因此，可以用作線粒體病治療劑、糖尿病預(yù)防·治療劑。另外，也可以包含在健康飲食品等中。另外，選擇圖表示將該高分子多酚以每天的各量給予糖尿病模型小鼠時(shí)，血糖值的變化。
文檔編號(hào)A61P25/08GK101072815SQ20058003541
公開日2007年11月14日 申請(qǐng)日期2005年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月4日
發(fā)明者沼田治, 藤原隆史, 細(xì)田和昭, 小澤哲夫 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人筑波大學(xué)