專(zhuān)利名稱(chēng)：給藥人il－18治療創(chuàng)傷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及人IL-18在治療創(chuàng)傷中的應(yīng)用，所述人IL-18被認(rèn)為是干擾素-γ-誘導(dǎo)因子(IGIF)。
背景技術(shù)：
本研究的起因是由于將分泌性蛋白質(zhì)治療靶向用于其發(fā)揮功能的部位(體液或細(xì)胞膜)會(huì)相對(duì)減輕痛苦。分泌性蛋白質(zhì)以及跨膜蛋白質(zhì)的胞外區(qū)域可以直接被給藥至體液，或者能通過(guò)自然途徑到達(dá)體液或膜。將蛋白質(zhì)分泌至細(xì)胞外空間的自然途徑是通過(guò)真核生物中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及原核生物中的內(nèi)膜(Palade，Science，189，347(1975)；Milstein等，Nature New Biol.，239，117(1972)；Blobel等，J.Cell Biol.，67，835(1975))。另一方面，還不清楚蛋白質(zhì)從細(xì)胞外部導(dǎo)入至細(xì)胞液的自然途徑(除了胞飲，蛇毒素侵入至細(xì)胞的機(jī)制)。因此細(xì)胞靶向蛋白治療法在本技術(shù)領(lǐng)域是非常困難的。
IL-18是最近發(fā)現(xiàn)的新的細(xì)胞因子?；钚匀薎L-18含有157個(gè)氨基酸殘基。其具有有效的生物活性，包括誘導(dǎo)T細(xì)胞和脾細(xì)胞生成干擾素γ-，增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性以及促進(jìn)幼稚CD4+T細(xì)胞分化成Th1細(xì)胞。另外，人IL-18增加GM-CSF的生成并減小IL-10的生成。IL-18已顯示出較IL-12更強(qiáng)的干擾素γ誘導(dǎo)作用，以及具有不同的受體并且利用特殊的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
CD4+T細(xì)胞是所用免疫應(yīng)答的重要調(diào)控因素。它被分為兩個(gè)亞型，即Th1和Th2。根據(jù)其能分泌的不同細(xì)胞因子來(lái)確定各個(gè)亞型。有趣的是，對(duì)分化最有效的誘導(dǎo)劑是細(xì)胞因子本身。從幼稚前體至Th2細(xì)胞的發(fā)育受到IL-4的誘導(dǎo)。IL-12早于IL-18被發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為是重要的Th1誘導(dǎo)細(xì)胞因子。IL-18也是一種Th1誘導(dǎo)細(xì)胞因子，并且在刺激干擾素γ生成方面比IL-12更有效。
Th1細(xì)胞分泌IL-2、干擾素γ以及TNF-β。干擾素γ是Th1細(xì)胞因子的特征，它直接作用于巨噬細(xì)胞增強(qiáng)其殺微生物作用(microbiocidal)和吞噬活性。結(jié)果，激活的巨噬細(xì)胞可以有效地破壞細(xì)胞內(nèi)的病原體以及腫瘤細(xì)胞。Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10以及IL-13，它們通過(guò)協(xié)助B細(xì)胞發(fā)育成產(chǎn)生抗體的細(xì)胞而發(fā)揮作用。綜合考慮，Th1細(xì)胞是形成細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的主要原因，而Th2細(xì)胞是體液免疫的原因。
創(chuàng)傷修復(fù)涉及包括多個(gè)細(xì)胞類(lèi)型、細(xì)胞外基質(zhì)成分以及多種介質(zhì)包括生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的的高度的有機(jī)相互作用。創(chuàng)傷修復(fù)可以由外傷、微生物或化學(xué)物質(zhì)而啟動(dòng)，這些引起組織損傷。雖然組織的完整性的修復(fù)是先天的宿主免疫應(yīng)答，但是當(dāng)創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程受到破壞時(shí)有多種情況。一些生長(zhǎng)因子已經(jīng)用于或嘗試用于經(jīng)放射或化學(xué)治療但效果有限的癌癥患者來(lái)預(yù)防粘膜炎。Peterson Adv.Stud.Med.，4(4B)S299-S310，(2005)。在四項(xiàng)涉及接受治療的癌癥患者的研究的2項(xiàng)以上中，粒細(xì)胞集落刺激因子(優(yōu)保津)對(duì)粘膜炎的發(fā)病率以及嚴(yán)重度有中等的效果。雖然結(jié)果不一致，但是粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(沙格司亭)減輕由化學(xué)治療和放射誘導(dǎo)的粘膜炎的嚴(yán)重度。對(duì)于粒細(xì)胞集落刺激因子和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子均僅證明了其對(duì)預(yù)防口腔粘膜炎的效果。研究顯示，角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Palifermin)非常有可能預(yù)防粘膜炎，它可以減少口腔粘膜炎的發(fā)病率并可以縮短口腔粘膜炎的病程。隨著針對(duì)粘膜炎病理生理學(xué)的制劑的出現(xiàn)，臨床醫(yī)生不再需要改變放射或者化學(xué)治療法，而是要調(diào)整治療設(shè)計(jì)，加入可以減少粘膜炎的發(fā)病率的制劑。非常明顯，這需要開(kāi)發(fā)一種可以增強(qiáng)創(chuàng)傷修復(fù)的新的治療性蛋白質(zhì)，特別是治療皮膚創(chuàng)傷，外科創(chuàng)傷，腿部潰瘍，糖尿病患者潰瘍，粘膜炎特別是胃腸道粘膜炎和口腔粘膜炎，以及肺損傷。


圖1顯示了天然人IL-18的氨基酸序列(SEQ ID NO1)。
圖2顯示了鼠IL-18的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
圖3顯示了鼠血小板來(lái)源的生長(zhǎng)因子-β(PDGF-β)的氨基酸序列(SEQ IDNO3)。通過(guò)除去一個(gè)信號(hào)肽(-20--1)以及N-端(1-61)和C-端(171-221)的前肽(劃線部分)，得到成熟的小鼠PDGF-β。
圖4顯示了人KGF的氨基酸序列(SEQ ID NO4)。
圖5顯示了局部給藥在腺病毒中編碼的鼠IL-18(SEQ ID NO2)對(duì)ob/ob小鼠的創(chuàng)傷修復(fù)的作用。每個(gè)數(shù)據(jù)均表示各組的平均值。
圖6顯示每日通過(guò)腹膜內(nèi)注射全身遞送鼠IL-18的純化蛋白(SEQ IDNO2)對(duì)ob/ob小鼠的創(chuàng)傷修復(fù)的作用。每個(gè)數(shù)據(jù)均表示各組的平均值。
圖7顯示了每日局部遞送人IL-18(SEQ ID NO1)對(duì)ob/ob小鼠的創(chuàng)傷修復(fù)的作用。每個(gè)數(shù)據(jù)均表示各組的平均值。

發(fā)明內(nèi)容
在EP 0692536A2、EP 0712931A2、EP0767178A1以及WO 97/2441號(hào)專(zhuān)利中公開(kāi)了人IL-18多肽。人IL-18的氨基酸序列以SEQ ID NO1列出。人IL-18多肽為干擾素γ-誘導(dǎo)多肽。它們對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫起重要的作用，包括通過(guò)T細(xì)胞和脾細(xì)胞誘導(dǎo)干擾素γ生成、增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性以及促進(jìn)天然CD4+T細(xì)胞分化成Th1細(xì)胞。
IL-18可以用于修復(fù)患者創(chuàng)傷，包括但不限于皮膚創(chuàng)傷，外科創(chuàng)傷，腿部潰瘍，糖尿病潰瘍，壓迫性潰瘍、粘膜炎，特別是胃腸道粘膜炎、口腔粘膜炎，以及肺修復(fù)。創(chuàng)傷修復(fù)與受損細(xì)胞再生成同類(lèi)細(xì)胞有關(guān)。創(chuàng)傷修復(fù)的過(guò)程包括下列細(xì)胞性活動(dòng)的系統(tǒng)協(xié)調(diào)增殖、遷移、分化以及再塑。細(xì)胞因子、化學(xué)因子、生長(zhǎng)因子以及作為細(xì)胞介質(zhì)的與特殊細(xì)胞有機(jī)相連(orchestrate)的粘附分子均參與這些活動(dòng)。Kampfer等，Molec.Med.6(12)10160-1027(2000)。白介素-18(IL-18)是一種促炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子，可以誘導(dǎo)腫瘤壞死因子-α、白介素1-β以及CC和CXC化學(xué)因子，它們?cè)趧?chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中的炎癥性階段發(fā)揮重要作用。Puren等，J.Clin.Invest.，101711-721(1998)。已經(jīng)確定，一些不同的細(xì)胞類(lèi)型包括角質(zhì)化細(xì)胞和活化的巨噬細(xì)胞可以合成IL-18，所述角質(zhì)化細(xì)胞和活化的巨噬細(xì)胞均在創(chuàng)傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。用人IL-18處理ConA-刺激的外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞(PBMC)的體外培養(yǎng)物可以誘導(dǎo)粒細(xì)胞單核細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的生成。Ushio等，J.Immunol.，1564274-4279(1996)。另外，IL-18顯示出誘導(dǎo)T-細(xì)胞和NK細(xì)胞生成干擾素γ(IFN-γ)的作用。粒細(xì)胞單核細(xì)胞集落刺激因子顯示出促進(jìn)傷口愈合的作用(Arnold等，J.Wound Care)，54400-402(1995)，并已經(jīng)在臨床用于治療患有慢性靜脈腿部潰瘍(venous legulcers)的患者。DaCosta等，Wound Rep.Reg.717-25(1999)。在創(chuàng)傷修復(fù)的鼠切除模型中，我們已經(jīng)證明IL-18促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)。IL-18促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)的機(jī)制可能是由于細(xì)胞因子的促炎癥反應(yīng)的性質(zhì)，或者是作為生長(zhǎng)因子的誘導(dǎo)劑例如粒細(xì)胞單核細(xì)胞集落誘導(dǎo)因子。
本發(fā)明的多肽可以通過(guò)公知的方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化，這些公知方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽(yáng)離子交換色譜法、磷酸纖維素色譜法、疏水作用色譜法、親和色譜法、羥磷灰石色譜法、凝集素色譜法以及高效液相色譜法。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)合成、分離和/或純化中多肽變性時(shí)，可以采用公知的重折疊蛋白質(zhì)的技術(shù)來(lái)恢復(fù)活性構(gòu)象。在WO 01/098455號(hào)專(zhuān)利中公開(kāi)了純化和產(chǎn)生活性人IL-18的方法。
本發(fā)明還提供了含有人IL-18多肽(SEQ ID NO1)的藥物組合物。該組合物含有治療有效量的化合物，還可以含可藥用可藥用的載體、稀釋劑或賦形劑。該藥學(xué)載體可以為無(wú)菌液體如水和油，所述油包括來(lái)自石油、動(dòng)物、植物或合成的油，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當(dāng)藥物組合物靜脈給藥時(shí)，水能用作載體。鹽溶液以及葡萄糖和甘油的水溶液也能作為例如注射溶液的液體載體。合適的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、面粉、白堊(chalk)、硅膠、硬脂酸鈉、單硬酯酸甘油酯、滑石、氯化鈉、干脫脂乳、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，該組合物還能含有較少量的潤(rùn)濕劑、乳化劑或pH緩沖劑。這些組合物能形成溶液、混懸劑、乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、粉劑、持續(xù)釋放制劑等形式。該組合物可以與慣用的粘合劑和載體如甘油三酯一起制成栓劑?？诜浞脚浞侥芎袠?biāo)準(zhǔn)的載體，如藥用級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。在E.W.Martin.的Remington′s Pharmaceutical Sciences中列舉了合適的藥物載體的示例。該組合物將含有治療有效量的通常為純化形式的化合物，以及合適量的載體來(lái)提供患者適當(dāng)?shù)慕o藥形式。該配方配方應(yīng)滿(mǎn)足給藥形式。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將該組合物按照日常規(guī)程制成適合給人靜脈給藥的藥物組合物。特別是，用于靜脈給藥的組合物是在無(wú)菌等滲水性緩沖液中的溶液。適當(dāng)時(shí)，該組合物還可以含有增溶劑和局部麻醉劑例如利多卡因，來(lái)減輕注射部分的疼痛。通常，組份以單獨(dú)或混合在一起以單位劑量的形式被提供，例如在如安瓶或sachette的標(biāo)明活性劑含量的密封容器中的干燥的經(jīng)低壓凍干的粉末或無(wú)水濃縮劑。當(dāng)組合物通過(guò)輸液給藥時(shí)，也可以在含有無(wú)菌的藥用級(jí)水或鹽水的輸液瓶中進(jìn)行配藥。當(dāng)組合物通過(guò)注射給藥時(shí)，可以提供一安瓶的注射用無(wú)菌水或鹽水，在給藥之前將各組份混合。
相應(yīng)的，所述多肽可以用于藥物的制備。本發(fā)明的藥物組合物可以配制成用作胃腸外給藥的溶液或低壓凍干的粉末。在使用之前通過(guò)添加適當(dāng)?shù)南♂寗┗蚱渌伤幱玫妮d體，可以將粉末重新溶解(reconstituted)。液體制劑可以是緩沖的、等滲的、含水的溶液。適當(dāng)稀釋劑的實(shí)例為常規(guī)等滲鹽溶液、標(biāo)準(zhǔn)的5％葡萄糖的水溶液、標(biāo)準(zhǔn)的5％葡萄糖的緩沖醋酸鈉或標(biāo)準(zhǔn)的5％葡萄糖的醋酸銨溶液。該配方特別適合胃腸外給藥，但是也可以用于口服給藥或包含于計(jì)量劑量的吸入器或霧化器中用于吹入給藥?？赡苄枰蛟撍幬锝M合物中添加賦形劑，例如聚乙烯吡咯烷酮、明膠、羥基纖維素、阿拉伯膠、聚乙二醇、甘露醇、氯化鈉或檸檬酸鈉。
另一方面，可以將該多肽膠囊化、片劑化，或者將其制成乳劑或糖漿用于口服給藥?？梢蕴砑涌伤幱玫墓腆w或液體載體來(lái)增強(qiáng)或穩(wěn)定該組合物，或方便組合物的制備。固體載體包括淀粉、乳糖、二水硫酸鈣、白土、硬脂酸鎂或硬脂酸、滑石、果膠、阿拉伯膠、瓊脂或明膠。液體載體包括糖漿、花生油、橄欖油、鹽和水。載體還可包括持續(xù)釋放材料，如單獨(dú)的單硬酯酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，或者再加蠟。固體載體的量不同，但是應(yīng)該為每劑量單位約20mg至約1g。該藥學(xué)制劑可以通過(guò)下述藥劑學(xué)的常規(guī)技術(shù)來(lái)制備，所述技術(shù)包括當(dāng)適合用于片劑時(shí)的研制(milling)、混合、制粒和壓片；或者用于硬明膠膠囊劑的研制、混合和充填。當(dāng)使用液體載體時(shí)，制劑可以制成糖漿劑、酏劑、乳劑或者含水或不含水混懸液。這樣的液體配方可以直接經(jīng)口給藥(p.o.)或者填充至軟明膠膠囊中給藥。
可以將人IL-18多肽制成藥物組合物，該組合物在可藥用的載體中含有有效量的多肽作為活性成分。對(duì)本發(fā)明的組合物可以采用含有多肽、在生理pH下緩沖的含水混懸液或溶液的易于注射的形式。用于胃腸外給藥的該組合物通常含有本發(fā)明的多肽的溶液或其溶解于可藥用的載體如含水載體中的混合物(cocktail)?？梢圆捎貌煌暮d體，例如0.4％鹽水、0.3％甘氨酸等。這些溶液是無(wú)菌的并且通常不含微粒物質(zhì)。這些溶液可以通過(guò)常規(guī)熟知的滅菌技術(shù)(例如，過(guò)濾)來(lái)滅菌。由于需要接近生理?xiàng)l件，因此該組合物可以含可藥用可藥用的輔助物質(zhì)，如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑等。在該藥物配方中的本發(fā)明的多肽的濃度可以根據(jù)所選擇的特定的給藥方式進(jìn)行較大地變化，例如以重量計(jì)，從小于約0.5％、通常為或至少為約1％，至差不多15或20％，并且可以主要根據(jù)流體體積、粘度等進(jìn)行選擇。
因此，可以制備用于肌肉注射的本發(fā)明的藥物組合物，使其含有1mL無(wú)菌緩沖的水以及約1ng至約100mg，例如約50ng至約30mg或者約5mg至約25mg的本發(fā)明的多肽。類(lèi)似地，可以制備用于靜脈輸注的本發(fā)明的藥物組合物，使其含有約250mL的無(wú)菌Ringer溶液以及約1mg至約30mg、或者約5mg至約25mg的本發(fā)明的多肽。制備胃腸外給藥的組合物的目前的方法為熟知的方法，或者對(duì)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的，并且在下列文獻(xiàn)中更加詳細(xì)地描述例如Remington′s Pharmaceutical Science，第15版，Mack出版公司，伊斯頓，賓夕法尼亞州。
當(dāng)被用于藥物制劑的制備中時(shí)，本發(fā)明的多肽可以為單位劑量的形式，其適當(dāng)?shù)闹委熡行┝磕鼙槐绢I(lǐng)域的技術(shù)人員輕松地確定。如果可以的情況下，該劑量可以在響應(yīng)階段內(nèi)，以醫(yī)師選擇的適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔重復(fù)給藥。
另外，可以任選進(jìn)行體外分析來(lái)幫助確定最佳劑量范圍。在配方中采用的精確的劑量也依賴(lài)于給藥途徑、疾病或障礙的嚴(yán)重度，并且應(yīng)該根據(jù)醫(yī)師的判斷以及患者的情況來(lái)確定。有效劑量可以通過(guò)從體外或動(dòng)物模型試驗(yàn)系統(tǒng)所得的劑量響應(yīng)曲線而推測(cè)得到。
典型地，對(duì)于向患者給藥的多肽的劑量為0.1mg/kg(患者體重)至100mg/kg(患者的體重)。給藥患者的劑量可以在0.1mg/患者的體重(kg)與20mg/患者的體重(kg)之間，或者1mg/kg(患者的體重)至10mg/kg(患者的體重)。一般，由于對(duì)外源多肽的免疫應(yīng)答，相對(duì)于來(lái)自其它物種的多肽，人多肽在人體中具有更長(zhǎng)的半衰期。因此，更少劑量的人多肽以及更少頻率的給藥常常是可能的。另外，通過(guò)修飾，例如脂質(zhì)化(lipidation)，可以增大本發(fā)明的多肽的吸收和組織透過(guò)(例如，進(jìn)入腦)，這樣可以減少本發(fā)明的多肽的給藥劑量和頻率。
本發(fā)明還提供了藥物試劑包或藥物盒，該藥物試劑包或藥物盒包含裝有1種或多種本發(fā)明的藥物組合物的成分的1個(gè)或多個(gè)的容器。任選與該一種或多種容器組合可以由政府機(jī)構(gòu)規(guī)定的形式通知，所述政府機(jī)構(gòu)調(diào)整藥物制劑或生物制品的制備、使用或出售，該通知反映通過(guò)機(jī)構(gòu)的許可，可以為人用給藥而進(jìn)行制備、使用或出售。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，將試劑盒與適當(dāng)數(shù)量的容器一起提供，該容器裝有對(duì)治療具體適應(yīng)癥所需要?jiǎng)┝俊?br> 在另一實(shí)施方案中，可以將該混合物或組合物遞送以小囊具體而言是脂質(zhì)體遞送(參見(jiàn)Langer，Science2491527-1533(1990)；Treat等，Liposomes in theTherapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein和Fidler(編輯)，Liss，紐約，第353-365頁(yè)(1989)；Lopez-Berestein，同上，第317-327頁(yè)；通常參見(jiàn)同上)在另一實(shí)施方案中，可以將該化合物或組合物以控式釋放系統(tǒng)遞送。在一實(shí)施方案中，可以使用泵(參見(jiàn)Langer，同上；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14201(1987)；Buchwald等，Surgery 88507(1980)；Saudek等，N.Engl.J.Med.321574(1989))。在另一實(shí)施方案中，能使用聚合物質(zhì)(參見(jiàn)Medical Applications of Controlled Release，Langer和Wise(編輯)，CRC Pres.，Boca Raton，F(xiàn)la.(1974)；Controlled Drug bioavailability，Drug Product Designand Performance，Smolen和Ball(編輯)，Wiley，紐約(1984)；Ranger等，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361(1983)；也參見(jiàn)Levy等，Science228190(1985)；During等，Ann.Neurol.25351(1989)；Howard等，J.Neurosurg.71105(1989))。在另一實(shí)施方案中，控釋釋放系統(tǒng)可以被放置在接近治療靶向的部位，即腦，因此僅需要全身劑量的一部分(參見(jiàn)，例如Goodson，MedicalApplications of Controlled Release，同上，第2卷，第115-138頁(yè)(1984))。在Langer(Science 2491527-1533(1990))的綜述中討論了其它的控釋系統(tǒng)。
人IL-18多肽(SEQ ID NO1)可以通過(guò)任意合適的體內(nèi)途徑給藥，可以根據(jù)需要重復(fù)給藥，例如從每日1次到3次給藥1天至約3周，到每周1次或兩周1次。選擇性地，可以改變?cè)撾膩?lái)降低負(fù)荷密度，因此達(dá)到口服生物利用度。治療的劑量和持續(xù)時(shí)間與本發(fā)明的分子在人體循環(huán)中的持續(xù)時(shí)間有關(guān)，并且能由本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)治療的情況和患者的綜合健康調(diào)整。
本發(fā)明提供了通過(guò)給藥患者有效量的包含人IL-18多肽(SEQ ID NO1)的本發(fā)明的化合物或藥物組合物來(lái)進(jìn)行治療、抑制和預(yù)防的方法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物基本上被純化(例如，基本上不含限制其效果或帶來(lái)不希望的副作用的物質(zhì))。當(dāng)化合物含有多肽時(shí)，能采用如上配方和給藥方法；其它適當(dāng)?shù)呐浞胶徒o藥方法可以選自下述的方案。
已知有不同的遞送系統(tǒng)，并可以用于本發(fā)明的化合物的給藥，例如，脂質(zhì)體中的包囊、微粒、微囊、能表達(dá)該化合物的重組細(xì)胞、受體介導(dǎo)的胞吞(參見(jiàn)，例如Wu等，J.Biol.Chem.2624429-4432(1987))、用逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體進(jìn)行的核酸構(gòu)建等。給藥的方法包括但不限于真皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外給藥和口服途徑。該化合物或組合物可以通過(guò)任意合適的途徑給藥，例如輸液或推注、通過(guò)上皮細(xì)胞或粘膜與皮膚的內(nèi)層吸收(例如，口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)以及可以與其它生物活性藥物一起給藥。給藥能全身給藥也可以局部給藥。另外，希望通過(guò)任意適當(dāng)?shù)耐緩綄⒈景l(fā)明的藥物化合物或組合物導(dǎo)入至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，這些途徑包括腦室內(nèi)和鞘內(nèi)注射；通過(guò)腦室內(nèi)導(dǎo)管可以更容易進(jìn)行腦室內(nèi)注射，例如，連接一個(gè)貯器(reservoir)如Ommaya貯器。還能采用肺部給藥，例如，通過(guò)使用吸入器或噴霧器以及具有霧化劑(aerosolizing agent)的配方。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中希望的是向需要治療的部位局部給藥本發(fā)明的藥物化合物或組合物。這種給藥方式可以通過(guò)下述示例實(shí)現(xiàn)，但不限于此，例如在手術(shù)時(shí)局部輸注；局部施用例如在手術(shù)后與創(chuàng)傷敷料結(jié)合，通過(guò)注射，通過(guò)導(dǎo)管，通過(guò)栓劑，通過(guò)移植片，所述移植片為多孔、非多孔、或凝膠狀材料，包括膜例如sialastic膜，或者纖維。當(dāng)給藥蛋白質(zhì)時(shí)希望使用不吸收蛋白質(zhì)的材料。
本發(fā)明的多肽的給藥方式可以是將藥物遞送至宿主的任意適當(dāng)?shù)耐緩?。本發(fā)明的多肽和藥物組合物對(duì)胃腸外給藥尤其有效，即皮下給藥、肌肉內(nèi)給藥、靜脈給藥或鼻內(nèi)給藥，或者如果用于修復(fù)皮膚上的創(chuàng)傷時(shí)局部給藥。該多肽能通過(guò)胃腸外給藥給藥患者來(lái)治療粘膜炎。
在不超出本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思以及基本特征的情況下，本發(fā)明可以通過(guò)其它具體方式來(lái)實(shí)施，并且相應(yīng)地應(yīng)參照權(quán)利要求書(shū)來(lái)確定本發(fā)明的范圍，而不是根據(jù)上述說(shuō)明書(shū)或下述實(shí)施例。
術(shù)語(yǔ)表提供以下解釋使在上文中經(jīng)常出現(xiàn)的特定術(shù)語(yǔ)更易于理解。
在此，術(shù)語(yǔ)“載體”是指用于給藥治療劑的稀釋劑、佐劑、賦形劑或者媒介物。
“分離的”是指從其自然狀態(tài)改變到“人工狀態(tài)”，也就是，如果它在自然界存在，那么它已經(jīng)被改變或被從原始環(huán)境中移出，或者兩種情況兼有。例如，多核苷酸或多肽自然存在于活組織中不是“分離的”，但是，同樣的多核苷酸或多肽從至少一種其自然狀態(tài)的共存的細(xì)胞物質(zhì)中分離出來(lái)就是“分離的”，就如該術(shù)語(yǔ)在此的使用。此外，通過(guò)轉(zhuǎn)化、基因操作或者其它重組方法被導(dǎo)入生物體的多核苷酸或多肽是“分離的”，即使該多核苷酸或多肽還存在于所述生物體，該生物體可以是活生物體或非活生物體。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“粘膜炎”是指由輻射或化學(xué)治療造成的器官例如在腸、膀胱、口腔上皮層的破壞，。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“藥物”包括本發(fā)明在獸醫(yī)上的應(yīng)用。術(shù)語(yǔ)“治療有效劑量”是指治療劑的劑量，所述劑量對(duì)緩解所選癥狀有效。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“可藥用的”是指經(jīng)聯(lián)邦或國(guó)家政府的調(diào)控機(jī)構(gòu)的認(rèn)可，或者在美國(guó)藥典或其它公認(rèn)的藥典中列出用于動(dòng)物，尤其為人用?！岸嚯摹笔侵负型ㄟ^(guò)肽鍵或經(jīng)修飾的肽鍵相互連接2個(gè)或多個(gè)氨基酸的任意多肽，即，肽電子等排體。“多肽”可以為短鏈，通常指肽、寡肽或低聚物，也可以為長(zhǎng)鏈，通常指蛋白質(zhì)。多肽可以包含除了20個(gè)基因編碼的氨基酸之外的氨基酸?！岸嚯摹卑ㄍㄟ^(guò)自然加工進(jìn)行修飾的氨基酸序列，例如翻譯后加工，也包括通過(guò)本領(lǐng)域熟知的化學(xué)修飾技術(shù)進(jìn)行修飾的氨基酸序列。在基礎(chǔ)課本中詳細(xì)描述了這些修飾，在專(zhuān)題著作中以及大量的研究文獻(xiàn)中敘述得更加細(xì)致。修飾可以發(fā)生在多肽的任意部位，包括肽的主鏈、氨基酸側(cè)鏈以及氨基或羧基端。一般認(rèn)為在給定多肽的一些位點(diǎn)可以存在相同或不同的程度的相同類(lèi)型的修飾。給定的多肽也可以含有多種類(lèi)型的修飾。多肽可以由于泛素化而形成分枝，也可以為具有或不具有分枝的環(huán)狀。環(huán)狀、分枝化以及分枝化環(huán)狀多肽可以是由于翻譯后自然加工，或者通過(guò)合成方法而形成。修飾包括乙?；?、?；?、ADP-糖基化、酰胺化、生物素酰化、與黃素共價(jià)連接、與血紅素部分共價(jià)連接、與核苷酸或核苷酸的衍生物共價(jià)連接、與脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物共價(jià)結(jié)合、與磷脂酰肌醇共價(jià)連接、交聯(lián)、環(huán)化、形成二硫鍵、脫甲基化、形成共價(jià)交聯(lián)、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲?；?、γ-羧化、糖基化、形成GPI錨、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻?；?、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、轉(zhuǎn)移RNA介導(dǎo)的將氨基酸加成至蛋白質(zhì)，例如精氨?；头核鼗?參見(jiàn)，例如Protein-Structureand Molecular Properties，第二版，T.E.Creighton，W.H.Freeman andCompany，紐約，1993；Wold，F(xiàn).，Post-translational Protein ModificationsPerspectives and Prospects，Post-translational Covalent Modification of protein，B.C.Johnson編輯，Academic Press，紐約，1983；Seifter等，Meth Enzymol，182，626-646，1990；Rattan等，Ann.NY Acad.Sci.，66348-62(1992))。
將生物活性化合物共價(jià)連接到水溶性聚合物上是改變或控制這些化合物的生物擾動(dòng)、藥代動(dòng)力學(xué)以及常為毒性的一種方法(Duncan，R.和Kopecek，J.(1984)Adv.Polym.Sci.5753-101)。已經(jīng)使用多種水溶性聚合物來(lái)達(dá)到這些效果，例如聚(唾液酸)、葡聚糖、聚(N-(2-羥丙基)異丁烯酰胺)(PHPMA)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙二醇-共-丙二醇)、聚(N-丙烯酰嗎啉(PAcM)以及聚(乙二醇)(PEG)(Powell，G.M.(1980)Polyethyleneglycol。在R.L.Davidson(編輯)Handbook of Water Soluble Gums and Resins.McGraw-Hill，紐約，第18章)。PEG具有理想的性質(zhì)非常低的毒性(Pang，S.N.J.(1993)J.Am.Coll.Toxicol.12429-456)、在水溶液中非常好的溶解性(Powell，supra)、低免疫原性和抗原性(Dreborg，S.和Akerblom，E.B.(1990)Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.6315-365)。在科技文獻(xiàn)(Clark，R.等，(1996)J.Biol.Chem.27121969-21977；Hershfield，M.S.(1997)Biochemistry andimmunology of poly(ethylene glycol)-modified adenosine deaminase(PEG-ADA)，在J.M.Harris和S.Zalipsky(編輯)Poly(ethylene glycol)中Chemistry and Biological Applications.American Chemical Society，華盛頓，，第145-154頁(yè)；Olson，K.等，(1997)Preparation and characterization ofpoly(ethylene glycol)ylated human growth hormone antagonist。在J.M.Harris和S.Zalipsky(編輯)Poly(ethylene glycol)中Chemistry and BiologicalApplications.American Chemical Society，華盛頓，第170-181頁(yè))中描述了在蛋白質(zhì)上含有單個(gè)或多個(gè)聚乙二醇鏈的PEG-綴合的或“PEG化的”蛋白治療學(xué)。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“創(chuàng)傷修復(fù)”是指關(guān)于愈合傷口的組織修復(fù)過(guò)程，包括但不限于封閉傷口修復(fù)。
將本說(shuō)明書(shū)中引用的包括但不限于專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)的所用出版物和參考物，全文引用作為參考，如同每個(gè)單獨(dú)的出版物或參考物被具體和單獨(dú)地全文引用作為參考。本申請(qǐng)要求優(yōu)先權(quán)的任何專(zhuān)利申請(qǐng)也以與出版物和參考物的上述方式相同的方式被全文引用作為參考。
實(shí)施例1切除性創(chuàng)傷修復(fù)模型糖尿病小鼠，如ob/ob品系，表現(xiàn)出延遲性創(chuàng)傷愈合。Stallmeyer等，Diabetologia 44471-479(2001)。ob/ob小鼠是自然出現(xiàn)的缺失瘦蛋白o(hù)b/ob基因的小鼠的品系，所述基因編碼瘦蛋白(Ieptin)。瘦蛋白與細(xì)胞因子類(lèi)I受體obRb結(jié)合，并活化細(xì)胞內(nèi)的減少食欲的信號(hào)級(jí)聯(lián)。由于ob/ob小鼠不能生成瘦蛋白，因此它們比較肥胖，為正常C57/B16小鼠的兩倍體重。該肥胖小鼠還有其它代謝缺陷，包括產(chǎn)熱減少、攝食過(guò)量、生育減少以及生長(zhǎng)激素的抑制。Ring等，Endocrinol.141(1)446-449(2000)。ob/ob小鼠的創(chuàng)傷恢復(fù)的延遲歸因于它們的糖尿病樣表型。
受損創(chuàng)傷修復(fù)模型提供了研究特殊細(xì)胞因子對(duì)創(chuàng)傷修復(fù)作用的機(jī)會(huì)，所述細(xì)胞因子可例舉如IL-18和生長(zhǎng)因子如血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)。研究表明，局部應(yīng)用PDGF-β可以增進(jìn)糖尿病小鼠品系db/db的創(chuàng)傷修復(fù)。Greenlaugh等，Am.J.Pathol.1361235-1246(1990)。該db/db品系的表型與ob/ob品系相似，但是db/db小鼠缺少瘦蛋白受體。db/db小鼠的創(chuàng)傷在細(xì)胞浸潤(rùn)、粒狀組織形成中表現(xiàn)明顯的延遲，并且表現(xiàn)延遲創(chuàng)傷愈合。血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF-β)對(duì)平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞既是促細(xì)胞分裂劑又是化學(xué)引誘物，并且對(duì)db/db小鼠的創(chuàng)傷引起快速的再次表皮細(xì)胞再生。雖然以往白介素-18(IL-18)沒(méi)有在創(chuàng)傷修復(fù)模型中作為治療劑使用，但是研究表明，ob/ob小鼠的創(chuàng)傷中IL-18的表達(dá)水平增加，但蛋白產(chǎn)物沒(méi)有增加。Kampfer等，J.Invest.Derm.113(3)369-74(1999)。由于IL-18是促炎細(xì)胞因子(Kampfer等，Eur.Cytokine Netw.11626-33(2000))，它可通過(guò)刺激細(xì)胞浸潤(rùn)至創(chuàng)傷處，在創(chuàng)傷愈合中起重要作用。
為了研究局部給藥IL-18或PDGF-β對(duì)創(chuàng)傷修復(fù)的作用，使用氯胺酮(90mg/kg)/賽拉嗪(10mg/kg)混合物(cocktail)麻醉10-14周齡的雌性ob/ob小鼠。在兔耳模型中腺病毒-介導(dǎo)的PDGF過(guò)表達(dá)表現(xiàn)出修正缺血性創(chuàng)傷修復(fù)。Liechty等，J.Invest.Dermatol.113375-383(1999)。Liechty等證實(shí)了，復(fù)制不足的腺病毒有效地將PDGF-β轉(zhuǎn)基因直接給藥至創(chuàng)傷部位的細(xì)胞。將每只小鼠的后背的上部剃毛，交替用乙醇和聚維酮碘擦拭形成一個(gè)無(wú)菌區(qū)。用無(wú)菌生檢打孔器使每只小鼠形成兩個(gè)直徑6mm的全厚度環(huán)形切除性創(chuàng)傷。將編碼鼠IL-18(SEQ ID NO2)、鼠PDGF-β(SEQ ID NO3的氨基酸1-61和171-221)或者對(duì)照(空腺病毒-CMV.Null))的腺病毒(1×1010病毒粒/創(chuàng)傷)直接局部遞送至創(chuàng)傷部位。鹽水對(duì)照也直接遞送至創(chuàng)傷部位。隨后將Polaxamer(普盧蘭尼克(Pluronic)F127在10％的磷酸鹽緩沖鹽(PBS)中)覆蓋在創(chuàng)傷上，再用透明的無(wú)菌敷料覆蓋。為了確定創(chuàng)傷愈合速率每間隔兩天將創(chuàng)傷的周線印記至透明膠片上。當(dāng)所有的創(chuàng)傷愈合，該研究結(jié)束時(shí)，將該透明光膠片光學(xué)掃描，并用Scion Image軟件(Scion Corporation，F(xiàn)rederick，Maryland，U.S.A)確定表面積。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖5。
通過(guò)直接克隆的方法得到對(duì)照腺病毒、Ad.mPDGF-β(SEQ ID NO3氨基酸1-61和171-221)(Sukmanm A.J.，Kallarakal，A.，F(xiàn)ornwald，J.，Kozarsky，K.F.，Appelbaum，E.，Shatzman，A.R.和Lu，Q.2002，Generation of recombinantadenovirus vectors by a direct cloning approach.In Gene Cloning andExpression Technologies，M.P.Weiner和Q.Lu(編輯).第341-355頁(yè).Eaton出版，Westborough，MA)。簡(jiǎn)而言之，將用于鼠PDGF-β的ORF經(jīng)PCR擴(kuò)增，并且將其克隆至pAC2XS的XbaI/SwaI位點(diǎn)，將該基因置于CMV IE啟動(dòng)因子的控制下。通過(guò)用限制酶PacI消化將腺病毒載體的經(jīng)純化的分子克隆DNA線性化，使ITRs暴露，并轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中用以腺病毒復(fù)蘇(rescue)。通過(guò)記載的CsCl顯帶法(Engelhardt，J.1999.Methods foradenovirus-mediated gene transfer to airway epithelium.In Methods inMolecular Medicine，Gene Therapy Protocols，P.Robbins(編輯).第169-184頁(yè).Humana Press，Totowa)將該腺病毒擴(kuò)增和純化。通過(guò)使用生物凝膠柱(Bio-Rad)使?jié)饪s的腺病毒除去鹽分，并將其于-80℃儲(chǔ)存在含有10％甘油的1×PBS中。使用在Osaki等，Gene Therapy 6808-815(1999)中描述的方法，可進(jìn)行該Ad.m-IL-18的構(gòu)建。
由于用腺病毒載體局部遞送了蛋白質(zhì)構(gòu)建物，Ad.m-PDGF-β(SEQ IDNO3的氨基酸1-61和171-221)以及Ad.m-IL-18(SEQ ID NO2)均顯著促進(jìn)ob/ob切除性創(chuàng)傷修復(fù)模型的創(chuàng)傷修復(fù)。與載體對(duì)照(Ad.CMV.Null)相比較，作為陽(yáng)性對(duì)照蛋白的Ad.m-PDGF-β(SEQ ID NO3的氨基酸1-61和171-221)以及Ad.m-IL-18(SEQ ID NO2)在第7.5和9.5日分別達(dá)到50％修復(fù)第0日的創(chuàng)傷(50％ Day Zero closure)，所述載體對(duì)照在創(chuàng)傷后第20日達(dá)到50％修復(fù)第0日創(chuàng)傷。另外，Ad.m-IL-18(SEQ ID NO2)和Ad.m-PDGF-β(SEQ ID NO3的氨基酸1-61和171-221)在20天內(nèi)均加速了創(chuàng)傷的完全愈合。創(chuàng)傷之后的第22天的研究結(jié)論表明，鹽水或載體對(duì)照組均沒(méi)有完全愈合。已經(jīng)證實(shí)了在切除性創(chuàng)傷修復(fù)模型中局部施用Ad.IL-18的陽(yáng)性作用，研究了全身遞送鼠IL-18蛋白質(zhì)(SEQ ID NO2)的效果。
為了確定系統(tǒng)遞送鼠IL-18(SEQ ID NO2)的作用，使用氯胺酮(90mg/kg)/賽拉嗪(10mg/kg)混合物麻醉10-14周齡的雌性ob/ob小鼠。在創(chuàng)傷過(guò)程之前的2小時(shí)，腹膜內(nèi)給藥小鼠多劑量(從0.1μg/0.5ml至100μg/0.5m1)的鼠IL-18蛋白質(zhì)(SEQ ID NO2)或者載體(不含鈣和鎂的PBS)。將每只小鼠的后背的上部剃毛，交替用乙醇和聚維酮碘擦拭形成一個(gè)無(wú)菌區(qū)。用無(wú)菌生檢打孔器使每只小鼠形成兩個(gè)直徑6mm的全厚度環(huán)形切除性創(chuàng)傷。將鹽水直接施用至創(chuàng)傷，之后用透明的無(wú)菌敷料覆蓋。為了確定創(chuàng)傷愈合速率每間隔兩天將創(chuàng)傷的周線印記至透明膠片上。當(dāng)所有的創(chuàng)傷愈合，該研究結(jié)束時(shí)，將該透明光膠片光學(xué)掃描，并用Scion Image軟件(Scion Corporation，F(xiàn)rederick，Maryland，U.S.A)確定表面積。在該系統(tǒng)研究的整個(gè)過(guò)程中，監(jiān)測(cè)小鼠體重的減少和增加。將該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖6。
由于系統(tǒng)遞送經(jīng)純化的蛋白質(zhì)，鼠IL-18(SEQ ID NO2)提高創(chuàng)傷修復(fù)的速率，并在0.1μg至100μg/小鼠/日的劑量范圍內(nèi)顯示劑量依賴(lài)性。最有效的劑量為50和100μg/小鼠/日，與載體對(duì)照相比較，這兩個(gè)劑量分別在第8和9日達(dá)到50％修復(fù)第0日創(chuàng)傷，載體對(duì)照在第16日達(dá)到50％修復(fù)第0日創(chuàng)傷。與PBS對(duì)照相比較，m-IL-18(SEQ ID NO2)治療提高了完全修復(fù)速率。
在ob/ob切除性創(chuàng)傷修復(fù)模型中，局部和全身遞送鼠IL-18(SEQ ID NO2)均可增強(qiáng)創(chuàng)傷修復(fù)。PDGF在我們的鼠創(chuàng)傷修復(fù)研究中被作為陽(yáng)性對(duì)照來(lái)使用。重組人血小板來(lái)源的生長(zhǎng)因子已經(jīng)被U.S.Food and Drug Administration許可來(lái)治療糖尿病足潰瘍。Wieman等，Am.J.Surg.176745-795(1998)。許多身體疾病來(lái)自于組織損傷，這些組織損傷破壞了組織的自然構(gòu)造，導(dǎo)致創(chuàng)傷。在該專(zhuān)利中提到的適應(yīng)癥均是通過(guò)用人IL-18(SEQ ID NO1)治療可以修復(fù)的組織損傷的示例。
實(shí)施例2對(duì)切除性創(chuàng)傷每日局部遞送人IL-18由于在鼠切除性創(chuàng)傷修復(fù)模型中，以腺病毒構(gòu)建物局部遞送鼠IL-18(SEQ ID NO2)是有效的，因此進(jìn)行了將純化的人IL-18(SEQ ID NO1)蛋白質(zhì)每日直接用于上述實(shí)施例1的創(chuàng)傷的研究。以10μg/30μl/創(chuàng)傷的劑量施用人IL-18蛋白質(zhì)(SEQ ID NO1)。磷酸緩沖鹽(PBS)作為稀釋劑對(duì)照。結(jié)果示于圖7，表明與PBS對(duì)照相比較，人IL-18(SEQ ID NO1)加速創(chuàng)傷修復(fù)。在臨床上，人PDGF已經(jīng)局部應(yīng)用來(lái)治療糖尿病足潰瘍。Wieman等，Am.J.Surg.176745-795(1998)。
實(shí)施例3腸粘膜炎模型癌癥治療，如化學(xué)治療或放射，常常由于腺管(crypt)的破壞導(dǎo)致胃腸道的細(xì)胞毒損傷。該腺管損耗導(dǎo)致潰瘍沿著上皮組織的裸露部位發(fā)展，引起胃腸道粘膜炎。一個(gè)密切相關(guān)的情況為，當(dāng)細(xì)胞毒劑破壞口腔的上皮層時(shí)，導(dǎo)致潰瘍發(fā)展，發(fā)生口腔粘膜炎。如果蛋白質(zhì)，如人角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)(SEQ ID NO4)在腸粘膜炎模型中具有活性，那么它通過(guò)刺激上皮的增殖和分化，可以作為有絲分裂因子。Potten等，Cell GrowthDiffer.12265-75(2001)?；蛘?，人KGF(SEQ ID NO4)可以作為細(xì)胞周期抑制劑，所述抑制劑在細(xì)胞毒損傷之前誘導(dǎo)干細(xì)胞停止周期，因此保護(hù)了干細(xì)胞，從而，延長(zhǎng)了腺管存活。Farrell等，Cancer Res.58933-39(1998)。同樣地，在口腔粘膜炎中降低干細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒損傷的敏感性及/或改善接觸后的再生應(yīng)答的治療，通過(guò)減少目前癌癥治療方法的副作用，將具有臨床上的作用。Sonis等，J.Am.Dent.Assoc.97468-472(1978)。
采用一種分析方法來(lái)說(shuō)明IL-18在粘膜炎中的作用腺管存活分析。
A.腸粘膜炎模型的腺管存活分析下述方法改良自EpiStem，Ltd.，Incubator Building，Grafton Street，Manchester，M13 9XX，UK.。
使用30只成年(10-12周齡)雄性BDF1小鼠。所用動(dòng)物飼養(yǎng)2周用以穩(wěn)定晝夜循環(huán)周期(Potten等，1977，Cell Tissue Kinet.，10，557)。將小鼠單獨(dú)的放置在12小時(shí)光亮黑暗循環(huán)的SPF柵欄單元中的通風(fēng)籠子(IVCs)中。整個(gè)過(guò)程中，動(dòng)物可以自由攝食和飲水。整個(gè)過(guò)程符合UK Home Office(AnimalProcedures)Act 1986。將動(dòng)物以，每組6只隨機(jī)分成以下6組(1)照射前以及照射后腹腔注射鹽水的組；(2)在照射前腹腔注射藥物，在照射后注射鹽水的組；(3)在照射前腹腔注射鹽水，在照射后注射藥物的組；(4)在照射前和照射后注射藥物的組；(5)未處理對(duì)照組；以及(6)照射前腹腔注射人KGF(SEQID NO4)，在照射后注射鹽水的組(陽(yáng)性對(duì)照)。
利用單劑量的13Gy X-射線照射，采用全身暴露造成腸損傷。13Gy為開(kāi)始的最佳中劑量，因?yàn)閼?yīng)該篩選出受試化合物的所有潛在保護(hù)作用(Withers等，1969，Rad.Res.，38，598)。所有動(dòng)物從開(kāi)始進(jìn)行處理到被處死均每日稱(chēng)重。動(dòng)物在照射4日后被處死。將小腸剝離并用Carnoy’s固定劑固定。處理所有組織用于顯微解剖學(xué)(石蠟包埋)。使用Carnoy’s固定材料對(duì)每個(gè)治療組中的小腸腺管的存活數(shù)量進(jìn)行記分并使用未處理對(duì)照組進(jìn)行大小校正，作為各組的“ClonoQuantTM”。對(duì)于每只小鼠，對(duì)10個(gè)腸橫切片進(jìn)行記分并計(jì)算每個(gè)橫切片的腺管數(shù)量的平均值(Farrell等，1998，Cancer Res.，58，933)。也測(cè)量腺管的厚度來(lái)校正由大小引起的評(píng)分誤差。再進(jìn)行大小校正之后，對(duì)每組的每個(gè)橫切片的腺管的平均數(shù)進(jìn)行記分。將采用的注射方案示于下表1。蛋白質(zhì)購(gòu)自PeproTech，，產(chǎn)品目錄為100-19。
表1

S＝腹膜內(nèi)注射鹽水D＝腹膜內(nèi)注射藥物KGF＝腹膜內(nèi)注射陽(yáng)性對(duì)照藥I＝用13Gy照射C＝篩選(Cull)Gp＝組根據(jù)該方案，在09:00進(jìn)行所有的注射。在15:00進(jìn)行照射。
在對(duì)04/135C的研究中，考察在照射之后鼠IL-18(SEQ ID NO2)對(duì)腸腺管存活的作用，該考察是在由EpiStem Ltd.EpiStem’s CLONOQUANT系統(tǒng)協(xié)約下進(jìn)行的，對(duì)小腸的橫切片中的再生腺管進(jìn)行識(shí)別和定量。在細(xì)胞毒損傷之后，再生的腺管迅速增多，并且十分容易從死亡的腺管中區(qū)分。人KGF(SEQ ID NO4)的劑量為6.25mg/kg/日，并在該研究中作為陽(yáng)性對(duì)照。鼠IL-18(SEQ ID NO2)的劑量為5mg/kg/日。將關(guān)于每個(gè)腺管周邊的腺管的存活數(shù)量的數(shù)據(jù)顯示在圖6中。
下表2中總結(jié)了從放射誘發(fā)粘膜炎模型中得到的數(shù)據(jù)。用于放射誘發(fā)的粘膜炎的研究中的陽(yáng)性對(duì)照人KGF(SEQ ID NO4)，在于照射之前給藥3天的情況下顯示出良好的活性。人KGF(SEQ ID NO4)組在存活腺管的數(shù)量上顯示為鹽水對(duì)照組的4倍。鼠IL-18(SEQ ID NO2)在于照射之前給藥3天的情況下，具有與人KGF(SEQ ID NO4)相當(dāng)?shù)幕钚裕湓谙俟艽婊罘矫骘@示出為鹽水對(duì)照組的3倍。與鹽水對(duì)照組比較，當(dāng)在照射前和照射后均給藥鼠IL-18(SEQ ID NO2)時(shí)，腺管存活的數(shù)量提高至2倍。當(dāng)僅在照射之后給藥鼠IL-18(SEQ ID NO2)時(shí)效果最小，對(duì)存活腺管僅導(dǎo)致提高至1.6倍。在照射之前給藥鼠IL-18(SEQ ID NO2)3天是最有效的治療方案。
雖然化學(xué)治療和放射治療對(duì)于殺死癌細(xì)胞是成功的治療方法，但是健康的組織也同時(shí)受到破壞。當(dāng)胃腸道上皮層缺乏抵抗力時(shí)，會(huì)出現(xiàn)潰瘍和腺管破壞，給患者帶來(lái)痛苦，患者不能進(jìn)食并容易受到感染。另外，粘膜炎的發(fā)展將導(dǎo)致病人在完成化學(xué)治療或放射治療的全程治療方案中缺少順應(yīng)性。在鼠模型中，KGF改善了放射和化學(xué)治療引起的口腔和胃腸道上皮的損傷。已經(jīng)顯示出，重組[人]KGF可以減輕接受氟尿嘧啶+亞葉酸治療的轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者的口腔粘膜炎。Meropol等，J.Clin.Oncol.211452-1458(2003)。在放射誘發(fā)的粘膜炎模型中，鼠IL-18(SEQ ID NO2)已經(jīng)顯示出對(duì)保護(hù)腸腺管的有效性，并可以用作對(duì)人的緩和治療。由于IL-18已經(jīng)在放射誘發(fā)的粘膜炎中顯示出陽(yáng)性作用，因此它也可以用于治療口腔粘膜炎中的受損上皮組織。
表2.
原始數(shù)據(jù)每個(gè)腺管環(huán)狀面的存活腺管的數(shù)量

序列表<110>史密絲克萊恩比徹姆公司(SMITHKLINE BEECHAM CORPORATION)DEDE，KimberlyLEE，Judithann<120>給藥人IL-8治療創(chuàng)傷的方法<130>PU60998<140>Herewith<141>2005-08-05<150>60/603,012<151>2004-08-20<160>4<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>157<212>PRT<213>人(Homo sapien)<400>1Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn1 5 10 15Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp20 25 30Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile35 40 45Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile50 55 60Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile65 70 75 80Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys85 90 95Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys100 105 110Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu115 120 125Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu130 135 140Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp145 150 155<210>2<211>157<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>2Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn15 10 15Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met20 25 30Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile35 40 45
Tyr Met Tyr Lys Asp Ser G1u Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser50 55 60Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile65 70 75 80Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser85 90 95Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu100 105 110Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu115 120 125Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp130 135 140Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser145 150 155<210>3<211>241<212>PRT<213>人(Homo sapien)<220>
<221>SIGNAL<222>(-241)...(20)<400>3Met Asn Arg Cys Trp Ala Leu Phe Leu Pro Leu Cys Cys Tyr Leu Arg-20 -15 -10 -5Leu Val Ser Ala Glu Gly Asp Pro Ile Pro Glu Glu Leu Tyr Glu Met1 5 10Leu Ser Asp His Ser Ile Arg Ser Phe Asp Asp Leu Gln Arg Leu Leu15 20 25His Arg Asp Ser Val Asp Glu Asp Gly Ala Glu Leu Asp Leu Asn Met30 35 40Thr Arg Ala His Ser Gly Val Glu Leu Glu Ser Ser Ser Arg Gly Arg45 50 55 60Arg Ser Leu Gly Ser Leu Ala Ala Ala Glu Pro Ala Val Ile Ala Glu65 70 75Cys Lys Thr Arg Thr Glu Val Phe Gln Ile Ser Arg Asn Leu Ile Asp80 85 90Arg Thr Asn Ala Asn Phe Leu Val Trp Pro Pro Cys Val Glu Val Gln95 100 105Arg Cys Ser Gly Cys Cys Asn Asn Arg Asn Val Gln Cys Arg Ala Ser110 115 120Gln Val Gln Met Arg Pro Val Gln Val Arg Lys Ile Glu Ile Val Arg125 130 135 140Lys Lys Pro Ile Phe Lys Lys Ala Thr Val Thr Leu Glu Asp His Leu145 150 155Ala Cys Lys Cys Glu Thr Ile Val Thr Pro Arg Pro Val Thr Arg Ser160 165 170Pro Gly Thr Ser Arg Glu Gln Arg Ala Lys Thr Pro Gln Ala Arg Val175 180 185Thr Ile Arg Thr Val Arg Ile Arg Arg Pro Pro Lys Gly Lys His Arg190 195 200Lys Phe Lys His Thr His Asp Lys Ala Ala Leu Lys Glu Thr Leu Gly205 210 215 220Ala<210>4
<211>164<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>4Met Cys Asn Asp Met Thr Pro Glu Gln Met Ala Thr Asn Val Asn Cys1 5 10 15Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly20 25 30Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg35 40 45Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn Asn50 55 60Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile65 70 75 80Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys85 90 95Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu100 105 110Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His115 120 125Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro Val130 135 140Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro145 150 155 160Met Ala Ile Thr
權(quán)利要求
1.一種在需要治療的患者中治愈創(chuàng)傷的方法，包括向所述患者給藥治療有效劑量的人IL-18多肽(SEQ ID NO1)的步驟。
2.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述創(chuàng)傷選自皮膚創(chuàng)傷、外科創(chuàng)傷、腿部潰瘍、糖尿病潰瘍、粘膜炎以及肺損傷。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中經(jīng)胃腸外給藥途徑給藥人IL-18。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述胃腸外給藥選自皮下給藥、肌內(nèi)給藥、靜脈給藥或和鼻內(nèi)給藥。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述粘膜炎為口腔粘膜炎。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述粘膜炎為腸粘膜炎。
7.一種在需要治療的患者中治愈創(chuàng)傷的方法，包括向所述患者給藥藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包括有效量的人IL-18多肽(SEQ ID NO1)和載體的組合。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述創(chuàng)傷選自皮膚創(chuàng)傷、外科創(chuàng)傷、腿部潰瘍、糖尿病潰瘍、粘膜炎以及肺損傷。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述粘膜炎為口腔粘膜炎。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述粘膜炎為腸粘膜炎。
11.如權(quán)利要求2所述的方法，其中經(jīng)胃腸外給藥途徑給藥所述藥物組合物。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述胃腸外給藥選自皮下給藥、肌內(nèi)給藥、靜脈給藥或和鼻內(nèi)給藥。
13.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述創(chuàng)傷為皮膚創(chuàng)傷，并且進(jìn)一步地向所述患者局部給藥所述藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明一般涉及人IL－18在治療皮膚創(chuàng)傷、外科創(chuàng)傷、腿部潰瘍、糖尿病患者潰瘍、胃腸道粘膜炎、口腔粘膜炎以及肺損傷中的用途，所述人IL－18也被認(rèn)為是干擾素－γ－誘導(dǎo)因子(IGIF)。
文檔編號(hào)A61K45/00GK101039696SQ200580033819
公開(kāi)日2007年9月19日 申請(qǐng)日期2005年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月20日
發(fā)明者朱迪森·李, 金伯利·A·戴德 申請(qǐng)人:史密絲克萊恩比徹姆公司